Name: Zestaw technik przesiewowych do szybkiego przeglądu funkcji neutrofili (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T12:40:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Poznaj protokół NeutroFun do szybkiej oceny funkcji neutrofili przy użyciu tanich chemikaliów w jednym eksperymencie. Metoda umożliwia wstępną analizę żywotności komórek, produkcji ROS, migracji i fagocytozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy uznają następujące agencje finansujące: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP i FINATEC.

Wszystkie eksperymenty były prowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi etycznymi określonymi przez komisję rewizyjną Uniwersytetu w Brasilii (proces 13364819.0.0000.5558), a próbki oznaczono kodami, aby zapewnić anonimowość dawców. Komórki pozyskano od zdrowych mężczyzn w wieku 18–35 lat, którzy podpisali świadomą zgodę i spełniali następujące kryteria kwalifikacji: niepalenie tytoniu ani papierosów elektronicznych, brak przewlekłych schorzeń oraz brak stanów zapalnych w ciągu ostatnich 14 dni.
1. Pobieranie krwi
<ol>
	<li>Aseptycznie nanieś 0,3 ml heparyny o stężeniu 5 000 IU/ml (patrz Tabela materiałów) w sterylnej strzykawce o pojemności 20 ml w celu jej heparynizacji.</li>
	<li>Założyć stazę żylną około 10 cm powyżej miejsca nakłucia i zidentyfikować żyłę łokciową środkową lub żyłę cephaliczną w celu wykonania wenipunkcji. 
	UWAGA: Należy upewnić się, że całkowity czas założenia stazy nie przekracza 1 min.</li>
	<li>Oczyścić miejsce nakłucia 70% alkoholem i przeprowadzić wenipunkcję.</li>
	<li>Po pobraniu krwi należy delikatnie odwrócić strzykawkę trzy lub cztery razy, aby prawidłowo wymieszać krew z heparyną.</li>
</ol>
2. Izolacja neutrofili
UWAGA: Leukocyty polimorfonuklearne (PMNs) są izolowane poprzez wirowanie w gradiencie gęstości, a następnie hipotoniczną lizę pozostałych erytrocytów (RBC), zgodnie z wcześniejszym opisem11 z pewnymi zmianami. Metoda ta nie jest obowiązkowa do przeprowadzenia testów przesiewowych i może zostać zastąpiona, o ile wybrana metoda zapewni żywotność &gt;97%, priming lub aktywację &lt;3% PMNs oraz dostarczy wystarczającą liczbę komórek do wszystkich testów, powtórzeń i warunków. Przeprowadzanie tych etapów w warunkach aseptycznych i stosowanie roztworów wolnych od endotoksyn jest obowiązkowe, aby uniknąć aktywacji komórek.
<ol>
	<li>Przygotować 12 ml rozcieńczeń mediów separacyjnych o stężeniu 60% i 70% (dostępnych komercyjnie; patrz Tabela materiałów) w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przygotuj gradient od dołu do góry, dodając po 4 ml roztworu o stężeniu 60% nad roztwór o stężeniu 70%, używając pipety o pojemności 5 ml. Czynność tę wykonuj ostrożnie, aby zapobiec zmieszaniu warstw na granicy faz.</li>
	<li>Ostrożnie nanieś 12 ml heparynowanej krwi warstwą na gradient gęstości. Centryfuguj przy 200 x g przez 15 min w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Od tego momentu, aż do aktywacji PMN, wszystkie używane odczynniki i probówki muszą być przechowywane w chłodni z lodem.</li>
	<li>Odrzuć warstwę osocza/komórek mononuklearnych, a następnie ostrożnie przenieś warstwę znajdującą się nad osadem erytrocytów do dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 ml, rozdzielając ją po około 7,5 ml do każdej z nich. Uzupełnij objętość w probówkach zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS; patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 min w temp. 19 °C.</li>
	<li>Przemyj osad komórkowy roztworem HBSS.
	<ol>
		<li>Odlać supernatant z probówki, a następnie delikatnie resuspender osad w 7 ml HBSS.</li>
		<li>Wiruj przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 19 °C aby usunąć wszystkie media separacyjne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź lizę hipotoniczną pozostałych erytrocytów.
	<ol>
		<li>Odrzucić supernatant i połączyć osady w jednej probówce.</li>
		<li>Resuspend pellet RBC/PMN w 3 ml sterylnego H2i dodaj 3 ml HBSS (2x) w ciągu 25 s w celu przywrócenia osmolarności. Następnie odwiruj przy 300 x g przez 5 min w temperaturze 19 °C.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.8.1 i 2.8.2, aż do uzyskania białego osadu pozbawionego erytrocytów. 
		UWAGA: Nadpłyn należy usunąć jak najszybciej, aby zminimalizować kontakt neutrofili z produktami rozpadu erytrocytów. Alternatywnie drugą lizę hipotoniczną można zastąpić delikatnym resuspensowaniem pozostałej warstwy erytrocytów i usunięciem całego nadpłynu, ponieważ pozostałe erytrocyta osadzą się powyżej granulocytów wielniasymiarowych (PMN).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odlać supernatant, delikatnie resuspender PMN w pozostałym buforze, a następnie przenieść je do schłodzonej na lodzie mikroprobówki. 
	UWAGA: Podczas przenoszenia resuspendowanych komórek za pomocą mikropipety należy odnotować ich objętość.</li>
	<li>Przenieś 3 x 1 µL zawiesiny komórkowej na czyste szkiełko przedmiotowe (trzy dołki z 1 µL po jednym) i zabarwić preparatem Fast Panoptic (patrz Tabela materiałów) do oceny morfologii i czystości12.
	<ol>
		<li>Aby wykonać barwienie preparatem Fast Panoptic, należy pięciokrotnie zanurzyć szkiełko w fiksatorze Panoptic.° 1, sześć razy w eozynie n° 2, a następnie dwukrotnie w hematoksylinie n° 3, przy czym każde zanurzenie trwa 1 s.</li>
		<li>Ostrożnie opłucz szkiełko przedmiotowe wodą destylowaną.</li>
		<li>Pozostawić do odcieknięcia i wyschnięcia na powietrzu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwować pod mikroskopem i policzyć 300 losowych komórek w każdej studzience, odróżniając w ten sposób neutrofile od pozostałych granulocytów.</li>
	<li>Transfer 1 µL zawiesiny komórkowej do 49 µL 0,2% roztworu błękitu trypanu13 następnie należy policzyć komórki przy użyciu komory Neubauera, rozróżniając komórki martwe od żywotnych.</li>
	<li>Dostosuj stężenie komórek do poziomu 6 667 komórek/µL przy użyciu roztworu składającego się z 50% autologicznej plazmy i 50% HBSS z dodatkiem wapnia i magnezu. Podziel 6 667 komórek/µL zawiesinę równomiernie pomiędzy mikroprobówki odpowiadające testowanym warunkom, w tym kontrolę negatywną. 
	UWAGA: Można zastosować dowolne stężenie komórek zbliżone do stężenia neutrofili krążących w organizmie modelowym, jednak dla zapewnienia powtarzalności wyników ważne jest stosowanie tego samego stężenia komórek we wszystkich eksperymentach.</li>
</ol>
<img alt="Gradient gęstości Percoll; schemat wirowania; lizy RBC; izolacja PMN; metoda separacji komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65329/65329fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Protokół izolacji neutrofili. Dwa stężenia medium separacyjnego (percoll) (A) są nakładane warstwowo (B), następnie krew zostaje naniesiona na górę gradientu separacyjnego (C). Po wirowaniu PMN znajduje się w warstwie środkowej (D), która zostaje podzielona do dwóch probówek o pojemności 15 mL (E). Zawiesinę komórkową płukano dwukrotnie w HBSS i wirowano (G-I) w celu usunięcia medium, następnie komórki resuspenderowano, a pozostałe RBC poddano dwóm cyklom lizy hipotonicznej (J-M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65329/65329fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
3. Przygotowanie do aktywacji neutrofili
<ol>
	<li>W mikroprobówkach 1,5 mL przygotować system aktywacji dla każdego z warunków w taki sposób, aby końcowe stężenie komórek wynosiło 6 600 cells/µL. Na przykład, aby przetestować efekty 100 nM fMLP (N-formylo-metionylu-leucylo-fenyloalaniny; patrz Tabela materiałów), dodać 5 µL fMLP o stężeniu 10 µM do 495 µL zawiesiny o stężeniu 6 667 cells/µL. Jako kontrolę negatywną (niestymulowaną) dodać HBSS zawierający Ca2+ i Mg2+. 
