Name: Generowanie podocytów pochodzących od pacjenta z biopsji skóry (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj protokół generowania podocytów pochodzących od pacjenta poprzez epizomalne przeprogramowanie fibroblastów skórnych w hiPSCs. Ta metoda umożliwia tworzenie spersonalizowanych modeli chorób podocytów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych (IZKF) Uniwersytetu Friedricha-Alexandra w Erlangen-Norymberdze z grantem numer M4-IZKF-F009 przyznanym Janinie Müller-Deile, oraz przez Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) pod nazwą projektu STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, grant numer 01GM2202D przyznany Janinie Müller-Deile. Dziękujemy Annalenie Kraus za wsparcie w wykonaniu zdjęć SEM.

Using Skin Biopsies to Generate Patient-Derived Podocytes

<ol><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li>
<li>Grgic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+podocyte+foot+processes+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).</li>
<li>Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+podocyte+slit+diaphragm-from+a+thin+grey+line+to+a+complex+signalling+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub.</a> Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).</li>
<li>Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+glomerular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of glomerular permeability.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 281 (4), F579-F596 (2001).</li>
<li>Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+complexity+of+the+podocyte+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).</li>
<li>Muller-Deile, J., Schiffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+directed+therapy+of+nephrotic+syndrome-can+we+bring+the+inside+out%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out.</a> Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).</li>
<li>Boehlke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hantavirus+infection+with+severe+proteinuria+and+podocyte+foot-process+effacement%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Kidney+Diseases%22%5BJournal%5D)">Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement.</a> American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).</li>
<li>Schiffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+actin-dependent+dynamin+oligomerization+ameliorates+chronic+kidney+disease+in+diverse+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models.</a> Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).</li>
<li>Kopp, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Podocytopathies.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 68(2020).</li>
<li>Wiggins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+podocytopathies%3A+a+unifying+view+of+glomerular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases.</a> Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).</li>
<li>Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+differentiation+in+cultured+rat+and+human+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).</li>
<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li>
<li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+line+demonstrating+nephrin+and+podocin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).</li>
<li>Eto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+protection+by+darbepoetin%3A+preservation+of+the+cytoskeleton+and+nephrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression.</a> Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).</li>
<li>Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+methods+of+glomerular+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+%26+Blood+Pressure+Research%22%5BJournal%5D)">Culture methods of glomerular podocytes.</a> Kidney & Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).</li>
<li>Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+expression%2C+behaviors%2C+and+responses+vary+in+different+lines+of+conditionally+immortalized+cultured+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).</li>
<li>Shih, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD2AP+localizes+to+the+slit+diaphragm+and+binds+to+nephrin+via+a+novel+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain.</a> The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).</li>
<li>Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+is+critical+for+the+plasma+membrane+localization+of+nephrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).</li>
<li>Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipping+your+feet+in+the+water%3A+podocytes+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Dipping your feet in the water: podocytes in urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).</li>
<li>Camici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+detection+of+podocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Urinary detection of podocyte injury.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 61 (5), 245-249 (2007).</li>
<li>Muller-Deile, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+preeclampsia+induced+microRNA-26a-5p+leads+to+proteinuria+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3621(2018).</li>
<li>Schenk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+focal+segmental+glomerulosclerosis+%28FSGS%29+factor+suPAR+using+CytoSorb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Apheresis%22%5BJournal%5D)">Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb.</a> Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).</li>
<li>Petermann, A., Floege, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+damage+resulting+in+podocyturia%3A+a+potential+diagnostic+marker+to+assess+glomerular+disease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron.+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity.</a> Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).</li>
<li>Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+excretion+of+viable+podocytes+in+health+and+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).</li>
<li>Petermann, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes+that+detach+in+experimental+membranous+nephropathy+are+viable%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable.</a> Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).</li>
<li>Sakairi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+lines+established+from+urine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).</li>
<li>Rauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+iPSCs+into+functional+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human iPSCs into functional podocytes.</a> PLoS One. 13 (9), e0203869(2018).</li>
<li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+human+somatic+reprogramming+to+iPS+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell.</a> Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).</li>
<li>Bang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+episomal+reprogramming+for+generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts.</a> Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).</li>
<li>Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+differentiation+of+mature+kidney+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+under+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e3779(2013).</li>
<li>Hoffding, M. K., Hyttel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+visualization+of+the+Mesenchymal-to-Epithelial+Transition+during+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>Bharathan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+markers+used+for+the+identification+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells.</a> Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+from+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).</li>
<li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+more+than+a+proliferation+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li>
<li>Vaz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+after+induced+pluripotent+stem+cells+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming.</a> Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147(2021).</li>
<li>Reiser, J., Altintas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Podocytes.</a> F1000Research. 5, 114(2016).</li>
<li>Ohmori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+NEPHRIN+localization+in+kidney+organoids+derived+from+nephrotic+patient+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 3982(2021).</li>
<li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten protokół oparty na hodowlach komórkowych łączy episomalne przeprogramowanie ludzkich fibroblastów skóry w specyficzne dla pacjenta hiPSC, a następnie różnicowanie w podocyty pochodzące z hiPSC. To pozwala nam badać związane z mutacjami zmiany podocytów u pacjentów z genetyczną chorobą kłębuszków nerkowych w odniesieniu do uszkodzenia podocytów. Protokół przeprogramowania fibroblastów skóry metodą bezintegracyjną za pomocą elektroporacji został zaadaptowany z opublikowanych prac Bang i wsp.32 oraz Okita i wsp.33. Protokół różnicowania podocytów od hiPSC jest zaadaptowany z opublikowanego protokołu z Musah i wsp.28,34,35. Dostępne są już publikacje opisujące powstawanie podocytów z hiPSC 27,34,35. Jednak dostarczony tutaj protokół jest zoptymalizowany i tańszy pod względem różnicowania hiPSC w podocyty. W porównaniu z opublikowanym protokołem Musah i wsp., przetestowaliśmy ten protokół na różnych odczynnikach powlekających, takich jak witronektyna, laminina silk-511 i rozpuszczona matryca błony podstawnej. Stężenia witronektyny i lamininy silk-511 można zmniejszyć do 2,5 μg/ml zamiast 5 μg/ml 28,34,35. Ponadto udało się obniżyć stężenie BMP7 i aktywiny A - dwóch bardzo drogich czynników wzrostu - o 50%, ze 100 ng/ml do 50 ng/ml.
Umożliwia to tańsze różnicowanie. Komórki progenitorowe nefronu od 7 dnia nadal się namnażały, a możliwość zamrożenia została pokazana już wcześniej. Namnażaliśmy te komórki po rozmrożeniu, a przed ostatecznym różnicowaniem w pożywce podstawowej zawierającej zmodyfikowaną pożywkę Eagle (DMEM) i B27 firmy Dulbecco przez kilka dni, co jeszcze bardziej obniżyło koszty. Oprócz etapów różnicowania, protokół ten opisuje wzrost fibroblastów z biopsji skóry z późniejszym generowaniem specyficznych dla pacjenta hiPSC poprzez przeprogramowanie episomalne. Połączenie tych dwóch metod umożliwia generowanie podocytów specyficznych dla pacjenta. W związku z tym przedstawiono tutaj kompletny protokół krok po kroku do generowania specyficznych dla pacjenta podocytów pochodzących z hiPSC, który nie został wcześniej opisany tak szczegółowo.
Ponieważ ogólny protokół obejmuje kilka różnych typów komórek, ważne jest, aby scharakteryzować wygenerowane typy komórek na różnych etapach. Komórki są w hodowli przez dłuższy czas, dlatego kontrola jakości powinna być przeprowadzana na różnych pasażach. Podczas pracy z hiPSC konieczne jest codzienne karmienie, a także monitorowanie zachowania i morfologii komórek. Sterylność pożywek różnicujących musi być zapewniona przez sterylizację filtra przez filtr 0,2 μm. Cały protokół, od biopsji skóry do podocytów pochodzących z hiPSC, trwa kilka miesięcy, ale możliwe jest zamrożenie komórek na różnych etapach procesu. Fibroblasty, wybrane klony hiPSC i proliferacyjne komórki progenitorowe nefronu po 7 dniach w pożywce różnicującej progenitory nefronu można zamrozić i wygenerować działający bank komórek.
Mimo że zdrowe podocyty pochodzące z hiPSC rozwijają wyraźną sieć pierwotnych i wtórnych procesów stopy (Figura 5A,B) i wyrażają typowy marker specyficzny dla podocytów (Figura 6A-C), charakterystyczne membrany szczelinowe, widoczne in vivo, są trudne do naśladowania w klasycznych dwuwymiarowych modelach hodowli komórkowych. Co więcej, komunikacja międzykomórkowa z innymi typami komórek kłębuszkowych nie jest możliwa w tym środowisku monohodowli.
Ze względu na ich końcowy stan zróżnicowany i brak zdolności do proliferacji, trudno jest badać podocyty ex vivo. Za pomocą warunkowego unieśmiertelniania pierwotnych podocytów możliwe jest przezwyciężenie tego ograniczenia poprzez wstawienie przełącznika termoczułego, w wyniku czego uzyskuje się model hodowli komórkowej, w którym komórki namnażają się w temperaturze 33 °C i różnicują się w temperaturze 37 °C13,14. Chociaż te ciPodocyty mają duży potencjał do badań nad podocytami, istnieją ograniczenia, takie jak brak ekspresji markerów, odróżnicowana morfologia i brak tworzenia wyrostków stopy15,16.
Różnicowanie podocytów od komórek somatycznych pochodzących od pacjenta umożliwia generowanie i porównywanie chorych podocytów ze zdrowymi komórkami kontrolnymi ex vivo. To pozwala nam badać uszkodzenia podocytów spowodowane mutacjami w genach specyficznych dla podocytów. Co więcej, praca z hiPSC ma potencjał do tworzenia trójwymiarowych modeli chorób w hodowlach komórkowych, a raczej organoidów43,44. Wspólna hodowla podocytów pochodzących z hiPSC z innymi komórkami kłębuszków nerkowych, takimi jak komórki śródbłonka kłębuszków nerkowych lub komórki mezangialne, może prowadzić do nowych informacji na temat komunikacji międzykomórkowej w zdrowiu i chorobie kłębuszków nerkowych.
Co więcej, charakterystyka i leczenie podocytów specyficznych dla pacjenta może być przeprowadzane ex vivo w analizie wysokoprzepustowej. Zindywidualizowane podejście otwiera możliwość zbadania nowych celów terapeutycznych dla określonych mutacji i prowadzenia zindywidualizowanej medycyny w przyszłości.

