Name: Protokół testu ścinania w celu określenia właściwości materiału jednokomórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj metodę testu ścinania do kwantyfikacji właściwości mechanicznych komórek nowotworowych i zdrowych przy użyciu mikroprzepływowych urządzeń. Ta technika umożliwia identyfikację nowych biomarkerów dla wczesnej diagnostyki raka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują poprzednim badaczom z grupy Soboyejo z Worcester Polytechnic Institute, którzy jako pierwsi zapoczątkowali tę technikę: doktorom Yifang Cao, Jingjie Hu i Vanessie Uzonwanne. Prace te były wspierane przez National Cancer Institute (NIH/NCI K22 CA258410 do M.D.). Figury zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.

1. Przygotowanie do pojedynczo-komórkowego testu ścinania
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa
	<ol>
		<li>Wysiać około 50 000 zawieszonych pojedynczych komórek do szalki Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm zawierającej 2 mL pożywki hodowlanej. 
		UWAGA: Przed wysianiem zawiesinę komórek należy wymieszać w vortexie, aby rozbić agregaty komórkowe.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez okres od 10 do 48 h, aby umożliwić ich przywieranie do podłoża oraz całkowite sformowanie białek cytoszkieletu. 
		UWAGA: Należy uwzględnić czas przywierania komórek, a także tempo ich proliferacji i wzrostu, aby zapewnić odpowiedni wzrost i adhezję komórek przy jednoczesnym unikaniu ich agregacji. Parametry te różnią się w zależności od typu komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Eksperyment z testem ścinania
<ol>
	<li>Przygotowanie mediów o lepkim przepływie do testów ścinania
	<ol>
		<li>Aby zapewnić lekko lepki przepływ medium (0,015–0,02 Pa·s), należy odmierzyć i dodać do medium hodowlanego 0,05% wagowo nietoksycznej i niealergizującej metylocelulozy (4 Pa·s).</li>
		<li>Aby zapewnić homogeniczność mieszaniny, należy wstępnie podgrzewać podstawową pożywkę przez około 10–20 min w temperaturze około 60–70 °C za pomocą mieszadła magnetycznego z funkcją grzania. Podczas ciągłego mieszania medium należy ostrożnie dodawać metylocelulozę w taki sposób, aby szybko się rozproszyła, co zapobiegnie koagulacji cząsteczek metylocelulozy. Proces ten powinien trwać przez ok. 15–24 h, aby zapewnić otrzymanie klarownego roztworu medium z celulozą. 
		UWAGA: Należy unikać nadmiernego podgrzewania roztworu.</li>
		<li>Aby zmierzyć lepkość medium przepływowego, należy przetestować ok. 0,5–1 ml reprezentatywnej próbki medium przepływowego przy użyciu reometru. Na podstawie odczytu należy określić lepkość cieczy i wykorzystać tę wartość do określenia lepkości medium cieczy ścinającej (μ) w celu obliczenia naprężenia ścinającego za pomocą równania (2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja aparatury do ścinania
	<ol>
		<li>Przygotuj układ do badania ścinania składający się z dwóch strzykawek (60 ml lub 100 ml) podłączonych do programowalnej pompy strzykawkowej w celu infuzji i odsysania lepkich pożywek hodowlanych (Rycina 1).</li>
		<li>Podłącz obie strzykawki do komory przepływowej poprzez rurki o średnicy 1/16 cala oraz złączki do rurek.</li>
		<li>Zamocuj gumową uszczelkę, aby zapewnić kontrolowany, jednorodny przepływ nad pojedynczymi komórkami wzdłuż drogi przepływu (Rysunek 1). Gumowa uszczelka występuje w różnych rozmiarach, w zależności od profilu przepływu, który ma zostać osiągnięty (laminarny lub turbulentny), oraz pożądanego obszaru obserwacji (np. długość 22,5 mm, szerokość 2,5 mm i wysokość 0,254 mm) (Rycina 1).</li>
		<li>Zaprogramuj pompę tak, aby podawała i pobierała określoną objętość cieczy (np. 60 ml) z określoną prędkością (np. 1 ml/min) i wybierz odpowiednie strzykawki (np. 60 ml). 
		UWAGA: Należy uwzględnić fabryczne ustawienia maksymalnej objętości infuzji i aspiracji, aby uniknąć zablokowania lub awarii urządzenia. Należy zastosować równanie (2) do obliczenia wymaganej szybkości ścinania pompy (przy założeniu, że znane są wymagane naprężenie i lepkość).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie do wstępnego ścinania
	<ol>
		<li>Napełnić strzykawkę przygotowanym lepkim medium przepływowym.</li>
		<li>Przymocuj strzykawkę wypełnioną 60 lub 100 ml (lub zgodnie z potrzebami) lepkiego medium przepływowego oraz pustą strzykawkę o pojemności 60 ml w odpowiednich miejscach na programowalnej pompie strzykawkowej. Poprzez za pomocą rurek i złączy do rurek połącz obie strzykawki z komorą przepływową.</li>
