Name: Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Poznaj izolację jąder z komórek progenitorowych serca myszy do analizy epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki. Ta metoda pozwala badać heterogeniczność komórkową i mechanizmy wrodzonych wad serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez ERA-CVD-2019 i ANR-JCJC-2020 do SS. Dziękujemy Zakładowi Genomiki i Bioinformatyki (GBiM) z laboratorium U 1251/Marseille Medical Genetics oraz anonimowym recenzentom za cenne uwagi.

Procedura na zwierzętach przyjęta w tym badaniu została zatwierdzona przez komisje etyczne Uniwersytetu Aix-Marseille (C2EA-14) i została przeprowadzona zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez wyznaczoną krajową komisję etyczną ds. doświadczeń na zwierzętach (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autoryzacja Apafis N°33927-2021111715507212).
1. Ustawianie krycia czasowego przed sekcją
<ol>
	<li>Aby wygenerować zarodki myszy, należy przeprowadzić krycie w czasie między dorosłymi myszami 9,5 dnia przed izolacją regionu serca. W tej procedurze wykorzystano myszy C57BL/6J typu dzikiego w wieku 2-6 miesięcy, a krycie w czasie przeprowadzono w nocy.</li>
	<li>Następnego ranka sprawdź, czy samice myszy mają korek dopochwowy. Za dzień, w którym czop zostanie zidentyfikowany, należy wziąć pod uwagę dzień embrionalny (E) 0,5.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanek i izolacja komórek
<ol>
	<li>Eutanazja ciężarnej samicy C57BL/6J w wieku 2-6 miesięcy po zapłodnieniu w 9,5 dniu po zapłodnieniu za pomocą CO2 ze zwiększonym stężeniem, a następnie zwichnięciem szyjki macicy. Oczyść dolną część brzucha 70% etanolem. 
	UWAGA: Nie zaleca się stosowania środków znieczulających przed zwichnięciem szyjki macicy, ponieważ naraziłoby to zarodki na zmiany środowiskowe, które mogłyby wpłynąć na późniejsze badania transkryptomiczne i epigenomiczne.</li>
	<li>Otwórz brzuch i otrzewną nożyczkami. Wizualizuj rogi macicy i użyj kleszczy, aby wyciąć oba rogi.</li>
	<li>Umieść rogi na szalce Petriego zawierającej zimne kompletne podłoże z 1% FBS. Chociaż nie jest wymagana określona objętość, należy zadbać o to, aby zarodki były całkowicie zanurzone w pożywce. Odpowiednia jest przybliżona objętość 10 ml na 10 cm szalki Petriego.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym ustawionym na 5-krotne powiększenie i za pomocą kleszczy usuń tkankę endometrium, łożysko i woreczek żółtkowy z każdego zarodka.</li>
	<li>Umieścić zarodki na szalce Petriego z zimnym, kompletnym podłożem z 1% FBS. Wypreparuj obszar serca embrionalnego, jak opisano na schematycznym zarodku zilustrowanym na Rysunek 1, w zimnym, kompletnym podłożu.</li>
	<li>Połącz ze sobą obszary serca wycięte z pięciu zarodków myszy w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Wirówki kubełkowe z funkcją wstępnego schładzania wahliwego do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Wirować przy 300x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w wirówce z odchylanym kubełkiem. Usunąć sklarowany osad i przemyć tkanki, dodając 1 ml PBS do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i powtórzyć etapy mycia, w sumie dwa płukania. Powtórz pranie dwukrotnie, zastępując PBS 0,05% trypsyną/EDTA (1x).</li>
	<li>W celu trawienia tkanek dodawać 50 μl 0,25% trypsyny/EDTA przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Po 5 minutach zastosuj delikatną dysocjację mechaniczną, wykonując gesty w górę iw dół, używając końcówki filtra o szerokim otworze.</li>
	<li>Dezaktywować aktywność trawienia trypsyny poprzez dodanie 350 μl kompletnej pożywki do zdysocjowanych komórek. Przepuścić zawieszone komórki przez sitko o wielkości 40 μm.</li>
</ol>
3. Liczenie komórek i ocena żywotności
UWAGA: Liczba komórek i żywotność są kluczowymi parametrami dla powodzenia eksperymentów z pojedynczymi komórkami. Podejście snATAC-seq jest wrażliwe na niewielkie zmiany w liczbie komórek. Zbyt mała liczba komórek prowadzi do nadmiernego trawienia chromatyny, co skutkuje większą liczbą odczytów i mapowaniem niedostępnych regionów chromatyny (szumu). Podobnie, posiadanie zbyt wielu komórek generuje fragmenty o dużej masie cząsteczkowej, które są trudne do zsekwencjonowania. W celu dokładnego określenia stężeń komórek i jąder, liczbę komórek i żywotność oceniano za pomocą dwóch różnych metod.
<ol>
	<li>Wykonać test błękitu trypanowego do zliczania komórek, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Wirować 0,4% roztwór barwiący błękit trypanowy, wirować przez 10 s w temperaturze pokojowej przy 2,000 x g i przenieść 10 μl do mikroprobówki.</li>
		<li>Za pomocą pipety wymieszać zawiesinę komórek i dodać 10 μl zawiesiny do już podanych 10 μl roztworu błękitu trypanowego. Dokładnie wymieszaj 10 razy pipetą.</li>