	UWAGA: W celu zademonstrowania tej metodologii zastosowano następujące końcowe stężenia stymulatorów: 100 nM fMLP, 16 µM fallaksyny, naturalnie występującego peptydu przeciwdrobnoustrojowego14, oraz 100 nM PMA (12-mirystynianu 13-octanu forbolu) (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C bez rotacji. 
	​UWAGA: Wszystkie alikwoty do testów funkcjonalnych są pobierane z tej zawiesiny komórkowej, nazywanej w dalszej części systemu aktywacji.</li>
</ol>
4. Test z błękitnym chlorkiem nitrotetrazoliu (NBT) do oceny produkcji ROS
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu roboczego NBT: Dla każdego stanu eksperymentalnego przygotować roztwór roboczy NBT (patrz Tabela materiałów) o stężeniu 6 mM zgodnie z poniższymi krokami:
	<ol>
		<li>Rozpuścić 0,0005 g NBT w 10 µL dimetylosulforku (DMSO) i mieszać na wortexie przez co najmniej 15 min.</li>
		<li>Dodać 90 µL HBSS Ca2+Mg2+ i mieszać na wortexie do 2 min. 
		UWAGA: Wszystkie kroki z wykorzystaniem NBT muszą być wykonywane w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonanie testu NBT na szkiełku.
	<ol>
		<li>Po 20 min aktywacji komórek delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową i ostrożnie przenieść 2 µL PMN na czyste szkiełko szklane. Inkubować przez 20 min w komorze nawilżanej w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Nie rozprowadzać zawiesiny komórkowej zbyt szeroko po szkiełku; w przeciwnym razie może ona wyschnąć przed inkubacją.</li>
		<li>Dodać 1 µL roztworu roboczego NBT na komórki i inkubować dalej przez 20 min w ciemności.</li>
		<li>Wysuszyć szkiełko ciepłym powietrzem i utrwalić kroplą metanolu w każdym okienku przez 1 min. Barwić 0,03% safraniną (patrz Tabela materiałów) przez 1 min.</li>
		<li>Delikatnie wypłukać szkiełko szklane wodą destylowaną.</li>
		<li>Pozostawić szkiełko do wyschnięcia na powietrzu i obserwować pod mikroskopem.</li>
		<li>Policzyć 100 losowych komórek w każdym okienku, rozróżniając neutrofile z i bez złogami formazanu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonanie spektrofotometrycznego testu NBT.
	<ol>
		<li>Po 40 min aktywacji komórek delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową i przenieść 90 µL PMN z układu aktywacyjnego do czystej mikroprobówki. Następnie ostrożnie dodać 20 µL roztworu NBT 6 mM. Inkubować w ciemności przez 20 min w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 100 µL 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS; patrz Tabela materiałów) i wymieszać na wortexie.</li>
		<li>Poddać sonikacji za pomocą sonikatora końcowego przy amplitudzie 60%, stosując pięć cykli po 15 s każdy z 15-sekundowymi odstępami. Wirować przy 12 000 x g przez 5 min.</li>
		<li>Przenieść 60 µL supernatantu do płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem i zmierzyć absorbancję produktu formazanu przy 570 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Test fagocytozy
<ol>
	<li>Przygotować zawiesinę o stężeniu 33 000 drożdżaków/µL dla każdego stanu, zgodnie z poniższym opisem:
	<ol>
		<li>Do 200 µL HBSS Ca2+Mg2+ dodać około 0,75 mg suchych drożdży (Saccharomyces cerevisiae; patrz Tabela materiałów) i inkubować w termomikserze w temperaturze 100 °C przy 500 obr./min przez co najmniej 15 min.</li>
		<li>Zmieszać zawiesinę za pomocą wortexa i przenieść 5 µL zawiesiny drożdży do 45 µL 0,2% barwnika błękitu trypanu. Policzyć drożdżaki, używając komory Neubauera.</li>
		<li>Dostosować stężenie początkowej zawiesiny do 33 000 komórek drożdży/µL przy użyciu HBSS Ca2+Mg2+. Przechowywać zawiesinę w lodzie do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 20 min aktywacji komórek delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową i przenieść 5 µL układu aktywacyjnego do 5 µL zawiesiny Saccharomyces cerevisiae o stężeniu 33 000 drożdżaków/µL do nowej sterylnej mikroprobówki. 
	UWAGA: Stosunek neutrofili do drożdżaków wynosi 1:5 (PMN:drożdżaki).</li>
	<li>Bezzwłocznie przenieść 6 µL zawiesiny PMN/drożdże do trzech pól czystego szkiełka przedmiotowego (po 2 µL na pole) i inkubować szkiełko w komorze wilgotnościowej przez 40 min. 
	UWAGA: Nie rozprowadzać zawiesiny komórkowej zbyt szeroko po szkiełku; w przeciwnym razie może ona wyschnąć przed zakończeniem inkubacji.</li>
	<li>Wysuszyć szkiełko strumieniem gorącego powietrza i zabarwić preparatem fast panoptic, zgodnie z opisem w kroku 2.9 powyżej. 
	UWAGA: Trzeci etap barwienia metodą fast panoptic jest krytyczny dla analizy mikroskopowej szkiełka. Barwienie szkiełka przez ≥3 s na tym etapie może sprawić, że będzie ono nieprzydatne do analizy, ponieważ utrudni to odróżnienie drożdżaków od lobów jądra neutrofilów.</li>
	<li>Obejrzeć szkiełka pod mikroskopem, przeliczając 100 losowych neutrofili w każdym polu i rozróżniając PMN dodatnie i ujemne pod kątem fagocytozy. 
	UWAGA: Obecność co najmniej jednej cząsteczki drożdżaków wewnątrz lub w bezpośrednim kontakcie z błoną komórkową PMN wskazuje na PMN dodatni pod kątem fagocytozy. W przypadku zainteresowania stosunkiem drożdżaków do neutrofili, należy policzyć również liczbę pochłoniętych cząsteczek drożdżaków.</li>
</ol>
6. Test chemotaksji PMN w czasie rzeczywistym
UWAGA: Test migracji jest przeprowadzany analogicznie do protokołu opisanego wcześniej15, z następującymi modyfikacjami:
<ol>
	<li>Przygotuj gradient chemotaktyczny, dodając 160 µL chemoatraktanta (np. fMLP, IL-8, C5 lub LTB4; patrz Tabela materiałów) do dolnej komory płytki analizatora komórkowego w czasie rzeczywistym (RTCA) opartego na impedancji. W przypadku kontroli negatywnych i próbek ślepych dodaj 160 µL HBSS Ca2+Mg2+.</li>
	<li>Zamocuj górną komorę i dodaj 25 µL HBSS Ca2+Mg2+. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 h, aby utworzył się gradient chemotaktyczny.</li>
	<li>Po 60 min aktywacji komórek delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową i nanieś 60 µL zawiesiny komórkowej do górnej komory. Do próbki ślepej dodaj 60 µL HBSS Ca2+Mg2+.</li>
	<li>Umieść płytkę RTCA i zaprogramuj oprogramowanie RTCA tak, aby mierzyło indeks komórkowy (CI) co 60 s przez 2 h. 
	UWAGA: Płytki RTCA można myć w celu ponownego użycia zgodnie z wcześniejszym opisem16. W skrócie: przemyj komory i elektrody RTCA trzy vezes solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), a następnie dwa razy wodą ultrapurystyczną typu I. Inkubuj dolną i górną komorę z 0,25% trypsyną oraz 0,53 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) przez 40 min. Przemyj wodą ultrapurystyczną trzy razy.</li>
</ol>
7. Analiza sugerująca obecność NET
<ol>
	<li>Po 10 min aktywacji komórek, delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową i przenieś 4 µL PMN z każdego badanego systemu aktywacji, dzieląc je na dwie studzienki czystego szkiełka przedmiotowego. Inkubuj w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 30 min.</li>
	<li>Dodaj 1 µL DNAse I do jednej ze studzienek i inkubuj przez 20 min w temperaturze 37 °C (w wilgotnej komorze).</li>
	<li>Osusz szkiełko i zabarw preparatem fast panoptic, zgodnie z opisem w kroku 2.9 sekcji „izolacja neutrofili”.</li>
	<li>Oceń preparaty pod mikroskopem. 
	UWAGA: Poszukuj wszelkich oznak uwalniania NET, charakteryzujących się obecnością struktur przypominających sieć. Po ich zidentyfikowaniu potwierdź, czy traktowanie DNAse I było w stanie usunąć takie struktury. Test ten sugeruje tworzenie się NET, gdyż do potwierdzenia ich obecności wymagane są dodatkowe analizy.</li>
</ol>

