Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Głównym celem tego protokołu jest zbadanie interakcji czynników genetycznych i środowiskowych w kontekście rozwoju serca i ich udziału we wrodzonych wadach serca. Podejścia oparte na pojedynczych jądrach, takie jak sekwencja RNA pojedynczych jąder i ataksja pojedynczych jąder, stają się kluczowymi metodami badania heterogeniczności komórkowej w zdrowiu i chorobie podczas rozwoju serca. Jednym z ograniczeń tych eksperymentów jest to, że cała próbka musi być uruchomiona jednocześnie.

Podczas pracy ze wszystkimi warunkami eksperymentalnymi, zebranie wystarczającej ilości świeżego materiału dla wszystkich warunków jednocześnie może być wyzwaniem. Chociaż w ostatnich latach nastąpił znaczny postęp w tej dziedzinie w dziedzinie pojedynczej komórki, główną trudnością jest przetwarzanie świeżych próbek. Unikanie trudności jest niezwykle korzystne w identyfikacji mechanizmu molekularnego leżącego u podstaw wrodzonej wady wad serca.

Protokół ten opisuje kroki, które należy wykonać, aby pomyślnie wyizolować wysokiej jakości jądra z zamrożonej zawiesiny komórek serca uzyskanej z zarodków myszy, a nasz protokół jest zgodny z sekwencją RNA-Seq pojedynczych jąder i ataksją pojedynczych jąder. Mamy nadzieję, że ta procedura pomoże zainteresowanym badaczom i zachęci ich do korzystania z tej potężnej metody w swoich badaniach. Zacznij od umieszczenia zarodków wypreparowanych od poddanej eutanazji ciężarnej samicy myszy w wieku od dwóch do sześciu miesięcy w zimnym, kompletnym podłożu z 1% płodową surowicą bydlęcą.

Po usunięciu tkanki endometrium, łożyska i woreczka żółtkowego z zarodka pod 5-krotnym powiększeniem, należy wypreparować komórki progenitorowe serca z zarodka za pomocą kleszczy. Wyciągnij wszystkie obszary serca wypreparowane z pięciu zarodków myszy do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i odwiruj je w wahadłowym wiadrze wstępnie schłodzonym do czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i przemyć tkankę jednym mililitrem PBS klasy hodowli tkankowej.

Odwirować probówki o sile 300G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń supernatant i powtórz dwa płukania jednym mililitrem PBS. Po zakończeniu zastąp PBS 0,05% trypsyny EDTA.

Odwirować i powtórzyć dwa płukania z 0,05% trypsyną EDTA. Aby strawić tkankę, dodaj 50 mikrolitrów 0,05% trypsyny EDTA i podgrzewaj przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie, po pięciu minutach, zastosuj delikatną dysocjację mechaniczną, zasysając zawiesinę w górę iw dół za pomocą końcówki filtra z szerokim otworem.

Dezaktywuj aktywność trawienia trypsyny, dodając 350 mikrolitrów kompletnej pożywki do zdysocjowanych komórek. Przepuść zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów. Przygotować komórki do zamrożenia, odwirowując świeżo zdysocjowaną zawiesinę komórkową.

Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze schłodzonego podłoża do zamrażania. Przenieść zawiesinę komórek do wstępnie schłodzonej kriofiolki i umieścić kriofiolkę w wstępnie schłodzonym pojemniku do zamrażania. Umieść pojemnik do zamrażania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na cztery do ośmiu godzin przed przeniesieniem go do ciekłego azotu w celu przeprowadzenia eksperymentów sekwencjonowania.

Rozpocznij od umieszczenia zamrożonej zdysocjowanej zawiesiny embrionalnych komórek serca zawierającej fiolki kriogeniczne w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną do dwóch minut. Dodać jeden mililitr kompletnego podłoża podgrzanego w temperaturze 37 stopni Celsjusza do rozmrożonej zawiesiny i wymieszać trzykrotnie pipetą. Następnie przenieść zawiesinę do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów, zawierającej 10 milimetrów ciepłego, kompletnego podłoża.