		<li>Przenieść 10 μl wybarwionych komórek na szkiełko liczące. Umieść szkiełko w liczniku, aby automatycznie obliczyć stężenie komórek i żywotność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj ocenę śmiertelności na podstawie fluorescencji, jak opisano poniżej. 
	UWAGA: Ten test opiera się na użyciu barwników fluorescencyjnych (ethidium homodimer-1, EthD-1 i kalceina AM) do oceny żywotności komórek. Użyto dostępnego na rynku zestawu i postępowano zgodnie z instrukcjami dostawcy dotyczącymi prawidłowego przygotowania i użytkowania.
	<ol>
		<li>Przygotować 10 μM roztwór EthD-1, dodając 5 μl dostarczonego 2 mM roztworu podstawowego EthD-1 do 1 ml sterylnego D-PBS klasy hodowli tkankowej i wirować przez 5 sekund, aby zapewnić całkowite wymieszanie.</li>
		<li>Przenieść 2,5 μl dostarczonego 4 mM roztworu podstawowego kalceiny AM do już przygotowanego roztworu EthD-1. Wiruj przez 5 sekund, aby zapewnić całkowite wymieszanie.</li>
		<li>Dodać 10 μl otrzymanego 10 μM roztworu roboczego EthD-1 i 10 μM kalceiny AM do 10 μl zawiesiny komórek. 
		UWAGA: Kalceina jest bardzo podatna na hydrolizę w roztworach wodnych, dlatego należy zużyć ten roztwór roboczy w ciągu 1 dnia.</li>
		<li>Przenieść 10 μl wybarwionych komórek na szkiełko liczące. Włóż szkiełko do automatycznego licznika komórek fluorescencyjnych. Policz aktywne komórki za pomocą filtru GFP, a martwe komórki za pomocą filtru RFP. 
		UWAGA: Obie metody liczenia dały podobną liczbę komórek i żywotność, a całkowita liczba świeżo zdysocjowanych komórek została oszacowana średnio na około 20 000 komórek na embrionalny region serca (0,06 mm3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zamrażanie komórek
<ol>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant bez dotykania dna probówki i ponownie zawiesić osad w 1 ml schłodzonego podłoża do zamrażania.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę komórek do wstępnie schłodzonego kriowialu i umieść kriowial we wstępnie schłodzonym pojemniku do zamrażania.</li>
	<li>Umieścić pojemnik w temperaturze -80 ◦C na 4 godziny do 8 godzin. Przenieść kriowial do ciekłego azotu w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów sekwencjonowania jednojądrowego RNA i ATAC. 
	UWAGA: Kriowial należy transportować na suchym lodzie przed użyciem. Z naszego doświadczenia wynika, że komórki mogą być przechowywane w ciekłym azocie przez co najmniej 6 miesięcy bez utraty żywotności komórek. Temperatura przechowywania powinna być zawsze utrzymywana poniżej -150 °C, aby zapobiec tworzeniu się kryształków lodu.</li>
</ol>
5. Rozmrażanie komórek i usuwanie martwych komórek
<ol>
	<li>Umieść kriowiale w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1-2 minuty. Usuń je, gdy w kriowiale pozostanie niewielki kryształ.</li>
	<li>Dodać 1 ml podgrzanego (37 °C) kompletnego podłoża. Wymieszać pipetą trzy razy. Przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml ciepłej, kompletnej pożywki.</li>
	<li>Przepuścić całą zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 30 μm. Przepłukać sitko 1-2 ml ciepłego kompletnego podłoża i zebrać przepływ do tej samej stożkowej probówki.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Przemyć jeden raz PBS i przenieść zawiesinę komórek do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego.</li>
	<li>Dodaj 100 μl dostarczonych mikrokulek magnetycznych do granulowanych komórek i homogenizuj pięć razy za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W międzyczasie przepłukać kolumnę separacji magnetycznej (pojemność: 1 x 107 do 2 x 108 komórek) 500 μL 1x buforu wiążącego.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji rozcieńczyć zawiesinę komórkową zawierającą mikrogranulki 500 μl 1x buforu wiążącego.</li>
	<li>Nanieść zawiesinę komórek (0,6 μl) na przygotowaną kolumnę do separacji magnetycznej. Przepływ to ujemnie wybrana frakcja żywych komórek, a frakcja zatrzymana magnetycznie to dodatnio wybrane martwe komórki.</li>
	<li>Zebrać ścieki z żywych komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Przepłukać mikroprobówkę o pojemności 1,5 ml, która zawierała zawiesinę komórek i kolumnę, 2 ml buforu wiążącego 1x i zebrać ścieki w tej samej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 min. Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu PBS-BSA i delikatnie wymieszać, pipetując pięć razy za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze. Przenieść zawiesinę komórek do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 min. Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego.</li>
	<li>Dodać 1 ml PBS-BSA w celu ponownego zawieszenia granulki i powtórzyć etap mycia, co daje w sumie dwa prania.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 100 μl roztworu PBS-BSA. Delikatnie wymieszać, pipetując 10 razy.</li>
