Name: Hybrydyzacja fluorescencji in situ w całości w celu zbadania spermatogenezy u komara Anopheles (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T12:25:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Poznaj technikę hybrydyzacji FISH w całości w celu badania spermatogenezy u komara Anopheles. Metoda zachowuje natywną strukturę cytologiczną i umożliwia analizę zachowania chromosomów w narządach rozrodczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem z Fundacji Billa i Melindy Gatesów oraz Open Philanthropy. Dziękujemy Facility for Imaging by Light Microscopy (FILM) w Imperial College London za analizę mikroskopową. Rysunek 2 został utworzony za pomocą Biorender.com.

1. Znakowanie sondą DNA
UWAGA: Poniżej znajdują się techniczne kroki do generowania fluorescencyjnych sond DNA, które specjalnie oznaczają chromosomy płciowe komarów An. gambiae.
<ol>
	<li>Etykietowanie sondy za pomocą PCR
	<ol>
		<li>Wyodrębnij genomowe DNA od poczwarek lub dorosłych samców w celu oznaczenia chromosomów X lub Y za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji genomowego DNA (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR: 200 ng genomowego DNA, 0,05 mM nieznakowanego nukleotydu (dATP, dCTP, dGTP), 0,015 mM dTTP i 1 uL fluorescencyjnie znakowanego dUTP (Cy3, Cy5 lub innego fluorochromu), 50 pmol startera do przodu i do tyłu (Tabela 1), 5 μL 10x buforu PCR i 10 U polimerazy DNA Taq (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Aby znakować 18S rDNA i satelitarny AgY53B (Tabela 1), należy przeprowadzić reakcję PCR przy użyciu następujących parametrów PCR: jeden cykl 95 °C przez 10 min; 35 cykli 95 °C przez 30 s, 52 °C przez 30 s i 72 °C przez 45 s; jeden cykl 72 °C przez 5 min; i końcowe zatrzymanie w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Aby uzyskać dobre stężenie sondy metodą znakowania PCR (~1 μg w 5 μL), co ma kluczowe znaczenie dla udanego WFISH, reakcja PCR powinna być bardzo wydajna. Z tego powodu przed oznakowaniem sondy zdecydowanie zaleca się przetestowanie skuteczności starterów wybranych do amplifikacji. Ponadto włączenie kontroli pozytywnej do reakcji PCR (bez fluorescencyjnego dUTP) pomoże zweryfikować skuteczność reakcji znakowania.</li>
		<li>Przechowuj sondę w temperaturze -20 °C w ciemnym miejscu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otrzymywanie 3' fluorescencyjnych sond oligonukleotydowych
	<ol>
		<li>Otrzymać dostępne na rynku fluorescencyjne sondy oligonukleotydowe jako zmodyfikowane oligonukleotydy poprzez dodanie fluorochromów Cy3 lub Cy5 (lub dowolnego innego fluorochromu) do końca 3' sekwencji nukleotydowej (patrz tabela materiałów). Patrz startery/oligonukleotydy w tabeli 1 dla sekwencji referencyjnych używanych do oznaczania regionu połączenia AgY477-AgY53B satelity sprzężonego z Y i satelity sprzężonego z chromosomem X od Contig_240. 
		UWAGA: Nie ma przeszkód technicznych związanych ze stężeniem oligonukleotydów znakowanych na końcu 3', ponieważ użytkownik zazwyczaj może to wybrać przed zakupem. Sugerujemy rozcieńczenie ~ 800 ng roztworu sondy oligo w buforze hybrydyzacyjnym w celu wydajnego etykietowania za pomocą sondy oligo. Specyficzne dla X i Y oligosondy były wcześniej używane dla WFISH przez Liang i Sharakhov19, a sekwencję referencyjną można znaleźć w Tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu hybrydyzacyjnego
UWAGA: Sondy fluorescencyjne wygenerowane w kroku 1 muszą zostać włączone do roztworu chemicznego, który hybrydyzuje z sekwencjami docelowymi.
<ol>
	<li>Wytrącanie sondy przed fluorescencyjną hybrydyzacją in situ 
	<ol>
		<li>Do probówki o pojemności 1,5 ml dodaj 5 μl znakowanej sondy DNA (jeśli uzyskano ją metodą znakowania PCR) lub 2,2 μl zmodyfikowanej 3' sondy oligo (~800 ng sondy) z etapu 1 i 5 μl DNA plemników łososia (patrz tabela materiałów). Połącz sondy specyficzne dla różnych regionów genomu w tej samej probówce i użyj ich jako unikalnego rozwiązania w poniższych krokach.</li>
		<li>Wytrącić sondę DNA, dodając 0,1 objętości 3 M octanu sodu i 2 objętości 100% etanolu. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2,5 godziny (wydłużenie czasu inkubacji w temperaturze -20 °C zwiększy ostateczną wydajność). Na tym etapie sondy można również przechowywać przez noc przed odwirowaniem.</li>
		<li>Wirować przy 17 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut, usunąć etanol i wysuszyć granulki na powietrzu w temperaturze pokojowej w ciemności przez ~20 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwiązanie do hybrydyzacji
	<ol>
		<li>Przed przystąpieniem do rozbioru jądra (krok 3) należy przygotować bufor hybrydyzacyjny, mieszając następujące odczynniki w probówce o pojemności 1,5: 500 μl formamidu, 0,2 g siarczanu dekstranu, 100 μl 20x cytrynianu soli fizjologicznej (SSC) i 200 μl sterylnego H20 (patrz tabela materiałów). Wirować roztwór hybrydyzacyjny przez 1 minutę i pozostawić siarczan dekstranu do rozpuszczenia w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Rozpuścić osad z kroku 2.1.3 w 20-30 μl buforu hybrydyzacyjnego (wirować przez około 1 minutę, szybko wirować i przechowywać probówki w temperaturze 37 °C w ciemności) w celu otrzymania roztworu hybrydyzacyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Sekcja i utrwalenie jądra
<ol>
	<li>W temperaturze pokojowej (RT) przeanalizuj21 co najmniej ~20 jąder od poczwarek lub 1-dniowych dorosłych w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym 1x fosforanem (PBS) i przenieś je na czyste szkiełko mikroskopowe zawierające świeżą kroplę 1x roztworu PBS.</li>
	<li>Przenieś jądra za pomocą końcówki z filtrem P1,000 o szerokim otworze lub końcówki igły preparacyjnej z kropli 1x PBS do naczynia zarodkowego zawierającego 3,7% formaldehydu w 1x PBS z 0,1% Tween-20 (PBST) i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć jądra w 1x PBST przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Inkubować jądra w 0,1 mg/ml RNAzy A (patrz Tabela Materiałów) rozcieńczonej w sterylnym 1x PBS przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór RNAzy, dodać roztwór penetrujący (1% Triton/0,1 M HCl w 1x PBST) i inkubować w temperaturze RT przez 10 min. 
	UWAGA: Proteinaza K może być stosowana jako środek penetrujący w końcowym stężeniu 10 μg/ml w 1x PBST w celu zwiększenia przepuszczalności jąder.</li>
	<li>Umyj jądra w 1x PBST dwa razy po 5 minut w RT.</li>
</ol>
4. Hybrydyzacja
UWAGA: Ta sekcja opisuje końcowe etapy hybrydyzacji in situ.
<ol>
	<li>Po etapie płukania (krok 3.5) przenieść jądra do 1,5 ml probówki z 20-30 μl roztworu hybrydyzacyjnego zawierającego wcześniej przygotowaną sondę (krok 2.2.2). Użyj końcówki pipety, aby delikatnie wymieszać roztwór. Delikatnie przesuń rurkę pięć razy, zanim przejdziesz do kolejnych kroków.</li>
	<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze 75 °C w celu denaturacji DNA.</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C (jeśli to możliwe, kołysząc przy prędkości mniejszej niż 100 obr./min) w celu przeprowadzenia hybrydyzacji DNA-DNA.</li>
	<li>Przenieś jądra z powrotem do naczynia z zarodkami za pomocą filtrowanej końcówki P1,000 o szerokim otworze i umyj je w 2x SSC podgrzanym do 50 °C przez 5 min. 
	UWAGA: Po etapie hybrydyzacji wymagany jest końcowy etap mycia przy użyciu 2x SSC; Odgrywa to ważną rolę w usuwaniu wszelkich sygnałów tła spowodowanych obecnością niehybrydyzowanych sond w tkance narządu. Jeśli obecny jest silny sygnał tła, zaleca się powtórzenie ostatniego kroku prania.</li>
	<li>Usunąć 2x SSC i zamontować jądra za pomocą dostępnego w handlu podłoża montażowego z 4′,6-dimidino-2-fenyloindolem (DAPI) (patrz tabela materiałów) na szkiełku podstawowym z matowego szkła, uszczelnić uszczelniaczem do szkiełek nakrywkowych i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie konfokalne. Całe jądra można wizualizować za pomocą obiektywów zanurzeniowych z olejkiem 40x lub 63x. Jeśli wykonywany jest stos z, sugerujemy użycie kroku z 1,25 μm.</li>
</ol>

