Name: Pomiar zużyciaO2 u Drosophila melanogaster za pomocą mikrorespirometrii kulometrycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj mikrorespirometrię kulometryczną do pomiaru zużycia tlenu u Drosophila melanogaster. Metoda pozwala badać wpływ mutacji CASK na metabolizm owadów w kontrolowanych warunkach temperaturowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Lindzie Restifo z University of Arizona za sugestię testowania zużycia O2 przez mutanty CASK oraz za wysłanie mutantów CASK i ich kongenicznych kontroli. Opłaty za publikację zostały zapewnione przez Wydziałowy Fundusz Reinwestycyjny z Wydziału Biologii University of College Park. Przestrzeń i część sprzętu zostały zapewnione przez uniwersytety w Shady Grove.

1. Hodowla i zbieranie much
<ol>
	<li>Utrzymywać muchy w temperaturze 25 °C w wąskich fiolkach zawierających standardowy pokarm dla Drosophila. 
	UWAGA: Wielkość próbki dla każdego genotypu powinna składać się z co najmniej dziewięciu kontrprób, z których każda składa się z pojedynczej komory respirometrycznej zawierającej 15-25 much, ustawionych zgodnie z opisem poniżej.</li>
	<li>Przenoś muchy co 2-3 dni.</li>
	<li>Znieczulij muchy CO2 , zbierz grupy 15-25 samców każdego genotypu i umieść każdą grupę w świeżych, niedrożdżowych fiolkach z pokarmem. 
	UWAGA: Samce wykorzystano w celu zmniejszenia zmienności ze względu na status rozrodczy. Metoda dotyczy obu płci.</li>
	<li>Pozwolić muchom na regenerację w temperaturze 25 °C przez co najmniej 24 godziny 
	UWAGA: Do czasu eksperymentu muchy powinny mieć 1-4 dni. Częstotliwość zbierania opisaną w kroku 1.3 można ustawić tak, aby zawęzić zakres wieku much.</li>
</ol>
2. Ustawienie i montaż komory respirometru
<ol>
	<li>Włącz łaźnię wodną i ustaw ją na żądaną temperaturę eksperymentu. 
	UWAGA: Poniższe eksperymenty przeprowadzono w temperaturze 25 °C przy użyciu probówek Schlenka o pojemności 50 ml jako komór. Komponenty należy zmontować tak, jak pokazano na rysunku <silna klasa="xfig">Rysunki 1A, 1B i 1C.</li>
	<li>Dokładnie wyczyść szklane połączenia komór i wtyczek czujników, rozpylając 70% etanolu na chusteczkę laboratoryjną (nie bezpośrednio na złącze) i wycierając kurz i stary smar z wtyczki czujnika (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Zetrzyj etanol świeżą chusteczką laboratoryjną.</li>
	<li>Na dno komory umieszczamy 1 cm kawałek bawełnianej rolki namoczonej w oczyszczonej wodzie, aby ustabilizować wilgotność.
	<ol>
		<li>Dodaj tyle wody (~0,5 ml), aby utworzyć małą kałużę na dnie bawełnianej bułki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrzyj wodę, która na złącze komory.</li>
	<li>Przenieś muchy do oznakowanych rurek polipropylenowych za pomocą lejka.
	<ol>
		<li>Zatkaj rurkę bawełnianą rolką. 
		UWAGA: Probówki składają się z polipropylenowej probówki o pojemności 5 ml, przyciętej do długości 5,5 cm i perforowanej gorącym nożem, aby umożliwić swobodną wymianę powietrza z komorą doświadczalną. Wiadomo, że znieczulenie CO2 powoduje nieprawidłowości metaboliczne, więc muchy są przenoszone bez znieczulenia, co wymaga większej ostrożności, aby uniknąć utraty much.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj jedną wentylowaną rurkę z muchami do każdej komory respirometru (na wierzchu mokrej bawełny).</li>
	<li>Napełnij wkłady z wapnem sodowym (4-5 granulek w tubie) i umieść je na górze rurki zawierającej muchy wewnątrz komory. 
	UWAGA: Wkłady z wapnem sodowanym składają się z probówek wirówkowych o pojemności 800 μl perforowanych 4-5 razy za pomocą wiertarki.</li>
	<li>Napełnij generatory O2 nasyconym roztworem siarczanu miedzi (CuSO4) poniżej poziomu otworów wentylacyjnych 
	UWAGA: Generatory O2 składają się z zakręcanych probówek wirówkowych z 4 otworami wywierconymi poniżej gwintów. Elektrody platynowe (Pt) i miedziane (Cu) są przylutowane do dwupinowego złącza, wkładane do otworów wywierconych w nasadce i mocowane żywicą epoksydową. ElektrolizaCuSO4 wytwarzaO2 zużywane przez organizm doświadczalny. CuSO4 jest toksyczny dla bezkręgowców, należy unikać rozlania lub wycieku i natychmiast go posprzątać.</li>
	<li>Podłącz napełniony generatorO2 do dwupinowego złącza na wtyczce czujnika. 
	UWAGA: Katoda miedziana musi być połączona z ujemnym wyjściem sterownika, a anoda platynowa z przewodem dodatnim. Odwrócenie połączeń spowoduje niepowodzenie eksperymentu.</li>
	<li>Umieść dwie małe krople przezroczystego smaru silikonowego po przeciwnych stronach szklanego złącza z uziemieniem wtyczki czujnika.</li>