Neutrophil Functional Assays for Screening Different Signaling Pathways

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Neutrofile są bardzo dynamicznymi i wrażliwymi komórkami, które żyją krótko i nie mogą być jeszcze kriokonserwowane19, co sprawia, że badania nad ich biologią są trudne. Dlatego ważne jest, aby postępować ostrożnie w celu uzyskania żywotnych, wzbogaconych i spoczynkowych neutrofili 11,20. W badaniu tym zastosowano technikę izolacji opartą na gęstości, która kładzie nacisk na delikatną i minimalną manipulację, a także stosowanie niskich temperatur aż do etapu aktywacji. Dodatkowo przetwarzanie krwi musi nastąpić w ciągu 30 minut po wkłuciu żyły i być przechowywane w temperaturze pokojowej. Niniejsza praca przedstawia możliwość zmniejszenia stresu manipulacyjnego i czasu eksperymentu. Aby jeszcze bardziej uprościć ten proces, wprowadziliśmy nowy krok (jako opcję) w protokole, który polega na usunięciu erytrocytów poprzez delikatne ponowne zawieszenie i aspirację warstwy erytrocytów po pojedynczej procedurze hemolizy. Ten etap zmniejsza stres manipulacyjny i czas eksperymentu, ponieważ usuwa większość erytrocytów za pomocą tylko jednego etapu hemolizy hipotonicznej. Należy jednak zauważyć, że umiejętności operatora mają duży wpływ na skuteczność tego kroku i nie zawsze może on całkowicie usunąć erytrocyty. Co więcej, aspiracja erytrocytów może prowadzić do utraty neutrofili, ale nie wpływa to na plon, ponieważ więcej neutrofili zostało początkowo odzyskanych z gradientu, gdy zbierano je bliżej warstwy erytrocytów. W związku z tym aspiracja RBC jest zalecana, jeśli testy nie wymagają najwyższej możliwej czystości lub jeśli operator ma niezmiennie dobre wyniki. W przypadku przedstawionych tutaj badań przesiewowych niewielka ilość zanieczyszczeń krwinkami czerwonymi (<3%) nie zakłóciłaby wyników.
Aby upewnić się, że wszystkie procedury są wykonywane w odpowiednim czasie, w tym przygotowanie odczynników, przedstawiono przepływ pracy (rysunek 2), który szczegółowo określa harmonogram i podział zadań między dwoma badaczami. Po zakończeniu wszystkich testów funkcjonalnych pozostałe komórki można przygotować do dalszych badań molekularnych, takich jak badania omiczne poprzez lizę komórek z odpowiednim buforem do lizy i przechowywaniem.
Produkcja ROS Wybuch oddechowy jest cechą charakterystyczną pobudzania i aktywacji neutrofili18,21, a ocena produkcji ROS jest powszechną metodą stosowaną do szacowania stanu aktywacji neutrofili. W badaniu tym oceniano produkcję ROS przy użyciu dwóch podejść: mikroskopii optycznej i spektrofotometrii.
Test NBT jest dobrze znanym podejściem do oceny wybuchu oddechowego u neutrofili22,23. Dwie powszechnie stosowane metody to testy oparte na mikroskopii optycznej (lub teście szkiełkowym) i spektrofotometrii 24,25,26. Chociaż mikroskopia optyczna pozwala na wizualizację szczegółów na poziomie komórki, jest podatna na stronniczość użytkownika. W związku z tym test szkiełkowy NBT służy jako jakościowe uzupełnienie testu spektrofotometrycznego dotyczącego cech fenotypowych, takich jak wzorce tworzenia formazanu, intensywność i agregacja komórek.
Krytycznymi etapami zarówno dla szkiełka NBT, jak i testów spektrofotometrycznych są całkowita rozpuszczalność NBT i formazanu. Wbrew zaleceniom producenta, NBT nie rozpuszcza się dobrze w wodzie. Jednak homogenizacja NBT w DMSO przez co najmniej 15 minut, a następnie dodanie wody/HBSS i wirowanie przez 2 minuty zapewnia całkowitą rozpuszczalność. Ponadto, aby przeanalizować absorbancję formazanu, należy osiągnąć dwa krytyczne etapy: (1) uwolnienie kryształów formazanu z komórek przez lizę PMN oraz (2) całkowite rozpuszczenie kryształów formazanu. Oba etapy osiągnięto poprzez potraktowanie osadu komórkowego 10% SDS, jak ostatnio sugerowano27, a następnie analizę sonikacji i absorbancji supernatantu przy 570 nm.
Ponadto wyniki NBT w ujemnych i pozytywnych grupach kontrolnych są pierwszym etapem badań przesiewowych, które należy ocenić. Ten krok musi wykazać niezwykłą różnicę, ponieważ ocena produkcji ROS za pomocą formazanu wskazuje, czy proces izolacji mógł być odpowiedzialny za niepożądane zmiany w stanie spoczynku komórek, czy to poprzez stymulację, czy hamowanie.
Inne metody, takie jak redukcja cytochromu c28 lub analiza cytometrii przepływowej29, są często stosowane do wykrywania ROS; Biorąc jednak pod uwagę podejście przesiewowe, ich zastosowanie wymaga dłuższego czasu eksperymentu, użycia specjalnych markerów i drogich instrumentów. Chemiluminescencja luminolu/izoluminolu jest szybką i opłacalną metodą wykrywania ROS, a jednocześnie umożliwia różnicowanie wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych ROS. Jednak do tej metody wymagany jest luminometr30,31. Chociaż koszt instrumentu można obejść poprzez wykorzystanie urządzenia, nadal nie nadawałoby się ono do analizy przesiewowej wykonywanej jednocześnie z innymi testami.
Fagocytozy Inkubacja PMN/drożdży zapewnia przegląd zdolności i skuteczności fagocytozy neutrofili poprzez zliczenie liczby neutrofili wykonujących fagocytozę oraz liczby drożdży pochłoniętych na neutrofil. Jednakże, ponieważ cząstka drożdży sama w sobie jest sygnałem aktywacji, porównanie grupy kontrolnej ze wstępnie potraktowanym PMN stanowi system podwójnej stymulacji, który może nie wykazywać znaczących zmian, jak pokazano w przypadku PMN traktowanego CTRL w porównaniu z fMLP (Figura 4). Niemniej jednak test ten jest przydatny do wskazania, czy potencjalny modulator miałby jakikolwiek wpływ na fagocytozę. Za pomocą tego testu przetestowano nowy peptyd przeciwdrobnoustrojowy, a wyniki wskazują na interesującą potencjalną reakcję na tę kombinację bodźców, która została niedawno omówiona jako potrzebna do skutecznej aktywacji32.
Krytycznym etapem tego testu jest barwienie, ponieważ analiza staje się niewiarygodna, jeśli szkiełko jest trzymane na panoptyce nr 3 (hematoksylinie) przez ≥3 s. Dzieje się tak, ponieważ komórek drożdży i płatów jądrowych neutrofili nie można od siebie odróżnić. Co więcej, podejście to pozwala na analizę morfologii neutrofili po ekspozycji na modulatory. Cytometria przepływowa jest kolejną skuteczną techniką analizy fagocytozy33, chociaż ma ograniczenia wynikające z trudności w rozróżnieniu między cząstkami związanymi z błoną a pochłoniętymi przez błonę oraz innymi czynnikami związanymi z proponowanym zestawem przesiewowym, jak omówiono w poprzednim temacie. To samo ograniczenie obserwuje się w metodzie opisanej w niniejszym dokumencie, chociaż należy ją traktować jako wstępne badanie przesiewowe w celu ukierunkowania dalszych badań.
Migracja w czasie rzeczywistym Protokół badań przesiewowych w czasie rzeczywistym został zoptymalizowany pod kątem oceny zdolności migracyjnej PMN. Chociaż poprzednie badanie sugerowało, że pokrycie spodu płytki RTCA było konieczne, aby test migracji wykazał różnicę między kontrolą ujemną a traktowaniem IL-815, badanie to wykazało wysokie wartości przedziału ufności (CI) dla komórek traktowanych fMLP bez dodatku środków powlekających. Wyniki wykazały wysoką powtarzalność przy znacznej migracji od 12 minut. Co więcej, analiza dopasowania krzywych uzyskanych danych migracyjnych może ujawnić parametry, takie jak maksymalny indeks komórek oraz wzrost i spadek nachylenia, które są przydatne do zrozumienia dynamiki migracji i mogą zależeć od stężenia lub różnić się w zależności od warunków. Najlepszym dopasowaniem do krzywych migracji neutrofili (ryc. 5) była skorygowana funkcja Gompertza34, pokazująca, że fMLP zwiększa maksymalny indeks komórek i zwiększa nachylenie.
Należy zwrócić szczególną uwagę, aby uniknąć pęcherzyków w systemie RTCA, ponieważ mogą one blokować ogniwa przechodzące przez elektrody, zagrażając eksperymentowi. Czynnikiem ograniczającym jest wysoki koszt płyt. Chociaż tańsze techniki analizują migrację komórek, brakuje im dobrej odtwarzalności lub są trudne i czasochłonne, jak w przypadku komory Boydena35. W związku z tym RTCA jest wiarygodną analizą migracji kompatybilną z innymi przedstawionymi tutaj testami przesiewowymi.
Sieci Wreszcie, opracowano obiecujący, łatwy i tani test do wstępnej oceny powstawania NET przy użyciu mikroskopii optycznej. Uzyskano go na podstawie obserwacji szkiełek fagocytozy, w których PMA, specyficzny bodziec indukujący NET, badany pod kątem wpływu na zdolność fagocytozy, indukował również tworzenie struktury przypominającej pajęczynę w porównaniu z grupami CTRL i fMLP. W tej pracy postawiono hipotezę, że struktury te mogą wskazywać na wydanie NET. Hipotezę taką przetestowano, traktując próbki DNazą I po aktywacji, gdzie nie znaleziono żadnych nitkowatych struktur w neutrofilach aktywowanych PMA. Założenie, że takie struktury mogą być NET, opiera się na fakcie, że PMA jest cytowany jako dobrze znany induktor powstawania NET36,37, odkryciu podobnych struktur za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu specyficznych markerów dla NET38,39 oraz degradacji NET katalizowanej przez DNazę I40,41. Należy podkreślić, że nie jest to metoda potwierdzania powstawania NET, a jedynie wstępne badanie, które sugeruje obecność NET. Chociaż ten test ma ograniczenia, ponieważ NET można pomylić z artefaktami barwiącymi, służy on istotnemu celowi, sugerując tworzenie NET w szybkim i tanim badaniu przesiewowym, które można przeprowadzić razem z innymi testami funkcjonalnymi. Po wykryciu, że mogą być istotne dla badania przesiewowego, NET mogą być dalej oceniane za pomocą mikroskopii konfokalnej lub elektronowej42, jak omówiono później.
W naszym laboratorium nowe peptydy przeciwdrobnoustrojowe, które również mogą mieć działanie immunomodulujące, są często oceniane za pomocą tego zestawu testów przesiewowych, aby lepiej kierować dalszą analizą wpływu niektórych peptydów na ludzkie neutrofile, ponieważ niektóre wykazują interesujące właściwości ROS43, fagocytozy, migracji i / lub modulacji NET.
Podsumowując, NeutroFun Screen oferuje cenne narzędzie do identyfikacji potencjalnych modulatorów aktywności neutrofili o normalnej gęstości na podstawie dużej liczby nieprzebadanych związków. Należy jednak pamiętać, że ta metoda służy jedynie jako wstępne badanie przesiewowe. Po tym wstępnym badaniu przesiewowym droższe, bardziej zaawansowane i czasochłonne metodologie mogą zostać skierowane do określonych funkcji lub ścieżek sugerowanych przez te pierwsze wyniki w celu walidacji danych. W przypadku produkcji ROS, fagocytozy i tworzenia NET istnieją alternatywne metody walidacji danych i uzyskiwania dalszych wyników ilościowych. Wizualizację i kwantyfikację NET można przeprowadzić za pomocą analizy mikroskopii immunofluorescencyjnej, która określa obecność i nakładanie się zewnątrzkomórkowego DNA i białek ziarnistych, takich jak mieloperoksydaza i elastaza neutrofilowa, jak opisano szczegółowo niedawno42. ROS odgrywają różne kluczowe role w wielu procesach biologicznych, dlatego ich badanie jest bardzo rozpowszechnione i zróżnicowane. Do najbardziej uznanych metodologii należą te, które wykorzystują przeciwciała, takie jak test immunoenzymatyczny (ELISA) i immunoblotting luminescencji lub wykrywanie fluorescencji - takie jak cytometria przepływowa komórek pod różnymi znakami - za pomocą DCFDA, spektroskopii EPR i pomiarów aktywności enzymatycznej44. Podobnie, solidna ocena fagocytozy jest również przeprowadzana na kilka sposobów; Alternatywne metody obejmują samą cytometrię przepływową45,46 lub w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną47. Opisana migracja komórek w czasie rzeczywistym jest solidnym i wystarczającym testem, który nie wymaga dalszej walidacji i przedstawia parametry, których inne metodologie nie mogą uwzględnić. Inne kombinacje takich metod mogą lepiej pasować do konkretnych scenariuszy, ale podsumowując, jest to szybka i niedroga kombinacja, która obejmuje wiele aktywności neutrofili.
Podsumowując, badanie to ma na celu dostarczenie zestawu testów składających się z prostych, szybkich i tanich metodologii do oceny wielu odpowiedzi neutrofili na nowe cząsteczki i warunki, jako sposób na lepsze skierowanie wysiłków w kierunku zaawansowanych metodologii. Jako główne ograniczenia, wyniki testów ROS, NET i fagocytozy należy uznać za wstępne i wymagają dalszej walidacji za pomocą bardziej szczegółowych i wyszukanych testów, a te, które opierają się na niezautomatyzowanym zliczaniu komórek pod mikroskopem, są podatne na nieświadome uprzedzenia.