Fluorescence In Situ Hybridization to Study Mosquito Spermatogenesis

<ol><li>World Malaria Report. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2022">https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2022</a> (2022).</li>
<li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+malaria+control+on+Plasmodium+falciparum+in+Africa+between+2000+and+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The effect of malaria control on Plasmodium falciparum in Africa between 2000 and 2015.</a> Nature. 526 (7572), 207-211 (2015).</li>
<li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Galizi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+sex+ratio+distortion+system+for+the+control+of+the+human+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito.</a> Nature Communications. 5 (1), 3977(2014).</li>
<li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li>
<li>Simoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+male-biased+sex-distorter+gene+drive+for+the+human+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A male-biased sex-distorter gene drive for the human malaria vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 38 (9), 1054-1060 (2020).</li>
<li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), E6736-E6743 (2015).</li>
<li>Bernardini, F., Kriezis, A., Galizi, R., Nolan, T., Crisanti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introgression+of+a+synthetic+sex+ratio+distortion+system+from+Anopheles+gambiae+into+Anopheles+arabiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Introgression of a synthetic sex ratio distortion system from Anopheles gambiae into Anopheles arabiensis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5158(2019).</li>
<li>Hammond, A. M., Galizi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+drives+to+fight+malaria%3A+Current+state+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Gene drives to fight malaria: Current state and future directions.</a> Pathogens and Global Health. 111 (8), 412-423 (2017).</li>
<li>Garrood, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Driving+down+malaria+transmission+with+engineered+gene+drives%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Driving down malaria transmission with engineered gene drives.</a> Frontiers in Genetics. 13, 891218(2022).</li>
<li>Hoermann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+drive+mosquitoes+can+aid+malaria+elimination+by+retarding+Plasmodium+sporogonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Gene drive mosquitoes can aid malaria elimination by retarding Plasmodium sporogonic development.</a> Science Advances. 8 (38), (2022).</li>
<li>Nash, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+gene+drives+for+population+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Integral gene drives for population replacement.</a> Biology Open. 8 (1), (2019).</li>
<li>Galizi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+sex-ratio+distortion+system+for+genetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 sex-ratio distortion system for genetic control.</a> Scientific Reports. 6 (1), 31139(2016).</li>
<li>Terradas, G., Hermann, A., James, A. A., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+analysis+of+Cas9+germline+transcript+distributions+in+gene-drive+Anopheles+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ analysis of Cas9 germline transcript distributions in gene-drive Anopheles mosquitoes.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 12 (1), (2022).</li>
<li>Durant, A. C., Donini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonium+transporter+expression+in+sperm+of+the+disease+vector+Aedes+aegypti+mosquito+influences+male+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ammonium transporter expression in sperm of the disease vector Aedes aegypti mosquito influences male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (47), 29712-29719 (2020).</li>
<li>Taxiarchi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+transcriptional+profiling+of+Anopheles+gambiae+spermatogenesis+reveals+mechanisms+of+sex+chromosome+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-resolution transcriptional profiling of Anopheles gambiae spermatogenesis reveals mechanisms of sex chromosome regulation.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14841(2019).</li>
<li>Pompon, J., Levashina, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+role+of+the+mosquito+complement-like+cascade+in+male+fertility+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A new role of the mosquito complement-like cascade in male fertility in Anopheles gambiae.</a> PLoS Biology. 13 (9), e1002255(2015).</li>
<li>Papathanos, P. A., Windbichler, N., Menichelli, M., Burt, A., Crisanti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vasa+regulatory+region+mediates+germline+expression+and+maternal+transmission+of+proteins+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%3A+A+versatile+tool+for+genetic+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The vasa regulatory region mediates germline expression and maternal transmission of proteins in the malaria mosquito Anopheles gambiae: A versatile tool for genetic control strategies.</a> BMC Molecular Biology. 10 (1), 13(2009).</li>
<li>Liang, J., Sharakhov, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premeiotic+and+meiotic+failures+lead+to+hybrid+male+sterility+in+the+Anopheles+gambiae+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%22%5BJournal%5D)">Premeiotic and meiotic failures lead to hybrid male sterility in the Anopheles gambiae complex.</a> Proceedings of the Royal Society B. 286 (1906), 20191080(2019).</li>
<li>Hall, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radical+remodeling+of+the+Y+chromosome+in+a+recent+radiation+of+malaria+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Radical remodeling of the Y chromosome in a recent radiation of malaria mosquitoes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15), E2114-E2123 (2016).</li>
<li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClements%2C+AN+%22The+Biology+of+Mosquitoes.+Volume+1%3A+Development%2C+Nutrition+and+Reproduction%22">The Biology of Mosquitoes. Volume 1: Development, Nutrition and Reproduction</a>. , CABI. Wallingford, Oxfordshire. (1992).</li>
<li>Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Methods. 68 (1), 218-227 (2014).</li>
<li>Helinski, M. E., Parker, A. G., Knols, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+biology+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Radiation biology of mosquitoes.</a> Malaria Journal. 8, S6(2009).</li>
<li>Huho, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+morphological+method+to+assess+the+age+of+male+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">A reliable morphological method to assess the age of male Anopheles gambiae.</a> Malaria Journal. 5 (1), 62(2006).</li>
<li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+spermiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Drosophila spermiogenesis.</a> Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressing+mosquito+populations+with+precision+guided+sterile+males%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Suppressing mosquito populations with precision guided sterile males.</a> Nature Communications. 12 (1), 5374(2021).</li>
<li>Thailayil, J., Magnusson, K., Godfray, H. C., Crisanti, A., Catteruccia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermless+males+elicit+large-scale+female+responses+to+mating+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spermless males elicit large-scale female responses to mating in the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13677-13681 (2011).</li>
<li>Haghighat-Khah, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+regulating+synthetic+sex+ratio+distortion+in+the+Anopheles+gambiae+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms regulating synthetic sex ratio distortion in the Anopheles gambiae germline.</a> Pathogens and Global Health. 114 (7), 370-378 (2020).</li>
<li>Yamamoto, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+male-specific+sterilization+system+using+the+mammalian+pro-apoptotic+factor+in+a+malaria+vector+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A synthetic male-specific sterilization system using the mammalian pro-apoptotic factor in a malaria vector mosquito.</a> Scientific Reports. 9 (1), 8160(2019).</li>