	<li>Włóż korek do komory i obróć korek (lub komorę) z umiarkowanym naciskiem, aby rozprowadzić smar w złączu.
	<ol>
		<li>Zetrzyj nadmiar tłuszczu chusteczką laboratoryjną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zatrzaśnij plastikowe zaciski Keck na złączach, aby zabezpieczyć zaślepki w komorach. Zmontowana komora powinna wyglądać następująco: <silna klasa="xfig">Rysunek 1C.</li>
	<li>Powtórz powyższe kroki dla liczby komór użytych w eksperymencie w danym dniu. 
	UWAGA: Liczba komór, które można nagrywać, jest ograniczona liczbą dostępnych komór, sterowników i wejść USB do komputera. W obecnych eksperymentach siedem komór było zwykle prowadzonych równolegle. Muchy doświadczalne, takie jak mutanty, powinny być dopasowane do odpowiednich grup kontrolnych. Komora ustawiona identycznie, ale bez much, powinna być włączona do każdego eksperymentu jako kontrola zmienności środowiska. Komory, w których znajdują się różne metody leczenia (mutant, dziki typ, zakaz latania) powinny być zmieniane między eksperymentami.</li>
	<li>Umieść zmontowane komory w stojaku w łaźni wodnej z otwartymi kurkami (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). 
	UWAGA: Aby uniknąć zmian okołodobowych, komory zostały umieszczone w łaźni między 9:30 a 9:50 rano dla wszystkich opisanych tutaj eksperymentów.</li>
	<li>Pozostaw otwarte kurki (trzymaj uchwyt równolegle do kranu). 
	UWAGA: Uważaj, aby woda nie dostała się do kurków.</li>
	<li>Pozostawić komory do zrównoważenia z otwartymi kranami przez około 30 minut. 
	UWAGA: Gdy komora jest wyrównana, podłącz elektronikę i skonfiguruj akwizycję danych zgodnie z poniższym opisem.</li>
</ol>
3. Konfiguracja kontrolerów i komputera
<ol>
	<li>Upewnij się, że przełączniki dostarczające prąd do generatorów O2 są w pozycji OFF (z dala od złącza; <silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Podłącz każdą skrzynkę kontrolera do dostępnego portu uniwersalnej magistrali szeregowej (USB). 
	UWAGA: Budowa i programowanie jednostek sterujących opisane gdzie indziej12.</li>
	<li>Podłącz sterowniki do komór respirometru za pomocą 6-żyłowych.</li>
	<li>Sprawdź, czy wyświetlacze organicznych diod elektroluminescencyjnych (OLED) sterowników (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D) wyświetlają parametry środowiskowe.</li>
	<li>Na krótko włącz generatory O2 za pomocą przełącznika na sterowniku (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).
	<ol>
		<li>Jeśli wartość prądu wzrośnie od zera do zakresu od 35 do 55 mA, sterownik i komora są gotowe do eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ, które porty COM są używane przez kontrolery, zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Kliknij ikonę Start w systemie Microsoft Windows.</li>
		<li>Kliknij ikonę ustawień.</li>
		<li>Kliknij Bluetooth i urządzenia.</li>
		<li>Upewnij się, że kontrolery i ich porty COM znajdują się na liście urządzeń.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz PuTTY na pulpicie i skonfiguruj plik dziennika dla każdego kanału respirometru, jak opisano poniżej. 
	UWAGA: PuTTY to bezpłatny bezpieczny klient powłoki i telnet, który służy do przesyłania danych do komputera za pośrednictwem portów COM.
	<ol>
		<li>Wybierz port COM dla kontrolera, wpisując numer portu w polu "Linia szeregowa" (Rysunek 2A).</li>
		<li>Kliknij Rejestrowanie.</li>
		<li>Wybierz opcję Printable Output (Wyjście do druku) w sekcji "Session logging" (Rysunek 2B).</li>
		<li>W obszarze Nazwa pliku dziennika kliknij przycisk Przeglądaj.</li>
		<li>W wybranym folderze utwórz nazwę pliku zawierającą informacje opisowe (np. datę, gatunek, numer portu COM).</li>
		<li>Kliknij Zapisz.</li>
		<li>Kliknij przycisk Otwórz. Otworzy się okno pokazujące, że rejestrowane są dane rozdzielane przecinkami (Rysunek 2C).</li>
		<li>Powtórz te czynności dla wszystkich innych kontrolerów używanych w eksperymencie. Dane wejściowe do każdego portu COM pojawią się jako osobne okno (Rysunek 2D).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przeprowadzanie eksperymentów
<ol>
	<li>Po zrównoważeniu komór przez 30 minut, uszczelnij je, zamykając kurki.</li>
	<li>Przykryj wannę i komory pojemnikiem z pianki polistyrenowej, aby utrzymać stabilne środowisko.</li>
	<li>Pozostawić do zrównoważenia przez kolejną godzinę.</li>
	<li>Włącz prąd do generatoraO2 każdej komory za pomocą przełącznika na skrzynce sterownika.</li>
	<li>Po aktywacji generatorów O2 upewnij się, że ciśnienie wzrasta do wstępnie ustawionego ciśnienia wyłączenia. 