Podocyty to wyspecjalizowane, pomitotyczne komórki nabłonka nerkowego, które wraz z błoną podstawną kłębuszka (GBM), komórkami śródbłonka kłębuszka i glikokaliksem tworzą barierę filtracyjną kłębuszka nerkowego. Fenotypowo podocyty składają się z ciała komórki i pierwotnych, zależnych od mikrotubul wypustek błonowych, a także wypustek wtórnych nazywanych stopkami1,2. Bariera filtracyjna kłębuszka, która filtruje mocz z krwi, składa się z okienkowanego śródbłonka, GBM oraz wyspecjalizowanego rodzaju połączenia międzykomórkowego łączącego sąsiadujące stopki podocytów, zwanego przeponą szczeliny podocytów3. W warunkach fizjologicznych białka większe od albuminy są zatrzymywane przez barierę filtracyjną ze względu na ich rozmiar i ładunek4.
Wiadomo, że mutacje w genach specyficznych dla cytoszkieletu lub podocytów, a także krążące czynniki wpływające na szlaki sygnalizacyjne podocytów, indukują zatarcia, odrywanie się lub apoptozę podocytów, co prowadzi do białkomoczu i stwardnienia kłębuszków. W szczególności kluczowe znaczenie mają reorganizacja cytoszkieletu, zmiany polarności podocytów lub uszkodzenie wypustek stopowych z towarzyszącą utratą szczelin błonowych5. Ze względu na swój stan terminalnego zróżnicowania, podocyty niemal nie podlegają zastępowaniu po oddzieleniu od GBM. Jednakże, jeśli podocyty pozostają przytwierdzone do GBM, mogą one nadal dojść do regeneracji po zatarciu i odtworzyć zazębiające się wypustki stopowe6,7,8. Dalsze zrozumienie zdarzeń prowadzących do uszkodzenia podocytów w różnych schorzeniach kłębuszkowych może dostarczyć nowych celów terapeutycznych, które pomogą w opracowaniu metod leczenia tych chorób. Uszkodzenie podocytów jest cechą charakterystyczną różnych chorób kłębuszkowych, w tym ogniskowego kłębuszkowego stwardnienia segmentowego (FSGS), nefropatii cukrzycowej, choroby zmian minimalnych oraz błoniastego zapalenia kłębuszków nerek, co wymaga wiarygodnych modeli podocytów ex vivo do badania mechanizmów patologicznych i potencjalnych podejść terapeutycznych w tych schorzeniach9,10. Podocyty można badać ex vivo za pomocą klasycznej pierwotnej hodowli komórkowej opartej na izolacji kłębuszków poprzez przesiewanie różnicowe11. Jednak ze względu na stan terminalnego zróżnicowania i ograniczoną zdolność do proliferacji, większość badaczy stosuje linie komórkowe ciPodocyte mysie lub ludzkie, które wykazują ekspresję wariantów antygenu T SV40 wrażliwych na temperaturę. Alternatywnie, ciPodocyty izoluje się z myszy transgenicznych posiadających unieśmiertniający gen SV40 Tag1,12.
ciPodocyty proliferują w temperaturze 33 °C, ale w temperaturze 37 °C wchodzą w stan zatrzymania wzrostu i zaczynają się różnicować13,14. Należy pamiętać, że dane eksperymentalne uzyskane z tych komórek powinny być interpretowane z pewną ostrożnością, ponieważ komórki te są generowane przy użyciu nienaturalnej insercji genu15. Ze względu na to, że komórki te zawierają gen immortalizujący, fizjologia komórkowa jest zmieniona wskutek trwającej proliferacji12. Linie komórkowe podocytów generowane tą metodą zostały niedawno zakwestionowane, ponieważ ciPodocyty myszy, ludzi i szczurów wykazują ekspresję synaptopodyny i nefryny na poziomie białka oraz NPHS1 i NPHS2 na poziomie mRNA w stopniu mniejszym niż 5% w porównaniu z ekspresją kłębuszkową16. Co więcej, większość linii komórkowych podocytów nie wykazuje ekspresji nefryny17,18. Chittiprol i wsp. opisali również znaczną różnicę w mobilności komórek oraz w reakcjach na puromycynę i doksorubicynę w przypadku ciPodocytów16. Podocyty można znaleźć w moczu po ich odłączeniu od GBM w różnych chorobach kłębuszkowych19,20,21,22. Żywe podocyty moczowe można hodować ex vivo przez okres do 2-3 tygodni, jednak większość komórek ulega apoptozie23,24. Co ciekawe, podocyty stwierdza się nie tylko w moczu pacjentów z chorobami kłębuszkowymi, ale także w moczu zdrowych osób, najprawdopodobniej w stanie starzenia się, z ograniczonym potencjałem replikacyjnym w hodowli24. Ponadto liczba podocytów pochodzących z moczu jest ograniczona, a komórki te w hodowli ulegają dedyferencjacji, wykazują mniej wypustek stopkowych, zmieniają morfologię i, co najważniejsze, mają ograniczoną zdolność do proliferacji. Ekspresja genów specyficznych dla podocytów jest nieobecna, zanika w ciągu kilku tygodni lub różni się pomiędzy tymi klonami komórkowymi. Niektóre komórki wykazujące pozytywny wynik dla markera specyficznego dla podocytów współwyrażały marker komórek nabłonkowych kanalików lub myofibroblastów i komórek kłębuszkowych, co sugeruje dedyferencję i/lub transdyferencję hodowlanych podocytów moczowych24,25.
Niedawno opisano generowanie linii komórkowych ciPodocyte pochodzących z moczu pacjentów i zdrowych ochotników poprzez transdukcję termoczułym dużym antygenem T SV40 oraz hTERT26. Wykazano ekspresję mRNA dla synaptopodyny, nestyny i białka CD2-associated, jednak w żadnym z klonów nie stwierdzono obecności mRNA podocyny. Oprócz problemów związanych z podocytami moczowymi, komórki te zawierają również wprowadzony gen unieśmiertniający, co wiąże się z omówionymi powyżej wadami.
W przeciwieństwie do nich, ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSCs) wykazują ogromną zdolność do samoodnawiania i różnicowania się w wiele typów komórek w odpowiednich warunkach. Wykazano wcześniej, że hiPSCs mogą służyć jako niemal nieograniczone źródło podocytów27,28.
W niniejszym materiale opisano dwuetapowy protokół generowania specyficznych dla pacjenta podocytów z fibroblastów skórnych pobranych z biopsji wycinanej skóry, z późniejszym przeprogramowaniem episomalnym do hiPSC oraz końcową różnicowaniem w podocyty pochodzące z hiPSC (Rysunek 1).
<img alt="Proces terapii genowej podocytów, schemat reprogramowania hiPSC, przesiewanie leków, spersonalizowane leczenie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Protokół generowania specyficznych dla pacjenta podocytów pochodzących z hiPSC. Graficzny przegląd protokołu generowania specyficznych dla pacjenta podocytów z fibroblastów skórnych pobranych z biopsji skóry poprzez reprogramowanie do hiPSC i różnicowanie w podocyty. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