<li>Papathanos, P. A., Windbichler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redkmer%3A+An+assembly-free+pipeline+for+the+identification+of+abundant+and+specific+X-chromosome+target+sequences+for+X-shredding+by+CRISPR+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Redkmer: An assembly-free pipeline for the identification of abundant and specific X-chromosome target sequences for X-shredding by CRISPR endonucleases.</a> The CRISPR Journal. 1 (1), 88-98 (2018).</li>
<li>Sharma, A., Kinney, N. A., Timoshevskiy, V. A., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+variation+of+the+X+chromosome+heterochromatin+in+the+Anopheles+gambiae+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Structural variation of the X chromosome heterochromatin in the Anopheles gambiae complex.</a> Genes. 11 (3), 327(2020).</li>
<li>Krzywinski, J., Sangaré, D., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+DNA+from+the+Y+chromosome+of+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Satellite DNA from the Y chromosome of the malaria vector Anopheles gambiae.</a> Genetics. 169 (1), 185-196 (2005).</li>
<li>Timoshevskiy, V. A., Sharma, A., Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+on+mitotic+chromosomes+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization on mitotic chromosomes of mosquitoes.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4215(2012).</li>
<li>Liang, J., Hodge, J. M., Sharakhov, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+phenotypes+of+sterile+hybrid+males+from+reciprocal+crosses+between+species+of+the+Anopheles+gambiae+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Asymmetric phenotypes of sterile hybrid males from reciprocal crosses between species of the Anopheles gambiae complex.</a> Frontiers in Ecology and Evolution. 9, 660207(2021).</li>
<li>Slotman, M., Torre, A. D., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+inviability+and+male+sterility+in+hybrids+between+Anopheles+gambiae+and+An.+arabiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of inviability and male sterility in hybrids between Anopheles gambiae and An. arabiensis.</a> Genetics. 167 (1), 275-287 (2004).</li>
<li>Wood, R. J., Newton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-ratio+distortion+caused+by+meiotic+drive+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Naturalist%22%5BJournal%5D)">Sex-ratio distortion caused by meiotic drive in mosquitoes.</a> The American Naturalist. 137 (3), 379-391 (1991).</li>
<li>Cazemajor, M., Joly, D., Montchamp-Moreau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-ratio+meiotic+drive+in+Drosophila+simulans+is+related+to+equational+nondisjunction+of+the+Y+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sex-ratio meiotic drive in Drosophila simulans is related to equational nondisjunction of the Y chromosome.</a> Genetics. 154 (1), 229-236 (2000).</li>
<li>Jaenike, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+chromosome+meiotic+drive%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Ecology+and+Systematics%22%5BJournal%5D)">Sex chromosome meiotic drive.</a> Annual Review of Ecology and Systematics. 32 (1), 25-49 (2001).</li>
<li>Courret, C., Chang, C. H., Wei, K. H., Montchamp-Moreau, C., Larracuente, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+drive+mechanisms%3A+Lessons+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%22%5BJournal%5D)">Meiotic drive mechanisms: Lessons from Drosophila.</a> Proceedings of the Royal Society B. 286 (1913), 20191430(2019).</li>
<li>Zanders, S. E., Unckless, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertility+costs+of+meiotic+drivers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertility costs of meiotic drivers.</a> Current Biology. 29 (11), R512-R520 (2019).</li>
<li>Newton, M. E., Wood, R. J., Southern, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytogenetic+analysis+of+meiotic+drive+in+the+mosquito%2C+Aedes+aegypti+%28L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">A cytogenetic analysis of meiotic drive in the mosquito, Aedes aegypti (L.).</a> Genetica. 46 (3), 297-318 (1976).</li>
<li>Carabajal Paladino, L. Z., Nguyen, P., Šíchová, J., Marec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+single-copy+genes+by+TSA-FISH+in+the+codling+moth%2C+Cydia+pomonella%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomic+Data%22%5BJournal%5D)">Mapping of single-copy genes by TSA-FISH in the codling moth, Cydia pomonella.</a> BMC Genomic Data. 15, S15(2014).</li>
<li>Bernardini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+Y+chromosome+function+between+malaria+vectors+of+the+Anopheles+gambiae+species+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Cross-species Y chromosome function between malaria vectors of the Anopheles gambiae species complex.</a> Genetics. 207 (2), 729-740 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zazwyczaj protokoły FISH wymagają zgniecenia narządu będącego przedmiotem zainteresowania, aby umożliwić barwienie chromosomów. Powoduje to utratę informacji dotyczących przestrzennego rozmieszczenia komórek w tym narządzie33. Protokół ten opisuje, w jaki sposób procesy biologiczne, takie jak spermatogeneza, mogą być badane in situ przy zachowaniu nienaruszonej natywnej struktury jądra i jego wewnętrznej organizacji cytologicznej. Sondy ukierunkowane na różne powtarzalne elementy DNA, które są szczególnie wzbogacone w chromosomy płci20, mogą być jednocześnie wykorzystywane do ujawnienia dynamiki dojrzewania plemników. W zależności od czasu wycięcia jądra, WFISH oferuje możliwość zbadania różnych etapów spermatogenezy poprzez rozwój komara. WFISH jest przydatny do badania określonych zjawisk, takich jak niezgodność hybryd, która u komarów Anopheles jest spowodowana obecnością defektów mejotycznych, takich jak niewydolność premejotyczna i brak dysjunkcji chromosomów płciowych 19,34,35. Oprócz aspektu biologicznego, spermatogeneza jest celem wielu strategii genetycznych opracowanych w celu zwalczania owadów szkodników, takich jak komary Anopheles. W tym kontekście, locus rDNA sprzężony z chromosomem X An. gambiae został wykorzystany jako cel do opracowania syntetycznego zniekształcacza proporcji płci, który, uszkadzając plemniki zawierające X, skłania potomstwo w stronę samców 4,8,13.
Technologia ta odzwierciedla działanie naturalnych popędów mejotycznych w stosunku płci, które zostały zidentyfikowane u kilku taksonów, w tym komarów, ale które nadal pozostają słabo poznane 28,36,37,38,39,40,41. WFISH daje możliwość zbadania tego zjawiska i toruje drogę do udoskonalenia lub ulepszenia strategii genetycznych opartych na zniekształceniach płciowych, na przykład poprzez dostarczenie informacji na temat tego, w jaki sposób na cytologię produkcji plemników wpływa wybór miejsc docelowych wykorzystywanych do rozdrabniania chromosomów płciowych. Chociaż z naszego doświadczenia wynika, że WFISH ma duże szanse na sukces, porażka nadal może się zdarzyć. Może to być spowodowane nieefektywnym poziomem przepuszczalności tkanek, który można przezwyciężyć poprzez wydłużenie czasu inkubacji roztworu penetrującego. Alternatywnie, proteinaza K może być stosowana na etapie przepuszczalności. W niektórych przypadkach zauważyliśmy niejednorodny poziom penetracji sondy, z wyższym sygnałem w jądrach spermatocytów i niższym sygnałem lub jego brakiem na etapie mejozy i spermiogenezy. Może to być spowodowane różnicą w poziomie przepuszczalności w zależności od stadium komórki. Ponadto projekt WFISH okazał się przydatny przy użyciu sond fluorescencyjnych zaprojektowanych do celowania w sekwencje DNA obecne w dużej liczbie kopii. W przypadku celowania w geny z pojedynczą kopią, wykrywanie sygnału może być niewystarczające. W takim przypadku należy zintegrować metody wzmacniania sygnału, takie jak wzmocnienie sygnału tyramidu (TSA)42.
Protokół ten można połączyć z barwieniem immunologicznym lub z transgenicznymi szczepami reporterowymi zawierającymi markery fluorescencyjne specyficzne dla linii zarodkowej16,18, ponieważ dodałoby to informacji o lokalizacji białka i ekspresji genów in situ. W niniejszej pracy WFISH jest opisany jako technika badania spermatogenezy u komarów Anopheles; Jednak biorąc pod uwagę wspólną anatomię męskich narządów rozrodczych, protokół ten można zastosować do innych gatunków komarów, które odgrywają rolę w przenoszeniu chorób. Podobnie, żeńska gametogeneza może być badana przy użyciu tej techniki. Ponadto można przeprowadzić badania cytologiczne w narządach lub tkankach będących przedmiotem zainteresowania, takich jak jelito środkowe komara, które jest celem inwazji pasożytów, lub nietypowe tła genetyczne, takie jak te u komarów hybrydowych43. Co więcej, technika ta może być potencjalnie przeniesiona na inne organizmy z rzędu muchówek.