Przełóż całą zawiesinę komórkową przez sitko o wielkości 30 mikrometrów i przepłucz sitko jednym do dwóch mililitrów ciepłego, kompletnego podłoża. Zebrać przepływ w tej samej stożkowej rurce. Następnie odwiruj probówki o temperaturze 300G przez pięć minut.

Po usunięciu supernatantu przemyć osad PBS i przenieść zawiesinę komórek do mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować zawiesinę komórkową i dodać 100 mikrolitrów dostarczonych mikrokulek magnetycznych do granulowanych komórek. Homogenizować zawiesinę pięć razy za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze przed 15 minutami inkubacji w temperaturze pokojowej.

W międzyczasie przepłukać magnetyczną kolumnę separacyjną 500 mikrolitrami buforu wiążącego. Po zakończeniu inkubacji rozcieńczyć mieszaninę zawiesiny komórek mikrogranulek za pomocą 500 mikrolitrów buforu wiążącego. Następnie dodaj 0,6 mililitra zawiesiny komórek do kolumny separacji magnetycznej.

Zbierz ścieki z żywych komórek w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Następnie przepłucz 1,5 mililitra mikroprobówkę, która zawierała zawiesinę komórek, używając jednego mililitra buforu wiążącego. Po przepłukaniu przenieś bufor wiążący z mikrorurki o pojemności 1,5 mililitra do kolumny i zbierz ścieki w tej samej 15-mililitrowej probówce.

Powtórzyć płukanie probówki o pojemności 1,5 mililitra przy użyciu jednego mililitra buforu wiążącego. Po odwirowaniu ścieków w temperaturze 300G przez pięć minut, usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Dodać jeden mililitr roztworu PBS BSA i delikatnie wymieszać, pipetując za pomocą końcówki pipety z szerokim otworem.

Następnie przenieś zawiesinę komórek do mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra. Ponownie odwirować zawiesinę komórkową i usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Powtórz dwa mycia jednego mililitra PBS BSA.

Po usunięciu jednego mililitra PBS BSA, ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach roztworu PBS BSA. Wymieszać pipetując 10 razy. Określić stężenie, wykonując test błękitu trypanowego, aby zapewnić liczbę komórek większą lub równą 100 000 komórek, i przeprowadzić opartą na fluorescencji ocenę żywotności komórek.

Dodatkowy etap sortowania i usuwania martwych komórek po rozmrożeniu pozwolił na uzyskanie czystszej zawiesiny komórek o znacznie wyższej żywotności komórek i poprawił jakość próbki wyjściowej. Aby uzyskać większą dokładność, do ilościowego określenia komórek i jąder zastosowano dwie różne metody liczenia, w tym błękit trypanowy i ocenę żywotności opartą na fluorescencji. W tym protokole zaobserwowano, że żywotność komórek przeszła od 80 do 90% przed izolacją jąder do mniej niż 5% po izolacji jąder.

Aby rozpocząć, oczyść miejsce pracy i materiały 70% etanolem i roztworem do usuwania RNazy. Świeżo przygotuj bufor do lizy, bufor do rozcieńczania lizy, 0,1-krotny bufor do lizy i bufor do płukania, a następnie utrzymuj na lodzie. Wirówki z kubełkiem wahadłowym z chłodzeniem wstępnym do czterech stopni Celsjusza.

Odwirować zawiesinę komórek progenitorowych serca w wirówce z wahadłowym wiadrem. Delikatnie usunąć cały szwanek, nie dotykając dna probówki. Dodaj 100 mikrolitrów schłodzonego buforu do lizy 0,1X do zawiesiny komórek i wymieszaj przez pipetowanie 10 razy.

Po pięciu minutach inkubacji na lodzie dodać jeden mililitr schłodzonego buforu do płukania i wymieszać. Po odwirowaniu zawiesiny usunąć supernatant i powtórzyć jeszcze dwa płukania schłodzonym buforem do przemywania wodą. Przygotować rozcieńczony bufor jąder.

Po ponownym zawieszeniu jąder w buforze jąder, umieścić roztwór podstawowy jąder na lodzie. Gdy jakość izolowanych jąder oceniono za pomocą oceny morfologii błony jądrowej, izolowane jądra wydawały się gładkie i jednolicie okrągłe pod mikroskopią w jasnym polu, co wskazuje na skuteczny proces izolacji.