W pierwszym kroku somatyczne fibroblasty skóry właściwej wyhodowano z biopsji wycięciowej skóry, a następnie przeprogramowano do hiPSC za pomocą metody bezintegracyjnej poprzez elektroporację plazmidami wykazującymi ekspresję czynników transkrypcyjnych OCT3/4, KLF4, SOX2 i c-MYC29,30,31. Powstałe kolonie hiPSC zostały następnie wyselekcjonowane i namnożone. Różnicowanie rozpoczęto od indukcji linii mezodermalnej poprzez aktywację szlaku sygnalizacyjnego WNT, a następnie wygenerowano komórki progenitorowe nefronów, które nadal posiadały zdolność do proliferacji. W końcowym etapie komórki zróżnicowano do podocytów. W tej procedurze zmodyfikowano i połączono wcześniej opublikowane protokoły przeprogramowania episomalnego w celu generowania hiPSC opracowane przez Bang i współpracowników32 oraz Okitę i współpracowników33, a także protokół różnicowania hiPSC do podocytów opracowany przez Musaha i współpracowników28,34,35.
Rzeczywiście, podocyty uzyskane zgodnie z naszym protokołem wykazywały fenotyp bliższy podocytom in vivo, pod względem rozwoju wyraźnej sieci pierwotnych i wtórnych wypustek stóp oraz ekspresji markerów specyficznych dla podocytów, takich jak synaptopodyna, podocyna i nefryna. Dzięki zastosowaniu podocytów pochodzących z hiPSC, tło genetyczne pacjenta zostaje zachowane podczas reprogramowania i różnicowania. Umożliwia to specyficzne dla pacjenta modelowanie chorób podocytów oraz odkrywanie potencjalnych substancji terapeutycznych ex vivo przy niemal nieograniczonej liczbie komórek. Co więcej, protokół ten jest małoinwazyjny, efektywny kosztowo, akceptowalny etycznie i może otwierać nowe możliwości w opracowywaniu leków.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mikro; m sterylny filtr</td><td>Rotilab</td><td>P668.1</td><td>do sterylizacji podłoża różnicującego</td></tr><tr><td>kwas all-trans retinowy</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72262</td><td>suplement do różnicowania</td></tr><tr><td>B27 suplement (50 x), bez surowicy</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>suplement do różnicowania bez surowicy</td></tr><tr><td>BG iMatrix-511 Jedwab</td><td>biogems</td><td>RL511S</td><td>dodatkowa opcja odczynnika do macierzy zewnątrzkomórkowej stosowanego w roztworze powlekającym do powlekania tworzyw sztucznych do hodowli komórkowych odpowiednich do hodowli hiPSC</td></tr><tr><td>Albumina surowica bydlęca (BSA)&nbsp;</td><td>Roth</td><td>8076.4</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Filter Cap Kolby do hodowli komórkowych, T75, 250 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-856</td><td>tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych odpowiednie do hodowli fibroblastów</td></tr><tr><td>CHIR99021 (5 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252917-06-9&nbsp;</td><td>Dodatek do różnicowania</td></tr><tr><td>Matryca kwalifikowana przez Corning Matrigel hESC&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>dodatkową opcję odczynnika do macierzy zewnątrzkomórkowej stosowanego w roztworze powlekającym do powlekania tworzyw sztucznych do hodowli komórkowych odpowiednich do hodowli hiPSC (solubilized basement membrane matrix)</td></tr> <tr><td>countess Szkiełka do komory do liczenia komórek</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>do zliczania komórek</td></tr><tr><td>countess II FL&nbsp; Automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>do zliczania komórek</td></tr><tr><td>probówki cryoPure, 2 ml, zakrętka QuickSeal, biała</td> Kriowiale <td>Sarstedt</td><td>72380</td><td>do zamrażania komórek</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (DMSO)&nbsp;</td><td>Roth</td><td>A994.1</td><td>do pożywki do zamrażania fibroblastów</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1 x)</td><td>Gibco</td><td>11320074</td><td>podstawowa pożywka do różnicowania</td></tr><tr><td>DMEM/F12 + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>podstawowa pożywka do podłoża fibroblastowego</td></tr><tr><td>System obrazowania EVOS M5000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF5000</td><td>fazowy mikroskop kontrastowy</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca premium, inaktywowana (FCS)</td><td>PAN Biotech P301902</td><td></td><td>serum do pożywki fibroblastowej, pożywki do zamrażania fibroblastów i pożywki do konserwacji podocytów</td></tr><tr><td>fisherbrand Kuwety do elektroporacji Plus, szczelina 4 mm, 800 &mikro; Pojemność L, sterylna</td><td></td> kuweta <td>Fisherbrand FB104</td><td>używana do elektroporacji/episomalnego przeprogramowania fibroblastów (odstęp 4 mm)</td></tr> <tr><td>Podłoże montażowe fluoromount-G, z DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td>Podłoże montażowe zawierające</td></tr><tr><td>igłę do miernika DAPI (0,6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance3</td><td>300700</td><td>do rozdzielania kolonii hiPSC na małe kawałki</td></tr><tr><td>ludzkie rekombinowane białko</td> <td>aktywiny A78001.1</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>suplement do różnicowania</td></tr><tr><td>ludzkie rekombinowane białko morfogenetyczne kości 7 (BMP7)</td><td>Peprotech</td><td>120-03P</td><td>suplement do różnicowania</td></tr><tr><td>ludzkiego białka rekombinowanego VEGF-165</td><td>Thermo Scientific</td><td>PHC9394</td><td>suplement do różnicowania</td></tr><tr><td>insulina-transferyna-selen (ITS -G) (100 x)</td><td>Gibco</td><td>41400045</td><td>suplement do pożywka do konserwacji podocytów</td></tr><tr><td>Pożywka LB</td><td>Roth</td><td>X964.1</td><td>do testu sterylności hodowli hiPSC</td></tr><tr><td>lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MP0035-1KT</td><td>komercyjny zestaw do wykrywania mykoplazmy</td></tr><tr><td>szkiełka mikroskopowe</td><td>Diagonal GmbH & Co.KG</td><td>21,102</td><td></td></tr><tr><td>mikroprobówka 1,5 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>72706400</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 Kompletny zestaw</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85850</td><td>podstawowa pożywka do pożywki hodowlanej hiPSC bez