Malaria stanowi ogromne obciążenie dla zdrowia i dobrobytu globalnej populacji ludzkiej. W 2021 roku Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) oszacowała, że malaria spowodowała 619 000 zgonów, z czego 96% miało miejsce w Afryce Subsaharyjskiej1. Choroba jest przenoszona przez komary należące do rodzaju Anopheles, a w Afryce Subsaharyjskiej trzy gatunki, a mianowicie Anopheles gambiae (An. gambiae), Anopheles coluzzi (An, coluzzi) i Anopheles arabiensis (An. Arabiensis) odgrywają nieproporcjonalnie dużą rolę w przenoszeniu malarii, odpowiadając za 95% przypadków malarii na świecie. Programy kontroli oparte na tradycyjnych metodach, takich jak środki owadobójcze i leki przeciwmalaryczne, uratowały miliony istnień ludzkich; Jednak w ostatnich latach rosnąca odporność na te metody kontroli podważyła ich skuteczność1,2. Ponadto ograniczenia nałożone przez pandemię COVID-19 wpłynęły na dostępność kluczowych interwencji w zakresie kontroli malarii, co według Światowego Raportu WHO na temat malarii z 2022 r. zwiększyło częstość występowania malarii1. W ciągu ostatnich dwóch dekad w warunkach laboratoryjnych opracowano nowatorskie metody kontroli genetycznej w celu zwalczania komarów Anopheles 3,4,5,6,7,8,9,10. Wśród tych strategii obiecująco wypadają te oparte na systemach napędu genowego (GDS) i syntetycznych zniekształcaczach proporcji płci (SD). GDS-y opierają się na możliwości przenoszenia, z bardzo dużą częstotliwością, modyfikacji genetycznej, która wpływa na płodność samic lub upośledza cykl życiowy pasożyta u komarów5,11,12. SD natomiast działają poprzez zniekształcanie proporcji płci potomstwa komarów w stosunku do samców, co z czasem prowadzi do załamania się populacji docelowej z powodu braku samic4,6,13. Główne składniki tych systemów genetycznych działają przede wszystkim na narządy rozrodcze komarów, gdzie gamety, jaja i plemniki są wytwarzane w wyniku podziału mejotycznego14.
W tym protokole, postęp w technikach cytogenetycznych jest wykorzystywany do badania spermatogenezy w An. gambiae, skupiając się na zachowaniu chromosomów in situ. Struktura jądra komara i procesy biologiczne, które w nim zachodzą, zostały wcześniej zbadane przy użyciu wielu metod cytologicznych, takich jak immunofluorescencja, fluorescencyjne transgeny reporterowe oraz fluorescencyjna hybrydyzacja in situ DNA i RNA (FISH)15,16,17,18,19,Dnia 20; Narządy mają kształt wrzecionowaty, w którym dolny biegun jest przymocowany do przewodu deferentnego połączonego z męskimi gruczołami dodatkowymi. W górnym biegunie nisza komórek macierzystych linii zarodkowej namnaża się i różnicuje w komórki spermatogonii osadzone w spermatocystach utworzonych przez komórki somatyczne. Po wielu rundach podziału mitotycznego spermatogonia różnicują się w spermatocyty, które wchodzą w mejozę. W profazie chromosomy autosomu i płci łączą się ze swoimi homologami i następuje krzyżowanie. Po podziałach mejotycznych powstają okrągłe haploidalne plemniki, które wchodzą w spermiogenezę, a proces ten prowadzi do powstania dojrzałych haploidalnych plemników, w których cytoplazma została usunięta, chromatyna jądrowa jest skondensowana, a wici wyłaniają się w podstawowej części jąder21,22 (Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2).
Ogólnie rzecz biorąc, spermiogeneza zaczyna się mniej więcej w połowie stadium poczwarki, a dojrzałe plemniki można wykryć w późnym stadium poczwarki w rezerwuarze plemników23. Proces dojrzewania spermatocyst trwa w dorosłym życiu23,24,25. W jądrach Anopheles każdy etap spermatogenezy można łatwo zidentyfikować, patrząc na morfologię jądrową komórek w każdej spermatocyście (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2). Hybrydyzacja in situ z fluorescencją całomocowaną (WFISH), opisana w tym protokole, pozwala naukowcom na specyficzne oznakowanie regionu chromosomalnego i śledzenie go podczas spermatogenezy, przy jednoczesnym zachowaniu natywnej struktury narządu i pozycji jąder komórkowych; Stanowi to zaletę w porównaniu ze standardowym protokołem DNA FISH, w którym narząd jest zwykle zgniatany, co prowadzi do uszkodzenia tkanki19. W obecnym protokole sondy fluorescencyjne są używane do barwienia powtarzających się sekwencji na chromosomach płci, a tym samym śledzenia ich zachowania podczas spermatogenezy, od diploidalnych komórek dzielących się do dojrzałych haploidalnych plemników. WFISH może być szczególnie przydatny do badania parowania mejotycznego chromosomów płci i badania fenotypów cytologicznych związanych z, na przykład, syntetycznymi zniekształcaczami proporcji płci, hybrydową bezpłodnością samców i nokautem genów zaangażowanych w spermatogenezę4,19,26,27.
Biorąc pod uwagę ich rolę jako wektorów malarii, komary Anopheles są celem coraz większej liczby strategii kontroli wektorów genetycznych, które często działają w narządach rozrodczych tych organizmów. Wygenerowano kilka mutantów komarów i fenotypów cytologicznych, które wymagają zbadania nowych technik cytologicznych26,27,28,29. Metoda opisana w tym badaniu rzuca światło na zrozumienie spermatogenezy, a także mechanizmów cytologicznych stojących za strategiami genetycznymi, które mają potencjał do kontrolowania komarów przenoszących malarię.