	<li>Określić stężenie i żywotność komórek przy użyciu wcześniej opisanych metod (krok 3.1 i krok 3.2). Aby przejść do następnego kroku, upewnij się, że liczba komórek wynosi ≥ 100 000 komórek. Zobacz Rysunek 2 dla reprezentatywnych wyników. 
	UWAGA: Kriokonserwacja powoduje utratę około 40% początkowego materiału wyjściowego żywych komórek. W zależności od początkowej liczby komórek, separacja kulek na kolumnie magnetycznej powoduje wysoką żywotność komórek, ale dzieli całkowitą liczbę komórek od dwóch do pięciu razy. Użycie kolumnowego zestawu magnetycznego do usuwania martwych komórek jest zalecane tylko wtedy, gdy dostępna jest wystarczająca ilość materiału wyjściowego.</li>
</ol>
6. Izolacja jąder
UWAGA: połączenie snATAC i snRNA-seq odbywa się z zawiesiną czystych i nienaruszonych jąder. Zaleca się optymalizację warunków lizy (czas lizy i stężenie NP40) dla zastosowanego typu ogniwa. Optymalny punkt czasowy lizy i stężenie detergentu to takie, które powodują lizę maksymalnej liczby komórek bez zakłócania morfologii jądrowej. Utratę komórek/jąder można zmniejszyć, stosując wirówkę z wahadłowym wiadrem zamiast wirówki o stałym kącie. Aby zminimalizować zatrzymywanie jąder na tworzywach sztucznych, zaleca się stosowanie końcówek do pipet i probówek wirówkowych o niskiej retencji. Może to zwiększyć regenerację jąder. Powlekanie końcówek pipet i probówek wirówkowych 5% BSA jest tańszą, ale bardziej czasochłonną alternatywą.
<ol>
	<li>Oczyść miejsce pracy i materiały 70% etanolem i roztworem do usuwania RNazy.</li>
	<li>Wirówki kubełkowe z odchylanym chłodzeniem wstępnym do temperatury 4 °C. Świeżo przygotować bufor do lizy, bufor do rozcieńczania lizy, 0,1x bufor do lizy i bufor do płukania (patrz Tabela 1). Utrzymuj na lodzie.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z odchylanym kubełkiem. Delikatnie usunąć cały szwanek, nie dotykając dna probówki, aby uniknąć przemieszczenia się osadu komórkowego.</li>
	<li>Dodać 100 μl schłodzonego 0,1x buforu do lizy. Delikatnie wymieszać, pipetując 10 razy. Inkubować przez 5 minut na lodzie.</li>
	<li>Dodać 1 ml schłodzonego buforu do płukania i delikatnie wymieszać, pipetując pięć razy. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant bez naruszania osadu jądrowego.</li>
	<li>Powtórz pranie ze schłodzonym buforem do mycia, w sumie trzy prania. Przygotować rozcieńczony bufor jąder. Po ponownym wymieszaniu utrzymać roztwór podstawowy jąder na lodzie.</li>
</ol>
7. Oceny jakości i ilości izolowanych jąder
UWAGA: Na podstawie początkowej liczby komórek i oszacowania około 50% utraty jąder podczas lizy komórek, ponownie umieść odpowiednią liczbę komórek w buforze jąder rozcieńczonych na zimno. Obliczenie objętości ponownego zawieszenia za pomocą schłodzonego, rozcieńczonego buforu jąder opiera się na docelowym odzysku jąder i odpowiadających im stężeniach podstawowych jąder zalecanych w podręczniku użytkownika producenta. Przykład tego obliczenia znajduje się w Protokole Dodatkowym 1.
<ol>
	<li>Opierając się na początkowej liczbie komórek i szacując około 50% utraty jąder podczas lizy komórek, ponownie zawiesić odpowiednią liczbę komórek w buforze jąder rozcieńczonych na zimno.</li>
	<li>Określić rzeczywiste stężenie jąder. Zmieszać 2 μl roztworu podstawowego jąder z 8 μl rozcieńczonego buforu jąder i dodać mieszaninę do wstępnie porcjowanych 10 μl roztworu roboczego błękitu trypanowego lub EthD-1/calceinAM. Policz jądra za pomocą automatycznego licznika komórek. Mniej niż 5% komórek powinno być zdolnych do życia. Zobacz Rysunek 3, aby uzyskać reprezentatywne wyniki.</li>
	<li>Obliczyć objętość jądra wyjściowego i objętość rozcieńczonego buforu jąder, aby uzyskać całkowitą objętość 5 μl przy stężeniu zalecanym dla reakcji transpozycji (patrz podręcznik użytkownika producenta). Przejdź natychmiast do reakcji transpozycji zgodnie z instrukcją obsługi17. 
	UWAGA: Wszystkie kroki od reakcji transpozycji do budowy bibliotek ATAC i GEX zostały wykonane zgodnie z instrukcją obsługi zestawu używanego do snRNA-seq i snATAC-seq combin17.</li>
</ol>
8. Analiza jakości bibliotek snRNA-seq i snATAC-seq
<ol>
	<li>Przed przystąpieniem do sekwencjonowania nowej generacji należy zweryfikować jakość i rozkład wielkości końcowych bibliotek snATAC-seq i ekspresji genów GEX. Oceń jakość i ilość sekwencji zidentyfikowanych w bibliotekach za pomocą systemów analizy fragmentów. Zobacz Rysunek 4 dla reprezentatywnych wyników oceny jakości. 
	UWAGA: Końcowy ślad bibliotek snATAC-seq powinien pokazywać okresowość nawijania nukleosomów, a rozmiary powinny wynosić od 200 pz do kilku Kbp, podczas gdy rozmiary w bibliotece ekspresji genów powinny wynosić od 300 pz do 600 pz.</li>
</ol>