		<li>Aby zapewnić łatwą identyfikację pojedynczych komórek oraz szczelne połączenie komory przepływowej z szalką Petriego, należy przymocować uszczelkę gumową do komory przepływowej.</li>
		<li>Odssać pożywkę hodowlaną z szalki Petriego zawierającej analizowane komórki.</li>
		<li>Wypłucz martwe komórki oraz komórki słabo przylegające, używając soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).</li>
		<li>Odssać PBS.</li>
		<li>Wstawić i zamocować komorę przepływową oraz gumową uszczelkę (~34 mm x 9 mm) na szalce Petriego (35 mm x 10 mm) zawierającej przytwierdzone komórki.</li>
		<li>Umieść dopasowaną mikrofluidyczną komorę przepływową z komórkami na szalce hodowlanej na mikroskopie odwróconym, ustawiając obiektyw mikroskopu na wysokości pozwalającej na uzyskanie wysokiej jakości obrazów o wysokich wartościach pikseli (zazwyczaj między 40x i 63x powiększenie) oraz monitor wyświetlacza.</li>
		<li>Wybierz obraz na żywo (time-lapse w wybranym oprogramowaniu) z oprogramowania mikroskopu na monitorze. Należy upewnić się, że oprogramowanie mikroskopu na komputerze PC posiada funkcję t (time-lapse) lub umożliwia rejestrację wideo.</li>
		<li>Ustaw ostrość obiektywu mikroskopu, zapewniając odpowiedni kontrast i wyraźne krawędzie komórek. Jest to niezbędne do przeprowadzenia analizy obrazu po przyłożeniu sił ścinających. Przesuń stolik mikroskopu tak, aby komórki były wyraźnie widoczne na monitorze i stanowiły obrazy z żywych komórek.</li>
		<li>Wybierz jedną komórkę lub kilka oddzielnych komórek w obrębie ścieżki obrazowania/przepływu zamontowanej komory przepływowej i szalki Petriego (obszaru/ścieżki powstałego w wyniku dopasowania uszczelki do komory przepływowej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ścinanie i obrazowanie
	<ol>
		<li>Aby utrzymać ciągły i jednolity przepływ, należy dobrać zbliżone prędkości infuzji i odpływu oraz zapewnić laminarny przepływ cieczy, zazwyczaj w przedziale między 1 ml/min i 5 ml/minW przypadku niskich reżimów przepływu laminarnego należy zapewnić liczbę Reynoldsa wynoszącą Re &lt; 100.</li>
		<li>Kliknij w Uruchom użyj pompy ścinającej do wstrzykiwania i odciągania cieczy ścinającej (przygotowanego medium lepkiego) ze stałą prędkością. Upewnij się, że podczas infuzji cieczy nie powstają pęcherzyki powietrza, ponieważ mogłoby to wprowadzić niekontrolowane zewnętrzne naprężenia działające na komórki.</li>
		<li>Rozpocznij nagrywanie wideo, klikając rejestruj w oprogramowaniu mikroskopu, zanim wprowadzony płyn ścinający dotknie badanych komórek pod mikroskopem.</li>
		<li>Kontynuuj rejestrację przez 7 min, przez pożądany czas ekspozycji na stres lub do momentu, aż interesująca nas komórka (lub komórki) oderwie się od dna naczynia. Kliknij zatrzymaj nagrywanie w oprogramowaniu mikroskopu po zakończeniu pomiaru zgodnie z oczekiwaniami.</li>
		<li>Zapisz nagranie i wyeksportuj jako pliki .tiffZaleca się wyodrębnianie obrazów w 1 klatka na sekundę do łatwej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Procedura cyfrowej korelacji obrazów (analiza obrazu)
	<ol>
		<li>Jeśli nagranie z mikroskopu zostało wyeksportowane jako plik wideo, należy przekonwertować je na klatki obrazu (preferowany format plików .tiff).</li>
		<li>Zaimportuj obrazy pochodzące z nagrania testu ścinania do oprogramowania Davis 10.1.2 (oprogramowanie DIC), aby śledzić ruch naturalnie wzorowanych struktur komórki poprzez lokalizowanie każdego bloku pikseli (podzbioru) obrazu referencyjnego w odpowiednich nowych obrazach (obrazach odkształconych) (Rycina 2).</li>
		<li>W celu optymalizacji korelacji należy zastosować rozmiar podzbioru 31 x 31 pikseli, wielkość kroku (odległość odkształcenia każdego podzbioru) 20 pikseli oraz opcję sum of the differential track, która śledzi odkształcenie nowego obrazu względem ostatniego obrazu. Wynikiem tej korelacji jest wykres odkształcenie-czas (Rycina 3), który można wyeksportować jako plik .csv do dalszej analizy w programie MATLAB.</li>
		<li>Wyznacz obszar zainteresowania dla wybranej pojedynczej komórki. Wybierz dowolne punkty w obrębie wyznaczonej komórki, aby śledzić odkształcenie. W przypadku nieregularnego kształtu, takiego jak komórka, użyj maski wielokąta (polygon mask), aby odwzorować geometrię komórki.</li>
		<li>Po wyznaczeniu obszaru wybierz konkretne punkty na komórce (jądro lub cytoplazma), które mają zostać poddane analizie, klikając add strain gauge i rysując poszczególne tensometry w punktach wewnątrz zdefiniowanej granicy komórkowej.</li>