<table><tbody><tr><td>Nukleotydy fluorescencyjne Amersham CyDye, Cy3-dUTP</td><td>Cytiva</td><td>PA53022</td><td></td></tr><tr><td>Nukleotydy fluorescencyjne Amersham CyDye, Cy5-dUTP</td><td>Cytiva</td><td>PA55022</td><td></td></tr><tr><td>ART Końcówki do pipet z filtrem szerokootworowym</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>CytoBond Zdejmowany uszczelniacz do szkiełek nakrywkowych</td><td>SciGene</td><td>2020-00-1</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa siarczanu dekstranu z Leuconostoc spp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906-5G</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Krew & Zestawy chusteczek&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia z zarodkami</td><td>VWR</td><td>70543-30</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, klasa molekularna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA GoTaq G2</td><td>Promega</td><td>M7841</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny, 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe, SuperFrost</td><td>VWR&nbsp;</td><td>631-0114</td><td></td></tr><tr><td>- PBS (10x), pH 7,4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldehyd (w/v), bez metanolu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant z DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36941</td><td></td></tr><tr><td>RNase A/T1 Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0551</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>Promega</td><td>U1330</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór octanu sodu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R1181</td><td></td></tr><tr><td>SP8 odwrócony mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Roztwór DNA plemników łososia</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>15632011</tr><tr><td>UltraPure SSC 20x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15557044</td><td></td></tr><tr><td>Primer sekwencje</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5'-CAATAAATTTCCTTTTTTTAATGATGC AAAATCTACGTCTCTCTAGC-3'-[Fluorochrome]</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Contig_240 (X)</td><td></td></tr><tr><td>5' AGAAGAATAGAATCAGAAATAGT CGG TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3'-[Fluorochrome]</td><td>Eurofins Genomics</td><td>AgY53B (Y)</td><td></td></tr><tr><td>5'-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGA T GAAGAAACCGACTATTC-3'-[Fluorochrome]</td><td>Eurofins Genomics</td><td>AgY477- AgY53B junction region (Y)</td><td></td></tr><tr><td>F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA</td><td>Eurofins Genomics</td><td>18S rDNA (X)</td><td></td></tr><tr><td>F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG</td><td>Eurofins Genomics</td><td>AgY53B (Y)</td><td></td></tr></tbody></table>

hybrydyzacja fluorescencji in situ w całości w celu zbadania spermatogenezy u komara anopheles

Whole-Mount Fluorescence In Situ Hybridization to Study Spermatogenesis in the Anopheles Mosquito

Spermatogeneza to złożony proces biologiczny, podczas którego diploidalne komórki przechodzą kolejne podziały mitotyczne i mejotyczne, po których następują duże zmiany strukturalne, tworząc haploidalne plemniki. Oprócz aspektu biologicznego, badanie spermatogenezy ma ogromne znaczenie dla zrozumienia i rozwoju technologii genetycznych, takich jak napęd genowy i syntetyczne zniekształcacze proporcji płci, które, zmieniając odpowiednio dziedziczenie mendlowskie i stosunek płci plemników, mogą być wykorzystane do kontrolowania populacji szkodników. Technologie te okazały się bardzo obiecujące w warunkach laboratoryjnych i mogą być potencjalnie wykorzystane do kontrolowania dzikich populacji komarów Anopheles, które są wektorami malarii. Ze względu na prostotę anatomii jąder i ich znaczenie medyczne, Anopheles gambiae, główny wektor malarii w Afryce Subsaharyjskiej, stanowi dobry model cytologiczny do badania spermatogenezy. Protokół ten opisuje, w jaki sposób hybrydyzacja in situ z całą mocowaniem (WFISH) może być wykorzystana do badania dramatycznych zmian w strukturze jądra komórkowego poprzez spermatogenezę przy użyciu sond fluorescencyjnych, które specyficznie barwią chromosomy X i Y. FISH zwykle wymaga przerwania narządów rozrodczych, aby odsłonić chromosomy mitotyczne lub mejotyczne i umożliwić barwienie określonych regionów genomu za pomocą sond fluorescencyjnych. WFISH umożliwia zachowanie natywnej struktury cytologicznej jądra, w połączeniu z dobrym poziomem wykrywania sygnału z sond fluorescencyjnych ukierunkowanych na powtarzalne sekwencje DNA. Dzięki temu naukowcy mogą śledzić zmiany w zachowaniu chromosomalnym komórek poddawanych mejozie wzdłuż struktury narządu, gdzie można wyraźnie wyróżnić każdą fazę procesu. Technika ta może być szczególnie przydatna do badania parowania mejotycznego chromosomów i badania fenotypów cytologicznych związanych na przykład z syntetycznymi zniekształcaczami proporcji płci, hybrydową męskością i nokautem genów zaangażowanych w spermatogenezę.