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells at Single-Cell Resolution

<ol><li>vander Bom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+epidemiology+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The changing epidemiology of congenital heart disease.</a> Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).</li>
<li>Bouma, B. J., Mulder, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+landscape+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Changing landscape of congenital heart disease.</a> Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).</li>
<li>Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+congenital+heart+disease%3A+The+contribution+of+the+noncoding+regulatory+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome.</a> Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).</li>
<li>Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+C%2C+Seminars+in+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Development of the human heart.</a> American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).</li>
<li>Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development of the human heart.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).</li>
<li>Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+in+the+heart%3A+When+every+epigenome+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts.</a> Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).</li>
<li>Tanay, A., Regev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+single-cell+genomics+from+phenomenology+to+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism.</a> Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).</li>
<li>Schwartzman, O., Tanay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+epigenomics%3A+Techniques+and+emerging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications.</a> Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).</li>
<li>Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics%3A+Multiple+measurements+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells.</a> Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).</li>
<li>Stefanovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hox-dependent+coordination+of+mouse+cardiac+progenitor+cell+patterning+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation.</a> Elife. 9, e55124(2020).</li>
<li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plate-based+single-cell+ATAC-seq+workflow+for+fast+and+robust+profiling+of+chromatin+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility.</a> Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Safabakhsh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+nuclei+from+frozen+human+heart+tissue+for+single-nucleus+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing.</a> Current Protocols. 2 (7), e480(2022).</li>
<li>Pimpalwar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+isolation+and+transcriptional+profiling+of+individual+cells+from+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart.</a> Heliyon. 6 (12), 05810(2020).</li>
<li>10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%2210x+Genomics%22">10x Genomics</a>. , CG000338_ChromiumNextGEM_Multiome_ATAC_GEX_User_Guide_RevF.pdf (2022).</li>
<li>Jia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+RNA-seq+and+ATAC-seq+analysis+of+cardiac+progenitor+cell+transition+states+and+lineage+settlement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement.</a> Nature Communications. 9 (1), 4877(2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+dual-omics+reveals+the+transcriptomic+and+epigenomic+diversity+of+cardiac+non-myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes.</a> Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+gene+regulatory+networks+underlying+murine+neonatal+heart+regeneration+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution.</a> Cell Reports. 35 (8), 109211(2021).</li>
<li>Ameen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+single-cell+analysis+of+cardiogenesis+identifies+developmental+trajectories+and+non-coding+mutations+in+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease.</a> Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneering+function+of+Isl1+in+the+epigenetic+control+of+cardiomyocyte+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate.</a> Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).</li>
<li>Manivannan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+profiling+unveils+dysregulation+of+cardiac+progenitor+cells+and+cardiomyocytes+in+a+mouse+model+of+maternal+hyperglycemia%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia.</a> Communications Biology. 5 (1), 820(2022).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data+with+structural+similarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity.</a> Nucleic Acids Research. 50 (21), e121(2022).</li>
<li>What is CellRanger. 10x Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger</a> (2023).</li>
<li>Hill, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+multi-omic+characterization+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease.</a> Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).</li>
<li>Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing%3A+In-depth+decoding+of+heart+biology+and+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genomics%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases.</a> Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).</li>
<li>Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+relief%3A+Emerging+methods+to+mitigate+dissociation-induced+artefacts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts.</a> Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).</li>
<li>Tabula Muris, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li>
<li>Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Batch+effects+in+single-cell+RNA-sequencing+data+are+corrected+by+matching+mutual+nearest+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMNN%3A+Batch+effect+correction+for+single-cell+RNA-seq+data+via+supervised+mutual+nearest+neighbor+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection.</a> Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097(2021).</li>
<li>Stefanovic, S., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA-dependent+transcriptional+and+epigenetic+control+of+cardiac+lineage+specification+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).</li>
<li>Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+proliferation%2C+and+growth+of+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Development, proliferation, and growth of the mammalian heart.</a> Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).</li>
<li>Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outflow+tract+formation-embryonic+origins+of+conotruncal+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42(2021).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated analysis of multimodal single-cell data.</a> Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).</li>
<li>Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+CUT%26RUN+method+for+regulation+network+reconstruction+of+low+abundance+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor.</a> Cellular Signalling. 96, 110361(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Analiza składu komórkowego rozwijającego się serca za pomocą połączonych badań snRNA-seq i snATAC-seq zapewnia głębsze zrozumienie pochodzenia wrodzonych wad serca26. Kilka laboratoriów badawczych badało wpływ kriokonserwacji tkanek serca na snRNA-seq27. Przeprowadzanie sekwencji snRNA-seq i snATAC-seq przy użyciu świeżej mikrowypreparowanej tkanki z mysich modeli chorób ludzkich może być logistycznie trudne przy porównywaniu różnych warunków eksperymentalnych. Dla danego e...