		<li>Kliknij Run, aby rozpocząć przetwarzanie odkształceń i uzyskać dane odkształcenia w funkcji czasu.</li>
		<li>Kliknij dwukrotnie (lub prawym przyciskiem myszy) na wygenerowanym wykresie odkształcenie-czas i wybierz export data as a spreadsheet.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Charakterystyka właściwości mechanicznych
<ol>
	<li>Charakterystyka właściwości wiskoelastycznych
	<ol>
		<li>Zapisz plik .csv zawierający dane odkształcenia w czasie z oprogramowania DIC w osobnym folderze, aby ułatwić ich odczyt przez program MATLAB.</li>
		<li>Uruchom program MATLAB i kliknij kartę edytora (editor tab), aby otworzyć stronę edytora i napisać kod, który odczyta arkusz kalkulacyjny komórka po komórce.</li>
		<li>Zmień ścieżkę MATLAB (ścieżkę do folderu, w którym znajduje się interesujący plik), aby uzyskać dostęp do folderu zawierającego dane do analizy, na przykład Users/Username/Desktop/data.</li>
		<li>Na stronie edytora MATLAB uzyskaj dostęp do danych z arkusza kalkulacyjnego za pomocą dostosowanego kodu. Na przykład: a1= xlsread('data','run1','A4:A183'), gdzie a1 reprezentuje identyfikator, xlsread to funkcja MATLAB, która odczytuje plik .csv (w tym przypadku jako arkusz kalkulacyjny), data to nazwa pliku, run1 to nazwa arkusza, a A4:A183 to zakres interesujących danych w komórce A arkusza kalkulacyjnego do analizy. Aby uzyskać pełne dopasowanie, przeanalizuj x i y (odpowiednio czas i odkształcenie). Na przykład: 
		a1=xlsread('data','run1','A4:A183'); 
		b1=xlsread('data','run1','B4:B183'); 
		gdzie a1 = x (czas), a b1 = y (odkształcenie).</li>
		<li>W programie MATLAB kliknij Apps | Curve Fitter | Custom Equation. Usuń reprezentatywne niestandardowe równanie i wprowadź równanie modelu wiskoelastycznego [równanie (1)], gdzie ε reprezentuje zmienną x, a t reprezentuje zmienną y. 
		<img alt="Równanie podatności pełzania, wzór sprężystości; relaksacja naprężeń; mechaniczna analiza materiałów." src="/files/ftp_upload/65333/65333eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">     (1) 
		Tutaj ε reprezentuje odkształcenie, σ reprezentuje naprężenie ścinające, η1 reprezentuje lepkość, E reprezentuje sprężystość, t reprezentuje czas, a τ reprezentuje czas relaksacji, który określa maksymalny czas potrzebny komórce na powrót do pierwotnego kształtu po pierwotnej deformacji. Jest on wyrażony jako τ = <img alt="Symbol η₂/E we wzorze mechaniki płynów, związany z lepkością i sprężystością w analizie badawczej." src="/files/ftp_upload/65333/65333eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2">, gdzie η2 jest wtórnym członem lepkości dla drugiego tłumika (Rysunek 4).</li>
		<li>Przypisz nowe zmienne do parametrów wiskoelastycznych w interfejsie niestandardowego równania. (ε, η1, E, σ, t oraz τ = <img alt="Symbol η₂/E we wzorze mechaniki płynów, związany z lepkością i sprężystością w analizie badawczej." src="/files/ftp_upload/65333/65333eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2">) będą reprezentować odpowiednio (x, a, b, K, y oraz c). Tutaj x i y są odpowiednio zmienną niezależną i zależną. Naprężenie ścinające (σ) można wyznaczyć za pomocą równania (2): 
		<img alt="Wzór równowagi statycznej, σ=6μQ/wh², przedstawiający koncepcję obliczania naprężeń." src="/files/ftp_upload/65333/65333eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3">     (2) 
		Tutaj μ reprezentuje lepkość ścinanego ośrodka płynnego, Q to natężenie przepływu pompy, a w i h to odpowiednio szerokość i wysokość kanału przepływowego przedstawionego na Rysunku 1C.</li>
		<li>Kliknij Select Data, aby wybrać Czas (a1) i Odkształcenie (b1) dla każdego zestawu danych.</li>
		<li>Upewnij się, że opcja Auto Fit jest zaznaczona. Dzięki temu dopasowanie zostanie wykonane automatycznie po wybraniu danych (x i y).</li>
		<li>Wybierz metody dopasowania, aby zawęzić warunki brzegowe. Kliknij Advanced Options w kategorii Methods i wybierz Nonlinear Least Squares. W sekcji Robust wybierz Off, a w sekcji Algorithm wybierz Trust-Region. Pozostałe parametry pozostaw bez zmian.</li>
		<li>Nowe zmienne po dopasowaniu (a, b i c) reprezentują odpowiednio właściwości wiskoelastyczne: lepkość, sprężystość i czas relaksacji (η1, E, EQUAT) komórki (Rysunek 5).</li>
		<li>Sprawdź, czy wartość współczynnika determinacji dopasowania jest wysoka (R2 &gt; 80%), aby upewnić się, że uzyskane dane można uznać za prawidłowe dopasowanie do modelu wiskoelastycznego (Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Enhancing Targeted Cancer Diagnosis by Quantifying Single-Cell Mechanics

