Generowanie podocytów pochodzących od pacjenta z biopsji skóry

Ten manuskrypt opisuje dwuetapowy protokół generowania specyficznych dla pacjenta podocytów z fibroblastów skóry poprzez episomalne przeprogramowanie w indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) i późniejsze różnicowanie w podocyty

Opisujemy protokół generowania ludzkich podocytów poprzez episomalne przeprogramowanie fibroblastów skóry w indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste. Komórki te znacznie lepiej przypominają podocyty in vivo niż podocyty unieśmiertelnione pod względem procesów stopy podocytów i ekspresji markera specyficznego dla podocytów. Podocyty są komórkami różnicującymi się końcowo.

Dlatego komórki te już się nie namnażają, a pierwotna analiza podocytów w hodowli komórkowej jest ograniczona. Mimo że problem ograniczonej liczby komórek został rozwiązany dzięki zastosowaniu warunkowo unieśmiertelnionych podocytów, podocyty te prezentują zdedyferencjowany fenotyp i zachowanie, co kwestionuje ich wykorzystanie w badaniach podstawowych. Za pomocą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, podocyty mogą być generowane in vitro w prawie nieograniczonej liczbie komórek o typowej morfologii podocytów, w tym odrębnych wyrostkach stopy i ekspresji markera specyficznego dla podocytów.

Wykorzystując specyficzne komórki macierzyste pacjenta do różnicowania się w podocyty, możliwe jest badanie zmian specyficznych dla choroby ex vivo. W tym przypadku wstępna biopsja skóry została pobrana od pacjenta z genetyczną chorobą podocytów. Podocyty wygenerowane za pomocą naszego protokołu to spersonalizowane chore komórki niosące mutację pacjenta.

W związku z tym komórki te stanowią ulepszony model ex vivo do badania chorób podocytów i potencjalnych substancji terapeutycznych w zindywidualizowanym podejściu. Na początek weź probówkę do biopsji skóry z pożywką fibroblastową. Usuń pożywkę i trzykrotnie przemyj biopsję stempla skóry pięcioma mililitrami sterylnego, wstępnie podgrzanego PBS.

Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś biopsję stempla skóry na 10-centymetrowe ostrze do hodowli komórkowej i pokrój je na trzy lub cztery części sterylnym skalpelem, pozostawiając naskórek i skórę właściwą. Przenieś każdy kawałek do sterylnego 35-milimetrowego plastikowego naczynia do hodowli komórek i delikatnie wciśnij go do naczynia hodowlanego. Pozostaw do wyschnięcia na 5 do 10 minut, aż płyn wyparuje, a biopsja zostanie przymocowana do plastikowej hodowli komórkowej.

Używając pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, dodaj kroplami jeden mililitr pożywki fibroblastowej wokół biopsji do końcowej objętości trzech mililitrów. Inkubuj próbkę przez siedem dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla bez karmienia lub przesuwania naczynia. Pod koniec inkubacji zmień pożywkę na świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę fibroblastów.

Na koniec użyj mikroskopu z kontrastem fazowym, aby monitorować wyrosłe wrzecionowate fibroblasty wokół biopsji skóry i zamrozić wybrane komórki po ich wyhodowaniu. Na początek weź kolbę z hodowanymi komórkami fibroblastów. Zakoduj 10-centymetrową płytkę do hodowli komórkowej odpowiednią do hodowli hiPSC czterema mililitrami zimnego roztworu do powlekania na płytkę i inkubuj płytkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie usuń pożywkę z fibroblastów i przemyj je czterema mililitrami wstępnie podgrzanego PBS na kolbę. Odessać PBS i zdysocjować fibroblasty za pomocą czterech mililitrów trypsyny-EDTA na kolbę, inkubując przez pięć do siedmiu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Monitoruj odklejanie się komórek za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym i, jeśli to konieczne, postukaj w bok kolby, aby oderwać komórki od plastikowej powierzchni.