Neutrofile są najliczniejszymi wrodzonymi komórkami odpornościowymi w ludzkiej krwi i są znane z tego, że odgrywają główną rolę w infekcjach i stanach zapalnych, będąc pierwszymi ratownikami, którzy docierają do miejsca uszkodzenia tkanki1. W ostatnich latach coraz częściej dostrzega się kluczową rolę, jaką neutrofile odgrywają w różnych chorobach oraz we wspieraniu homeostazy2. Neutrofile nie tylko mają ściśle regulowaną sygnalizację, ale także uczestniczą w regulacji innych składników układu odpornościowego3,4,5. Dlatego badanie neutrofili i ich wielu nietypowych funkcji komórkowych, takich jak chemotaksja, migracja odwrotna6, fagocytoza7, breathing burst8 oraz uwalnianie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NETs)7, jest niezbędne w wielu kontekstach badawczych, w których konieczna jest ocena potencjalnych zmian funkcjonalnych, morfologicznych lub molekularnych neutrofili wywołanych przez określone warunki w warunkach analiza.
Świeżo wyizolowane neutrofile są nieuleczalnie zróżnicowane, krótkotrwałe, bardzo dynamiczne i łatwo aktywowane9. Jednak nie osiągnięto jeszcze skutecznej metody przechowywania, która nie wpływa na odpowiedzi neutrofili, co utrudnia wykonywanie wielu testów, które muszą być nieprzerwane. Co więcej, wcześniej opisane analizy funkcjonalne 10,11, oparte na testach wymagających cytometrii i/lub barwienia fluorescencyjnego, mogą nie być realnym wyborem, gdy potrzebna jest szeroka i wstępna ocena neutrofili.
Aby rozwiązać te problemy, ten protokół opisuje zestaw testów, które mogą być przeprowadzone po pojedynczym procesie izolacji, w tym ocena żywotności komórek, produkcja reaktywnych form tlenu (ROS), migracja w czasie rzeczywistym i fagocytoza Saccharomyces cerevisiae, których wyniki mogą być wykorzystane do przeprowadzenia szczegółowych badań uzupełniających. Procedura ta, nazwana NeutroFun Screen, została zaprojektowana tak, aby obejmowała wiodące czynności efektorowe, z wyjątkiem degranulacji, i może być wykonana w średnim czasie 4 godzin, w tym 1 godzinę aktywacji. Ponadto pozostałe komórki można wykorzystać do bardziej szczegółowych podejść, takich jak badania omiczne. Zaletą tej metody jest równowaga między szybkością, kompleksowością, kosztem i dokładnością.
Ponadto, istnieje sposób na łatwe zaobserwowanie wstępnej sugestii NETs, bez konkretnych znaczników, ale wystarczających, aby wskazać, czy dalsze wysiłki w tym kierunku byłyby warte zachodu. Różnorodność testowanych funkcji ma na celu połączenie punktów wspólnych między testami, skrócenie czasu i kosztów analizy. Głównym celem tej metody jest zapewnienie zrównoważonej, funkcjonalnej analizy dotyczącej szybkości, kompleksowości, kosztów i dokładności, która pozwala na przegląd odpowiedzi neutrofili, co czyni ją użytecznym początkowym krokiem w badaniu wpływu nowych bodźców na neutrofile o normalnej gęstości.

