Ustanowienie mieszanych kultur komórek neuronalnych i glejowych z embrionalnych mózgów myszy w celu zbadania infekcji i odporności wrodzonej
30 czerwca 2023
Ten protokół prezentuje unikalny sposób generowania kultur komórkowych ośrodkowego układu nerwowego z embrionalnych mózgów myszy w 17. dniu do badań neuro(immunologicznych). Model ten można analizować przy użyciu różnych technik eksperymentalnych, w tym RT-qPCR, mikroskopii, ELISA i cytometrii przepływowej.
Ostatecznym pytaniem badawczym mojego projektu jest ustalenie, w jaki sposób możemy manipulować wrodzonymi odpowiedziami immunologicznymi ośrodkowego układu nerwowego w celu ochrony przed infekcjami wirusowymi. Obecnie badamy ich odpowiedź na głęboko przeciwwirusowe białko, interferon beta. Wyzwaniem eksperymentalnym jest wygenerowanie wystarczającej liczby komórek, aby umożliwić szczegółowe badania.
Każdy wynik musi zostać zweryfikowany przy użyciu wielu technik, a to niestety może skutkować ubojem wielu zwierząt. Ze względu na dużą liczbę komórek generowanych przez tę nowatorską technikę hodowli, można zbadać wiele różnych warunków eksperymentalnych na jednej ciężarnej myszy. Ponadto stosowanie alternatywnych metod in vitro tam, gdzie to możliwe, również znacznie zmniejsza cierpienie zwierząt.
Metoda ta zmniejsza i udoskonala wykorzystanie zwierząt ściśle zgodnie z zasadami trzech R. Ta metoda hodowli może być stosowana do rozwiązywania wielu różnych pytań badawczych przy użyciu różnych metod odczytu, takich jak Eliza, QPCR, mikroskopia i cytometria przepływowa. Technika ta może pomóc innym badaczom w ograniczeniu i udoskonaleniu ich wykorzystania przez zwierzęta. Mamy nadzieję, że uda nam się lepiej zrozumieć wrodzoną odpowiedź przeciwwirusową, modulując ją w celu ochrony przed oportunistycznymi wirusami, takimi jak ludzki poliomawirus drugi lub wirus Johna Cunninghama, jak powszechnie wiadomo, główny czynnik PML, który może być poważnym skutkiem ubocznym leków immunosupresyjnych stosowanych w leczeniu stwardnienia rozsianego i innych chorób.
Zacznij od umieszczenia złożonej w ofierze ciężarnej myszy na grzbiecie na desce sekcyjnej. Za pomocą kleszczy uszczypnij linię środkową brzucha. Za pomocą ostrych nożyczek przetnij brzuch przez skórę i otrzewną od genitaliów do klatki piersiowej nad linią środkową.
Usuń macicę zawierającą zarodki i natychmiast umieść ją na lodzie. Ostrożnie przetnij worek z żółtkiem po bokach łożyska i usuń zarodki. Następnie umieść odcięte głowy embrionów w mrożonym naczyniu zawierającym HBSS z niedoborem wapnia i magnezu.
Umieść głowę w 35-milimetrowym naczyniu skierowanym w lewo. Przebij jedno oko krawędzią kleszczy, mocno trzymając podbródek drugim. Delikatnie oderwij skórę głowy od karku wzdłuż linii środkowej w kierunku pyska.
Użyj ustawionych pod kątem kleszczy, aby przejść przez biały owalny rdzeń kręgowy i rozłup czaszkę wzdłuż linii środkowej, odsłaniając mózg. Delikatnie oderwij czaszkę od boków. Następnie wyjmij mózg z czaszki i pozbądź się czaszki.
Użyj kleszczy, aby usunąć opony mózgowe. Umieść mózgi w biżu zawierającym dwa mililitry HBSS z niedoborem wapnia i magnezu. Dodaj 250 mikrolitrów 10 razy trypsyny do bijou.
Rozetrzeć mózgi, potrząsając bijou, a następnie inkubować je przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj dwa mililitry inhibitora trypsyny sojowej do każdego bijou. Wstrząśnij, aby równomiernie rozprowadzić inhibitor.
Bez wirowania przenieś dwa mililitry supernatantu z każdego białka do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Używając igły o rozmiarze 19 dołączonej do pięciomililitrowej strzykawki, odessać zawiesinę dwukrotnie, aby rozdzielić pozostałe komórki w biżuterii. Powtórzyć aspirację dwukrotnie za pomocą igły o rozmiarze 21.
