Podwiązanie lewego przedsionka w zarodku ptaka jako model zmienionego obciążenia hemodynamicznego we wczesnym rozwoju naczyniowym
16 czerwca 2023
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualny do wykonania modelu podwiązania lewego przedsionka (LAL) w zarodku ptaka. Model LAL zmienia przepływ wewnątrzsercowy, który zmienia obciążenie naprężeniem ścinającym ścianę, naśladując zespół niedorozwoju lewego serca. Przedstawiono podejście do przezwyciężenia wyzwań związanych z tym trudnym modelem mikrochirurgii.
Nasze laboratorium koncentruje się na wpływie przepływu krwi i obciążenia ciśnieniowego na zarodkowe łuki i komory aorty ptaków. Naszym celem jest przyczynienie się do złożonych mechanizmów biomechanicznych, które łączą morfologię naczyń krwionośnych z obciążeniem mechanicznym w modelu LAL. Utrzymujemy również silny program badań klinicznych i chirurgicznych w zakresie bioinżynierii.
W niedawnym wspólnym badaniu przeprowadzonym przez grupę profesora Yoppa w Imperial College, modelowanie elementów skończonych oparte na obrazie i sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek zostały wykorzystane do zilustrowania rosnącego rozszerzenia szczepów mięśnia sercowego w komorach po lewym ultra podwiązaniu w drugim i piątym etapie. Taka wiedza może przełożyć się na śmiertelne interwencje sercowo-naczyniowe u ludzi. Mniejsza jama lewej komory i ucisk w całych zachyłkach beleczkowych zostały wchłonięte przez interwencję LAL.
Ponadto LAL zmienił normalną strukturę komór i przeorientował wygląd beleczkowania. Ponadto model LAL spowodował powiększenie jamy prawej komory, zmiany w budowie beleczkowania oraz zwiększenie obciążenia objętości mięśnia sercowego. LAL wpływa na obciążenie hemodynamiczne w zarodku pisklęcia, prowadząc do zespołu hipoplazji lewego serca.
Elastyczność normalnie rozwijającego się mięśnia sercowego ulega zmianom, szczególnie w fenotypie HLHS. Odkrycia te mogą pomóc w opracowaniu potencjalnych metod leczenia na potrzeby badań klinicznych i ukierunkować modele konkurencji predykcyjnej. Zacznij od delikatnego oczyszczenia skorupek zapłodnionych jaj kurzych z białego leghornu za pomocą niestrzępiących się chusteczek nasączonych etanolem.
Jaja wysiadywać końcem aż do pożądanego etapu, zwykle HH 20 do 21. Przed przystąpieniem do zabiegu należy przygotować wymaganą liczbę węzłów, zawiązując luźny węzeł naciągany w szew 10/0 o długości 1,5 centymetra. Upewnij się, że węzeł nie jest ciasny i jest wystarczająco duży, aby zmieścić się nad przedsionkami.
Delikatnie rozłup skorupkę jajka odwrotnym końcem pęsety, mocno podtrzymując jajko, aby zapobiec niechcianym pęknięciom. Otwórz okienko z końca jaja i usuń zarówno zewnętrzną, jak i wewnętrzną błonę. Użyj mikronożyczek, aby usunąć tylko niezbędną błonę witeliny Gdy zarodek uwolni się od błony witeliny, umieść pęsetę z zamkniętą końcówką pod grzbietowym segmentem zarodka i delikatnie odwróć ją, aby odsłonić lewą stronę.
Usuń wszystkie błony bezpośrednio wokół pąka przedsionkowego, usuwając najpierw grube błony, a następnie używając drobniejszej pęsety do drobnego usunięcia błony. Umieść wcześniej przygotowany węzeł blisko zarodka. Prawidłowo ustaw otwarty węzeł nad lewym zawiązkiem przedsionka, aby wykonać zaciskanie węzła.
Za pomocą mikronożyczek odetnij nadmiar końców szwu jak najbliżej pąka i usuń nadmiar kawałków szwu pęsetą. Na koniec, za pomocą zamkniętej pęsety, przywróć zarodek do pierwotnej pozycji. Po zakończeniu mikrochirurgii przykryj jajo podwójną warstwą paraformu i włóż je z powrotem do inkubatora.
Podwiązanie lewego przedsionka lub modele LAL wykazały, że uzyskano bardziej zwartą strukturę mięśnia sercowego ze znaczącymi zmianami morfologicznymi w porównaniu z normalnym rozwojem. Wokół śródmiąższu serca zaobserwowano odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej przypominające zwłóknienie mięśnia sercowego. Pomiary porowatości morfometrycznej wykazały mniejszą jamę lewej komory i zagęszczenie beleczkowate w modelach LAL.
Przy HH 25 modelu LAL zaobserwowano powiększoną jamę prawej komory, zmienioną architekturę beleczkowania i objętość mięśnia sercowego. Obrazowanie modeli LAL za pomocą optycznej koherentnej tomografii wykazało znaczne zmniejszenie wielkości i średnicy lewej komory w porównaniu z kontrolą. Grupy LAL wykazały również wzrost grubości ścianek w porównaniu z grupami kontrolnymi przy HH 25.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół wizualny wykonania modelu ligacji lewego przedsionka (LAL) u embrionów ptaków, który naśladuje zespół hipoplazji lewej komory serca poprzez zmianę przepływu wewnątrzsercowego oraz obciążenia naprężeniem ścinającym ścian own.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biomechanika układu sercowo-naczyniowego
- Embriologia ptaków
- Bioinżynieria chirurgiczna
Wstęp
- Model LAL jest wykorzystywany do badania wpływu zmienionego przepływu krwi na rozwój serca.