<ol><li>Sethi, S., Ali, S., Philip, P. A., Sarkar, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+advances+in+molecular+biomarkers+for+cancer+diagnosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Clinical advances in molecular biomarkers for cancer diagnosis and therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14771-14784 (2013).</li>
<li>Runel, G., Lopez-Ramirez, N., Chlasta, J., Masse, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+properties+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Biomechanical properties of cancer cells.</a> Cells. 10 (4), 887(2021).</li>
<li>Hu, J., Zhou, Y., Obayemi, J. D., Du, J., Soboyejo, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+the+viscoelastic+properties+and+the+actin+cytoskeletal+structure+of+triple+negative+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">An investigation of the viscoelastic properties and the actin cytoskeletal structure of triple negative breast cancer cells.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 86, 1-13 (2018).</li>
<li>Onwudiwe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+creep+properties+and+the+cytoskeletal+structures+of+non-tumorigenic+breast+cells+and+triple-negative+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Investigation of creep properties and the cytoskeletal structures of non-tumorigenic breast cells and triple-negative breast cancer cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 110 (5), 1004-1020 (2022).</li>
<li>Ani, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear+assay+study+of+single+normal%2Fbreast+cancer+cell+deformation+and+detachment+from+poly-di-methyl-siloxane+%28PDMS%29+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">A shear assay study of single normal/breast cancer cell deformation and detachment from poly-di-methyl-siloxane (PDMS) surfaces.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 91, 76-90 (2019).</li>
<li>Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanics+and+biophysics+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Biomechanics and biophysics of cancer cells.</a> Acta Biomaterialia. 3 (4), 413-438 (2007).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+viscoelasticity+of+human+osteosarcoma+cells+using+a+shear+assay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Investigation of the viscoelasticity of human osteosarcoma cells using a shear assay method.</a> Journal of Materials Research. 21 (8), 1922-1930 (2006).</li>
<li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+measurement+of+human+osteosarcoma+cell+elastic+modulus+using+shear+assay+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science.+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">On the measurement of human osteosarcoma cell elastic modulus using shear assay experiments.</a> Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 18 (1), 103-109 (2007).</li>
<li>Onwudiwe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeletal+structure+and+the+statistical+variations+of+the+mechanical+properties+of+non-tumorigenic+breast+and+triple-negative+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeletal structure and the statistical variations of the mechanical properties of non-tumorigenic breast and triple-negative breast cancer cells.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 119, 104505(2021).</li>
<li>Kirmizis, D., Logothetidis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+probing+in+the+measurement+of+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy probing in the measurement of cell mechanics.</a> International Journal of Nanomedicine. 5, 137-145 (2010).</li>
<li>Haase, K., Pelling, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+cell+mechanics+with+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society.+Interface%22%5BJournal%5D)">Investigating cell mechanics with atomic force microscopy.</a> Journal of the Royal Society. Interface. 12 (104), 20140970(2015).</li>
<li>Zhang, H., Liu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+for+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society.+Interface%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers for single cells.</a> Journal of the Royal Society. Interface. 5 (24), 671-690 (2008).</li>
<li>Peterman, E. J. G., Gittes, F., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+heating+in+optical+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Laser-induced heating in optical traps.</a> Biophysical Journal. 84, 1308-1316 (2003).</li>
<li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of living cells.</a> Journal of Biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).</li>
<li>Evans, E., Yeung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparent+viscosity+and+corticcal+tension+of+blood+granulocytes+determined+by+micropipet+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Apparent viscosity and corticcal tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration.</a> Biophysical Journal. 56 (1), 151-160 (1989).</li>
<li>Van Vliet, K. J., Bao, G., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biomechanics+toolbox%3A+experimental+approaches+for+living+cells+and+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Materialia%22%5BJournal%5D)">The biomechanics toolbox: experimental approaches for living cells and biomolecules.</a> Acta Materialia. 51 (19), 5881-5905 (2003).</li>
<li>Moeendarbary, E., Harris, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+principles%2C+practices%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: principles, practices, and prospects.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).</li>
<li>Choi, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+shear+stress+promotes+epithelial-mesenchymal+transition+by+downregulating+ERK+and+GSK3beta+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic shear stress promotes epithelial-mesenchymal transition by downregulating ERK and GSK3beta activities.</a> Breast Cancer Research. 21 (1), 6(2019).</li>
<li>Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeling+stress%3A+The+mechanics+of+cancer+progression+and+aggression%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 17(2018).</li>
<li>Onwudiwe, K., Najera, J., Siri, S., Datta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+tumor+mechanical+stresses+promote+cancer+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Do tumor mechanical stresses promote cancer immune escape.</a> Cells. 11 (23), 3840(2022).</li>
<li>Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+interstitial+fluid+pressure+-+an+obstacle+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).</li>
<li>Krog, B. L., Henry, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanics+of+the+circulating+tumor+cell+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).</li>
<li>Moose, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+resist+mechanical+destruction+in+circulation+via+RhoA%2Factomyosin-dependent+mechano-adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation.</a> Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).</li>
<li>Mao, B. H., Nguyen Thi, K. M., Tang, M. J., Kamm, R. D., Tu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interface+stiffness+and+topographic+feature+dictate+interfacial+invasiveness+of+cancer+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">The interface stiffness and topographic feature dictate interfacial invasiveness of cancer spheroids.</a> Biofabrication. 15 (1), (2023).</li>
<li>Kashani, A. S., Packirisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+optimize+elasticity+for+efficient+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Cancer cells optimize elasticity for efficient migration.</a> Royal Society Open Science. 7 (10), 200747(2020).</li>
<li>Riehl, B. D., Kim, E., Bouzid, T., Lim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microenvironmental+cues+and+mechanical+loading+milieus+in+breast+cancer+cell+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The role of microenvironmental cues and mechanical loading milieus in breast cancer cell progression and metastasis.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 608526(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Metoda testu ścinania, która obejmuje stworzenie pseudo-mechanobiologicznego środowiska w celu symulacji interakcji komórek z otaczającym mikrośrodowiskiem mechanicznym i ich reakcji na naprężenia mechaniczne, stworzyła katalog właściwości mechanicznych komórek, których wzorce wskazują na zachowaną fizyczną atypię wśród linii komórek nowotworowych 3,4,5,7,8 . ...