<table><tbody><tr><td>CIM-Plate 16</td><td>Agilent&nbsp;</td><td></td><td></td>5665825001</tr><tr><td>Czytnik płytek CLARIOstar&nbsp;</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td>US Numer patentu 9,733,124 Szczegóły Produktu: Oprogramowanie do analizy danych MARS</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek Din</td><td>&acirc; mika</td><td>1582</td><td></td></tr><tr><td>DNAza I</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>DN 25</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuwodna</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Szybkie barwienie panoptyczne</td><td>Laborclin</td><td>620529</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko szkiełkowe</td><td>Exacta</td><td>7102</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli z wapniem, z magnezem, bez czerwieni fenolowej.</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>55037C</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli bez chlorku wapnia, siarczanu magnezu i wodorowęglanu sodu.</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Blau</td><td>&nbsp; </td><td></td>7896014655229</tr><tr><td>Komora laminarna</td><td>Veco</td><td>VLFS-12</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Zeiss</td><td>415501-0101-002</td><td>Szczegóły Produktu:</td></tr><tr><td>Blok mieszający</td> Primostar 1 <td>BIOER</td><td>MB-102</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer ulepszony jasny New</td><td>Optik</td><td>1110000</td><td></td></tr><tr><td>N-formylo-metionylo-leucylo-fenyloalanina</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>F3506</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium</td><td>Neon</td><td>CAS 298-83-9</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Cytiva</td><td>17089101</td><td>media separacyjne</td></tr><tr><td>Phorbol 12-mirystynian 13-octan</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Tabletka soli fizjologicznej buforowanej fosforanami</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>ROTOFIX 32 A</td><td>Hettich</td><td>1206</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td>Fleischmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Safranin</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>50240</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Cytiva</td><td>17-1313-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Vetec</td><td>CI 23850</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>0K-0500-902</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence Analiza komórek w czasie rzeczywistym (RTCA) DP (podwójne zastosowanie)</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>380601050</td><td>Szczegóły produktu: System RTCA składający się ze sprzętu detekcyjnego, płytek ogniw i oprogramowania</td></tr></tbody></table>

zestaw technik przesiewowych do szybkiego przeglądu funkcji neutrofili

A Set of Screening Techniques for a Quick Overview of the Neutrophil Function

Neutrofile są znane jako jedna z pierwszych linii obrony we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i mogą wykonywać wiele szczególnych funkcji komórkowych, takich jak chemotaksja, migracja wsteczna, fagocytoza, degranulacja cytotoksycznych enzymów i metabolitów oraz uwalnianie DNA jako zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NET). Neutrofile nie tylko mają ściśle uregulowaną sygnalizację, ale także uczestniczą w regulacji innych składników układu odpornościowego. Ponieważ świeże neutrofile są terminalnie zróżnicowane, krótkotrwałe i bardzo zmienne wśród osobników, ważne jest, aby jak najlepiej wykorzystać pobrane próbki. Badacze często muszą przeprowadzać testy przesiewowe, aby ocenić przegląd wielu funkcji neutrofili, na które mogą mieć wpływ określone warunki podlegające ocenie. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowano zestaw testów przeprowadzających pojedynczy proces izolacji neutrofili o normalnej gęstości, poszukując równowagi między szybkością, kompleksowością, kosztami i dokładnością. Wyniki mogą być wykorzystane do uzasadnienia i ukierunkowania dogłębnych badań uzupełniających. Procedura ta może być przeprowadzona w średnim czasie 4 godzin i obejmuje ocenę żywotności komórek, produkcji reaktywnych form tlenu (ROS), migracji w czasie rzeczywistym i fagocytozy drożdży na szkiełkach szkiełkowych, pozostawiając wystarczającą ilość komórek do bardziej szczegółowych podejść, takich jak badania omiczne. Co więcej, procedura obejmuje sposób na łatwą obserwację wstępnej sugestii NET po szybkim barwieniu panoptycznym zaobserwowanym za pomocą mikroskopii świetlnej, przy braku specyficznych markerów, aczkolwiek wystarczających, aby wskazać, czy dalsze wysiłki w tym kierunku byłyby warte zachodu. Różnorodność testowanych funkcji łączy punkty wspólne dla testów, skracając czas analizy i zmniejszając koszty. Procedura została nazwana NeutroFun Screen i choć ma ograniczenia, równoważy wyżej wymienione czynniki. Co więcej, celem tej pracy nie jest konkretny zestaw testów, ale raczej wytyczna, którą można łatwo dostosować do zasobów i wymagań każdego laboratorium.