Wśród wad wrodzonych, najczęściej występują wrodzone wady serca (CHD), występujące u około 1% żywych urodzeń każdego roku1,2. Mutacje genetyczne są identyfikowane tylko w mniejszości przypadków, co sugeruje, że inne przyczyny, takie jak nieprawidłowości w regulacji genów, są zaangażowane w etiologię CHD2,3. Rozwój serca to złożony proces obejmujący różnorodne i oddziałujące na siebie typy komórek, co sprawia, że identyfikacja przyczynowych mutacji niekodujących i ich wpływu na regulację genów jest wyzwaniem. Organogeneza serca rozpoczyna się od komórkowych komórek progenitorowych, które dają początek różnym podtypom komórek serca, w tym komórkom mięśnia sercowego, fibroblastów, nasierdzia i wsierdzia4,5. Genomika pojedynczych komórek staje się kluczową metodą badania rozwoju serca i oceny wpływu heterogeniczności komórkowej na zdrowie i chorobę6. Rozwój metod multiomicznych do jednoczesnego pomiaru różnych parametrów i rozszerzenie potoków obliczeniowych ułatwiło odkrycie typów i podtypów komórek w zdrowym i chorym sercu6. W tym artykule opisano niezawodny protokół izolacji pojedynczego jądra dla zamrożonych komórek progenitorowych serca uzyskanych z zarodków myszy, który jest zgodny z dalszymi sekwencjami snRNA i snATAC-seq (a także połączonymi sekwencjami snRNA i snATAC-seq)7,8,9.
ATAC-seq to solidna metoda, która pozwala na identyfikację regulatorowych otwartych regionów chromatyny i pozycjonowanie nukleosomów10,11. Informacje te są wykorzystywane do wyciągania wniosków na temat lokalizacji, tożsamości i aktywności czynników transkrypcyjnych. Aktywność czynników chromatyny, w tym remodelerów, a także aktywność transkrypcyjna polimerazy RNA, mogą być zatem analizowane, ponieważ metoda jest bardzo czuła do pomiaru ilościowych zmian w strukturze chromatyny1,2. W ten sposób ATAC-seq zapewnia solidne i bezstronne podejście do odkrywania mechanizmów kontrolujących regulację transkrypcji w określonym typie komórki. Protokoły ATAC-seq zostały również zweryfikowane w celu pomiaru dostępności chromatyny w pojedynczych komórkach, ujawniając zmienność w architekturze chromatyny w populacjach komórek10,12,13.
Chociaż w ostatnich latach nastąpił znaczący postęp w dziedzinie pojedynczych komórek, główną trudnością jest przetwarzanie świeżych próbek potrzebnych do przeprowadzenia tych eksperymentów14. Aby obejść tę trudność, przeprowadzono różne testy w celu przeprowadzenia analiz, takich jak snRNA-seq i snATAC-seq z zamrożoną tkanką lub komórkami serca15,16.
Do analizy danych genomicznych pojedynczych komórek użyto kilku platform17. Szeroko stosowanymi platformami do ekspresji genów w pojedynczej komórce i profilowania ATAC są platformy do enkapsulacji wielu kropel mikroprzepływowych17. Ponieważ platformy te wykorzystują komory mikroprzepływowe, zanieczyszczenia lub agregaty mogą zatkać system, powodując, że dane nie będą nadawały się do użytku. Tak więc powodzenie badań pojedynczych komórek zależy od dokładnej izolacji pojedynczych komórek/jąder.
Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje podobne podejście do ostatnich badań z użyciem snRNA-seq i snATAC-seq w celu zrozumienia wrodzonych wad serca18,19,20,21,22,23. Procedura ta wykorzystuje enzymatyczną dysocjację świeżo wypreparowanej tkanki serca, a następnie kriokonserwację komórek progenitorowych serca myszy. Po rozmrożeniu żywe komórki są oczyszczane i przetwarzane w celu izolacji jądrowej. W tej pracy protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do uzyskania danych snRNA-seq i snATAC-seq z tego samego preparatu jądrowego mysich komórek progenitorowych serca.