surowicy</td></tr><tr><td>pojemnik do zamrażania nalgene Mr.Frosty</td><td>Roth</td><td>AC96.1&nbsp;</td><td>w celu zapewnienia optymalnych warunków zamrażania</td></tr><tr><td>normalna surowica kozia</td><td>abcam</td><td>ab 7481</td><td>do roztworu preinkubacyjnego i rozcieńczalnika przeciwciał</td></tr><tr><td>nunc 24-dołkowe płytki</td><td>Thermo Scientific</td><td>142485</td><td>tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych odpowiednie do hodowli hiPSC</td></tr><tr><td>płytki 48-dołkowe nunc&nbsp;</td>Tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych <td>Thermo Scientific</td><td>152640</td><td>odpowiednie do hodowli hiPSC</td></tr><tr><td>nunc 6-dołkowe&nbsp;</td><td>Termo Scientific</td><td>140685</td><td>tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych odpowiednie do hodowli hiPSC</td></tr><tr><td>nunc Naczynia EasYDish Dish 100 mm</td><td>Termo Scientific</td><td>150466</td><td>tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych odpowiednie do hodowli hiPSC</td></tr><tr><td>nunc MicroWell 96-Well, Nunclon z powłoką Delta, z płaskim dnem Microplate</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych odpowiednie do hodowli hiPSC</td></tr><tr><td>nutriFreez D10 Podłoże do kriokonserwacji</td><td>Sartorius</td><td>05-713-1E&nbsp;</td><td>bezsurowicowa pożywka do kriokonserwacji komórek progenitorowych hiPSC i nefronów</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td>medium do elektroporacji&nbsp;</td></tr><tr><td>pCXLE-hMLN</td><td>Addgene</td><td>#27079</td><td>plazmid do przeprogramowania episomalnego</td></tr><tr><td>plazmid pCXLE-hOCT3/4</td><td>Addgene</td><td>#27077</td><td>plazmid do przeprogramowania epizodycznego</td></tr><tr><td>plazmid pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>#27078</td><td>plazmid do episomalnego przeprogramowania</td></tr><tr><td>penicyliny-streptomycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td>w celu uniknięcia zanieczyszczenia bakteryjnego</td></tr><tr><td>tworzywo sztuczne szkiełka nakrywkowe</td><td>Sarstedt</td><td>&nbsp; 83.1840.002</td><td>do barwienia immunofluorescencyjnego hiPSC i podocytów pochodzących z hiPSC</td></tr><tr><td>ROTI Histofix</td><td>Roth</td><td>P087.3</td><td>handlowy paraformaldehyd (4 %) do utrwalania komórek</td></tr><tr><td>RPMI 1640 + L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>21875034</td><td>podstawowa pożywka do konserwacji podocytów</td></tr><tr><td>komora barwiąca StainTray pokrywa</td><td>Roth</td><td>HA51.1</td><td></td></tr><tr><td>stemPro Accutase Odczynnik do dysocjacji komórek</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>enzymatyczny roztwór do oddzielania komórek stosowany do dysocjacji hiPSC</td></tr><tr><td>sterylny roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (1 x)</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>stosowany do mycia i powlekania</td></tr><tr><td>sterylnej wody</td><td>Roth</td><td>T1432</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka bez igły 20 ml</td><td>BD Plastipak</td><td>300629</td><td>do filtracji sterylizacji podłoże różnicujące</td></tr><tr><td>TC szalka 100 mm</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,902</td><td>sterylne tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych stosowane do cięcia biopsji skóry i hodowli fibroblastów</td></tr><tr><td>TC szalka 35 mm</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,900</td><td>sterylne tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych stosowane do wyrastania fibroblastów z biopsji skóry</td></tr><tr><td>triton X 100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td>do roztworu preinkubacyjnego&nbsp;</td></tr><tr><td>trypan Blue Stain (0,4 %) do stosowania z automatycznym licznikiem komórek Countess</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>do zliczania komórek</td></tr><tr><td>trypsyna-EDTA (10 x)&nbsp;</td><td>Odczynnik</td> dysocjacyjny Biowest <td>X0930-100</td><td>stosowany do fibroblastów i komórek progenitorowych nefronów</td></tr><tr><td>probówka 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271-N</td><td></td></tr><tr><td>probówka 50 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>witronektyna ACF</td><td>Sartorius</td><td>05-754-0002</td><td>odczynnik do macierzy zewnątrzkomórkowej stosowany w roztworze powlekającym do powlekania tworzyw sztucznych do hodowli komórkowych odpowiednich do hodowli</td></tr> <tr><td>hiPSCDichlorowodorek Y-27632 (10 mg)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>w celu uniknięcia apoptozy hiPSC podczas rozszczepiania</td></tr><tr><td><silne>Przeciwciała pierwotne</silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60093.1</td><td>marker pluripotencji, rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60062FI.1</td><td>marker pluripotencji, rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>marker proliferacji, rozcieńczenie 1:300</td></tr><tr><td>synaptopodyna</td><td>Proteintech</td><td>21064-1-AP</td><td>marker specyficzny dla podocytów, rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>nefryna</td><td>Progen</td><td>Marker</td><td>specyficzny dla podocytów GP-N2, rozcieńczenie 1:25</td></tr><tr>marker specyficzny dla<td>podocytów podocin</td><td>proteintech</td><td>20384-1-AP</td><td>, rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td><silne>przeciwciała drugorzędowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kozi IgG świnki morskiej (H+L) Przeciwciało drugorzędowe o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21435</td><td>wtórne i ciało, rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, wysoce zaadsorbowane krzyżowo</td><td>Invitrogen</td><td>A31634</td><td>wtórne i ciało, rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>osło anty-Królicze IgG (H + L) Wysoce zaadsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>wtórne i jego ciało, rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-mysie anty-IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>wtórne i itbody, rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>wtórne i jego ciało, rozcieńczenie 1:1000</td></tr></tbody></table>