W niniejszej pracy zastosowano metodę WFISH do zbadania zachowania chromosomów podczas spermatogenezy u An. gambiae. Pierwszym kluczowym krokiem w zastosowaniu tego protokołu jest uzyskanie jąder, które wykazują niski poziom zmian morfologicznych po wypreparowaniu. Do pomyślnego przeprowadzenia dyssekcji jąder wymagana jest podstawowa wiedza z zakresu anatomii komara; poniżej przedstawiono wskazówki dotyczące tej procedury. U komarów z rodzaju Anopheles dojrzałe jądra znajdują się w szóstym segmencie odwłoka w stadium poczwarki oraz imago21. Jak pokazano na Rysunku 1, vas deferens łączy jądra z gruczołami akcesoryjnymi samca (MAGs), które znajdują się w ostatnim segmencie odwłoka. Gruczoły MAGs są połączone z pojedynczym przewodem ejakulacyjnym, który dostarcza plemniki i płyny nasienne do organu kopulacyjnego i zewnętrznej części aparatu genitalnego samca21. Cały wewnętrzny aparat genitalny samca można wypreparować, stosując różne podejścia w zależności od stadium życiowego komara. W stadium poczwarki jądra można łatwo zidentyfikować pod stereomikroskopem przez przejrzystą kutykulę, patrząc na stronę brzuszną odwłoka w pobliżu szóstego segmentu (Rysunek 1). Aby wypreparować jądra, dolna część odwłoka, w tym szósty segment, może zostać odizolowana od reszty ciała za pomocą dwóch igieł i przeniesiona do czystej kropli 1x PBS. Po usunięciu ostatniego segmentu cały aparat można wycisnąć z odwłoka, wywierając delikatny nacisk igłami sekcyjnymi. Aby wypreparować jądra u dorosłych samców, pierwszym krokiem jest odizolowanie całego odwłoka w świeżej kropli 1x PBS, a następnie wyciągnięcie ostatniego segmentu z chwytnikami, które są kopulacyjnymi strukturami samca (Rysunek 1). Na tym etapie powinna pojawić się dolna część gruczołów MAGs, która jest łatwo identyfikowalna dzięki żółtemu kolorowi. Następnie cały aparat samca można powoli wyciągnąć przy pomocy igły lub pęsety w kropli 1x PBS, aż do momentu, gdy widoczna stanie się para jąder przytwierdzona do vas deferens. Przed przystąpieniem do fiksacji ważne jest odizolowanie jąder od pozostałych części aparatu samca poprzez przecięcie w pobliżu dolnej części vas deferens (Rysunek 1).
Wiek poczwarek lub samców dorosłych jest istotnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę w zależności od badanego etapu spermatogenezy. U An. gambiae spermatogeneza rozpoczyna się we wczesnej/środkowej fazie poczwarki i trwa przez cały okres życia osobnika24. Od 3 h do 10 h po przepoczwarczeniu w jądrach bardziej reprezentowane są etapy premeiotyczne i meiotyczne (profaza meiotyczna, podziały meiotyczne), DNA spermatyd jest stosunkowo niekondensowane, a dojrzałe plemniki nie zostały jeszcze utworzone. Późne poczwarki oraz osobniki dorosłe w wieku 1 dnia zapewniają dobrą równowagę między etapami premeiotycznymi, meiotycznymi i postmeiotycznymi (Rysunek 2 i Rysunek 3). U osobników dorosłych w wieku powyżej 4 dni etapy premeiotyczne i spermatocysty są słabiej reprezentowane, a jądra są zajęte głównie przez dojrzałe plemniki znajdujące się w zbiorniku nasiennym.
Aby zbadać zachowanie chromosomów płci w różnych etapach spermatogenezy, przeprowadzono WFISH w jądrach wypreparowanych w późnym stadium poczwarki, aby zapewnić dobrą reprezentację całego procesu. W celu śledzenia zachowania tych chromosomów zastosowano sondy fluorescencyjne specyficzne dla sekwencji powtórzonych zlokalizowanych wyłącznie na chromosomie X lub Y. Sondy fluorescencyjne można wytworzyć za pomocą PCR lub nabyć komercyjnie jako oligonukleotydy znakowane na końcu 3'. Zaleca się stosowanie oligonukleotydów o długości &gt;40 bps, aby umożliwić dobrą detekcję sygnału z fluorescencyjnej sondy oligo. Według naszego doświadczenia oligonukleotydy znakowane na końcu 3' wykazują lepszą detekcję sygnału niż sondy znakowane metodą PCR. Ponadto liczba kopii sekwencji docelowej jest czynnikiem, który może wpływać na skuteczność WFISH. W przypadku niepowodzenia znakowania sugeruje się zastosowanie metody znakowania PCR na dłuższym fragmencie lub zaprojektowanie kilku oligonukleotydów specyficznych dla regionu docelowego.
Obecne metody, oparte na zastosowaniu roztworu przenikającego (1% Triton/0,1 M HCl w 1x PBST), zapewniają dobry poziom permeabilizacji jąder w jądrach oraz penetrację sond, co skutkuje pomyślną reakcją hybrydyzacji. Sondy oligonukleotydowe specyficzne dla sekwencji repetytywnych chromosomów płci mogą zostać zaprojektowane w oparciu o szczegółową charakterystykę elementów repetytywnych przeprowadzoną przez Halla i współpracowników20. Ponadto sekwencje konsensusowe specyficzne dla elementów repetytywnych związanych z chromosomem X lub Y można uzyskać za pomocą platformy bioinformatycznej, takiej jak potok RedKmer30. Należy zauważyć, że sondy do chromosomów płci mogą być skierowane przeciwko elementom repetytywnym, takim jak satelity i retrotranspozony, i mogą wykazywać różny poziom hybrydyzacji z chromosomami X lub Y w zależności od badanego gatunku20,31,32. Jak pokazano na Rysunku 3, wysoki poziom hybrydyzacji sond oraz niskie tło pozwoliły na wizualizację docelowych chromosomów w trakcie całej spermatogenezy. Sparowanie znakowanych chromosomów płci było widoczne w etapach premeiotycznych i meiotycznych. Następnie wykryto chromosomy X lub Y w jądrach komórek haploidalnych powstałych w wyniku podziałów meiotycznych. W dalszej kolejności można było śledzić spermatydy z chromosomem X lub Y w trakcie spermiogenezy, charakteryzującej się różnym stopniem kondensacji DNA, aż do końcowego etapu dojrzałych plemników o kształcie strzałki. W obecnym układzie doświadczalnym zastosowano serie obrazów konfokalnych (Z-stacks), aby uzyskać informacje dotyczące trójwymiarowej organizacji przestrzennej komórek podczas tego procesu (Wideo 1).
