Protokół testu ścinania w celu określenia właściwości materiału jednokomórkowego

Fizyczne cechy raka są stosunkowo nowymi i ekscytującymi tematami w badaniach nad rakiem. Nasze badania mają na celu szczegółowe scharakteryzowanie właściwości mechanicznych zarówno komórek rakowych, jak i nienowotworowych, aby lepiej zrozumieć mechanizmy fizyczne, dzięki którym komórki rakowe przeżywają siły ścinające w organizmie i atakują układ odpornościowy. Najnowszym osiągnięciem w mojej dziedzinie badań jest zastosowanie urządzeń mikroprzepływowych i technik wysokoprzepustowych.

Tak więc, w badaniu, na większą skalę, odkształcalność komórek i lepkosprężyste właściwości komórek, a także w identyfikacji nowych biomarkerów, takich jak regulacja białek cytoszkieletu i białek macierzy zewnątrzkomórkowej we wczesnej diagnostyce raka. Obecne wyzwania eksperymentalne związane z tą dziedziną to złożoność mikrośrodowiska guza, skala i przepustowość, translacja kliniczna, standaryzacja i odtwarzalność oraz integracja danych multimodalnych. Tak więc, niektóre z istotnych odkryć, które ustaliłem w tej dziedzinie, z moich poprzednich badań i z moich obecnych badań, to to, że komórki rakowe można odróżnić od normalnych komórek, na podstawie ich reakcji na naprężenia mechaniczne, a stopień, w jakim odporność na naprężenia mechaniczne zależy od integralności strukturalnej, która jest podyktowana w rozsądnym stopniu przez obecność białek cytoszkieletu, takich jak nitkowata aktyna. i inne białka strukturalne w komórce.

Nasz protokół oferuje proste, powtarzalne i nieniszczące podejście do mechanicznego charakteryzowania hodowanych komórek. Jest to przeciwieństwo innych technik, takich jak AFM i pęseta optyczna, które wymagają pewnego poziomu wiedzy technicznej w celu przeprowadzenia eksperymentu, przy stosunkowo niskiej przepustowości. Dzięki zastosowaniu techniki testu ścinania znacznie rozwiniemy charakterystykę mechaniczną pojedynczych komórek, a także pomożemy w wielu różnych obszarach przekrojowych, takich jak diagnostyka chorób rzadkich, spersonalizowana diagnoza i opieka oraz monitorowanie interakcji leków jednokomórkowych.

Rozpocznij protokół od przygotowania lepkiego podłoża do badania ścinania. W tym celu należy podgrzać podstawowe podłoże hodowlane przez około 10 do 20 minut w temperaturze od 60 do 70 stopni Celsjusza za pomocą mieszadła magnetycznego lub płyty grzejnej. Ciągle mieszając pożywkę, delikatnie dodaj do niej metylocelulozę, aby pomóc cząsteczkom komórek metylowych szybko się rozproszyć bez koagulacji.

Pozwól temu procesowi kontynuować się przez około 15 do 24 godzin, aby zapewnić klarowną, jednorodną mieszankę podłoża i celulozy. Aby ustawić aparat ścinający, przymocuj gumową uszczelkę do ścieżki przepływu, aby zamocować połączenie między komorą przepływową a szalką Petriego i zapewnić kontrolowany równomierny przepływ pojedynczych komórek. Gumowa uszczelka występuje w różnych rozmiarach w zależności od chęci przepływu, profilu i obszaru obserwacji.

Następnie skonfiguruj system prób ścinania składający się z podwójnych strzykawek o pojemności 60 lub 100 mililitrów podłączonych do programowalnej pompy strzykawkowej do infuzji i pobierania lepkiej pożywki hodowlanej. Napełnić strzykawkę preparatywnym lepkim podłożem przepływowym i przymocować napełnioną strzykawkę w odpowiednim miejscu na pompie strzykawkowej. Następnie podłączyć pustą strzykawkę do drugiego miejsca strzykawki na pompie strzykawkowej.

Za pomocą jednego 16-calowego przewodu i łączników przewodów podłącz obie strzykawki do komory przepływowej. Zaprogramuj pompę tak, aby zaparzała i pobierała określoną objętość płynu z określoną szybkością i wybierz odpowiednie strzykawki. Na ekranie wyświetlany jest przykładowy program.

Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z płytki Petriego, aby przygotować się do ścinania. Następnie włóż i zamocuj komorę przepływową z gumową uszczelką na szalce Petriego zawierającej dołączone komórki. Umieść dopasowaną komorę przepływu mikroprzepływowego z komórkami w naczyniu na odwróconym mikroskopie podłączonym do monitora wyświetlacza.