<table><tbody><tr><td>2100 Bioanalizator Instrument</td><td>Agilent</td><td></td><td>Nr katalogowy</td></tr><tr><td>5M Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>59222C-500ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA 10%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A1595-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip J Zestaw pojedynczych komórek, 16 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>1000230</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Jednokomórkowy Multiome ATAC + pakiet odczynników do ekspresji genów, 4 rxns (w tym bufor jąder 20X)</td><td>10X Genomics</td><td>1000285</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka komory do liczenia komórek Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Hrabina III</td><td>FL Thermofisher</td><td></td><td>Brak numeru katalogowego</td></tr><tr><td>Digitonina (5%)</td><td>Thermofisher</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-5x5ML</td><td></td></tr><tr><td>Probówki DNA LoBind&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190094</td><td>sterylny i wolny od RNaz</td></tr><tr><td>zestaw podwójnego indeksu TT Set A 96 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>1000215</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 ml&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td></td><td></td>352096</tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td></td><td></td>10788561</tr><tr><td>HI-FBS</td><td>Thermofisher</td><td>A3840001</td><td>Inaktywowany termicznie</td></tr><tr><td>zestaw DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>ŻYWY/MARTWY Zestaw do żywotności/cytotoksyczności</td><td>Thermofisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>MACS Zestaw do usuwania martwych komórek: Mikrokulki Romoval z martwymi komórkami, bufor wiążący 20X</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Inteligentne filtry siatkowe MACS (30 &mikro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Milieu McCoy 5A&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>MS Kolumny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>NovaSeq 6000 S2</td><td>Illumina</td><td></td><td>Brak numeru katalogowego</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna (długopis/paciorkowiec)</td><td>Thermofisher</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer Mini 40&micro; m</td><td>PluriSelect</td><td>V-PM15-2021-12</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor skał</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-270-333-M005</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw pojedynczych indeksów N Zestaw A, 96 rxn</td><td>10X Genomics</td><td>1000212</td><td></td></tr><tr><td>Standard 90mm szalka Petriego Sterilin</td><td>Thermofisher</td><td>101R20</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda podwójnie destylowana</td><td>Thermofisher</td><td>R0582</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek Trizma roztwór (HCl)</td><td>Sigma</td><td>T2194-100ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue stain (0,4%)</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 0,05% - EDTA 1X</td><td>Thermofisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z filtrem o szerokim otworze 200 &mu; l</td><td>Labcon</td><td>1152-965-008-9</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS SteREO Discovery.V8</td><td>ZEISS</td><td></td><td>Brak numeru katalogowego</td></tr></tbody></table>

izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

Rozwijające się serce to złożona struktura zawierająca różne komórki progenitorowe kontrolowane przez złożone mechanizmy regulacyjne. Badanie ekspresji genów i stanu chromatyny poszczególnych komórek pozwala na identyfikację typu i stanu komórki. Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawniło szereg ważnych cech heterogeniczności sercowych komórek progenitorowych. Jednakże metody te są na ogół ograniczone do świeżych tkanek, co ogranicza badania w różnych warunkach doświadczalnych, ponieważ świeża tkanka musi być przetworzona jednocześnie w tym samym przebiegu w celu zmniejszenia zmienności technicznej. Dlatego w tej dziedzinie potrzebne są łatwe i elastyczne procedury generowania danych z metod takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA-seq) i test pojedynczego jądra chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (snATAC-seq). W tym miejscu przedstawiamy protokół szybkiej izolacji jąder do kolejnych monojądrowych dualomiki (combined snRNA-seq i snATAC-seq). Metoda ta pozwala na izolację jąder z zamrożonych próbek komórek progenitorowych serca i może być łączona z platformami wykorzystującymi komory mikroprzepływowe.

W porównaniu do przygotowywania zawiesin pojedynczych komórek dla podejść jednokomórkowych, przygotowanie zawiesin pojedynczych jąder jest znacznie bardziej wymagające i wymaga wyższego stopnia rozdzielczości oraz przetworzenia. Kluczowym czynnikiem dla sukcesu połączonej analizy snRNA-seq i snATAC-seq jest czysta i nienaruszona zawiesina jąder. Protokół efektywnej izolacji jąder musi być dostosowany do każdego rodzaju tkanki i stanu (świeżego lub zamrożonego). W niniejszym opracowaniu opisano zoptymalizowany protokół iz...

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...