Za pomocą igły 23G przenieś komórki z bijou do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej supernatant komórek. I wirować w temperaturze 200G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą pięciomilimetrowej pipety serologicznej przenieś cały supernatant do nowej 15-mililitrowej probówki wirówkowej, nie naruszając osadu.
Powtórzyć wirowanie. Dodaj 10 mililitrów pożywki galwanicznej do probówki zawierającej połączone granulki z obu etapów wirowania. I dobrze wymieszaj, aby utworzyć całą zawiesinę.
Zabarwić komórki błękitem trypanowym i policzyć za pomocą hemocytometru lub licznika komórek. Płytkie komórki należy poszczepić, dodając wymaganą objętość zawiesiny embrionalnej komórki mózgowej myszy E17 do płytki studzienki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod pięcioma do 7% dwutlenku węgla przez dwie do czterech godzin.
Po usunięciu pożywki dodaj nowe podłoża różnicujące do każdej studzienki. Dociśnij wszelkie pływające szkiełka nakrywkowe za pomocą sterylnej końcówki pipety. Utrzymuj kultury, usuwając część supernatantu i zastępując go świeżymi pożywkami różnicującymi trzy razy w tygodniu.
Hodowle wizualizowano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego dla NG2 i nestyny jako markerów rozwojowych, SMI31, MBP i NeuN jako markerów neuronalnych oraz CNP, GFAP i Iba1 jako markerów glejowych. Zakażenie kultur neurotropowym wirusem lasu Semliki wpłynęło na oligodendrocyty i neurony. Badania qRT-PCR zakażonych komórek wykazały regulację w górę chemotaktycznego cytokiny Ccl5 mRNA w hodowlach traktowanych interferonem beta.
Badania ELISA wykazały zwiększoną Ccl5 w supernatancie, wykazując w ten sposób korelację między mRNA a ekspresją białka. Badania cytometryczne zawiesiny pojedynczej komórki wykazały, że 70% komórek pozostało zdolnych do życia. Obecna była duża liczba mikrogleju, neuronów i astrocytów, podczas gdy oligodendrocyty były najliczniejsze.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nową metodę generowania kultur komórek ośrodkowego układu nerwowego z mózgów myszy w 17. dniu embrionalnym, mającą na celu zrozumienie wrodzonych odpowiedzi immunologicznych na infekcje wirusowe. Platforma ta umożliwia szczegółowe analizy przy użyciu technik eksperymentalnych, takich jak RT-qPCR, mikroskopia, ELISA i cytometria przepływowa, co w ostateczności ma pomóc w ograniczeniu wykorzystania zwierząt w badaniach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuro(immuno)logia
- Techniki hodowli komórkowej
- Badania nad infekcjami wirusowymi
Wprowadzenie
- Badanie koncentruje się na manipulowaniu wrodzonymi odpowiedziami immunologicznymi ośrodkowego układu nerwowego.
- Eksploruje ono działanie interferonu beta, silnego białka przeciwwirusowego.
- Tradycyjne metody hodowli komórkowych często prowadzą do uboju zwierząt.
- Ta nowatorska technika pozwala na bardziej efektywne generowanie komórek, ograniczając cierpienie zwierząt.
Cel badania
- Zbadanie sposobów ochrony ośrodkowego układu nerwowego przed infekcjami wirusowymi.
- Ocena wielu warunków eksperymentalnych u jednej myszy.
- Poprawa zrozumienia wrodzonej odpowiedzi przeciwwirusowej w kontekście chorób takich jak stwardnienie rozsiane.
Zastosowane metody
- Kultury komórkowe wyhodowano z mózgów myszy w 17. dniu embrionalnym.
- W celu walidacji wyników komórki analizowano za pomocą RT-qPCR, mikroskopii, testu ELISA oraz cytometrii przepływowej.
- Przestrzegano szczegółowych procedur pozyskiwania i hodowania komórek, w tym konkretnych odczynników i etapów inkubacji.
- Kluczowe markery wykorzystane do analizy to NG2, nestin, SMI31, MBP, NeuN, CNP, GFAP i Iba1.
Główne wyniki
- Metoda pozwoliła na uzyskanie wystarczającej liczby żywych komórek do przeprowadzenia kompleksowej analizy.
- Badania wykazały nadekspresję mRNA Ccl5 oraz jej korelację z ekspresją białka.