Przenieś oderwane komórki do 50-mililitrowej stożkowej rurki i umyj puste kolby sześcioma mililitrami wstępnie podgrzanej pożywki fibroblastowej. Zbierz i połącz pozostałe komórki w stożkowej probówce. Następnie odwirować komórki w temperaturze 200 g przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w trzech mililitrach świeżego, wstępnie podgrzanego PBS. Policz komórki. Przenieś 1,5 razy 10 do 6 fibroblastów do nowej stożkowej probówki i napełnij PBS do znaku pięciu milimetrów.

Odwirować probówkę o masie 200 g przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad ogniwa w pięciu mililitrach pożywki do elektroporacji i ponownie odwirować.

W międzyczasie odessać roztwór powlekający z powlekanej 10-centymetrowej płytki do hodowli komórkowej i dodać siedem mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki fibroblastowej. Pod koniec wirowania wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad ogniwa w podłożu elektroporacyjnym o stężeniu 1,5 razy 10 do 6 komórek w 250 mikrolitrach. Przenieś zawiesinę ogniw o pojemności 250 mikrolitrów do kuwety elektroporacyjnej z czteromilimetrową odstępem.

Następnie przygotuj mieszankę do transfekcji plazmidu, dodając cztery mikrogramy każdego plazmidu do całkowitej objętości 50 mikrolitrów pożywki do elektroporacji. Przenieś mieszaninę transfekcji do kuwety. Delikatnie wymieszaj, przesuwając i elektropomuluj jednym impulsem o napięciu 280 woltów.

Na koniec przenieś 150 mikrolitrów elektroporowanych fibroblastów na przygotowaną 10-centymetrową płytkę do hodowli komórkowej. Trzykrotnie poruszyć płytkę we wszystkich kierunkach, aby rozprowadzić komórki i inkubować przez noc. Fibroblasty prezentowały długi, wrzecionowaty fenotyp o wielkości od 150 do 300 nanometrów.

Po przeprogramowaniu pojawiają się kolonie z małymi hiPSC o wielkości 50 mikrometrów, wykazujące wyraźne granice. HiPSC wyróżniają się wysokim stosunkiem jąder do ciał i zwiększonym tempem proliferacji. Na początek weź płytkę z elektroporowanymi fibroblastami i obserwuj tworzenie się kolonii hiPSC pod mikroskopem kontrastowym z 10x do 20x obiektywu.

Kolonie hiPSC o średnicy 300 mikrometrów, wyraźnych granicach i wysokim stosunku jąder do ciał nadają się do zbierania. Przed zbiorem pokryć studzienki 96-dołkowej płytki odpowiedniej do hodowli hiPSC 100 mikrolitrami roztworu powlekającego i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Podczas inkubacji zaznacz długopisem interesujące nas kolonie na dnie naczynia do hodowli komórkowych.

W celu ostatecznego przygotowania płytki 96-dołkowej należy usunąć roztwór powlekający i dodać 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej hiPSC zawierającej 10 mikromoli inhibitora ROCK Y27632 do każdej studzienki. Następnie umyj komórki podgrzanym PBS i dodaj świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę hodowlaną hiPSC zawierającą 10 mikromoli inhibitora ROCK Y27632 przed pobraniem w celu usunięcia martwych komórek. Wybierz kolonie hiPSC za pomocą igły pomiarowej i podziel kolonie na małe kawałki, rysując siatkę do każdej kolonii.

Następnie użyj mikroskopu z kontrastem fazowym, aby sprawdzić, czy kolonie zostały pomyślnie podzielone na części. Na koniec przenieś kolonie za pomocą pipety o pojemności 100 mikrolitrów na przygotowaną 96-dołkową płytkę, trzymając pipetę pionowo nad kolonią. Pozwól komórkom przyczepić się przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla bez zakłóceń.

Następnego dnia zastąp pożywkę 200 mikrolitrami świeżej pożywki hodowlanej hiPSC w celu usunięcia inhibitora ROCK Y27632 i umieść płytki z powrotem w inkubatorze. Monitoruj 96-dołkową płytkę i oznacz dołki pomyślnie wybranymi klonami. W tym momencie oznaczone klony można rozszerzać i zamrażać.

Obrazy z kontrastem fazowym z powodzeniem przeprogramowały kolonie hiPSC, wybrane hiPSC, spontanicznie zróżnicowane kolonie, kolonie bez hiPSC oraz zbyt gęstą hodowlę hiPSC.