	UWAGA: 1017 hPa, czyli nieco powyżej ciśnienia atmosferycznego, zostało użyte jako ciśnienie "OFF" w tej serii eksperymentów. Powrót do ciśnienia otoczenia będzie wskazywał na wyciek gazu z komór. Co więcej, pozwala na stosowanie tego samego ciśnienia we wszystkich eksperymentach, niezależnie od ciśnienia atmosferycznego otoczenia. Ciśnienie "ON" wynosiło 1016 hPa, co oznacza, że ciśnienie musiało spaść tylko o 1 hPa przed aktywacją generatoraO2. Zapewniło to odpowiednią czułość do pomiaru spożyciaO2 u Drosophila. Gdy komora zostanie podgrzana do ciśnienia do ustawienia "OFF", prąd powinien spaść do zera.</li>
	<li>Niech eksperyment będzie trwał przez co najmniej 3 godziny 
	UWAGA: Wyższe VO2 w podwyższonych temperaturach może pozwolić na skrócenie czasu eksperymentu. Od czasu do czasu monitoruj, aby upewnić się, że sprzęt działa, ale unikaj nadmiernej aktywności w pobliżu komór, która może wpływać na stabilność temperatury.</li>
</ol>
5. Eksperyment końcowy
<ol>
	<li>Wyłącz generatory O2 we wszystkich sterownikach. 
	UWAGA: Najpierw należy unikać uruchamiania generatorów O2, gdy komory są otwarte.</li>
	<li>Otwórz kurki, aby rozszczelnić komory.</li>
	<li>Pozostaw otwarte okna PuTTY na kolejne 5-15 minut, aby zapewnić ostateczną linię bazową.</li>
	<li>Zamknij okno PuTTY dla każdego kontrolera, kończąc nagrania. 
	UWAGA: Wszystkie eksperymenty kończyły się między 16:50 a 17:10.</li>
	<li>Odłącz czujniki od.</li>
	<li>Przenieś komory do suchego stojaka.</li>
	<li>Wyjmuj pojedynczo zaślepki czujników z komór.</li>
	<li>Odłącz generatoryO2 i umieść je w stojaku na rury.</li>
	<li>Wytrzyj smar z wtyczki czujnika i trzymaj go w stojaku.</li>
	<li>Oczyść smar ze złączy komory i usuń rurki z muchami i wapnem sodowym.</li>
	<li>Znieczulij muchy w każdej probówce za pomocą CO2, dotknij łodzi z wagą i zważ na mikrowadze.
	<ol>
		<li>Rejestruj wagę i liczbę much dla każdej rurki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrzuć muchy lub odłóż je na bok do dodatkowych zabiegów.</li>
	<li>Wrzuć wapno sodowane z wkładów do pojemnika na odpady.</li>
	<li>Otwórz generatorO2 i wyrzuć roztwórCuSO4 do pojemnika na odpady.
	<ol>
		<li>Przepłucz elektrody i rurkę oczyszczoną wodą.</li>
		<li>Umieść stojaki na probówki do suszenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza danych transferu ładunku
<ol>
	<li>Importuj dane jako tekst rozdzielany przecinkami do arkusza kalkulacyjnego, przy czym każdy rekord składa się z osobnego arkusza.</li>
	<li>Zapisz dane dotyczące prądu i czasu dla każdego impulsu generatoraO2. Zaczynając od pierwszego impulsu po osiągnięciu ciśnienia w komorze, zapisuj czas rozpoczęcia i czas zakończenia (jako numery wierszy) każdego impulsu prądowego. Jest to numer wiersza, gdy prąd przekracza zero (zwykle do około 45-50 mA) do ostatniego wiersza, który jest powyżej zera.</li>
	<li>Utwórz tabelę w arkuszu, aby zapisać następujące dane:
	<ol>
		<li>Średnia amplituda prądu podczas impulsu: = ŚREDNIA([pierwszy wiersz impulsu]:[ostatni wiersz impulsu]) dla każdego impulsu (z bieżącej kolumny).</li>
		<li>Czas trwania impulsu: ([Ostatni wiersz impulsu] - [pierwszy wiersz impulsu[-jeden wiersz]])/1000 dla każdego impulsu (z kolumny czasu w milisekundach).</li>
		<li>Całkowity czas eksperymentu: [czas na początku ostatniego impulsu] - [czas na końcu pierwszego impulsu po natężeniu ciśnienia w komorze] (z kolumny czasu w minutach).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie oblicz transfer ładunku (Q) dla każdego impulsu (średni prąd X czas trwania)</li>
	<li>Zsumuj ładunek ze wszystkich impulsów, aby obliczyć całkowity ładunek (Qtot).</li>
</ol>
7. Analiza zużyciaO2
<ol>
	<li>Skonfiguruj nowy arkusz kalkulacyjny dla wszystkich danych i wprowadź lub oblicz następujące wartości dla każdej komory:
	<ol>
		<li>Qtot (całkowita opłata)</li>
		<li>Pieprzyki (= Q ÷ 96485 × 4)</li>
		<li>mL O2 (= mole × 22413 mL/mol)</li>
		<li>Łączny czas (z powyższej analizy danych)</li>
		<li>mL min-1 (= ml O2 ÷ czasu całkowitego)</li>
		<li>Waga w gramach (muszki znieczulone i zważone, zmierzona po eksperymencie)</li>
		<li>mL min-1 g-1 (= mL min-1 ÷ wagowo w gramach)</li>
		<li>ml/h/g (powyższa × 60)</li>
		<li>mg/mucha (= masa much ÷ liczba much)</li>
		<li>μL mucha-1 h-1 (= (mL min-1 × 3600) ÷ liczba much).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tabelaryczne dane dla każdego leczenia (np. genotyp)</li>
	<li>Porównaj zabiegi za pomocą ANOVA, testu t lub testu Mann-Whitney u-test 13.</li>
</ol>