Metoda izolacji oparta na gęstości zastosowana w niniejszym badaniu (Rysunek 1) spełniła kryteria wymagane dla proponowanych eksperymentów. Parametry neutrofili uzyskane tą metodą obejmowały żywotność ≥98%, czystość ≥94% oraz wydajność komórkową ≥1,5 x 107, przy braku wykrywalnej aktywacji w testach przesiewowych. Dwoma istotnymi etapami izolacji PMN są przeciwkrzepliwość oraz usuwanie RBC. Utrzymywanie probówki lub strzykawki z krwią przeciwkrzepliwą w delikatnym ruchu kołyszącym przed nałożeniem na gradient gęstości oraz wybór metody usuwania RBC w celu zapobiegania zarówno aktywacji, jak i kontaminacji mogą wpływać na wydajność i powtarzalność eksperymentu.
W celu przeprowadzenia funkcjonalnego przeglądu działania neutrofili opracowano schemat postępowania, który pozwolił na wykonanie proponowanych testów przesiewowych przez co najmniej dwóch badaczy w średnim czasie 4 h, przy czym 1 h przeznaczono na aktywację, a 2 h na monitorowanie migracji w czasie rzeczywistym, co przedstawiono na Rysunku 2.
<img alt="Proces izolacji PMN, schemat badania NET, oś czasu migracji komórek; mikroskopia, konfiguracja analizy RTCA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65329/65329fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat NeutroFun Screen. W celu oceny panelu odpowiedzi funkcjonalnych wywołanych przez specyficzne badane warunki, schemat NeutroFun Screen zakłada udział co najmniej dwóch badaczy. Badacz 1 (R1) rozpoczyna proces izolacji PMN, po którym następuje dostosowanie stężenia komórek i inkubacja w systemie aktywacyjnym, podczas gdy równolegle badacz 2 (R2) przygotowuje materiały do przeprowadzenia kolejnych testów, które są podzielone między nich: R1 wykonuje testy fagocytozy, NET oraz spektrofotometryczne testy NBT; R2 przeprowadza testy migracji w czasie rzeczywistym oraz testy NBT na szkiełkach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65329/65329fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Klasyczny test NBT17 zoptymalizowano zarówno pod kątem oceny na preparatach, jak i spektrofotometrycznej oceny tworzenia formazanu w wyniku reakcji NBT z RWP generowanymi przez PMN. Analiza spektrofotometryczna umożliwiła względną kwantyfikację pomiędzy poszczególnymi warunkami, natomiast analiza mikroskopowa była przydatna do opisu i analizy półilościowej, pozwalając ocenić regularność rozmieszczenia kryształów, morfologię oraz liczbę komórek zawierających formazan. Wyniki analizy spektrofotometrycznej przedstawiono na Rysunku 3A, wskazując, że 100 nM PMA indukuje zwiększoną produkcję RWP (w średnim stosunku 3:2:1) w porównaniu z grupami fMLP i kontrolną. Wyniki testu NBT na preparatach (Rysunek 3B) potwierdziły wyniki spektrofotometryczne, wykazując również PMA jako najsilniejszy bodziec indukujący produkcję RWP w porównaniu z fMLP (Rysunek 3C), co zostało wcześniej wykazane poprzez bezpośredni pomiar RWP za pomocą cytometrii18. W odniesieniu do liczenia komórek, liczba neutrofili zawierających kryształy formazanu wykazała stosunek 7:4:1 w warunkach PMA:fMLP:kontrola, ujawniając również różne wzorce rozmieszczenia formazanu pomiędzy PMN aktywowanymi przez fMLP a PMA; traktowanie fMLP prowadziło do intensywnej aktywacji pojedynczych komórek, podczas gdy PMA indukowało tworzenie kryształów formazanu rozproszonych w całej cytoplazmie w większości PMN. Ponadto zaobserwowano kilka cech morfologicznych różniących te warunki, takich jak wyraźna agregacja komórek po traktowaniu PMA. Brak takich typowych cech aktywacji oraz niskie poziomy formazanu w grupie kontrolnej wskazały, że stan spoczynku nie został istotnie zaburzony. Zatem test NBT okazał się prostym, niedrogim i niezawodnym badaniem produkcji RWP przez neutrofile, które może być stosowane do oceny zdolności i intensywności danego bodźca do indukcji produkcji RWP.
<img alt="Wykres absorbancji, obrazy z mikroskopu i wykres słupkowy przedstawiają odpowiedź neutrofili na CTRL, fMLP, PMA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65329/65329fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Test NBT. (A>) Ocena spektrofotometryczna wyrzutu oddechowego neutrofili w różnych warunkach (kontrola negatywna: 100 nM fMLP i 100 nM PMA) na podstawie absorbancji formazanu (490-630 nm). Dane od czterech dawców przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). * = wszystkie grupy różnią się od siebie (p≤ 0,05); £ = Porównania CTRL względem PMA oraz fMLP względem PMA wykazują istotne różnice (p≤ 0,05). (B>) Test na szkiełku może być analizowany jakościowo, określając intensywność złogów formazanu, ich lokalizację wewnątrz komórki oraz agregację komórek. Czarne strzałki wskazują kryształy formazanu. Paski skali: 20 µm. (C>) Liczba PMN zawierających formazan, policzona za pomocą mikroskopii optycznej. Dane od ośmiu dawców przedstawiono jako średnia ± SD. *** p &lt; 0,0001, test t Studenta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65329/65329fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Preparaty do badania fagocytozy wykorzystano do określenia wskaźnika fagocytozy jako procentu neutrofili wykazujących aktywność fagocytarną, co przedstawiono na Rysunku 4. Chociaż zarówno 100 nM fMLP, jak i 16 µM peptydy przeciwdrobnoustrojowej indukowali pozornie zwiększone pochłanianie drożdżaków, różnica ta nie była istotna statystycznie aż do momentu podwójnej stymulacji, która znacząco nasiliła fagocytozę w porównaniu z grupą kontrolną i może sugerować występowanie odpowiedzi w wyniku podwójnej stymulacji.
<img alt="Analiza fagocytozy; wykres słupkowy; efekty peptydów przeciwdrobnoustrojowych; obrazy mikroskopowe; porównanie danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65329/65329fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Test fagocytozy. Neutrofile oceniano pod kątem ich zdolności do fagocytozy (liczenie neutrofili zawierających drożdże). Chociaż ekspozycja na 100 nM fMLP lub 16 µM peptyd przeciwdrobnoustrojowy przed inkubacją z drożdżami zwiększyła fagocytozę w porównaniu z grupą kontrolną, (A) wzrost ten nie był istotny statystycznie. Co interesujące, wstępna inkubacja z fMLP, a następnie dodanie peptydy przeciwdrobnoustrojowego, doprowadziła do znaczącego zwiększenia fagocytozy w ludzkich neutrofilach (gwiazdka między CTRL a fMLP + peptyd przeciwdrobnoustrojowy). (B) Czarne strzałki wskazują komórki drożdży, zielone strzałki wskazują same neutrofile, a czerwone strzałki wskazują neutrofile dokonujące fagocytozy. Dane od pięciu dawców przedstawiono jako średnia ± SD. Paski skali: 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65329/65329fig04large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Przykład wyników migracji komórek w czasie rzeczywistym przedstawiono na Rysunku 5, obrazującym znany efekt chemotaktyczny 100 nM fMLP na neutrofile. Kinetyka migracji komórek została dopasowana do modelu Gompertza, co umożliwiło porównanie jego parametrów.
<img alt="Wykres porównujący wzrost indeksu komórkowego; fMLP vs CTRL; dopasowanie danych za pomocą funkcji wykładniczej; serie czasowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65329/65329fig05v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Migracja komórek w czasie rzeczywistym. Indeks komórkowy odzwierciedla impedancję elektryczną wynikającą z migracji komórek. W tym teście fMLP zastosowano jako kontrolę pozytywną migracji neutrofilów, dodając 100 nM fMLP do dolnej komory. Kontrola negatywna (CTRL) zawierała w dolnej komorze wyłącznie HBSS. Nałożone krzywe przedstawiają dopasowanie danych do modelu Gompertza, zmodyfikowanego w celu optymalnego dopasowania do nachyleń wstępujących i opadających. Dane od trzech dawców, przedstawione jako średnia ± SD.* p &lt; 0,05, test t Studenta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65329/65329fig05largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Na koniec przedstawiono prosty test z użyciem mikroskopii optycznej sugerujący obecność NET, w którym PMN-y barwiono barwnikiem panoptycznym. Można zaobserwować, że w przypadku niektórych specyficznych bodźców indukujących NET, takich jak PMA lub niektóre peptydy przeciwdrobnoustrojowe, nawet po krótkim czasie aktywacji (1 h) widoczne są włókniste struktury przypominające sieci w pobliżu komórek, podczas gdy nie występuje to w innych warunkach, takich jak kontrola negatywna i fMLP (Rycina 6). Aby lepiej poprzeć tę tezę, po 40 min aktywacji komórek za pomocą 100 nm PMA lub peptydu przeciwdrobnoustrojowego dodano DNazę I, co doprowadziło do usunięcia struktur typu NET (Rycina 6). Chociaż metoda ta nie nadaje się do pełnej charakterystyki NET i może być podatna na artefakty, stanowi ona tani, prosty i interesujący punkt wyjścia do uzasadnienia dalszych nakładów na analizę NET, szczególnie w kontekstach, w których efekty bodźców są nieznane lub słabo opisane.
<img alt="Reakcja neutrofili pod wpływem PMA, fMLP i peptydów; mikroskopia, odpowiedź komórkowa, badanie immunologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65329/65329fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Test sugerujący tworzenie NET. Jakościowa analiza neutrofili barwionych panoptykiem po 1 h aktywacji na szkiełku przedmiotowym może wskazywać na uwalnianie NET. Grupy CTRL (A,B) oraz fMLP (C,D) nie wykazały żadnych oznak uwalniania NET, podczas gdy aktywacja PMA (E-H) indukowała tworzenie struktur podobnych do NET, które uległy degradacji po zastosowaniu DNase I (I-L). Badanie wpływu peptydu przeciwbakteryjnego na neutrofile wykazało, że taki bodziec może być w stanie wywołać uwalnianie NET, ponieważ na szkiełkach pojawiły się struktury podobne do NET (M-P), które zostały zdegradowane przez DNase I (Q-T). Czerwone strzałki wskazują struktury podobne do NET. Paski skali: 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65329/65329fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół zawiera zestaw testów funkcjonalnych neutrofili, które mają być używane jako metoda przesiewowa w celu pokrycia funkcji z różnych ścieżek sygnałowych. Protokół zawiera wstępną i prostą ocenę żywotności komórek, czystości, produkcji reaktywnych form tlenu, migracji w czasie rzeczywistym, fagocytozy oraz wstępną sugestię pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.