Badanie różnic biofizycznych między komórkami nowotworowymi i nienowotworowymi pozwala na nowe możliwości diagnostyczne i terapeutyczne1. Zrozumienie, w jaki sposób różnice w biomechanice/mechanobiologii przyczyniają się do progresji guza i oporności na leczenie, ujawni nowe możliwości terapii celowanej i wczesnej diagnozy2.
Chociaż wiadomo, że właściwości mechaniczne komórek rakowych różnią się od normalnych komórek (np. lepkosprężystość błony plazmatycznej i otoczki jądrowej)3,4,5, brakuje solidnych i powtarzalnych metod pomiaru tych właściwości w żywych komórkach6. Metoda testu ścinania służy do ilościowego określenia właściwości mechanicznych komórek poprzez poddanie pojedynczych komórek działaniu płynnego naprężenia ścinającego i analizę ich indywidualnych reakcji i odporności na przyłożone naprężenie3,4,5,7,8,9. Chociaż do scharakteryzowania właściwości mechanicznych pojedynczych komórek zastosowano kilka metod i technik, mają one tendencję do wpływania na właściwości materiału komórkowego poprzez: i) perforację/uszkodzenie błony komórkowej z powodu głębokości wgłębienia, złożonej geometrii końcówki lub usztywnienia podłoża związanego z mikroskopią sił atomowych (AFM)10,11, ii) wywoływanie fotouszkodzeń komórek podczas pułapkowania optycznego12,13, lub iii) wywoływanie złożonych stanów naprężeń związanych z aspiracją mikropipet14,15. Te zewnętrzne efekty są związane ze znaczną niepewnością co do dokładności pomiarów lepkosprężystości komórek6,16,17.
Aby rozwiązać te ograniczenia, opisana tutaj metoda testu ścinania zapewnia wysoce kontrolowane i proste podejście do symulacji fizjologicznego przepływu w ciele bez wpływu na właściwości materiału komórkowego w tym procesie. Naprężenia ścinające płynów w tym teście reprezentują naprężenia mechaniczne doświadczane przez komórki w ciele przez płyny w śródmiąższu guza lub we krwi podczas krążenia18,19,20. Co więcej, te stresy płynne sprzyjają różnym złośliwym zachowaniom w komórkach nowotworowych, w tym progresji, migracji, przerzutom i śmierci komórki19,21,22,23, które różnią się między komórkami rakotwórczymi i nienowotworowymi. Co więcej, zmienione cechy mechaniczne komórek rakowych (tj. często są one "bardziej miękkie" niż normalne komórki znajdujące się w tym samym narządzie) pozwalają im przetrwać we wrogim mikrośrodowisku guza, atakować otaczające normalne tkanki i dawać przerzuty do odległych miejsc24,25,26. Tworząc pseudobiologiczne środowisko, w którym komórki doświadczają fizjologicznych poziomów naprężeń ścinających płyny, osiąga się proces, który jest fizjologicznie istotny i nie jest destrukcyjny dla komórki. Reakcje komórkowe na te przyłożone naprężenia ścinające płyn pozwalają nam scharakteryzować właściwości mechaniczne komórki.
Ten artykuł zawiera protokół testu ścinania do obszernego badania właściwości mechanicznych i zachowania komórek rakowych i nierakowych pod wpływem przyłożonego naprężenia ścinającego. Komórki reagują na siły zewnętrzne w sposób elastyczny i lepki, dlatego mogą być idealizowane jako materiał lepkosprężysty3. Technika ta dzieli się na: (i) hodowlę rozproszonych pojedynczych komórek, (ii) kontrolowane zastosowanie naprężeń ścinających płynu, (iii) obrazowanie in situ i obserwację zachowania komórek (w tym odporności na naprężenia i deformacje), (iv) analizę odkształceń komórek w celu określenia zakresu deformacji oraz (v) charakterystykę właściwości lepkosprężystych pojedynczych komórek. Badając te mechaniczne właściwości i zachowania, złożona mechanobiologia komórkowa może zostać wydestylowana do wymiernych danych. Protokół opisujący tę metodę pozwala na katalogowanie i porównywanie różnych typów komórek złośliwych i niezłośliwych. Kwantyfikacja tych różnic może pomóc w ustaleniu biomarkerów diagnostycznych i terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>CELL CULTURE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>,25% Trypsyna, 2,21 mM EDTA, 1x[-] wodorowęglan sodu</td><td>Corning</td><td>25-053-ci</td><td>Do oddzielania komórek od substratu w hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>15 ml Probówki wirówkowe</td><td>Falcon firmy Corning</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szalki Petriego</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki</td> <td>wirówkoweFalcon by Corning</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>dowolna</td><td></td><td>Do sterylnej hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Modyfikacja pożywki Eagle's Medium firmy Dulbecco (DMEM) 1x</td><td>Corning</td><td>10-013-cv</td><td>Lub dowolna inna pożywka do hodowli komórek. DMEM użyto do hodowli komórek U87</td></tr><tr><td>Rękawice</td><td>dowolne</td><td></td><td>Do sterylnej hodowli komórek</td></tr><tr><td>Heracell Vios 160i Inkubator CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>51033770</td><td>Do inkubacji podczas hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Kaptur</td><td>dowolny</td><td></td><td>Do sterylnej hodowli komórek</td></tr><tr><td>Mikropipeta</td><td>dowolna</td><td></td><td>Do sterylnej hodowli komórek</td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet</td><td>dowolny</td><td></td><td>Do sterylnych hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica/dowolny</td><td></td><td>Do sterylnych hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez wapnia i magnezu PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td>dowolny</td><td></td><td>Do sterylnych hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>dowolne</td><td></td><td>Do sterylnej hodowli komórek</td></tr><tr><td>Precyzyjny inkubator płynny GP 10</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>T25 Kolba</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>T75 Kolba</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td><mocny>SHEAR TEST</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mL zlewka</td><td>dowolna</td><td></td><td>Do tworzenia lepkiego podłoża ścinającego DMEM + metylocelulozy</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora przepływowa + uszczelka gumowa</td><td>Glycotech</td><td>31-001</td><td>Zestaw komory przepływowej okrągłej (do naczyń do hodowli tkankowych 35 mm)</td></tr><tr><td>Reometr hybrydowy</td><td>HR-2 Discovery Reometr</td><td></td> hybrydowy <td>Do oznaczania lepkości płynu ścinającego</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>dowolne</td><td></td><td>Do tworzenia lepkich mediów ścinających DMEM + metyloceluloza</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>dowolne</td><td></td><td>Do tworzenia DMEM + metyloceluloza lepkie media ścinające</td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>dowolna</td><td></td><td>Aby zwiększyć lepkość DMEM w mediach przepływowych</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>KD Scientific Geminin 88 plus</td><td>788088</td><td>Do programowania infuzji i pobierania płynów</td></tr><tr><td>Strzykawki, rurki i łączniki</td><td></td><td></td><td>Do konfiguracji aparatu ścinającego</td></tr><tr><td>SOFTWARE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ABAQUS</td><td>Oprogramowanie Simulia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitial Image Correlation</td><td>LaVision, Niemcy</td><td>DAVIS 10.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>Leica/dowolne oprogramowanie</td><td></td><td></td>mikroskopowe</tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATLAB</td><td>MATLAB_R2020B</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół testu ścinania w celu określenia właściwości materiału jednokomórkowego