- Zrozumienie mechanizmów biomechanicznych jest kluczowe dla przeniesienia wyników badań na interwencje sercowo-naczyniowe u ludzi.
- W poprzednich badaniach wykorzystano techniki obrazowania i modelowania do analizy odkształceń mięśnia sercowego.
- W niniejszym protokole omówiono wyzwania związane z technikami mikrochirurgicznymi.
Cel badania
- Aby zapewnić kompleksowy przewodnik przeprowadzania modelu LAL w embrionach ptaków.
- Aby zbadać związek między morfologią naczyniową a obciążeniem mechanicznym.
- Aby usprawnić techniki chirurgiczne w badaniach z zakresu bioinżynierii.
Zastosowane metody
- Protokół wizualny podwiązania lewego przedsionka w embrionach ptaków.
- Modelowanie metodą elementów skończonych na podstawie obrazowania.
- Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek.
- Ocena odkształceń mięśnia sercowego po operacji.
Główne wyniki
- Wykazano wpływ LAL na rozmiar jamy lewej komory.
- Zidentyfikowano efekty kompresji w zagłębieniach beleczkowych.
- Przedstawiono wnioski dotyczące zmian odkształcenia mięśnia sercowego po interwencji.
- Przyczyniono się do zrozumienia śmiertelnych interwencji sercowo-naczyniowych u ludzi.
Wnioski
- Model LAL jest cennym narzędziem do badania rozwoju serca.
- Otrzymane wyniki mogą wpłynąć na podejście kliniczne do wrodzonych wad serca.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych spostrzeżeniach w celu poprawy wyników chirurgicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Model zarodka ptaka z podwiązaniem lewego przedsionka (LAL) umożliwia precyzyjną manipulację obciążeniem hemodynamicznym w celu badania wczesnego rozwoju układu sercowo-naczyniowego oraz mechanizmów powstawania chorób. Model ten stanowi kontrolowany system do mechanistycznej oceny ryzyka i walidacji celów w badaniach nad wrodzonymi wadami serca, zwiększając wiarygodność prognostyczną na etapie odkrywania i w fazie przedklinicznej. Jego znaczenie translacyjne podkreśla zdolność do naśladowania zespołu hipoplazji lewego serca (HLHS), krytycznej ludzkiej wady wrodzonej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia analizę mechanistyczną morfogenezy serca w zmienionych warunkach hemodynamicznych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów dla genów i szlaków zaangażowanych w patogenezę HLHS.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez powiązanie zaburzeń mechanicznych z efektami molekularnymi i strukturalnymi.
- Zapewnia platformę pozwalającą na uzyskanie pewności prognostycznej w początkowej fazie wyboru celów sercowo-naczyniowych.
Przesiew i opracowanie testu
- Generuje zaburzone źródła komórkowe i tkankowe do późniejszych analiz z zakresu hodowli tkanek i biologii naczyniowej.
- Wspiera standaryzację testów poprzez zapewnienie powtarzalnych i mierzalnych odczytów morfologicznych i molekularnych.
- Umożliwia ilościową ocenę kompakcji komory oraz architektury beleczkowej w celu przesiewowego badania potencjalnych interwencji.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do skalowalnych analiz obrazowych oraz workflow opartych na omice.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelowaniem HLHS w kontekście patologii w celu odkrycia translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych do przedklinicznej walidacji hipotez terapeutycznych.
- Wspiera decyzje o rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez modelowanie klinicznie istotnych fenotypów serca.
- Umożliwia predykcyjne ograniczanie ryzyka w odniesieniu do kandydackich interwencji w kontrolowanym systemie embrionalnym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model LAL wpisuje się w kontinuum od odkryć do fazy przedklinicznej, umożliwiając manipulacje biomechaniką serca w oparciu o postawione hipotezy oraz następczą analizę molekularną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wpływu zmienionego przepływu i ciśnienia na rozwój serca.
- Przesiew: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki morfologiczne i molekularne dla rozwoju testów.
- Analityka: Dostarcza mierzalne punkty końcowe, takie jak wielkość komory, grubość ścian oraz struktura beleczkowata, do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Modeluje fenotypy istotne dla chorób w celu dopasowania biomarkerów i zapewnienia ciągłości przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku dla badań mechanistycznych i walidacji celów w ramach różnych programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechaniczną w walidacji celów sercowo-naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowane, powtarzalne i skalowalne manipulacje oraz analizy embrionalne.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne kapitałowo sortowanie portfolio we wczesnej fazie B&R w obszarze sercowo-naczyniowym.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów i interwencji istotnych w kontekście danej choroby.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga zaawansowanej wiedzy z zakresu mikrochirurgii oraz znajomości embriologii ptaków.
- Wymaga dostępu do obrazowania o wysokiej rozdzielczości oraz infrastruktury do ilościowej analizy morfometrycznej.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Może wymagać adaptacji do zastosowania w alternatywnych systemach modelowych lub dla określonych punktów końcowych analizy molekularnej.
- Wydajność próbek oraz stopień złożoności technicznej mogą ograniczać przepustowość i skalowalność w przypadku przesiewów na dużą skalę.