Zestaw technik przesiewowych do szybkiego przeglądu funkcji neutrofili

Neutrophils are known as one of the first lines of defense in the innate immune response and can perform many particular cellular functions, such as ...

Protokół przesiewowy NeutroFun zapewnia grupę testów funkcjonalnych, które wykorzystują tanie chemikalia i mogą być wykonane w jednym eksperymencie ze świeżych neutrofili. Pozwala to na wstępną ocenę niektórych głównych funkcji neutrofili w celu przeprowadzenia bardziej pracochłonnych i kosztownych badań uzupełniających. Badania nad neutrofilami wykorzystują różne warunki modulacji, takie jak cytokiny, peptydy, produkty mikrobiomu i bodźce fizyczne.Dodatkowo zagadnienia analityczne obejmują cytometrię przepływową, proteomikę, urządzenia mikropickowe i immunocytochemię. Szeroko zakrojone operacje marki i testy stosowane w połączeniu sprawiają, że praca nad neutrofilami jest długa, pracochłonna i kosztowna. Zazwyczaj zmniejsza to liczbę badanych warunków lub liczbę wykonywanych testów.Obecne najnowocześniejsze metody wymagają drogich materiałów eksploatacyjnych, wielu ogniw i długotrwałych procedur przygotowawczych. Nasz protokół, NeutroFun screen, oferuje szybsze i bardziej ekonomiczne podejście do oceny funkcjonalności komórek w porównaniu z innymi metodami. Osiąga się to poprzez łączenie różnych analiz w ramach protokołu przy jednoczesnym zachowaniu dokładności i kompleksowości wyników.Dwóch badaczy wykonuje ten proces jednocześnie, aby uzyskać szybki przegląd funkcji neutrofili. Recenter pierwszy izoluje PNN, dostosowuje stężenie i inkubuje systemy aktywacji, podczas gdy badacz drugi przygotowuje materiały do kolejnych testów, następnie badacz pierwszy wykonuje testy fagocytozy, sugestii NET i kolorymetryczne NBT, podczas gdy badacz drugi przeprowadza migrację w czasie rzeczywistym i testy slajdów NBT. Przygotować 12 mililitrów rozcieńczeń 60% i 70% pożywki separacyjnej w 50-mililitrowych stożkowych probówkach.Następnie przygotuj gradient od dołu do góry, dodając cztery mililitry na raz do 60% rozcieńczenia do 70% rozcieńczenia za pomocą pięciomililitrowej pipety. Następnie ostrożnie ułóż 12 mililitrów heparynizowanej krwi na wierzchu gradientu gęstości i odwiruj w 200 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć warstwy plazmy i komórek jednojądrzastych, a następnie ostrożnie przenieś około 7,5 mililitra warstwy nad osadem erytrocytów do dwóch 15-mililitrowych stożkowych probówek.Odwirować probówki o sile 300 G przez pięć minut w temperaturze 19 stopni Celsjusza. Kontynuuj mycie osadu komórkowego zrównoważonym roztworem soli Hanksa lub HBSS. Następnie wykonaj hipotoniczną lizę i usuń pozostałe czerwone krwinki.Po odrzuceniu supernatantu delikatnie zawiesić wielojądrzaste neutrofile w pozostałym buforze i przenieść je do lodowato zimnej probówki do mikrowirówki. Następnie przenieś trzy jednomikrolitrowe porcje zawiesiny komórek do czystego szkiełka podstawowego. Barwienie za pomocą szybkiego panoptiku w celu oceny morfologii i czystości komórek.Obserwuj komórki pod mikroskopem i policz 300 losowych komórek w każdym dołku. Oznacz neutrofile i inne typy komórek, aby ocenić czystość separacji. Następnie przenieś jeden mikrolitr zawiesiny komórek do 49 mikrolitrów 0,2% niebieskiego barwnika trypanowego i policz martwe i żywotne komórki za pomocą komory Neubauera.Dostosuj stężenie komórek do 6 667 komórek na mikrolitr, z 50% osoczem autologicznym i 50% HBSS, uzupełnionym wapniem i magnezem. Następnie równomiernie podzielić zawiesinę komórek na 1,5 mililitrowe probówki wirówkowe odpowiadające warunkom testowym, w tym kontroli ujemnej. Przygotuj system aktywacji dla każdego stanu, upewniając się, że końcowe stężenie komórek pozostaje na poziomie 6 600 wielojądrzastych neutrofili na mikrolitr.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez obracania. Zacznij od rozpuszczenia 0,0005 grama NBT w 10 mikrolitrach DMSO. Po wirowaniu przez 15 minut dodać 90 mikrolitrów zbilansowanego roztworu soli Hanka lub HBSS z wapniem i magnezem oraz jeden mikrolitr badanych substancji.Ponownie wiruj rurkę przez maksymalnie dwie minuty. Aby wykonać test szkiełka NBT, delikatnie wymieszaj i przenieś dwa mikrolitry wcześniej przygotowanych aktywowanych neutrofili wielojądrzastych na czyste szkiełko podstawowe. Inkubować szkiełko w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.Następnie dodaj jeden mikrolitr roztworu roboczego NBT na komórki. Inkubować ponownie przez 20 minut, chroniąc przed światłem. Po wysuszeniu szkiełka napraw je, nakładając kroplę metanolu do każdej studzienki na jedną minutę.Zabarwić szkiełko 0,03 safraniną przez dodatkową minutę. W każdym dołku policz 100 losowych komórek, różnicujących neutrofile ze złogami formazanu i bez nich. Aby wykonać test spektrometrii NBT, delikatnie wymieszać i przenieść 90 mikrolitrów wcześniej przygotowanych aktywowanych neutrofili wielojądrzastych do czystej probówki mikrowirówkowej, a następnie ostrożnie dodać 20 mikrolitrów sześciomilimolowego roztworu NBT i inkubować probówkę w ciemności przez 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.Po inkubacji dodać 100 mikrolitrów 10% SDS i wirować. Sonikuj za pomocą sonografu końcówki o amplitudzie 60%, dodając pięć cykli po 15 sekund każdy i 15-sekundowe odstępy. Wirować przy 12 000 g przez pięć minut.Przenieść 60 mikrolitrów supernatantu na przezroczystą 96-dołkową płytkę i zmierzyć absorbancję produktu formazanu przy 570 nanometrach. Wyniki testu spektrofotometrycznego wykazały, że 100 nanomolowych PMA indukowało zwiększoną produkcję ROS w porównaniu z fMLP i grupami kontrolnymi. Wyniki testu szkiełkowego NBT potwierdziły wyniki spektrofotometryczne, pokazując PMA jako najbardziej intensywny bodziec indukujący produkcję ROS w porównaniu z fMLP.Dodaj około 0,75 miligrama suchych drożdży do 200 mikrolitrów zbilansowanego roztworu soli Hanka lub HBSS zawierającego jony wapnia i magnezu. Następnie inkubuj mieszaninę w termomikserze w temperaturze 100 stopni Celsjusza i 500 obr./min przez minimum 15 minut. Po inkubacji przenieś pięć mikrolitrów zawiesiny drożdży do 45 mikrolitrów 0,2% niebieskiego barwnika trypanowego.Policz komórki drożdży za pomocą komory Neubauera. Dostosuj stężenie początkowej zawiesiny do 33 000 komórek drożdży na mikrolitr za pomocą HBSS z wapniem i magnezem. Następnie delikatnie wymieszaj i przenieś pięć mikrolitrów wcześniej przygotowanych aktywowanych neutrofili wielojądrzastych do pięciu mikrolitrów zawiesiny komórek drożdży w nowej sterylnej probówce do mikrowirówek.Natychmiast przenieść sześć mikrolitrów wielojądrzastych neutrofili i zawiesiny drożdży do trzech dołków czystego szkła podstawowego, po dwa mikrolitry każdy, i inkubować szkiełko w wilgotnej komorze przez 40 minut. Po barwieniu szybkim panoptykiem obserwuj komórki pod mikroskopem. Chociaż zarówno 100-nanomolowy fMLP, jak i 16-mikromolowy peptyd przeciwdrobnoustrojowy indukowały zwiększone pochłanianie drożdży, różnica nie była statystycznie istotna aż do podwójnej stymulacji, która znacznie zwiększyła fagocytozę w porównaniu z grupą kontrolną.Przygotuj gradient chemotaktologiczny, dodając 160 mikrolitrów chemoatraktantu do dolnej komory analizatora komórek w czasie rzeczywistym opartego na impedancji lub płytki RTCA. W przypadku kontroli ujemnych i ślepych prób dodaj 160 mikrolitrów zbilansowanego roztworu soli Hanka lub HBSS z wapniem i magnezem. Przymocuj górną komorę i dodaj 25 mikrolitrów HBSS z wapniem i magnezem.Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę, aby utworzyć gradient chemotaktologiczny. Następnie delikatnie wymieszaj i przenieś 60 mikrolitrów wcześniej przygotowanych aktywowanych neutrofili wielojądrzastych do górnej komory. Następnie dodaj 60 mikrolitrów HBSS z wapniem i magnezem do ślepej próby.Umieść płytkę RTCA w analizatorze i zaprogramuj jego oprogramowanie tak, aby mierzyło indeks komórki co 60 sekund przez dwie godziny. Dopasuj krzywą do uzyskanych danych. Migracja komórek w czasie rzeczywistym wykazała chemotaktyczny wpływ 100 nanomolowych fMLP na neutrofile.Delikatnie wymieszać i przenieść cztery mikrolitry wcześniej przygotowanego aktywowanego wielojądrzastego układu neutrofili poddanego ocenie do dwóch studzienek czystego szklanego szkiełka. Inkubować szkiełko w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Dodaj jeden mikrolitr DNazy I do jednego z dołków i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po barwieniu szybkim panoptykiem oceń pod mikroskopem. Analiza jakościowa neutrofili barwionych panoptyką wykazała, że grupy kontrolne i fMLP nie wykazywały żadnych oznak uwalniania netto, podczas gdy aktywacja PMA indukowała tworzenie struktur podobnych do siatki, została zdegradowana przez leczenie DNazą I. Wpływ peptydu przeciwdrobnoustrojowego na neutrofile pokazał, że taki bodziec może być w stanie wywołać uwolnienie netto, ponieważ prezentowane struktury siatkowe szkiełka zostały zdegradowane przez DNAzę I.