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties

Nieregularna biomechanika jest cechą charakterystyczną biologii nowotworów, która jest przedmiotem szeroko zakrojonych badań. Właściwości mechaniczne ogniwa są podobne do właściwości materiału. Odporność komórki na stres i napięcie, czas relaksacji i elastyczność to właściwości, które można wyprowadzić i porównać z innymi typami komórek. Ilościowe określenie właściwości mechanicznych komórek nowotworowych (złośliwych) w porównaniu z normalnymi (niezłośliwymi) pozwala naukowcom na dalsze odkrywanie biofizycznych podstaw tej choroby. Chociaż wiadomo, że właściwości mechaniczne komórek nowotworowych stale różnią się od właściwości mechanicznych normalnych komórek, brakuje standardowej procedury eksperymentalnej pozwalającej wywnioskować te właściwości z komórek w hodowli. 
Ten artykuł przedstawia procedurę ilościowego określania właściwości mechanicznych pojedynczych komórek in vitro za pomocą testu ścinania płynów. Zasada tego testu polega na zastosowaniu naprężeń ścinających płynu na pojedynczą komórkę i optycznym monitorowaniu powstałej deformacji komórkowej w czasie. Właściwości mechaniczne komórek są następnie charakteryzowane za pomocą cyfrowej analizy korelacji obrazu (DIC) i dopasowywania odpowiedniego modelu lepkosprężystego do danych eksperymentalnych wygenerowanych z analizy DIC. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiony tutaj protokół ma na celu zapewnienie bardziej skutecznej i ukierunkowanej metody diagnozowania trudnych do leczenia nowotworów.

Protokół badania ścinania w połączeniu z analizą odkształceń przy użyciu DIC i modelu lepkosprężystego pozwala na skuteczne ilościowe określenie właściwości mechanicznych pojedynczej komórki in vitro. Metoda ta została przetestowana na liniach komórkowych ludzkich i mysich, w tym na prawidłowych komórkach piersi człowieka (MCF-10A)3,4,9, komórkach raka piersi trójujemnego o niskim potencjale przerzutowym (MDA-MB-468)<su...

Ten protokół przedstawia ilościowe określanie właściwości mechanicznych nowotworowych i nienowotworowych linii komórkowych in vitro. Konserwatywne różnice w mechanice komórek nowotworowych i prawidłowych mogą działać jako biomarker, który może mieć wpływ na rokowanie i diagnozę.

Protokół testu ścinania w celu określenia właściwości materiału jednokomórkowego

Irregular biomechanics are a hallmark of cancer biology subject to extensive study. The mechanical properties of a cell are similar to those of a ...