generowanie podocytów pochodzących od pacjenta z biopsji skóry

Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

Podocyty to komórki nabłonkowe znajdujące się w miejscu oddawania moczu kłębuszkowej bariery filtracyjnej, które przyczyniają się do selektywnej funkcji filtrowania kłębuszków nerkowych. Mutacje w genach specyficznych dla podocytów mogą powodować ogniskowe segmentalne stwardnienie kłębuszków nerkowych (FSGS), a podocyty są również dotknięte wieloma innymi nefropatiami pierwotnymi i wtórnymi. Ze względu na ich zróżnicowaną naturę, pierwotne modele hodowli komórkowych są ograniczone dla podocytów. Dlatego zwykle stosuje się komórki warunkowo unieśmiertelnione. Jednak te warunkowo unieśmiertelnione podocyty (ciPodocyty) mają kilka ograniczeń: komórki mogą deróżnicować się w hodowli, zwłaszcza gdy osiągną konfluencję, a kilka markerów specyficznych dla podocytów ulega ekspresji tylko nieznacznie lub wcale. Stawia to pod znakiem zapytania wykorzystanie cypodocytów i ich przydatność do celów fizjologicznych, patofizjologicznych i klinicznych. W tym miejscu opisujemy protokół generowania ludzkich podocytów - w tym podocytów specyficznych dla pacjenta - z biopsji dziurkowania skóry poprzez episomalne przeprogramowanie fibroblastów skóry w hiPSC, a następnie różnicowanie w podocyty. Podocyty te znacznie lepiej przypominają podocyty in vivo pod względem cech morfologicznych, takich jak rozwój wyrostków stopy i ekspresja markera specyficznego dla podocytów. Wreszcie, co ważne, komórki te utrzymują mutacje pacjentów, co skutkuje ulepszonym modelem ex vivo do badania chorób podocytów i potencjalnych substancji terapeutycznych w zindywidualizowanym podejściu.