Adapting Microrespirometry for Drosophila - Insights into CASK Mutant Metabolism

<ol><li>Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rates+in+genetically+based+long+lived+strains+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila.</a> Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).</li>
<li>Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nutrient+balance+shapes+phenotypic+traits+of+Drosophila+melanogaster+in+interaction+with+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+A%3A+Molecular+%26+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dietary nutrient balance shapes phenotypic traits of Drosophila melanogaster in interaction with gut microbiota.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 241, 110626(2020).</li>
<li>Burggren, W., Souder, B. M., Ho, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rate+and+hypoxia+tolerance+are+affected+by+group+interactions+and+sex+in+the+fruit+fly+%28Drosophila+melanogaster%29%3A+new+data+and+a+literature+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Metabolic rate and hypoxia tolerance are affected by group interactions and sex in the fruit fly (Drosophila melanogaster): new data and a literature survey.</a> Biology Open. 6, 471-480 (2017).</li>
<li>Lighton, J. R. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLighton%2C+JRB+%22Measuring+Metabolic+Rates%22">Measuring Metabolic Rates</a>. , Oxford University Press. Oxford. (2019).</li>
<li>Fiorino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallelized%2C+real-time%2C+metabolic-rate+measurements+from+individual+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Parallelized, real-time, metabolic-rate measurements from individual Drosophila.</a> Scientific Reports. 8 (1), 14452(2018).</li>
<li>Berrigan, D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+temperature+and+activity+on+the+rate+of+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Influence of temperature and activity on the rate of adult Drosophila melanogaster.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. 118 (4), 1301-1307 (1997).</li>
<li>Hulbert, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rate+is+not+reduced+by+dietary-restriction+or+by+lowered+insulin%2FIGF-1+signalling+and+is+not+correlated+with+individual+lifespan+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Experimental Gerontology. 39 (8), 1137-1143 (2004).</li>
<li>Botero, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromin+regulates+metabolic+rate+via+neuronal+mechanisms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Neurofibromin regulates metabolic rate via neuronal mechanisms in Drosophila.</a> Nature Communications. 12 (1), 4285(2021).</li>
<li>Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Metabolic+Rate+in+Drosophila+using+Respirometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 51681(2014).</li>
<li>Ross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-specific+decrease+in+aerobic+efficiency+associated+with+increase+in+oxygen+free+radical+production+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 46 (11), 1477-1480 (2000).</li>
<li>Brown, E. B., Klok, J., Keene, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+metabolic+rate+in+single+flies+during+sleep+and+waking+states+via+indirect+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring metabolic rate in single flies during sleep and waking states via indirect calorimetry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 376, 109606(2022).</li>
<li>Sandstrom, D. J., Offord, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxygen+consumption+in+Tenebrio+molitor+using+a+sensitive%2C+inexpensive%2C+sensor-based+coulometric+microrespirometer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxygen consumption in Tenebrio molitor using a sensitive, inexpensive, sensor-based coulometric microrespirometer.</a> Journal of Experimental Biology. 225 (9), jeb243966(2022).</li>
<li>Becker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+dysfunction+in+CASK-related+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Presynaptic dysfunction in CASK-related neurodevelopmental disorders.</a> Translational Psychiatry. 10 (1), 312(2020).</li>
<li>Slawson, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+Regulation+of+Locomotor+Behavior+of+Drosophila+melanogaster+Depends+on+a+CASK+Isoform+Containing+CaMK-Like+and+L27+Domains%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Central Regulation of Locomotor Behavior of Drosophila melanogaster Depends on a CASK Isoform Containing CaMK-Like and L27 Domains.</a> Genetics. 187 (1), 171-184 (2011).</li>
<li>Slawson, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dopamine+release+by+CASK-%C3%8E2+modulates+locomotor+initiation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of dopamine release by CASK-Î2 modulates locomotor initiation in Drosophila melanogaster.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).</li>
<li>Andrew, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+motor-behavior+abnormalities+in+two+Drosophila+models+of+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders.</a> Journal of Neurogenetics. 35 (1), 1-22 (2021).</li>
<li>Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+Modulates+Metabolic+Rate+and+Temperature+Sensitivity+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dopamine Modulates Metabolic Rate and Temperature Sensitivity in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 7 (2), e31513(2012).</li>
<li>Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+correlation+between+body+mass+and+metabolic+rate+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lack of correlation between body mass and metabolic rate in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 50 (5), 445-453 (2004).</li>
<li>Norton, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeation+of+gases+through+solids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Permeation of gases through solids.</a> Journal of Applied Physics. 28 (1), 34-39 (1957).</li>
<li>Hoegh-Guldberg, O., Manahan, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coulometric+measurement+of+oxygen-consumption+during+development+of+marine+invertebrate+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Coulometric measurement of oxygen-consumption during development of marine invertebrate embryos and larvae.</a> Journal of Experimental Biology. 198 (1), 19-30 (1995).</li>
<li>Sohal, R. S., Agarwal, A., Agarwal, S., Orr, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+overexpression+of+copper-+and+zinc-containing+superoxide+dismutase+and+catalase+retards+age-related+oxidative+damage+and+increases+metabolic+potential+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (26), 15671-15674 (1995).</li>
<li>Van Voorhies, W. A., Melvin, R. G., Ballard, J. W. O., Williams, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+manometric+microrespirometers+for+measuring+oxygen+consumption+in+small+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Validation of manometric microrespirometers for measuring oxygen consumption in small arthropods.</a> Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1132-1137 (2008).</li>
<li>Herreid, C. F., Full, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cockroaches+on+a+treadmill%3A+Aerobic+running%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cockroaches on a treadmill: Aerobic running.</a> Journal of Insect Physiology. 30 (5), 395-403 (1984).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Powyższa procedura przedstawia pomiar zużyciaO2 u D. melanogaster za pomocą elektronicznego kulometrycznego mikrorespirometru. Uzyskane dane dotyczące spożyciaO2 u dzikiego typu D. melanogaster mieściły się w zakresach opisanych w większości poprzednich publikacji przy użyciu różnych metod (Tabela 1), choć nieco niższe niż te podawane przez innych 3,6.
Kluczowe kroki dotyczyły dw...

