Zestaw technik przesiewowych do szybkiego przeglądu funkcji neutrofili

Protokół przesiewowy NeutroFun zapewnia grupę testów funkcjonalnych, które wykorzystują tanie chemikalia i mogą być wykonane w jednym eksperymencie ze świeżych neutrofili. Pozwala to na wstępną ocenę niektórych głównych funkcji neutrofili w celu przeprowadzenia bardziej pracochłonnych i kosztownych badań uzupełniających. Badania nad neutrofilami wykorzystują różne warunki modulacji, takie jak cytokiny, peptydy, produkty mikrobiomu i bodźce fizyczne.

Dodatkowo zagadnienia analityczne obejmują cytometrię przepływową, proteomikę, urządzenia mikropickowe i immunocytochemię. Szeroko zakrojone operacje marki i testy stosowane w połączeniu sprawiają, że praca nad neutrofilami jest długa, pracochłonna i kosztowna. Zazwyczaj zmniejsza to liczbę badanych warunków lub liczbę wykonywanych testów.

Obecne najnowocześniejsze metody wymagają drogich materiałów eksploatacyjnych, wielu ogniw i długotrwałych procedur przygotowawczych. Nasz protokół, NeutroFun screen, oferuje szybsze i bardziej ekonomiczne podejście do oceny funkcjonalności komórek w porównaniu z innymi metodami. Osiąga się to poprzez łączenie różnych analiz w ramach protokołu przy jednoczesnym zachowaniu dokładności i kompleksowości wyników.

Dwóch badaczy wykonuje ten proces jednocześnie, aby uzyskać szybki przegląd funkcji neutrofili. Recenter pierwszy izoluje PNN, dostosowuje stężenie i inkubuje systemy aktywacji, podczas gdy badacz drugi przygotowuje materiały do kolejnych testów, następnie badacz pierwszy wykonuje testy fagocytozy, sugestii NET i kolorymetryczne NBT, podczas gdy badacz drugi przeprowadza migrację w czasie rzeczywistym i testy slajdów NBT. Przygotować 12 mililitrów rozcieńczeń 60% i 70% pożywki separacyjnej w 50-mililitrowych stożkowych probówkach.

Następnie przygotuj gradient od dołu do góry, dodając cztery mililitry na raz do 60% rozcieńczenia do 70% rozcieńczenia za pomocą pięciomililitrowej pipety. Następnie ostrożnie ułóż 12 mililitrów heparynizowanej krwi na wierzchu gradientu gęstości i odwiruj w 200 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć warstwy plazmy i komórek jednojądrzastych, a następnie ostrożnie przenieś około 7,5 mililitra warstwy nad osadem erytrocytów do dwóch 15-mililitrowych stożkowych probówek.

Odwirować probówki o sile 300 G przez pięć minut w temperaturze 19 stopni Celsjusza. Kontynuuj mycie osadu komórkowego zrównoważonym roztworem soli Hanksa lub HBSS. Następnie wykonaj hipotoniczną lizę i usuń pozostałe czerwone krwinki.

Po odrzuceniu supernatantu delikatnie zawiesić wielojądrzaste neutrofile w pozostałym buforze i przenieść je do lodowato zimnej probówki do mikrowirówki. Następnie przenieś trzy jednomikrolitrowe porcje zawiesiny komórek do czystego szkiełka podstawowego. Barwienie za pomocą szybkiego panoptiku w celu oceny morfologii i czystości komórek.

Obserwuj komórki pod mikroskopem i policz 300 losowych komórek w każdym dołku. Oznacz neutrofile i inne typy komórek, aby ocenić czystość separacji. Następnie przenieś jeden mikrolitr zawiesiny komórek do 49 mikrolitrów 0,2% niebieskiego barwnika trypanowego i policz martwe i żywotne komórki za pomocą komory Neubauera.

Dostosuj stężenie komórek do 6 667 komórek na mikrolitr, z 50% osoczem autologicznym i 50% HBSS, uzupełnionym wapniem i magnezem. Następnie równomiernie podzielić zawiesinę komórek na 1,5 mililitrowe probówki wirówkowe odpowiadające warunkom testowym, w tym kontroli ujemnej. Przygotuj system aktywacji dla każdego stanu, upewniając się, że końcowe stężenie komórek pozostaje na poziomie 6 600 wielojądrzastych neutrofili na mikrolitr.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez obracania. Zacznij od rozpuszczenia 0,0005 grama NBT w 10 mikrolitrach DMSO. Po wirowaniu przez 15 minut dodać 90 mikrolitrów zbilansowanego roztworu soli Hanka lub HBSS z wapniem i magnezem oraz jeden mikrolitr badanych substancji.

Ponownie wiruj rurkę przez maksymalnie dwie minuty. Aby wykonać test szkiełka NBT, delikatnie wymieszaj i przenieś dwa mikrolitry wcześniej przygotowanych aktywowanych neutrofili wielojądrzastych na czyste szkiełko podstawowe. Inkubować szkiełko w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Następnie dodaj jeden mikrolitr roztworu roboczego NBT na komórki. Inkubować ponownie przez 20 minut, chroniąc przed światłem. Po wysuszeniu szkiełka napraw je, nakładając kroplę metanolu do każdej studzienki na jedną minutę.