- Odnotowano obecność zróżnicowanych mikroglejów, neuronów i astrocytów, co potwierdza efektywność zastosowanej metody.
- Cytometria przepływowa wykazała, że 70% komórek zachowało żywotność po hodowli.
Wnioski
- Niniejsze badanie prezentuje udoskonaloną metodę tworzenia kultur komórek OUN, co pozwala na ograniczenie zależności od modeli zwierzęcych.
- Metoda ta wnosi istotny wkład w badania neuro(immuno)logiczne, w szczególności w zrozumienie odpowiedzi wirusowych.
- Wyniki mają znaczenie dla lepszego modelowania chorób oraz pogłębienia wiedzy na temat mechanizmów ochrony OUN.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mieszane hodowle neuronów i gleju z embrionalnych mózgów myszy stanowią skalowalny i powtarzalny system in vitro do badania mechanizmów infekcji oraz odporności wrodzonej OUN. Platforma ta umożliwia wielomodalną analizę o wysokiej zawartości danych przy jednoczesnym ograniczeniu liczby wykorzystywanych zwierząt, co zwiększa wiarygodność predykcyjną we wczesnej fazie odkryć neuroimmunologicznych. Metoda ta podnosi efektywność portfela badań poprzez umożliwienie zastosowania wielu warunków eksperymentalnych z jednego źródła zwierzęcego, co ułatwia rzetelną walidację celów i minimalizację ryzyka mechanistycznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie wrodzonych odpowiedzi odpornościowych na infekcję wirusową w fizjologicznie istotnym kontekście OUN.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów przeciwwirusowych, takich jak szlaki interferonu beta.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez modelowanie interakcji neuron-gleja oraz odpowiedzi cytokinowych.
- Zapewnia platformę do eksploracji infekcji i odporności OUN w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Generuje odpowiednią liczbę komórek do wysokoprzepustowych badań przesiewowych oraz opracowywania analiz multipleksowych.
- Umożliwia ilościowe odczyty za pomocą RT-qPCR, ELISA, mikroskopii oraz cytometrii przepływowej.
- Pozwala na standaryzację i powtarzalność testów w wielu różnych warunkach eksperymentalnych.
- Przygotowuje zwalidowane systemy istotne dla OUN do oceny związków i analizy szlaków sygnałowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Modeluje istotne dla przebiegu choroby populacje komórek OUN oraz ich interakcje na potrzeby translacyjnych badań nad biomarkerami.
- Zgodniuje wyniki in vitro z przedklinicznymi punktami końcowymi w zakresie infekcji i odporności.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój programów neuroimmunologicznych poprzez dostarczanie predykcyjnych danych in vitro.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od etapu wczesnego odkrywania po walidację przedkliniczną w badaniach nad infekcjami OUN.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta metoda hodowli mieszanej stanowi pomost między wczesnym odkrywaniem, walidacją celów a badaniami przedklinicznymi w obszarze neuroimmunologii oraz w procesach badawczych nad infekcjami OUN.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących modulacji odporności wrodzonej i odpowiedzi przeciwwirusowych w systemach istotnych dla OUN.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, skalowalne hodowle do opracowywania ilościowych, wielomodalnych testów.
- Analityka: Dostarcza wiarygodne pomiary ekspresji cytokin, żywotności komórek i profili markerów do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie wyników in vitro do biomarkerów istotnych dla choroby i punktów końcowych badań przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Oferuje wielokrotnego użytku, zestandaryzowaną platformę dla różnorodnych pytań badawczych dotyczących infekcji OUN i odporności.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad infekcjami OUN.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów hodowli komórkowych OUN.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową dzięki umożliwieniu prowadzenia badań wielowariantowych z jednego źródła zwierzęcego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów z zakresu neuroimmunologii i infekcji OUN.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie sekcji embrionalnej, hodowli komórek OUN oraz wielomodalnych technik analitycznych.
- Wymaga dostępu do aparatury do mikroskopii, cytometrii przepływowej, RT-qPCR oraz testów ELISA.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności przygotowania hodowli i analizy.
- Adaptacja do innych modeli OUN lub gatunków może wymagać optymalizacji protokołu.
- Ograniczenia metody in vitro obejmują częściowe odzwierciedlenie złożoności in vivo oraz kwestie etyczne związane z wykorzystaniem tkanki embrionalnej.