Możliwość pomiaru tempa przemiany materii jest kluczowa dla pełnego zrozumienia organizmu w jego kontekście środowiskowym. Na przykład, konieczne jest zmierzenie tempa przemiany materii, aby zrozumieć jej rolę w długości życia1, roli diety w metabolizmie2, czyli progu stresu hipoksyjnego3.
Istnieją dwa ogólne podejścia do pomiaru tempa przemiany materii4. Kalorymetria bezpośrednia mierzy wydatek energetyczny bezpośrednio poprzez pomiar produkcji ciepła. Kalorymetria pośrednia mierzy produkcję energii za pomocą innych środków, często za pomocą respirometrycznego pomiaru zużyciaO2 (VO2), produkcji CO2 lub obu. Chociaż kalorymetria bezpośrednia została zastosowana do małych ektotermii, w tym Drosophila melanogaster5, respirometria jest technicznie prostsza i częściej stosowana.
Kilka form respirometrii zostało z powodzeniem wykorzystanych do pomiaru tempa metabolizmu u dzikich i zmutowanych D. melanogaster i dostarczyło wglądu w metaboliczne efekty temperatury6, środowisko społeczne3, diet3,7,oraz zaburzenia neurorozwojowe8. Dzielą się one na dwie klasy, które różnią się znacznie pod względem kosztów i złożoności. Manometria jest najprostszą i najtańszą metodą9,10, w której muchy umieszcza się w szczelnej komorze, która zawiera absorbent CO2 i która jest połączona cienką kapilarą ze zbiornikiem płynu. W miarę zużywania O2 i absorpcji CO2 ciśnienie w komorze spada i płyn jest wciągany do kapilary. Objętość naczynia włosowatego wypełniona płynem jest zatem proporcjonalna do VO2. Bardziej rozbudowane wersje, które kompensują siłę wywieraną przez płyn w kapilarze, zostały również użyte na D. melanogaster1. Manometria ma tę zaletę, że jest prosta i niedroga, ale ponieważ jest wrażliwa na ciśnienie, wymaga stałych warunków środowiskowych. Ponadto, ponieważ zużyty O2 nie jest wymieniany, ciśnienie parcjalne O2 (PO2) stopniowo spada wewnątrz komór.
Respirometria z wykorzystaniem analizy gazowej jest również regularnie stosowana dla D. melanogaster. W tym przypadku gazy są próbkowane w regularnych odstępach czasu z zamkniętych komór zawierających muchy i wysyłane do analizatora podczerwieni2,6,11. Ten typ aparatury ma tę zaletę, że jest dostępny na rynku, jest mniej wrażliwy na warunki środowiskowe, a gazy są odświeżane podczas pobierania próbek, dzięki czemu PO2 pozostaje stabilny. Jednak sprzęt może być drogi i skomplikowany w obsłudze.
Niedawno opracowany mikrorespirometr kulometryczny12 stanowi niedrogą, czułą i stabilną alternatywę dla istniejących systemów. W praktyce organizm umieszcza się w hermetycznej komorze, w której zużywaO2, a wydychany CO2 jest usuwany przez materiał absorpcyjny, co powoduje spadek ciśnienia w komorze netto. Gdy ciśnienie wewnętrzne spada do wstępnie ustawionego progu (próg ON), prąd przepływa przez generator elektrolitycznyO2, zwracając ciśnienie do drugiego progu (próg OFF), zatrzymując elektrolizę. Przenoszenie ładunku przez generatorO2 jest wprost proporcjonalne do ilości O2 wymaganej do ponownego zwiększenia ciśnienia w komorze i dlatego może być wykorzystane do pomiaru O2 zużywanego przez organizm4. Metoda jest bardzo czuła, precyzyjnie mierzy VO2, a regularna wymianaO2 może utrzymać PO2 na prawie stałym poziomie przez godziny lub dni.
Kulometryczny mikrorespirometr używany w tym badaniu wykorzystuje multimodalny (ciśnienie, temperatura i wilgotność) elektroniczny czujnik. Czujnik jest obsługiwany przez mikrokontroler, który wykrywa niewielkie zmiany ciśnienia i aktywuje wytwarzanieO2 po osiągnięciu progu niskiego ciśnienia12. Aparatura ta jest składana z gotowych części, może być używana w wielu różnych komorach i środowiskach eksperymentalnych i została z powodzeniem wykorzystana do badania wpływu masy ciała i temperatury na chrząszcza Tenebrio molitor. W niniejszym badaniu mikrorespirometr został przystosowany do pomiaru zużyciaO2 u D. melanogaster, który ma około 1% masy T. molitor. Czułość aparatury została zwiększona poprzez obniżenie progu aktywacji wytwarzaniaO2, a stabilność środowiskowa została zwiększona poprzez przeprowadzenie eksperymentów w łaźni wodnej o kontrolowanej temperaturze oraz poprzez utrzymanie wilgotności wewnątrz komór na poziomie lub zbliżonym do 100%.
Białko CASK (kinaza białkowa seryny zależna od kalmoduliny), część rodziny kinaz guanylanowych związanych z błoną (MAGUK), jest molekularnym rusztowaniem w różnych kompleksach wielobiałkowych, a mutacje w CASK są związane z zaburzeniami neurorozwojowymi u ludzi i u D. melanogaster13,14. Żywotny mutant D. melanogaster, CASKΔ18, zakłóca aktywność neuronów dopaminergicznych15 i zmniejsza poziom aktywności o ponad 50% w porównaniu z kontrolami kongenicznymi14,16. Ze względu na obniżony poziom aktywności mutantów CASK i rolę katecholamin w regulacji metabolizmu17 postawiliśmy hipotezę, że ich standardowe tempo przemiany materii, a tym samym zużycieO2, zostanie radykalnie zmniejszone w porównaniu z kontrolami.
Zużycie O2 zostało zmierzone w CASKΔ18 i ich kongenerach typu dzikiego, w(ex33). Grupy much umieszczono w komorach respirometrycznych, zmierzono zużycieO2, obliczono zużycieO2 i wyrażono je zarówno w odniesieniu do masy, jak i na muchę. Aparatura zarejestrowała VO2 u much typu dzikiego, co było zgodne z wcześniejszymi badaniami i mogło rozróżnić spożycie O2 na muchę u much dzikich i zmutowanych CASK.