Dzięki temu protokołowi krok po kroku, który łączy reprogramowanie episomalne i różnicowanie, możliwe jest generowanie podocytów niosących mutację pacjenta w genie istotnym dla funkcjonowania podocytów. Umożliwia to analizę specyficznych dla danej choroby zmian w podocytach ex vivo. Tło genetyczne pacjenta jest zachowane podczas całego protokołu na wszystkich etapach rozwoju komórek. Ponadto, ograniczenie wynikające z niewystarczającej liczby terminalnie zróżnicowanych, nieproliferujących podocytów można pokonać, wykorzystując podocyty pochodzące z hiPSC. Chociaż generowanie podocytów hiPSC z namnożonych fibroblastów skóry właściwej via reprogramowanie do hiPSC i późniejsze różnicowanie w podocyty zajmuje kilka miesięcy, możliwe jest zamrożenie komórek na trzech różnych etapach protokołu (Rysunek 2). Zamrażanie jest możliwe w przypadku fibroblastów, hiPSC oraz komórek progenitorowych nefronu po 7 dniach różnicowania w medium do różnicowania progenitorów nefronu. Dzięki temu możliwe jest tworzenie banków komórek roboczych oraz przeprowadzanie eksperymentów na szeroką skalę.
<img alt="Schemat przeprogramowania episomalnego z hiPSC i różnicowaniem do podocytów; obrazy mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Poszczególne etapy protokołu widziane przez mikroskop kontrastowy. (A) Przerośnięte fibroblasty skórne. (B) Tworzenie się kolonii hiPSC po przeprogramowaniu. (C) Wyselekcjonowana hodowla hiPSC. (D) Komórki mezodermy po 2 dniach różnicowania. (E) Komórki progenitorowe nefronów po 14 dniach różnicowania w medium do różnicowania progenitorów nefronów. (F) Terminalnie zróżnicowane podocyty pochodzące z hiPSC. Paski skali reprezentują 300 µm (A,B,D-F) oraz 150 µm (C). Symbol płatka śniegu wskazuje możliwe etapy mrożenia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Ponieważ generowane podocyty pochodzące z hiPSC przechodzą przez długi protokół z drastycznymi zmianami typu i morfologii komórek, charakterystyka komórkowa jest obowiązkowa. Morfologię komórek, taką jak rozmiar i kształt, a także charakterystykę wzrostu, można monitorować za pomocą mikroskopu w kontraście fazowym. Fibroblasty wykazują wydłużony, wrzecionowaty fenotyp o rozmiarach od 150 µm do 300 µm (Ryc. 2A). Po przeprogramowaniu pojawiają się kolonie małych hiPSC o rozmiarze 50 µm. Kolonie te mają wyraźne granice, a komórki hiPSC charakteryzują się wysokim stosunkiem wielkości jądra do cytoplazmy oraz zwiększoną szybkością proliferacji (Ryc. 2C). Ponieważ podocyty są komórkami ostatecznie zróżnicowanymi, szybkość proliferacji spada wraz z postępującym różnicowaniem, a morfologia komórek zmienia się w duże, gwiazdowate podocyty o rozmiarze 300 µm z wyraźnymi wypustkami stopkowymi (Ryc. 2F).
Stopień zrastań (konfluencja) jest krytycznym punktem hodowli hiPSC, a spontaniczna różnicowanie może wystąpić, gdy kolonie stają się zbyt gęste (Rysunek 3). Kolonie te muszą zostać usunięte przed pasażowaniem poprzez zeskrobanie dotkniętych obszarów naczynia hodowlanego.
<img alt="Obrazy z mikroskopii kultur komórkowych, sześć typów: morfologia komórkowa, skala 300 μm. Analiza optyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przykłady hiPSC o różnej jakości. Obrazy w kontraście fazowym pomyślnie (A) przeprogramowanych kolonii hiPSC i (B) wyselekcjonowanych hiPSC, a także (C) różnicowania spontanicznego, (D,E) kolonii niebędących hiPSC oraz (F) zbyt gęstej hodowli hiPSC. Paski skali reprezentują 300 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig04large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
Różne typy komórek w tym protokole muszą zostać zwalidowane pod kątem ekspresji specyficznego markera. Po reprogramowaniu hiPSC odzyskują zdolność do pluripotencji i wykazują ekspresję markerów proliferacji i pluripotencji, takich jak SSEA4, OCT3/4 oraz Ki67 (Rycina 4)38,39,40. Znane jest, że reprogramowanie, podobnie jak długotrwała hodowla hiPSC i różnicowanie, może prowadzić do nieprawidłowego kariotypu lub indukować mutacje41. Dlatego też tło genetyczne hodowanych komórek powinno być monitorowane w czasie i przy różnych pasażach za pomocą prążkowania G oraz sekwencjonowania całego egzomu.
<img alt="Analiza immunofluorescencyjna: markery komórkowe Ki67, OCT3/4, SSEA4; obraz mikroskopowy, skala 100 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Charakterystyka wygenerowanych hiPSC za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Charakterystyka wygenerowanych hiPSC poprzez barwienie na (A) marker proliferacji Ki67, a także markery pluripotencji (B) OCT3/4 oraz (C) SSEA4. Paski skali reprezentują 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Pod kątem morfologicznym podocyty pochodzące z hiPSC mają kształt gwiazdy i wykazują odmienną sieć długich pierwotnych i wtórnych wypustek stóp w porównaniu do ciPodocytes (Rysunek 5). Podocyty pochodzące z hiPSC wykazują ekspresję białek markerowych specyficznych dla podocytów, takich jak synaptopodyna, nefryna i podocyna (Rysunek 6A-C)42.
<img alt="Obrazy w kontraście fazowym i SEM komórek hPSC i ePodo, pokazujące różnice w morfologii komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Morfologia podocytów pochodzących z hiPSC w porównaniu do ciPodocytów.Porównanie (A,B) podocytów pochodzących z hiPSC od zdrowego dawcy z (C,D) ciPodocytami pod kątem morfologii komórkowej i filopodiów przy użyciu mikroskopu kontrastowego fazowego (A,C) oraz skaningowego mikroskopu elektronowego (B,D). Paski skali reprezentują 150 µm (A,C) oraz 20 µm (B,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
W związku z tym porównanie podocytów pochodzących z hiPSC nie tylko od zdrowych dawców, ale także od pacjentów z mutacjami w genach specyficznych dla podocytów, pozwala na indywidualną charakterystykę mutacji pacjenta ex vivo.
<img alt="Ekspresja białek w podocytach pochodzących z iPSC oraz cPodocytach; synaptopodyna, nefryna, podocyna; obrazy mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Charakterystyka markera specyficznego dla podocytów w podocytach pochodzących z hiPSC oraz ciPodocytach. Porównanie (A-C>) podocytów pochodzących z hiPSC od zdrowego dawcy z (D-F>) ciPodocytami pod kątem białek markerowych specyficznych dla podocytów: synaptopodyny (A,D), nefryny (B,E) i podocyny (C,F). Paski skali odpowiadają 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1. Skład wszystkich pożywek i roztworów do hodowli komórkowych użytych w badaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/Table%201_REv2.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten manuskrypt opisuje dwuetapowy protokół generowania specyficznych dla pacjenta podocytów z fibroblastów skóry poprzez episomalne przeprogramowanie w indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) i późniejsze różnicowanie w podocyty.