Fizyczne cechy raka są stosunkowo nowymi i ekscytującymi tematami w badaniach nad rakiem. Nasze badania mają na celu szczegółowe scharakteryzowanie właściwości mechanicznych zarówno komórek rakowych, jak i nienowotworowych, aby lepiej zrozumieć mechanizmy fizyczne, dzięki którym komórki rakowe przeżywają siły ścinające w organizmie i atakują układ odpornościowy. Najnowszym osiągnięciem w mojej dziedzinie badań jest zastosowanie urządzeń mikroprzepływowych i technik wysokoprzepustowych.Tak więc, w badaniu, na większą skalę, odkształcalność komórek i lepkosprężyste właściwości komórek, a także w identyfikacji nowych biomarkerów, takich jak regulacja białek cytoszkieletu i białek macierzy zewnątrzkomórkowej we wczesnej diagnostyce raka. Obecne wyzwania eksperymentalne związane z tą dziedziną to złożoność mikrośrodowiska guza, skala i przepustowość, translacja kliniczna, standaryzacja i odtwarzalność oraz integracja danych multimodalnych. Tak więc, niektóre z istotnych odkryć, które ustaliłem w tej dziedzinie, z moich poprzednich badań i z moich obecnych badań, to to, że komórki rakowe można odróżnić od normalnych komórek, na podstawie ich reakcji na naprężenia mechaniczne, a stopień, w jakim odporność na naprężenia mechaniczne zależy od integralności strukturalnej, która jest podyktowana w rozsądnym stopniu przez obecność białek cytoszkieletu, takich jak nitkowata aktyna. i inne białka strukturalne w komórce.Nasz protokół oferuje proste, powtarzalne i nieniszczące podejście do mechanicznego charakteryzowania hodowanych komórek. Jest to przeciwieństwo innych technik, takich jak AFM i pęseta optyczna, które wymagają pewnego poziomu wiedzy technicznej w celu przeprowadzenia eksperymentu, przy stosunkowo niskiej przepustowości. Dzięki zastosowaniu techniki testu ścinania znacznie rozwiniemy charakterystykę mechaniczną pojedynczych komórek, a także pomożemy w wielu różnych obszarach przekrojowych, takich jak diagnostyka chorób rzadkich, spersonalizowana diagnoza i opieka oraz monitorowanie interakcji leków jednokomórkowych.Rozpocznij protokół od przygotowania lepkiego podłoża do badania ścinania. W tym celu należy podgrzać podstawowe podłoże hodowlane przez około 10 do 20 minut w temperaturze od 60 do 70 stopni Celsjusza za pomocą mieszadła magnetycznego lub płyty grzejnej. Ciągle mieszając pożywkę, delikatnie dodaj do niej metylocelulozę, aby pomóc cząsteczkom komórek metylowych szybko się rozproszyć bez koagulacji.Pozwól temu procesowi kontynuować się przez około 15 do 24 godzin, aby zapewnić klarowną, jednorodną mieszankę podłoża i celulozy. Aby ustawić aparat ścinający, przymocuj gumową uszczelkę do ścieżki przepływu, aby zamocować połączenie między komorą przepływową a szalką Petriego i zapewnić kontrolowany równomierny przepływ pojedynczych komórek. Gumowa uszczelka występuje w różnych rozmiarach w zależności od chęci przepływu, profilu i obszaru obserwacji.Następnie skonfiguruj system prób ścinania składający się z podwójnych strzykawek o pojemności 60 lub 100 mililitrów podłączonych do programowalnej pompy strzykawkowej do infuzji i pobierania lepkiej pożywki hodowlanej. Napełnić strzykawkę preparatywnym lepkim podłożem przepływowym i przymocować napełnioną strzykawkę w odpowiednim miejscu na pompie strzykawkowej. Następnie podłączyć pustą strzykawkę do drugiego miejsca strzykawki na pompie strzykawkowej.Za pomocą jednego 16-calowego przewodu i łączników przewodów podłącz obie strzykawki do komory przepływowej. Zaprogramuj pompę tak, aby zaparzała i pobierała określoną objętość płynu z określoną szybkością i wybierz odpowiednie strzykawki. Na ekranie wyświetlany jest przykładowy program.Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z płytki Petriego, aby przygotować się do ścinania. Następnie włóż i zamocuj komorę przepływową z gumową uszczelką na szalce Petriego zawierającej dołączone komórki. Umieść dopasowaną komorę przepływu mikroprzepływowego z komórkami w naczyniu na odwróconym mikroskopie podłączonym do monitora wyświetlacza.Konfiguracja jest teraz gotowa do przyłożenia naprężenia ścinającego płynu do pojedynczej komórki i optycznego monitorowania powstałego odkształcenia komórkowego. Aby wykonać protokół testu ścinania jednokomórkowego, należy użyć wstępnie zmontowanego zestawu aparatu ścinającego składającego się z dopasowanej mikroprzepływowej komory przepływowej umieszczonej na szalce Petriego zawierającej interesujące komórki. Umieść cały zestaw na odwróconym mikroskopie z wystarczająco wysokim obiektywem i monitorem.Ustaw ostrość obiektywu mikroskopu, zapewniając odpowiedni kontrast i wyraźne krawędzie komórek. Przesuń stolik mikroskopu, aby upewnić się, że komórki są wyraźnie widoczne na monitorze wyświetlacza i są obrazami na żywo. Wybrać jedną komórkę lub wiele odrębnych komórek w obrębie ścieżki obrazowania lub przepływu dopasowanej komory przepływowej i płytki Petriego.Aby utrzymać ciągły, równomierny przepływ lepkich pożyw, wybierz podobne szybkości infuzji i odstawienia. Zapewnić prawidłowy przepływ laminarny płynu o liczbie Reynoldsa lub Re mniejszej niż 100. Kliknij przycisk Uruchom na pompie ścinającej, aby wstrzykiwać i odbierać płyn ścinający w sposób ciągły.Upewnij się, że podczas wlewu płynów nie ma pęcherzyków powietrza. Rozpocznij nagrywanie wideo, klikając przycisk Nagraj w oprogramowaniu, zanim podany płyn ścinający wejdzie w kontakt z komórką zainteresowania pod mikroskopem. Kontynuuj nagrywanie przez siedem minut lub przez żądany czas ekspozycji na stres lub do momentu, gdy komórka będąca przedmiotem zainteresowania odetnie się od dna naczynia.Kliknij przycisk Zatrzymaj nagrywanie w oprogramowaniu mikroskopu, gdy przebieg zostanie zakończony zgodnie z potrzebami. Oprogramowanie automatycznie zapisuje zdjęcia i filmy, które można zebrać za pomocą dysków flash w celu dalszej analizy. Wyodrębnij obrazy jako pliki TIFF, najlepiej z prędkością jednej klatki na sekundę w celu łatwej analizy.Aby przeprowadzić cyfrową korelację obrazów lub DIC za pomocą oprogramowania DIC, należy zaimportować obrazy pochodzące z zapisu testu ścinania do oprogramowania DIC, najlepiej w formacie pliku TIFF. Aby uzyskać zoptymalizowaną korelację, wybierz opcję sumy różniczkowej, która śledzi deformację nowego obrazu w stosunku do ostatniego obrazu. Wybierz podzbiór o rozmiarze 31 x 31 pikseli i rozmiarze kroku 20 pikseli.Odwzorowuj obszar zainteresowania dla wybranej pojedynczej komórki. W przypadku nieregularnego kształtu, takiego jak komórka, użyj maski wielokąta, aby odwzorować geometrię komórki. Wybierz dowolne punkty w odwzorowanej komórce, aby śledzić deformację.Po zmapowaniu wybierz określone punkty w komórce, takie jak jądro lub cytoplazma, które mają być analizowane, klikając przycisk Dodaj tensometr i rysując poszczególne czujniki tensometryczne w punktach w zdefiniowanej granicy komórki. Kliknij Start, aby rozpocząć przetwarzanie szczepu i uzyskać dane dotyczące odkształcenia w funkcji czasu. Wykres czasu odkształcenia wygenerowany w wyniku tej korelacji można wyeksportować jako plik CSV do dalszej analizy w MATLAB.Kliknij dwukrotnie lub kliknij prawym przyciskiem myszy wygenerowany wykres czasu odkształcenia i wybierz opcję Eksportuj dane. DIC klatek obrazu wyodrębnionych z zapisów testu ścinania z powodzeniem wygenerował dane dotyczące czasu odkształcenia zgodne z reakcją naprężenia pełzania. Wyniki badań z wykorzystaniem techniki próby ścinania wykazały, że komórki nowotworowe były na ogół bardziej podatne mechanicznie i mniej lepkie niż normalne komórki.Zaobserwowano, że sztywność i lepkość komórek zmniejszają się wraz ze zwiększoną progresją raka od normalnego stanu komórki do stanu lekko przerzutowego, a ostatecznie do stanu silnie przerzutowego. Jednak czas relaksacji dla tych typów komórek nie wykazał znaczących zmian.