Konfiguracja jest teraz gotowa do przyłożenia naprężenia ścinającego płynu do pojedynczej komórki i optycznego monitorowania powstałego odkształcenia komórkowego. Aby wykonać protokół testu ścinania jednokomórkowego, należy użyć wstępnie zmontowanego zestawu aparatu ścinającego składającego się z dopasowanej mikroprzepływowej komory przepływowej umieszczonej na szalce Petriego zawierającej interesujące komórki. Umieść cały zestaw na odwróconym mikroskopie z wystarczająco wysokim obiektywem i monitorem.

Ustaw ostrość obiektywu mikroskopu, zapewniając odpowiedni kontrast i wyraźne krawędzie komórek. Przesuń stolik mikroskopu, aby upewnić się, że komórki są wyraźnie widoczne na monitorze wyświetlacza i są obrazami na żywo. Wybrać jedną komórkę lub wiele odrębnych komórek w obrębie ścieżki obrazowania lub przepływu dopasowanej komory przepływowej i płytki Petriego.

Aby utrzymać ciągły, równomierny przepływ lepkich pożyw, wybierz podobne szybkości infuzji i odstawienia. Zapewnić prawidłowy przepływ laminarny płynu o liczbie Reynoldsa lub Re mniejszej niż 100. Kliknij przycisk Uruchom na pompie ścinającej, aby wstrzykiwać i odbierać płyn ścinający w sposób ciągły.

Upewnij się, że podczas wlewu płynów nie ma pęcherzyków powietrza. Rozpocznij nagrywanie wideo, klikając przycisk Nagraj w oprogramowaniu, zanim podany płyn ścinający wejdzie w kontakt z komórką zainteresowania pod mikroskopem. Kontynuuj nagrywanie przez siedem minut lub przez żądany czas ekspozycji na stres lub do momentu, gdy komórka będąca przedmiotem zainteresowania odetnie się od dna naczynia.

Kliknij przycisk Zatrzymaj nagrywanie w oprogramowaniu mikroskopu, gdy przebieg zostanie zakończony zgodnie z potrzebami. Oprogramowanie automatycznie zapisuje zdjęcia i filmy, które można zebrać za pomocą dysków flash w celu dalszej analizy. Wyodrębnij obrazy jako pliki TIFF, najlepiej z prędkością jednej klatki na sekundę w celu łatwej analizy.

Aby przeprowadzić cyfrową korelację obrazów lub DIC za pomocą oprogramowania DIC, należy zaimportować obrazy pochodzące z zapisu testu ścinania do oprogramowania DIC, najlepiej w formacie pliku TIFF. Aby uzyskać zoptymalizowaną korelację, wybierz opcję sumy różniczkowej, która śledzi deformację nowego obrazu w stosunku do ostatniego obrazu. Wybierz podzbiór o rozmiarze 31 x 31 pikseli i rozmiarze kroku 20 pikseli.

Odwzorowuj obszar zainteresowania dla wybranej pojedynczej komórki. W przypadku nieregularnego kształtu, takiego jak komórka, użyj maski wielokąta, aby odwzorować geometrię komórki. Wybierz dowolne punkty w odwzorowanej komórce, aby śledzić deformację.

Po zmapowaniu wybierz określone punkty w komórce, takie jak jądro lub cytoplazma, które mają być analizowane, klikając przycisk Dodaj tensometr i rysując poszczególne czujniki tensometryczne w punktach w zdefiniowanej granicy komórki. Kliknij Start, aby rozpocząć przetwarzanie szczepu i uzyskać dane dotyczące odkształcenia w funkcji czasu. Wykres czasu odkształcenia wygenerowany w wyniku tej korelacji można wyeksportować jako plik CSV do dalszej analizy w MATLAB.

Kliknij dwukrotnie lub kliknij prawym przyciskiem myszy wygenerowany wykres czasu odkształcenia i wybierz opcję Eksportuj dane. DIC klatek obrazu wyodrębnionych z zapisów testu ścinania z powodzeniem wygenerował dane dotyczące czasu odkształcenia zgodne z reakcją naprężenia pełzania. Wyniki badań z wykorzystaniem techniki próby ścinania wykazały, że komórki nowotworowe były na ogół bardziej podatne mechanicznie i mniej lepkie niż normalne komórki.

Zaobserwowano, że sztywność i lepkość komórek zmniejszają się wraz ze zwiększoną progresją raka od normalnego stanu komórki do stanu lekko przerzutowego, a ostatecznie do stanu silnie przerzutowego. Jednak czas relaksacji dla tych typów komórek nie wykazał znaczących zmian.