Generowanie podocytów pochodzących od pacjenta z biopsji skóry

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the ...

Opisujemy protokół generowania ludzkich podocytów poprzez episomalne przeprogramowanie fibroblastów skóry w indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste. Komórki te znacznie lepiej przypominają podocyty in vivo niż podocyty unieśmiertelnione pod względem procesów stopy podocytów i ekspresji markera specyficznego dla podocytów. Podocyty są komórkami różnicującymi się końcowo.Dlatego komórki te już się nie namnażają, a pierwotna analiza podocytów w hodowli komórkowej jest ograniczona. Mimo że problem ograniczonej liczby komórek został rozwiązany dzięki zastosowaniu warunkowo unieśmiertelnionych podocytów, podocyty te prezentują zdedyferencjowany fenotyp i zachowanie, co kwestionuje ich wykorzystanie w badaniach podstawowych. Za pomocą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, podocyty mogą być generowane in vitro w prawie nieograniczonej liczbie komórek o typowej morfologii podocytów, w tym odrębnych wyrostkach stopy i ekspresji markera specyficznego dla podocytów.Wykorzystując specyficzne komórki macierzyste pacjenta do różnicowania się w podocyty, możliwe jest badanie zmian specyficznych dla choroby ex vivo. W tym przypadku wstępna biopsja skóry została pobrana od pacjenta z genetyczną chorobą podocytów. Podocyty wygenerowane za pomocą naszego protokołu to spersonalizowane chore komórki niosące mutację pacjenta.W związku z tym komórki te stanowią ulepszony model ex vivo do badania chorób podocytów i potencjalnych substancji terapeutycznych w zindywidualizowanym podejściu. Na początek weź probówkę do biopsji skóry z pożywką fibroblastową. Usuń pożywkę i trzykrotnie przemyj biopsję stempla skóry pięcioma mililitrami sterylnego, wstępnie podgrzanego PBS.Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś biopsję stempla skóry na 10-centymetrowe ostrze do hodowli komórkowej i pokrój je na trzy lub cztery części sterylnym skalpelem, pozostawiając naskórek i skórę właściwą. Przenieś każdy kawałek do sterylnego 35-milimetrowego plastikowego naczynia do hodowli komórek i delikatnie wciśnij go do naczynia hodowlanego. Pozostaw do wyschnięcia na 5 do 10 minut, aż płyn wyparuje, a biopsja zostanie przymocowana do plastikowej hodowli komórkowej.Używając pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, dodaj kroplami jeden mililitr pożywki fibroblastowej wokół biopsji do końcowej objętości trzech mililitrów. Inkubuj próbkę przez siedem dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla bez karmienia lub przesuwania naczynia. Pod koniec inkubacji zmień pożywkę na świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę fibroblastów.Na koniec użyj mikroskopu z kontrastem fazowym, aby monitorować wyrosłe wrzecionowate fibroblasty wokół biopsji skóry i zamrozić wybrane komórki po ich wyhodowaniu. Na początek weź kolbę z hodowanymi komórkami fibroblastów. Zakoduj 10-centymetrową płytkę do hodowli komórkowej odpowiednią do hodowli hiPSC czterema mililitrami zimnego roztworu do powlekania na płytkę i inkubuj płytkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie usuń pożywkę z fibroblastów i przemyj je czterema mililitrami wstępnie podgrzanego PBS na kolbę. Odessać PBS i zdysocjować fibroblasty za pomocą czterech mililitrów trypsyny-EDTA na kolbę, inkubując przez pięć do siedmiu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Monitoruj odklejanie się komórek za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym i, jeśli to konieczne, postukaj w bok kolby, aby oderwać komórki od plastikowej powierzchni.Przenieś oderwane komórki do 50-mililitrowej stożkowej rurki i umyj puste kolby sześcioma mililitrami wstępnie podgrzanej pożywki fibroblastowej. Zbierz i połącz pozostałe komórki w stożkowej probówce. Następnie odwirować komórki w temperaturze 200 g przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w trzech mililitrach świeżego, wstępnie podgrzanego PBS. Policz komórki. Przenieś 1,5 razy 10 do 6 fibroblastów do nowej stożkowej probówki i napełnij PBS do znaku pięciu milimetrów.Odwirować probówkę o masie 200 g przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad ogniwa w pięciu mililitrach pożywki do elektroporacji i ponownie odwirować.W międzyczasie odessać roztwór powlekający z powlekanej 10-centymetrowej płytki do hodowli komórkowej i dodać siedem mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki fibroblastowej. Pod koniec wirowania wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad ogniwa w podłożu elektroporacyjnym o stężeniu 1,5 razy 10 do 6 komórek w 250 mikrolitrach. Przenieś zawiesinę ogniw o pojemności 250 mikrolitrów do kuwety elektroporacyjnej z czteromilimetrową odstępem.Następnie przygotuj mieszankę do transfekcji plazmidu, dodając cztery mikrogramy każdego plazmidu do całkowitej objętości 50 mikrolitrów pożywki do elektroporacji. Przenieś mieszaninę transfekcji do kuwety. Delikatnie wymieszaj, przesuwając i elektropomuluj jednym impulsem o napięciu 280 woltów.Na koniec przenieś 150 mikrolitrów elektroporowanych fibroblastów na przygotowaną 10-centymetrową płytkę do hodowli komórkowej. Trzykrotnie poruszyć płytkę we wszystkich kierunkach, aby rozprowadzić komórki i inkubować przez noc. Fibroblasty prezentowały długi, wrzecionowaty fenotyp o wielkości od 150 do 300 nanometrów.Po przeprogramowaniu pojawiają się kolonie z małymi hiPSC o wielkości 50 mikrometrów, wykazujące wyraźne granice. HiPSC wyróżniają się wysokim stosunkiem jąder do ciał i zwiększonym tempem proliferacji. Na początek weź płytkę z elektroporowanymi fibroblastami i obserwuj tworzenie się kolonii hiPSC pod mikroskopem kontrastowym z 10x do 20x obiektywu.Kolonie hiPSC o średnicy 300 mikrometrów, wyraźnych granicach i wysokim stosunku jąder do ciał nadają się do zbierania. Przed zbiorem pokryć studzienki 96-dołkowej płytki odpowiedniej do hodowli hiPSC 100 mikrolitrami roztworu powlekającego i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Podczas inkubacji zaznacz długopisem interesujące nas kolonie na dnie naczynia do hodowli komórkowych.W celu ostatecznego przygotowania płytki 96-dołkowej należy usunąć roztwór powlekający i dodać 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej hiPSC zawierającej 10 mikromoli inhibitora ROCK Y27632 do każdej studzienki. Następnie umyj komórki podgrzanym PBS i dodaj świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę hodowlaną hiPSC zawierającą 10 mikromoli inhibitora ROCK Y27632 przed pobraniem w celu usunięcia martwych komórek. Wybierz kolonie hiPSC za pomocą igły pomiarowej i podziel kolonie na małe kawałki, rysując siatkę do każdej kolonii.Następnie użyj mikroskopu z kontrastem fazowym, aby sprawdzić, czy kolonie zostały pomyślnie podzielone na części. Na koniec przenieś kolonie za pomocą pipety o pojemności 100 mikrolitrów na przygotowaną 96-dołkową płytkę, trzymając pipetę pionowo nad kolonią. Pozwól komórkom przyczepić się przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla bez zakłóceń.Następnego dnia zastąp pożywkę 200 mikrolitrami świeżej pożywki hodowlanej hiPSC w celu usunięcia inhibitora ROCK Y27632 i umieść płytki z powrotem w inkubatorze. Monitoruj 96-dołkową płytkę i oznacz dołki pomyślnie wybranymi klonami. W tym momencie oznaczone klony można rozszerzać i zamrażać.Obrazy z kontrastem fazowym z powodzeniem przeprogramowały kolonie hiPSC, wybrane hiPSC, spontanicznie zróżnicowane kolonie, kolonie bez hiPSC oraz zbyt gęstą hodowlę hiPSC.