<img alt="Obrazy mikroskopowe anatomii owadów: widoki grzbietowy i brzuszny z opisanymi sekcjami A-D." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65356/65356fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Jądra wypreparowane z poczekułek i 1-dniowych dorosłych samców Anopheles gambiae. (A) Brzuch wypreparowany na późnym etapie poczekułki, pokazujący położenie jąder w pobliżu szóstego segmentu brzusznego. Jądra można zidentyfikować przez kutykulę; widoczne są jako brązowawe struktury po obu stronach brzucha (oznaczone strzałkami). (B) Jądra wypreparowane na etapie poczekułki, pokazujące dojrzałe jądra (1), vas deferens (przewód nasienny) (2), gruczoły akcesoryjne samca (MAGs) (3) oraz przewód wytryskowy (4). (C) Brzuch wypreparowany z 1-dniowego dorosłego samca po usunięciu bazalnego segmentu chwytnego. Gruczoły MAGs można wycisnąć z brzucha, przykładając delikatny nacisk (biała strzałka). (D) Wewnętrzny aparat rozrodczy samca wypreparowany z 1-dniowego dorosłego samca. Biała strzałka wskazuje miejsce zajmowane przez dojrzałe plemniki, które widoczne są jako biały agregat na biegunie bazalnym jądra. Paski skali: (A,C) 200 µm; (B,D) 100 µm. Cyfry rzymskie od I do VIII oznaczają segmenty brzuszne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65356/65356fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat spermatogenezy z etapami komórkowymi: komórki macierzyste, spermatocyty, podziały meiotyczne, spermatydy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65356/65356fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przedstawienie spermatogenezy u Anopheles gambiae. Obraz po lewej stronie przedstawia jądro późnej poczwarki An. gambiae po barwieniu całego preparatu DAPI. Po prawej stronie znajduje się wersja schematyczna dla lepszej wizualizacji. Obserwując kształt jądra i stopień kondensacji, stosunkowo łatwo jest śledzić wszystkie etapy spermatogenezy, od komórek diploidalnych do haploidalnych plemników. Nisza komórek macierzystych znajduje się w górnym biegunie narządu, gdzie rozpoczyna się różnicowanie w spermatogonia. Liczba komórek spermatogoniów zwiększa się po podziale mitotycznym (komórki zielone), a spermatocysty zwiększają swój rozmiar (komórki żółte). Komórki spermatogoniów różnicują się w spermatocyty po wielu rundach podziałów mitotycznych (komórki niebieskie). Spermatocyty, charakteryzujące się względnie większymi jądrami niż komórki na innych etapach procesu, są komórkami, które przejdą podział meiotyczny. Komórki przechodzące mejozę można wykryć, obserwując obecność chromosomów na różnych etapach mejozy; chiasmaty i chromosomy w metafazie można dostrzec nawet przy małym powiększeniu. Etapy przedmeiotyczne są nadreprezentowane w jądrach wypreparowanych na wczesnym etapie poczwarki. Po pierwszym i drugim podziale meiotycznym powstają spermatydy, które zazwyczaj znajdują się w środkowej części jądra. Jądra spermatyd wykazują pewien stopień zmienności kształtu, od okrągłego po kształt przypominający strzałkę. Spermatydy wchodzą w proces spermiogenezy, podczas którego jądra zaczynają się kondensować, a ich struktura zmienia się w kropki w kształcie strzałek. Gdy komary osiągają dojrzałość płciową po wyjściu z poczwarki, spermatocysty zawierające dojrzałe plemniki mogą zajmować większość objętości jądra kosztem spermatocyst na innym etapie rozwoju. Pasek skali: 20 µm. Gwiazdka (*) oznacza część apikalną jądra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65356/65356fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna jąder komórkowych w analizie chromosomowej; schemat podkreśla oddziaływania DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65356/65356fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: WFISH w jądrze An. gambiae wypreparowanym z późnego stadium poczwarki. WFISH wykonano z użyciem sond specyficznych dla chromosomów X (Contig_240) i Y (sonda oligonukleotydowa specyficzna dla AgY53B). (A) WFISH pozwala śledzić zachowanie chromosomów płci podczas spermatogenezy, od komórek diploidalnych do haploidalnych plemników. Na tym obrazie można dostrzec gwałtowne zmiany, jakim podlegają jądra podczas spermatogenezy. Markowanie chromosomów płci umożliwia rozróżnienie między komórkami diploidalnymi a haploidalnymi. W komórkach diploidalnych sygnał z chromosomów płci jest powiązany z tymi samymi jądrami. W komórkach haploidalnych (spermatydach i plemnikach) sygnał z chromosomów płci jest rozdzielony w wyniku redukcyjnego podziału meiotycznego. (B,C) Obraz jądra o większym powiększeniu (63x) przedstawionego w punkcie (A). Obrazy zostały pozyskane w różnych pozycjach wzdłuż osi Z. Białe przerywane ramki wskazują obszar akwizycji. (B) Stadium przejściowe między spermatocytami a spermatydami, ukazujące formowanie się komórek haploidalnych i rozdzielanie sygnałów z chromosomów płci do osobnych jąder. (C) Stadium przejściowe między haploidalnymi spermatydami a dojrzałymi plemnikami. Etap ten pokazuje zmiany w stopniu kondensacji jądra; dojrzałe plemniki wykazują bardziej skondensowany i wydłużony kształt niż spermatydy. Paski skali: (A), 30 µm; (B,C), 10 µm; Szary: DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65356/65356fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sekwencja docelowa</td>
			<td>Sekwencja starterów i konsensus sond oligonukleotydowych</td>
			<td>Literatura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kontig_240 (X)</td>
			<td>5’-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC 
			AAAATCTACGTCTCTAGC-3’-[Fluorochrom]</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgY53B (Y)</td>
			<td>5’AGAAGAATAGAATCAGAATAGTCGG 
			TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3’-[fluorochrom]</td>
			<td>Niniejsze badanie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgY477- 
			AgY53B 
			złącze 
			region (Y)</td>
			<td>5’-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGAT 
			GAAGAAACCGACTATTC-3’-[Fluorochrom]</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S rDNA (X)</td>
			<td>F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC 
			R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgY53B (Y)</td>
			<td>F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT 
			R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG</td>
			<td>19</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista sond oligonukleotydowych specyficznych dla chromosomu X lub Y u An. gambiae.
Wideo 1: Stos 3D WFISH wykonany na jądrze An. gambiae wypreparowanym z późnego stadium poczwarki. Aby uzyskać trójwymiarową reprezentację procesu spermatogenezy, można wykonać stos 3D konfokalny na jądrach wykazujących niewielką liczbę zmian strukturalnych. W niniejszym badaniu stosy wykonano z odstępem 1,25 µm między dwoma przekrojami optycznymi przy użyciu obiektywu olejowego 63x lub 40x, aby nie utracić informacji o 3D organizacji przestrzennej komórek. Szary: DAPI, żółty: Contig_240 (X), magenta: AgY53B (Y). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65356/Video-1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>