Głównym celem tego protokołu jest zbadanie interakcji czynników genetycznych i środowiskowych w kontekście rozwoju serca i ich udziału we wrodzonych wadach serca. Podejścia oparte na pojedynczych jądrach, takie jak sekwencja RNA pojedynczych jąder i ataksja pojedynczych jąder, stają się kluczowymi metodami badania heterogeniczności komórkowej w zdrowiu i chorobie podczas rozwoju serca. Jednym z ograniczeń tych eksperymentów jest to, że cała próbka musi być uruchomiona jednocześnie.Podczas pracy ze wszystkimi warunkami eksperymentalnymi, zebranie wystarczającej ilości świeżego materiału dla wszystkich warunków jednocześnie może być wyzwaniem. Chociaż w ostatnich latach nastąpił znaczny postęp w tej dziedzinie w dziedzinie pojedynczej komórki, główną trudnością jest przetwarzanie świeżych próbek. Unikanie trudności jest niezwykle korzystne w identyfikacji mechanizmu molekularnego leżącego u podstaw wrodzonej wady wad serca.Protokół ten opisuje kroki, które należy wykonać, aby pomyślnie wyizolować wysokiej jakości jądra z zamrożonej zawiesiny komórek serca uzyskanej z zarodków myszy, a nasz protokół jest zgodny z sekwencją RNA-Seq pojedynczych jąder i ataksją pojedynczych jąder. Mamy nadzieję, że ta procedura pomoże zainteresowanym badaczom i zachęci ich do korzystania z tej potężnej metody w swoich badaniach. Zacznij od umieszczenia zarodków wypreparowanych od poddanej eutanazji ciężarnej samicy myszy w wieku od dwóch do sześciu miesięcy w zimnym, kompletnym podłożu z 1% płodową surowicą bydlęcą.Po usunięciu tkanki endometrium, łożyska i woreczka żółtkowego z zarodka pod 5-krotnym powiększeniem, należy wypreparować komórki progenitorowe serca z zarodka za pomocą kleszczy. Wyciągnij wszystkie obszary serca wypreparowane z pięciu zarodków myszy do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i odwiruj je w wahadłowym wiadrze wstępnie schłodzonym do czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i przemyć tkankę jednym mililitrem PBS klasy hodowli tkankowej.Odwirować probówki o sile 300G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń supernatant i powtórz dwa płukania jednym mililitrem PBS. Po zakończeniu zastąp PBS 0,05% trypsyny EDTA.Odwirować i powtórzyć dwa płukania z 0,05% trypsyną EDTA. Aby strawić tkankę, dodaj 50 mikrolitrów 0,05% trypsyny EDTA i podgrzewaj przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie, po pięciu minutach, zastosuj delikatną dysocjację mechaniczną, zasysając zawiesinę w górę iw dół za pomocą końcówki filtra z szerokim otworem.Dezaktywuj aktywność trawienia trypsyny, dodając 350 mikrolitrów kompletnej pożywki do zdysocjowanych komórek. Przepuść zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów. Przygotować komórki do zamrożenia, odwirowując świeżo zdysocjowaną zawiesinę komórkową.Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze schłodzonego podłoża do zamrażania. Przenieść zawiesinę komórek do wstępnie schłodzonej kriofiolki i umieścić kriofiolkę w wstępnie schłodzonym pojemniku do zamrażania. Umieść pojemnik do zamrażania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na cztery do ośmiu godzin przed przeniesieniem go do ciekłego azotu w celu przeprowadzenia eksperymentów sekwencjonowania.Rozpocznij od umieszczenia zamrożonej zdysocjowanej zawiesiny embrionalnych komórek serca zawierającej fiolki kriogeniczne w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną do dwóch minut. Dodać jeden mililitr kompletnego podłoża podgrzanego w temperaturze 37 stopni Celsjusza do rozmrożonej zawiesiny i wymieszać trzykrotnie pipetą. Następnie przenieść zawiesinę do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów, zawierającej 10 milimetrów ciepłego, kompletnego podłoża.Przełóż całą zawiesinę komórkową przez sitko o wielkości 30 mikrometrów i przepłucz sitko jednym do dwóch mililitrów ciepłego, kompletnego podłoża. Zebrać przepływ w tej samej stożkowej rurce. Następnie odwiruj probówki o temperaturze 300G przez pięć minut.Po usunięciu supernatantu przemyć osad PBS i przenieść zawiesinę komórek do mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować zawiesinę komórkową i dodać 100 mikrolitrów dostarczonych mikrokulek magnetycznych do granulowanych komórek. Homogenizować zawiesinę pięć razy za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze przed 15 minutami inkubacji w temperaturze pokojowej.W międzyczasie przepłukać magnetyczną kolumnę separacyjną 500 mikrolitrami buforu wiążącego. Po zakończeniu inkubacji rozcieńczyć mieszaninę zawiesiny komórek mikrogranulek za pomocą 500 mikrolitrów buforu wiążącego. Następnie dodaj 0,6 mililitra zawiesiny komórek do kolumny separacji magnetycznej.Zbierz ścieki z żywych komórek w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Następnie przepłucz 1,5 mililitra mikroprobówkę, która zawierała zawiesinę komórek, używając jednego mililitra buforu wiążącego. Po przepłukaniu przenieś bufor wiążący z mikrorurki o pojemności 1,5 mililitra do kolumny i zbierz ścieki w tej samej 15-mililitrowej probówce.Powtórzyć płukanie probówki o pojemności 1,5 mililitra przy użyciu jednego mililitra buforu wiążącego. Po odwirowaniu ścieków w temperaturze 300G przez pięć minut, usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Dodać jeden mililitr roztworu PBS BSA i delikatnie wymieszać, pipetując za pomocą końcówki pipety z szerokim otworem.Następnie przenieś zawiesinę komórek do mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra. Ponownie odwirować zawiesinę komórkową i usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Powtórz dwa mycia jednego mililitra PBS BSA.Po usunięciu jednego mililitra PBS BSA, ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach roztworu PBS BSA. Wymieszać pipetując 10 razy. Określić stężenie, wykonując test błękitu trypanowego, aby zapewnić liczbę komórek większą lub równą 100 000 komórek, i przeprowadzić opartą na fluorescencji ocenę żywotności komórek.Dodatkowy etap sortowania i usuwania martwych komórek po rozmrożeniu pozwolił na uzyskanie czystszej zawiesiny komórek o znacznie wyższej żywotności komórek i poprawił jakość próbki wyjściowej. Aby uzyskać większą dokładność, do ilościowego określenia komórek i jąder zastosowano dwie różne metody liczenia, w tym błękit trypanowy i ocenę żywotności opartą na fluorescencji. W tym protokole zaobserwowano, że żywotność komórek przeszła od 80 do 90% przed izolacją jąder do mniej niż 5% po izolacji jąder.Aby rozpocząć, oczyść miejsce pracy i materiały 70% etanolem i roztworem do usuwania RNazy. Świeżo przygotuj bufor do lizy, bufor do rozcieńczania lizy, 0,1-krotny bufor do lizy i bufor do płukania, a następnie utrzymuj na lodzie. Wirówki z kubełkiem wahadłowym z chłodzeniem wstępnym do czterech stopni Celsjusza.Odwirować zawiesinę komórek progenitorowych serca w wirówce z wahadłowym wiadrem. Delikatnie usunąć cały szwanek, nie dotykając dna probówki. Dodaj 100 mikrolitrów schłodzonego buforu do lizy 0,1X do zawiesiny komórek i wymieszaj przez pipetowanie 10 razy.Po pięciu minutach inkubacji na lodzie dodać jeden mililitr schłodzonego buforu do płukania i wymieszać. Po odwirowaniu zawiesiny usunąć supernatant i powtórzyć jeszcze dwa płukania schłodzonym buforem do przemywania wodą. Przygotować rozcieńczony bufor jąder.Po ponownym zawieszeniu jąder w buforze jąder, umieścić roztwór podstawowy jąder na lodzie. Gdy jakość izolowanych jąder oceniono za pomocą oceny morfologii błony jądrowej, izolowane jądra wydawały się gładkie i jednolicie okrągłe pod mikroskopią w jasnym polu, co wskazuje na skuteczny proces izolacji.