generation-of-patient-derived-podocytes-from-skin-biopsies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie opisujemy protokół pozyskiwania ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez różnicowanie komórek w określonych warunkach chemicznych. Wygenerowane podocyty mogą być wykorzystane do badań nefrotoksyczności i modelowania chorób.

Pozyskiwanie ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych: procedura ukierunkowanego różnicowania dojrzałych podocytów nerkowych z komórek macierzystych

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego i szczegółowego protokołu generowania genetycznie zmodyfikowanej ludzkiej organotypowej skóry z keratynocytów naskórka i zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej

Proponujemy protokół, który pokazuje, jak różnicować indukowane pluripotencjalne keratynocyty i fibroblasty pochodzące z komórek macierzystych oraz generować organoid skóry 3D, używając tych keratynocytów i fibroblastów. Protokół ten zawiera dodatkowy krok generowania humanizowanego modelu myszy. Przedstawiona tutaj technika usprawni badania dermatologiczne.

Generowanie organoidu 3D skóry z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych krwią pępowinową

Prezentowany tutaj jest chemicznie zdefiniowany protokół pozyskiwania ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych o wysokiej skuteczności (&gt;90%) i niezależny od manipulacji genetycznych czy selekcji subpopulacji. Protokół ten pozwala na uzyskanie pożądanego typu komórek w ciągu 26 dni i może być przydatny do testowania nefrotoksyczności i modelowania choroby.

Sterowane różnicowanie dojrzałych podocytów nerkowych od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach zdefiniowanych chemicznie

Prezentowany tutaj jest protokół do opracowania spersonalizowanego systemu organ-on-a-chip, który podsumowuje strukturę i funkcję bariery filtracyjnej kłębuszków nerkowych poprzez integrację genetycznie dopasowanych komórek nabłonka i śródbłonka naczyniowego, zróżnicowanych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ten bioinżynieryjny system może przyczynić się do rozwoju medycyny precyzyjnej nerek i powiązanych zastosowań.

Izogeniczny chip kłębuszków nerkowych zaprojektowany z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Dysocjacja komórek z konkretnych typów tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów agitacji tkanki, aby uzyskać wysoką liczbę żywych komórek zdolnych do hodowli. Urządzenie Miltenyi gentleMACS Dissociator optymalizuje to zadanie dzięki prostemu, praktycznemu protokołowi. W niniejszej publikacji wyjaśniono zastosowanie tego urządzenia w odniesieniu do tkanki nerwowej.

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki nerwowej myszy

Opisano szybką i skuteczną metodę izolacji żywych dorosłych komórek macierzystych nabłonka ze skóry ludzkiej. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne macierzy kolagenowej skóry, a następnie wyrywanie mieszków włosowych i izolację zawiesin pojedynczych komórek lub fragmentów tkanki do hodowli komórkowej.

Izolacja i hodowla dorosłych epitelialnych komórek macierzystych ze skóry człowieka

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

Białka mogą albo przyjąć natywną strukturę, albo nieprawidłowo sfałdować się w nierozpuszczalny amyloid. Warunki, które sprzyjają szlakowi nieprawidłowego fałdowania, prowadzą do powstawania różnych typów włókienek amyloidowych. Opisane tu metody pozwalają na szybką konwersję natywnych białek do amyloidu in vitro.

Szybkie wytwarzanie amyloidu z białek natywnych in vitro

Tutaj opisujemy protokół oparty na epigenetycznym przeprogramowaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w kierunku generowania jednorodnej populacji komórek progenitorowych mięśni szkieletowych, które w dopuszczalnych warunkach hodowli tworzą trójwymiarowe skupiska kurczliwych włókien mięśniowych (miosfer), które podsumowują biologiczne cechy ludzkich mięśni szkieletowych.

Generowanie miosfer z hESC poprzez przeprogramowanie epigenetyczne

Poznaj protokół generowania podocytów pochodzących od pacjenta poprzez epizomalne przeprogramowanie fibroblastów skórnych w hiPSCs. Ta metoda umożliwia tworzenie spersonalizowanych modeli chorób podocytów.

Generowanie podocytów pochodzących od pacjenta z biopsji skóry

Przeglądaj więcej filmów