Biorąc pod uwagę ich prostą anatomię, jądra Anopheles oferują dobry model cytologiczny do badania spermatogenezy. Protokół ten opisuje hybrydyzację in situ z fluorescencją na całej górze, technikę stosowaną do badania tego procesu biologicznego, a także fenotyp szczepów transgenicznych zawierających mutacje w genach zaangażowanych w produkcję plemników.

Hybrydyzacja fluorescencji in situ w całości w celu zbadania spermatogenezy u komara Anopheles

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural ...

Zakres naszych badań polega na opracowaniu i udostępnieniu opłacalnych i zrównoważonych strategii genetycznych, które mają na celu zmniejszenie liczby komarów przenoszących malarię w Afryce Południowej. W ciągu ostatnich kilku lat wykazaliśmy moc technologii napędu genowego w tłumieniu populacji komarów w klatkach. Obecnie przeprowadzamy szereg eksperymentów, aby rzucić wyzwanie tym technologiom w bardziej złożonej konfiguracji eksperymentalnej i odpowiedzieć na wymagania regulacyjne, które są absolutnie niezbędne do potencjalnego wdrożenia tych technologii w tej dziedzinie.FISH to molekularna technika cytogenetyczna, która pozwala na barwienie określonej sekwencji DNA. Zazwyczaj wiąże się to ze zgnieceniem narządu będącego przedmiotem zainteresowania, co może spowodować utratę informacji o przestrzennym układzie komórek. Whole-mount FISH pozwala na zachowanie natywnej struktury cytologicznej narządów.Whole-mount FISH może być używany do badania zachowania chromosomów w narządach rozrodczych komarów. Narządy rozrodcze są celem kilku genetycznych strategii kontroli wektorów. Całościowy projekt FISH może rzucić światło na mechanizm, który zachodzi w narządach rozrodczych komarów w czasie dobrym, a także w każdym interesującym go szczepie genetycznym.Zacznij od użycia komercyjnego zestawu do ekstrakcji w celu ekstrakcji genomowego DNA z poczwarek lub z dorosłych samców komarów Anopheles. Następnie przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR. Oznacz 18 SRDNA i satelitę A GY53B, wykonując reakcję PCR.Aby przygotować roztwór hybrydyzacyjny, dodaj pięć mikrolitrów znakowanej sondy DNA do 1,5 mililitrowej probówki. Następnie dodaj pięć mikrolitrów DNA plemników łososia. Wytrącić sondę DNA, dodając dwie objętości 100% etanolu i 0,1 objętości trzech molowych octanu sodu.Przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej 2,5 godziny. Odwirować probówkę o stężeniu 17 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń etanol i powietrze, wysusz granulki w temperaturze pokojowej w ciemności przez 20 minut.Następnie przygotuj bufor hybrydyzacyjny w 1,5 mililitrowej probówce. Wirować roztwór przez jedną minutę i pozostawić siarczan dekstranu do rozpuszczenia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby otrzymać roztwór hybrydyzacyjny, rozpuść paletę DNA w 20 do 30 mikrolitrach buforu hybrydyzacyjnego.Wiruj roztwór przez minutę, wykonaj szybkie wirowanie i przechowuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Zacznij od wycięcia co najmniej 20 jąder z poczwarek komarów anopheles w sterylnym PBS. Przenieś jądra na czyste szkiełko mikroskopowe zawierające świeżą kroplę PBS.Używając pokrętłowe końcówki z filtrem P1000 lub końcówki igły preparcyjnej, przenieś jądra do naczynia z zarodkami zawierającego 3,7% formaldehydu w PBST. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie myj jądra w PBST przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Przenieś jądra do szalki zarodkowej zawierającej RNAA i inkubuj ją przez pół godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń roztwór RNA i dodaj jeden mililitr roztworu penetrującego. Inkubować jądra w roztworze penetrującym w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Następnie umyj jądra i PBST dwa razy po pięć minut każde. Przenieś jądra do 1,5 mililitrowej probówki zawierającej od 20 do 30 mikrolitrów roztworu hybrydyzacyjnego za pomocą znakowanej sondy DNA. Inkubuj mieszaninę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w doku, aby umożliwić hybrydyzację.Za pomocą końcówki z filtrem P 1000 z białym otworem przenieś jądra do naczynia z zarodkami, a następnie umyj je w 2XSSC przez pięć minut. Wyjąć SSC, a następnie zamontować jądra na szkiełku podstawowym z matowego szkła za pomocą dostępnego w handlu podłoża montażowego zawierającego DAPI. Uszczelnij szkiełko uszczelniaczem do szkiełek nakrywkowych i inkubuj je w temperaturze pokojowej w ciemności przez dwie godziny.Dobry poziom hybrydyzacji pozwolił na wizualizację docelowych chromosomów podczas spermatogenezy. Sparowanie znakowanych chromosomów płci można było zaobserwować w stadiach przedmiotycznych i miotycznych. Spermitidy zawierające X lub Y można było śledzić przez cały okres spermiogenezy charakteryzującej się różnymi poziomami kondensacji DNA, aż do ostatniego etapu dojrzałych plemników w kształcie strzały.

whole-mount-fluorescence-situ-hybridization-to-study-spermatogenesis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Analizy czasowej i przestrzennej ekspresji genów odgrywają kluczową rolę w genomice funkcjonalnej. Hybrydyzacja in situ całego preparatu jest przydatna do określania lokalizacji transkryptów w obrębie tkanek i przedziałów subkomórkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół hybrydyzacji in situ z modyfikacjami dla konkretnych tkanek docelowych u komarów.

Hybrydyzacja in situ gruczołów ślinowych, jajników i embrionów komarów wektorowych

Wśród trzech rodzajów komarów, mianowicie Anopheles, Aedes oraz Culex, techniki fizycznego mapowania genomu opracowano jedynie dla Anopheles, którego przedstawiciele posiadają czytelne chromosomy politeniczne. W przypadku rodzajów Aedes i Culex mapowanie cytogenetyczne pozostaje jednak wyzwaniem ze względu na niską jakość chromosomów politenicznych. Przedstawiamy tutaj uniwersalny protokół otrzymywania wysokiej jakości preparatów chromosomów mitotycznych oraz zoptymalizowany protokół FISH dla...

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ na chromosomach mitotycznych komarów

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Malowanie chromosomów jest użyteczną metodą do badania organizacji jądra komórkowego i ewolucji kariotypu. W tym miejscu demonstrujemy podejście do izolowania i amplifikacji określonych regionów zainteresowania z pojedynczych chromosomów politenowych, które są następnie wykorzystywane do dwu- i trójwymiarowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Malowanie chromosomów 2D i 3D u komarów malarii

Artykuł opisuje metody i odczynniki niezbędne do przeprowadzenia hybrydyzacji, reakcji łańcuchowej, fluorescencji RNA, hybrydyzacji in situ (HCR, RNA, WM-FISH), aby ujawnić wgląd w przestrzenną i komórkową rozdzielczość genów receptorów chemosensorycznych w czułku komara i palpie szczękowym.

Hybrydyzacja Reakcja łańcuchowa RNA Cała góra Fluorescencja in situ Hybrydyzacja genów chemosensorycznych w przydatkach węchowych komarów

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę opartą na zastosowaniu taśmy klejącej do pobierania próbek z powierzchni pomidorów oraz innych świeżych produktów rolnych, a następnie szybką detekcję całych komórek Salmonella przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Opisano nową metodę wysokoprzepustową, która umożliwia detekcję i względną kwantyfikację ekspresji małego RNA oraz mRNA z pojedynczych komórek bakteryjnych przy użyciu sond z zablokowanymi kwasami nukleinowymi oraz cytometrii przepływowej połączonej z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ.

Cytometria przepływowa z użyciem zablokowanych kwasów nukleinowych oraz hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (LNA flow-FISH): metoda detekcji bakteryjnych małych RNA

Opisujemy tutaj prostą metodę fluorescencji in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii w tkankach owadów i roślin. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację mRNA w całych ujęciach i przekrojach mikroskopowych.

Fluorescencyjne hybrydyzacje in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii endosymbiotycznych w tkankach roślinnych i owadzich

Opisana jest prosta metoda ustalania pierwotnych ludzkich hodowli łożyskowych (kosmków) i narządów dziesiętnych. Hodowle kosmków i narządów dziesiętnych są nieocenionymi narzędziami do badania patogenezy na styku człowieka z matką i płodem. Wykazano zakażenie fakultatywną bakterią wewnątrzkomórkową Listeria monocytogenes.

Ludzkie posiewy łożyska i narządów dziesiętnych w celu zbadania zakażeń na granicy matczyno-płodowej

Tutaj prezentujemy protokół hodowli ludzkich monowarstw enteroidowych lub kolonoidowych, które mają nienaruszoną funkcję bariery, do badania interakcji nabłonkowo-mikrobiota gospodarza na poziomie komórkowym i biochemicznym.

Ludzkie monowarstwy okrężnicy do badania interakcji między patogenami, komensalami i nabłonkiem jelitowym gospodarza

Poznaj technikę hybrydyzacji FISH w całości w celu badania spermatogenezy u komara Anopheles. Metoda zachowuje natywną strukturę cytologiczną i umożliwia analizę zachowania chromosomów w narządach rozrodczych.

Hybrydyzacja fluorescencji in situ w całości w celu zbadania spermatogenezy u komara Anopheles

Przeglądaj więcej filmów