nuclei-isolation-from-mouse-cardiac-progenitor-cells-for-epigenome

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Profilowanie ekspresji pojedynczych komórek umożliwia szczegółową analizę ekspresji genów w poszczególnych komórkach. Opisujemy metody izolacji kardiomiocytów oraz przygotowania otrzymanych lizatów do analizy całego transkryptomu za pomocą mikromacierzy lub qPCR specyficznych celów.

Profilowanie transkrypcyjne pojedynczych komórek kardiomiocytów dorosłej myszy

Jądra komórek serca są izolowane metodą sedymentacji gęstościowej i znakowane immunologicznie przeciwciałami przeciwko materiałowi pericentriolarnemu 1 (PCM-1) w celu identyfikacji i sortowania jąder kardiomiocytów za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego izolowania wysokiej jakości jąder ze świeżej lub zamrożonej tkanki do dalszego masowo równoległego sekwencjonowania RNA. Uwzględniamy opcje detergencyjno-mechanicznego i hipotoniczno-mechanicznego rozbijania tkanek oraz lizy komórek, które można wykorzystać do izolacji jąder.

Izolacja dorosłych jąder rdzenia kręgowego do masowo równoległego sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Izolacja pojedynczych jąder opiera się na dysocjacji i przenikaniu błony komórkowej za pomocą detergentów, etapach, które wymagają optymalizacji i są podatne na wprowadzanie artefaktów technicznych. Demonstrujemy bezdetergentowy i bezenzymatyczny protokół szybkiej izolacji nienaruszonych jąder bezpośrednio z całej tkanki, uzyskując jądra odpowiednie do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) lub ATAC-seq.

Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną

Tutaj prezentujemy protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych nerek myszy, który poprawia reprezentację typów komórek rdzeniastych nerek i pozwala uniknąć artefaktów ekspresji genów spowodowanych dysocjacją enzymatyczną tkanki.

Izolacja jąder z nerki dorosłej myszy w celu sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Przedstawiamy metodę izolowania komórek i jąder śródbłonka od światła tętnic szyjnych myszy wystawionych na stabilne lub zaburzone warunki przepływu w celu przeprowadzenia eksperymentów omicznych na pojedynczych komórkach.

Izolacja komórek śródbłonka ze światła tętnic szyjnych myszy do eksperymentów multiomicznych na pojedynczych komórkach

Ten protokół opisuje szczegółowe, niskonakładowe przygotowanie próbki do sekwencjonowania pojedynczego jądra, w tym sekcję górnych zwojów szyjnych i gwiaździstych myszy, dysocjację komórek, krioprezerwację, izolację jądra i kodowanie kreskowe hashtagów.

Izolacja i multipleksowanie jądra o niskim poziomie wejściowym z przeciwciałami kodowymi zwojów współczulnych myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Tutaj prezentujemy protokół izolacji jąder z błyskawicznie zamrożonych, zarchiwizowanych tkanek wątroby dla jednojądrowego sekwencjonowania RNA, sekwencji ATAC i multiomiki stawów (sekwencja RNA i sekwencja ATAC).

Izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej

Sukces transkryptomiki i multiomiki pojedynczej komórki/pojedynczego jądra w dużej mierze zależy od jakości komórek/jąder. Dlatego izolowanie komórek/jąder od tkanek i ich oczyszczanie musi być wysoce ustandaryzowane. Protokół ten opisuje przygotowanie jąder z mózgu i szpiku kostnego do dalszego testu multiomu pojedynczego jądra.

Wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder

Opisujemy protokół ekstrakcji wysokiej jakości jąder z indukowanych kriokonserwowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących ze zrębu/śródbłonka i komórek krwi, aby wspierać analizy sekwencjonowania nowej generacji pojedynczego jądra. Wytwarzanie wysokiej jakości, nienaruszonych jąder jest niezbędne w eksperymentach multiomicznych, ale dla niektórych laboratoriów może stanowić barierę wejścia w tę dziedzinę.

Izolacja jądrowa z kriokonserwowanych komórek krwi pochodzących z in vitro

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Poznaj izolację jąder z komórek progenitorowych serca myszy do analizy epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki. Ta metoda pozwala badać heterogeniczność komórkową i mechanizmy wrodzonych wad serca.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Przeglądaj więcej filmów