<table><tbody><tr><td>Adapter termometru 19/22</td><td>Wilmad-Labglass</td><td>ML-280-702</td><td>Wtyczka czujnika</td></tr><tr><td>2 ml Rurki z nakrętką</td><td>Fisher</td><td>3464</td><td>Generator O2</td></tr><tr><td>Złącze 2-pinowe</td><td>Zyamy</td><td>40PIN-RFB10</td><td>Generator O2: przycięty do 2-pinowego</td></tr><tr><td>4-pinowego złącza żeńskiego</td><td>TE Connectivity</td><td>215299-4</td><td>Wtyczka czujnika</td></tr><tr><td>5 ml Rurka polipropylenowa</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>przycięta do 5,5 cm i perforowana&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml Schlenk Tube 19/22 Przegub</td><td>Laboy</td><td>HMF050804</td><td></td></tr><tr><td>Komora 6-żyłowy</td><td>Zenith</td><td>6-żyłowy 26 ga</td><td></td></tr><tr><td>6-pinowe żeńskie złącze grodziowe</td><td>Switchcraft</td><td>17982-6SG-300</td><td>Kontroler</td></tr><tr><td>6-pinowe złącze żeńskie</td><td>Switchcraft</td><td>18982-6SG-522</td><td>Wtyczka czujnika</td></tr><tr><td>6-pinowe złącze męskie</td><td>Switchcraft</td><td>16982-6PG-522</td><td></td></tr><tr><td>800 ul rurka wirówkowa</td><td>Fisher</td><td>05-408-120</td><td>Wkład sodowo-wapniowy</td></tr><tr><td>ABS Plastikowa obudowa</td><td>Bud Industries</td><td>Kontroler PS-11533-G</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Nano Każdy</td><td>kontroler</td><td>ABX00028 Arduino LLC</td><td></td></tr><tr><td>Czujnik BME 280</td><td>DIYMall</td><td>FZ1639-BME280</td><td>Płytka drukowana wtyczki czujnika</td></tr><tr><td></td><td>Lheng</td><td>5 X 7 cm</td><td>Kontroler</td></tr><tr><td>Siarczan miedzi</td><td>BioPharm</td><td>BC2045</td><td>O2 Generator</td></tr><tr><td>Komputer</td><td>Azulle</td><td>Byte4</td><td>Akwizycja danych</td></tr><tr><td>Bawełniane bułki</td><td>Kajukajudo</td><td>#2</td><td>Przecięte na pół, aby zatkać rurki przeciw muchom Pocięte na ćwiartki dla wilgoci</td></tr><tr><td>Komora środowiskowa</td><td>Percival</td><td>I30 VLC8</td><td>Żywica</td></tr><tr><td>epoksydowa</td> do pielęgnacji much<td>JB Weld</td><td>Plastic Bonder</td><td>Bezpieczne elektrody w generatorze O2</td></tr><tr><td>Fly Food</td><td>Lab Express</td><td>Type R</td><td>Fly Care</td></tr><tr><td>Keck Clamps</td><td>uxcell</td><td>a20092300ux0418</td><td>Zabezpiecza szklane połączenie komory z zatyczką</td></tr><tr>Wtyczka <td>czujnika</td>epoksydowego <td>Loctite</td><td>E-30CL</td> o<td>niskiej lepkości</td></tr><tr><td>Wyświetlacz OLED Kontroler</td><td>IZOKEE</td><td>IZKE31-IIC-WH-3</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Wire 24 ga</td><td>uGems</td><td>14349</td><td>Generator O2</td></tr><tr><td>Smar silikonowy</td><td>Dow-Corning</td><td>High Vacuum Grease</td><td>Seals Połączenie komora-grzyb</td></tr><tr><td>Soda Wapno</td><td>Jorvet</td><td>JO553</td><td>Absorpcja CO2</td></tr><tr><td>Przełącznik dwustabilny</td><td>E-Switch</td><td>100SP1T1B1M1QEH</td><td>Kontroler</td></tr><tr><td>USB Sabrent</td><td></td><td>Kontroler CB-UM63</td><td>Hub</td></tr><tr><td>USB Hub</td><td>Atolla</td><td>Hub 3.0</td><td>Podłącz kontrolery do komputera</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Amersham</td><td>56-1165-33</td><td>Kontrola temperatury</td></tr><tr><td>Zbiornik do kąpieli wodnej</td><td>Szklane klatki</td><td>15-litrowa akrylowa wanna bez kołnierza</td> do <td>respirometrów</td></tr></tbody></table>

pomiar zużyciao2 u drosophila melanogaster za pomocą mikrorespirometrii kulometrycznej

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

Mikrorespirometria kulometryczna to prosta, tania metoda pomiaru zużycia O2 przez małe organizmy przy jednoczesnym utrzymaniu stabilnego środowiska. Mikrorespirometr kulometryczny składa się z hermetycznej komory, w której O2 jest zużywany, a CO2 wytwarzany przez organizm jest usuwany przez pożywkę absorpcyjną. Wynikający z tego spadek ciśnienia wyzwala produkcję elektrolituO2, a ilość wytwarzanegoO2 jest mierzona poprzez rejestrowanie ilości ładunku użytego do jego wytworzenia. W niniejszej pracy metoda została dostosowana do Drosophila melanogaster testowanego w małych grupach, z czułością aparatu i warunkami środowiskowymi zoptymalizowanymi pod kątem wysokiej stabilności. Ilość O2 spożywana przez muchy typu dzikiego w tym aparacie jest zgodna z ilością mierzoną w poprzednich badaniach. Specyficzne dla masy spożycieO2 przez mutanty CASK, które są mniejsze i wiadomo, że są mniej aktywne, nie różniło się od kontroli kongenicznych. Jednak niewielki rozmiar mutantów CASK spowodował znaczne zmniejszenie zużyciaO2 w przeliczeniu na muchę. Dlatego mikrorespirometr jest w stanie zmierzyć zużycieO2 u D. melanogaster, może rozróżniać niewielkie różnice między genotypami i dodaje wszechstronne narzędzie do pomiaru tempa metabolizmu.

Wyjścia ciśnienia i prądu kontrolera respirometru dla jednej komory w jednym eksperymencie przedstawiono na Ryc. 3A. Pierwszy, długi impuls prądu zwiększył ciśnienie w komorze z ciśnienia otoczenia (około 992 hPa) do ustalonego progu wyłączenia (OFF) wynoszącego 1017 hPa. W miarę jak muchy zużywały O2, a CO2 był pochłaniany, ciśnienie powoli spadało, aż osiągnęło próg włączenia (ON) wynoszący 1016 hPa, co aktywowało przepływ prądu przez generator O2. W przeds...

Kulometryczna respirometria jest idealna do pomiaru tempa metabolizmu małych organizmów. Po dostosowaniu do Drosophila melanogaster w niniejszym badaniu, zmierzone spożycieO2 mieściło się w zakresie zgłoszonym dla dzikiego typu D. melanogaster w poprzednich badaniach. Konsumpcja O2 na muchę przez mutanty CASK, które są mniejsze i mniej aktywne, była znacznie niższa niż w przypadku typu dzikiego.