Zabarwić szkiełko 0,03 safraniną przez dodatkową minutę. W każdym dołku policz 100 losowych komórek, różnicujących neutrofile ze złogami formazanu i bez nich. Aby wykonać test spektrometrii NBT, delikatnie wymieszać i przenieść 90 mikrolitrów wcześniej przygotowanych aktywowanych neutrofili wielojądrzastych do czystej probówki mikrowirówkowej, a następnie ostrożnie dodać 20 mikrolitrów sześciomilimolowego roztworu NBT i inkubować probówkę w ciemności przez 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Po inkubacji dodać 100 mikrolitrów 10% SDS i wirować. Sonikuj za pomocą sonografu końcówki o amplitudzie 60%, dodając pięć cykli po 15 sekund każdy i 15-sekundowe odstępy. Wirować przy 12 000 g przez pięć minut.

Przenieść 60 mikrolitrów supernatantu na przezroczystą 96-dołkową płytkę i zmierzyć absorbancję produktu formazanu przy 570 nanometrach. Wyniki testu spektrofotometrycznego wykazały, że 100 nanomolowych PMA indukowało zwiększoną produkcję ROS w porównaniu z fMLP i grupami kontrolnymi. Wyniki testu szkiełkowego NBT potwierdziły wyniki spektrofotometryczne, pokazując PMA jako najbardziej intensywny bodziec indukujący produkcję ROS w porównaniu z fMLP.

Dodaj około 0,75 miligrama suchych drożdży do 200 mikrolitrów zbilansowanego roztworu soli Hanka lub HBSS zawierającego jony wapnia i magnezu. Następnie inkubuj mieszaninę w termomikserze w temperaturze 100 stopni Celsjusza i 500 obr./min przez minimum 15 minut. Po inkubacji przenieś pięć mikrolitrów zawiesiny drożdży do 45 mikrolitrów 0,2% niebieskiego barwnika trypanowego.

Policz komórki drożdży za pomocą komory Neubauera. Dostosuj stężenie początkowej zawiesiny do 33 000 komórek drożdży na mikrolitr za pomocą HBSS z wapniem i magnezem. Następnie delikatnie wymieszaj i przenieś pięć mikrolitrów wcześniej przygotowanych aktywowanych neutrofili wielojądrzastych do pięciu mikrolitrów zawiesiny komórek drożdży w nowej sterylnej probówce do mikrowirówek.

Natychmiast przenieść sześć mikrolitrów wielojądrzastych neutrofili i zawiesiny drożdży do trzech dołków czystego szkła podstawowego, po dwa mikrolitry każdy, i inkubować szkiełko w wilgotnej komorze przez 40 minut. Po barwieniu szybkim panoptykiem obserwuj komórki pod mikroskopem. Chociaż zarówno 100-nanomolowy fMLP, jak i 16-mikromolowy peptyd przeciwdrobnoustrojowy indukowały zwiększone pochłanianie drożdży, różnica nie była statystycznie istotna aż do podwójnej stymulacji, która znacznie zwiększyła fagocytozę w porównaniu z grupą kontrolną.

Przygotuj gradient chemotaktologiczny, dodając 160 mikrolitrów chemoatraktantu do dolnej komory analizatora komórek w czasie rzeczywistym opartego na impedancji lub płytki RTCA. W przypadku kontroli ujemnych i ślepych prób dodaj 160 mikrolitrów zbilansowanego roztworu soli Hanka lub HBSS z wapniem i magnezem. Przymocuj górną komorę i dodaj 25 mikrolitrów HBSS z wapniem i magnezem.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę, aby utworzyć gradient chemotaktologiczny. Następnie delikatnie wymieszaj i przenieś 60 mikrolitrów wcześniej przygotowanych aktywowanych neutrofili wielojądrzastych do górnej komory. Następnie dodaj 60 mikrolitrów HBSS z wapniem i magnezem do ślepej próby.

Umieść płytkę RTCA w analizatorze i zaprogramuj jego oprogramowanie tak, aby mierzyło indeks komórki co 60 sekund przez dwie godziny. Dopasuj krzywą do uzyskanych danych. Migracja komórek w czasie rzeczywistym wykazała chemotaktyczny wpływ 100 nanomolowych fMLP na neutrofile.

Delikatnie wymieszać i przenieść cztery mikrolitry wcześniej przygotowanego aktywowanego wielojądrzastego układu neutrofili poddanego ocenie do dwóch studzienek czystego szklanego szkiełka. Inkubować szkiełko w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Dodaj jeden mikrolitr DNazy I do jednego z dołków i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po barwieniu szybkim panoptykiem oceń pod mikroskopem. Analiza jakościowa neutrofili barwionych panoptyką wykazała, że grupy kontrolne i fMLP nie wykazywały żadnych oznak uwalniania netto, podczas gdy aktywacja PMA indukowała tworzenie struktur podobnych do siatki, została zdegradowana przez leczenie DNazą I. Wpływ peptydu przeciwdrobnoustrojowego na neutrofile pokazał, że taki bodziec może być w stanie wywołać uwolnienie netto, ponieważ prezentowane struktury siatkowe szkiełka zostały zdegradowane przez DNAzę I.