shear-assay-protocol-for-determination-single-cell-material

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Komórka ścinająca jest przeznaczona do pomiarów rozpraszania neutronów pod małym kątem w płaszczyźnie gradientu prędkości-prędkości ścinania i służy do charakteryzowania złożonych płynów. Pomiary przestrzennie rozdzielcze w kierunku gradientu prędkości są możliwe do badania materiałów z pasmami ścinania. Zastosowania obejmują badania dyspersji koloidalnych, roztworów polimerowych i struktur samoorganizujących się.

Pomiar mikrostruktury materiału pod przepływem za pomocą rozpraszania neutronów w 1-2 płaszczyznach przepływu i małym kącie

Ten test adhezji przepływu dostarcza prostego, bardzo efektownego modelu interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi. Pompa strzykawkowa służy do generowania naprężeń ścinających, a mikroskopia konfokalna rejestruje obrazy w celu określenia ilościowego. Celem tych badań jest skuteczne ilościowe określenie adhezji limfocytów T przy użyciu warunków przepływu.

Test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów T

Tutaj przedstawiono przebieg pracy dla hodowli i analizy ekspresji genów komórek śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających. Uwzględniono fizyczny układ do jednoczesnego przechowywania i monitorowania wielu komór przepływowych w kontrolowanym środowisku oraz zastosowanie egzogennego referencyjnego RNA do ilościowej reakcji PCR.

Analiza ekspresji genów komórek śródbłonka narażonych na naprężenia ścinające przy użyciu wielu komór przepływowych z równoległą płytką

Tutaj opisujemy użycie wysokoprzepustowego bioreaktora mikroprzepływowego połączonego z mikroskopem fluorescencyjnym do analizy wpływu naprężeń ścinających na biofilmy Pseudomonas aeruginosa wyrażające białka zielonej fluorescencji, w tym ustawienie instrumentu, określenie pokrycia biofilmu, tempa wzrostu i właściwości morfologicznych.

Analiza naprężeń ścinających w żywych komórkach u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikroprzepływowego o wyższej przepustowości

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Opisujemy metodę w roztworze, polegającą na zastosowaniu równomiernego ścinania do receptorów powierzchni płytek krwi za pomocą wiskozymetrii stożko-płytkowej. Metoda ta może być również stosowana w szerszym zakresie do stosowania ścinania do innych typów komórek i fragmentów komórek i nie musi być ukierunkowana na określoną parę ligand-receptor.

Jednolity test ścinania dla ludzkich receptorów płytkowych i komórkowych za pomocą wiskozymetrii stożkowo-płytkowej

Przedstawiona tutaj jest metoda mechanicznego fenotypowania pojedynczych komórek za pomocą opartej na elektronice platformy mikroprzepływowej zwanej mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Platforma ta utrzymuje umiarkowaną przepustowość 1-10 komórek/s, mierząc zarówno elastyczne, jak i lepkie właściwości biofizyczne komórek.

Mechano-Node-Pore Sensing: szybka, niewymagająca oznaczeń platforma do wieloparametrowych pomiarów lepkosprężystych pojedynczych komórek

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Opisujemy protokół izolacji i hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej (hSVECs). Udostępniamy również szczegółowe metody wytwarzania naprężeń ścinających i rozciągania w celu zbadania naprężeń mechanicznych w hSVEC.

Izolacja komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka i narażenie na kontrolowane poziomy naprężeń ścinających i rozciągania

Ta metoda mierzy skłonność komórki do pękania unieruchomionych dupleksów DNA prezentujących ligand, aby zgłosić względne siły przyciągania komórkowego. Pęknięte oligonukleotydy fluorescencyjne są dostarczane do komórki i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej, rejestrując historię mechaniczną komórki. Pozwala to na wysokoprzepustowy pomiar generowania siły komórkowej w kontekście mechanofentypowania komórkowego.

Wysokoprzepustowy pomiar mechanotypu komórkowego metodą cytometrii przepływowej w oparciu o pęknięcie i dostarczenie sond napięcia DNA do komórek

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający uzyskanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek z całych rogówek myszy poprzez sekwencyjne trawienie kolagenazą A i trypsyną. Metoda ta daje żywotne pojedyncze komórki o wysokiej integralności RNA, co sprawia, że są kompatybilne z dalszymi zastosowaniami, takimi jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek czy cytometrprzepływowy y.

Protokół do pobierania zawiesiny jednokomórkowej z rogówek myszy

Poznaj metodę testu ścinania do kwantyfikacji właściwości mechanicznych komórek nowotworowych i zdrowych przy użyciu mikroprzepływowych urządzeń. Ta technika umożliwia identyfikację nowych biomarkerów dla wczesnej diagnostyki raka.

Protokół testu ścinania w celu określenia właściwości materiału jednokomórkowego

Przeglądaj więcej filmów