Pomiar zużyciaO2 u Drosophila melanogaster za pomocą mikrorespirometrii kulometrycznej

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

Nasze badania koncentrują się na tym, jak temperatura i aktywność wpływają na metabolizm owadów. Jest to niezbędne, aby zrozumieć, w jaki sposób gatunki ewoluowały, aby przetrwać w swoim otoczeniu i jak będą nadal przystosowywać się do zmieniającego się świata. Zrozumienie fizjologii i zachowania poszczególnych organizmów jest kluczowe dla tego przedsięwzięcia.Tempo przemiany materii można mierzyć bezpośrednio, mierząc produkcję ciepła lub pośrednio, mierząc zużycie tlenu lub produkcję dwutlenku węgla. Chociaż technicznie możliwe jest zmierzenie produkcji ciepła przez organizm tak mały jak muszka owocowa, częściej stosuje się metody pośrednie. Obecne wyzwania związane z pomiarem metabolizmu w tej skali obejmują koszty, stabilność środowiska i niezawodność.Dostępne na rynku systemy są niezawodne, stabilne i stosunkowo łatwe do zakupu, ale mogą być skomplikowane i drogie. Manometry dla majsterkowiczów są niedrogie, ale mogą wprowadzać błędy i wymagać produkcji dla każdego eksperymentu. Respirometr kulometryczny jest stosunkowo niedrogi, łatwy w obsłudze, zapewnia wygodny odczyt parametrów środowiskowych, a wszystkie elementy są wielokrotnego użytku.Ponadto regularna wymiana tlenu utrzymuje stabilne środowisko przez wiele godzin, a nawet dni W laboratorium będziemy badać zmienność metaboliczną między ustalonymi szczepami kontrolnymi Drosophila oraz wpływ hiper i hipoaktywnych mutantów na zużycie tlenu. W terenie zaczniemy badać tempo metabolizmu i tolerancję temperatury dzikich chrząszczy przystosowanych do życia w pustyni. Zacznij od utrzymywania much w temperaturze 25 stopni Celsjusza w wąskich fiolkach wypełnionych standardowym pokarmem dla drosophila.Włącz łaźnię wodną i dostosuj temperaturę zgodnie z wymaganiami. Użyj chusteczki laboratoryjnej spryskanej 70% etanolem, aby wyczyścić zmielone szklane połączenia komór i zaślepek czujników, a następnie użyj świeżej chusteczki, aby usunąć pozostały etanol. Następnie umieść na dnie komory centymetrowy kawałek bawełnianej rolki nasączonej oczyszczoną wodą, aby stworzyć stabilne środowisko wilgotności.Dodaj tyle wody, aby utworzyć skromną kałużę u podstawy bawełnianej rolki. Upewnij się, że złącze komory jest suche, wycierając rozlaną wodę. Ostrożnie przenieś muchy do oznakowanych rurek polipropylenowych za pomocą lejka i zatkaj rurki bawełnianą rolką.Teraz dodaj wentylowaną rurkę zawierającą muchy do każdej komory respirometru. Napełnij wkłady z wapnem sodowym i umieść je w górnej części rurki zawierającej muchy wewnątrz komory. Następnie napełnij generatory tlenu nasyconym roztworem siarczanu miedzi, upewniając się, że poziom pozostaje poniżej otworów wentylacyjnych.Podłącz napełniony generator tlenu do dwupinowego złącza znajdującego się na wtyczce czujnika. Umieść dwie małe krople przezroczystego smaru silikonowego po przeciwnych stronach szklanego złącza z uziemieniem wtyczki czujnika. Włóż korek do komory i delikatnie obracaj go z umiarkowanym naciskiem, aby równomiernie rozprowadzić smar w złączu.Zetrzyj nadmiar tłuszczu za pomocą chusteczki laboratoryjnej. Następnie zabezpiecz zaślepki komory, zatrzaskując się na plastikowych zaciskach Keck. Umieść zmontowane komory w stojaku w łaźni wodnej, upewniając się, że kurki są otwarte.Utrzymuj kurki w pozycji otwartej i pozwól komorom zrównoważyć się przez około 30 minut. Upewnij się, że przełączniki dostarczające prąd do generatorów tlenu są wyłączone. Podłącz sterowniki do komór respirometru za pomocą sześciu przewodów i sprawdź, czy wyświetlacze organicznych diod elektroluminescencyjnych na sterownikach aktywnie wyświetlają parametry środowiskowe.Teraz aktywuj generatory tlenu za pomocą przełącznika na sterowniku. Gdy wartość prądu wzrośnie od zera do poziomu od 35 do 55 miliamperów, sterownik i komora są gotowe do eksperymentów. Po wyłączeniu generatorów tlenu zidentyfikuj porty komunikacyjne, z których korzystają sterowniki.Otwórz oprogramowanie PuTTY na pulpicie i skonfiguruj plik dziennika dla każdego kanału respirometru, wybierając port komunikacyjny dla kontrolera, wprowadzając numer tego portu w polu linii szeregowej. Następnie kliknij przycisk Rejestrowanie. Wybierz dane wyjściowe do wydrukowania w rejestrowaniu sesji, a następnie pod nazwą pliku dziennika kliknij przycisk Przeglądaj.W wybranym folderze utwórz nazwę pliku zawierającą informacje opisowe, a następnie kliknij przycisk Zapisz. Kliknij przycisk Otwórz, a otworzy się okno z rejestrowanymi danymi rozdzielanymi przecinkami. Powtórz ten proces dla wszystkich innych używanych kontrolerów.Każde wejście portu komunikacyjnego zostanie wyświetlone w osobnym oknie. Po wyrównaniu komór przez 30 minut należy je uszczelnić, zamykając kurki. Przykryj wannę i komory pojemnikiem z pianki polistyrenowej, aby stworzyć stabilne środowisko i równoważyć przez godzinę.Zainicjuj prąd do generatora tlenu w każdej komorze za pomocą przełącznika znajdującego się na skrzynce sterownika. Po aktywacji generatorów tlenu sprawdź, czy ciśnienie wzrasta do wstępnie zdefiniowanego ciśnienia wyłączenia. Po eksperymencie wyłącz generatory tlenu na wszystkich sterownikach i otwórz kurki, aby rozszczelnić komory.Pozwól, aby okna PuTTY pozostały otwarte przez pięć do 15 minut, aby ustalić ostateczną linię bazową, a następnie zakończ nagrywanie, zamykając okno PuTTY dla każdego kontrolera. Odłącz czujniki od i przetransportuj komory do suchego stojaka. Jeden po drugim wyjmij zaślepki czujników z komór, odłącz generatory tlenu i ostrożnie umieść je w stojaku na probówki.Następnie zetrzyj smar z wtyczki czujnika i umieść go z powrotem w stojaku. Oczyść smar ze złączy komory i usuń rurki zawierające muchy i wapno sodowane. Na koniec zapisz wagę i liczbę much dla każdej rurki.Ilościowe dane dotyczące zużycia tlenu dla much z mutacją typu dzikiego i CASK delta 18 wykazały, że masowe jednostkowe zużycie tlenu nie różniło się znacząco między kontrolami typu dzikiego i mutantami CASK delta 18. Zużycie tlenu analizowane w przeliczeniu na muchę wykazało, że zużycie tlenu było znacznie zmniejszone w CASK delta 18 w porównaniu z kontrolami typu dzikiego. Jednak średnia masa much CASK delta 18 była niższa niż w przypadku kontroli typu dzikiego.