a-set-screening-techniques-for-quick-overview-neutrophil

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje test in vitro do badania interakcji neutrofil-biofilm. Bakterie chorobotwórcze osadzone w biofilmie i wyizolowanych neutrofilach oznaczono za pomocą znaczników fluorescencyjnych, a odpowiedź immunologiczną neutrofili i unikanie odpowiedzi immunologicznej przez bakterie oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Test in vitro do badania interakcji między neutrofilami a biofilmem

Ten protokół szczegółowo opisuje test przeznaczony do pomiaru chemotaksji ludzkich neutrofili z jednej kropli krwi pełnej z solidną powtarzalnością. Takie podejście pozwala obejść potrzebę separacji neutrofili i wymaga tylko kilku minut czasu na przygotowanie testu. Chip mikroprzepływowy umożliwia wielokrotny pomiar chemotaksji neutrofili w czasie u niemowląt lub małych ssaków, gdzie objętość próbki jest ograniczona.

Platforma mikroprzepływowa do pomiaru chemotaksji neutrofili z nieprzetworzonej krwi pełnej

Neutrofile odgrywają ważną rolę nie tylko w obronie gospodarza przed atakującymi mikroorganizmami, ale są również zaangażowane w immunologiczny nadzór nad komórkami nowotworowymi. W tym miejscu opisano techniki związane z izolacją neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych oraz metody monitorowania funkcji przeciwnowotworowych neutrofili in vitro i in vivo.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych

Neutrofile to najliczniejszy rodzaj białych krwinek. Opisano tutaj izolację neutrofili z krwi ludzkiej metodą separacji w gradinie gęstości i różnicowanie ludzkich komórek promielocytowych (HL60) wzdłuż szlaku granulocytarnego; w celu zbadania ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na leki przeciwchłoniakowe.

Izolacja i analiza neutrofili w celu określenia ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na środki terapeutyczne

Ten artykuł przedstawia szczegółową metodę przeprowadzania szybkiego testu chemotaksji neutrofili poprzez integrację wbudowanej izolacji neutrofili z krwi pełnej oraz testu chemotaksji na pojedynczym chipie mikroprzepływowym.

Kompleksowa metoda do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili bezpośrednio z kropli krwi

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania obecności neutrofili w stałych/permeabilizowanych odcinkach histologicznych i oceny stanu aktywacji żywych, oczyszczonych neutrofili. W szczególności peptyd MUB40 wiąże laktoferynę obecną w ziarnistościach specyficznych dla neutrofili i trzeciorzędowych. Ekspozycja zawartości granulek poprzez przepuszczalność lub aktywację neutrofili pozwala na znakowanie neutrofili.

Peptyd MUB40 do stosowania w wykrywaniu zdarzeń zapalnych za pośrednictwem neutrofili

Obecny protokół opisuje badanie interakcji neutrofil-biofilm. Biofilmy Staphylococcus aureus tworzy się in vitro i inkubuje z neutrofilami ludzkimi pochodzącymi z krwi obwodowej. Odpowiedź oksydacyjna neutrofili jest określana ilościowo, a lokalizacja neutrofili w biofilmie jest określana za pomocą mikroskopii.

Standaryzowane testy in vitro do wizualizacji i ilościowego określenia interakcji między ludzkimi neutrofilami a biofilmami Staphylococcus aureus

Prezentowany tutaj jest protokół do indukcji i analizy in vitro zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NET). Kwantyfikacja DNA, katelicydyny (LL37) i aktywności enzymów dostarczyła danych, które pokazują zmienność składu i morfologii NET indukowanych przez bodźce mikrobiologiczne i chemiczne w podobnie kontrolowanych warunkach.

Analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi

Prezentujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) przy użyciu systemu analizy żywych komórek, w połączeniu z zależnym od przepuszczalności błony metodą podwójnego barwnika.

Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) znacznie wzrastają w kilku chorobach. LDN są zwykle izolowane poprzez sortowanie komórek. Przedstawiamy praktyczną metodę uzyskania czystego i skutecznego LDN. Po wirowaniu krwi obwodowej z gradientem gęstości komórki są inkubowane za pomocą mikrogranulek magnetycznych, a następnie LDN rozdzielane przez kolumny magnetyczne.

Szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości

Poznaj protokół NeutroFun do szybkiej oceny funkcji neutrofili przy użyciu tanich chemikaliów w jednym eksperymencie. Metoda umożliwia wstępną analizę żywotności komórek, produkcji ROS, migracji i fagocytozy.

Zestaw technik przesiewowych do szybkiego przeglądu funkcji neutrofili

Przeglądaj więcej filmów