measuring-o2-consumption-drosophila-melanogaster-using-coulometric

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zaburzenia metaboliczne należą do najczęstszych chorób u ludzi. Genetycznie podatny organizm modelowy D. melanogaster może być wykorzystany do identyfikacji nowych genów regulujących metabolizm. W artykule opisano stosunkowo prostą metodę, która pozwala na badanie tempa przemiany materii u much poprzez pomiar ich produkcji CO2 .

Pomiar tempa przemiany materii u Drosophila za pomocą respirometrii

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru utleniania paliwa u Drosophila melanogaster, w której muchom podawane są śladowe ilości specyficznych, znakowanych radioaktywnie substratów metabolicznych. Wydychany znakowany radioizotopowo CO2 powstający w wyniku utleniania paliwa jest zbierany i mierzony.

Pomiar produkcji dwutlenku węgla z substratów znakowanych radioaktywnie u Drosophila melanogaster

W tym artykule opisana jest metoda pomiaru zużycia tlenu za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości w permeabilizowanych piersiach Drosophila. Technika ta wymaga minimalnej ilości tkanki w porównaniu z klasyczną techniką izolacji mitochondriów, a uzyskane wyniki są bardziej istotne fizjologicznie.

Pomiar mitochondrialnego zużycia tlenu w przepuszczalnych włóknach Drosophila przy użyciu minimalnych ilości tkanki

Test podawania mikropłytek oferuje ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania spożycia płynów u Drosophila. Urządzenie wydrukowane w 3D łączy 96-dołkową mikropłytkę, w której trzymane są muchy, z 1536-dołkową mikropłytką, z której muchy spożywają roztwór pokarmowy z barwnikiem znacznikowym. Spadek objętości roztworu jest mierzony spektrofotometrycznie.

Wysokoprzepustowy test na mikropłytkach do ilościowego oznaczania spożycia u Drosophila

Technika ta umożliwia zastosowanie wysokorozdzielczej spektroskopii protonowej MR z rotacją pod kątem magicznym (HRMAS 1H-MRS) do charakterystyki molekularnej żywych Drosophila melanogaster przy użyciu konwencjonalnego spektrometru o indukcji 14,1 tesla wyposażonego w sondę HRMAS.

Spektroskopia rezonansu magnetycznego żywych much Drosophila melanogaster z wykorzystaniem wiru pod magicznym kątem

Reakcje elektrofizjologiczne neuronów sensorycznych węchu na odoranty u owadów można mierzyć za pomocą rejestracji z pojedynczych sensyli. W tym artykule wideo zademonstrujemy, jak przeprowadzić rejestrację z pojedynczych sensyli w czułkach muszki owocowej (Drosophila melanogaster) oraz w palpach szczękowych komara malarycznego (Anopheles gambiae).

Rejestracja z pojedynczych sensyli u owadów Drosophila melanogaster oraz Anopheles gambiae

Genetycznie kodowane narzędzia optogenetyczne umożliwiają nieinwazyjną manipulację specyficznymi neuronami w mózgu Drosophila. Takie narzędzia mogą identyfikować neurony, których aktywacja jest wystarczająca do wywołania lub stłumienia określonych zachowań. W tym miejscu przedstawiamy metodę aktywacji rodopsyny kanałowej2, która ulega ekspresji w docelowych neuronach u swobodnie chodzących muszek.

Optogenetyczna stymulacja zachowań ucieczkowych u Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster są przydatne w badaniu manipulacji genetycznych lub środowiskowych, które wpływają na zachowania takie jak spontaniczna aktywność lokomotoryczna. Tutaj opisujemy protokół, który wykorzystuje monitory z wiązkami podczerwieni i oprogramowanie do analizy danych do ilościowego określania spontanicznej aktywności lokomotorycznej.

Oznaczanie spontanicznej aktywności lokomotorycznej u Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia unikania osób zestresowanych. Ten paradygmat jest potężny, ale przyjazny dla użytkownika i może być wykorzystany do oceny wpływu genów i środowiska na jeden rodzaj interakcji społecznych u Drosophila melanogaster.

Prosty test do ilościowego oznaczania unikania społecznego u Drosophila melanogaster

Wpływ genów i środowiska na przestrzeń społeczną Drosophila melanogaster można określić ilościowo za pomocą potężnego, ale prostego paradygmatu analitycznego. Pokazujemy tutaj różne czynniki, które mogą wpływać na tę przestrzeń społeczną, a zatem muszą być brane pod uwagę przy projektowaniu eksperymentów w tym paradygmacie.

Warunki wpływające na przestrzeń społeczną u Drosophila melanogaster

Poznaj mikrorespirometrię kulometryczną do pomiaru zużycia tlenu u Drosophila melanogaster. Metoda pozwala badać wpływ mutacji CASK na metabolizm owadów w kontrolowanych warunkach temperaturowych.

Pomiar zużycia_O2 u Drosophila melanogaster za pomocą mikrorespirometrii kulometrycznej

Przeglądaj więcej filmów