Pomiar zużycia_O2 u Drosophila melanogaster za pomocą mikrorespirometrii kulometrycznej

Nasze badania koncentrują się na tym, jak temperatura i aktywność wpływają na metabolizm owadów. Jest to niezbędne, aby zrozumieć, w jaki sposób gatunki ewoluowały, aby przetrwać w swoim otoczeniu i jak będą nadal przystosowywać się do zmieniającego się świata. Zrozumienie fizjologii i zachowania poszczególnych organizmów jest kluczowe dla tego przedsięwzięcia.

Tempo przemiany materii można mierzyć bezpośrednio, mierząc produkcję ciepła lub pośrednio, mierząc zużycie tlenu lub produkcję dwutlenku węgla. Chociaż technicznie możliwe jest zmierzenie produkcji ciepła przez organizm tak mały jak muszka owocowa, częściej stosuje się metody pośrednie. Obecne wyzwania związane z pomiarem metabolizmu w tej skali obejmują koszty, stabilność środowiska i niezawodność.

Dostępne na rynku systemy są niezawodne, stabilne i stosunkowo łatwe do zakupu, ale mogą być skomplikowane i drogie. Manometry dla majsterkowiczów są niedrogie, ale mogą wprowadzać błędy i wymagać produkcji dla każdego eksperymentu. Respirometr kulometryczny jest stosunkowo niedrogi, łatwy w obsłudze, zapewnia wygodny odczyt parametrów środowiskowych, a wszystkie elementy są wielokrotnego użytku.

Ponadto regularna wymiana tlenu utrzymuje stabilne środowisko przez wiele godzin, a nawet dni W laboratorium będziemy badać zmienność metaboliczną między ustalonymi szczepami kontrolnymi Drosophila oraz wpływ hiper i hipoaktywnych mutantów na zużycie tlenu. W terenie zaczniemy badać tempo metabolizmu i tolerancję temperatury dzikich chrząszczy przystosowanych do życia w pustyni. Zacznij od utrzymywania much w temperaturze 25 stopni Celsjusza w wąskich fiolkach wypełnionych standardowym pokarmem dla drosophila.

Włącz łaźnię wodną i dostosuj temperaturę zgodnie z wymaganiami. Użyj chusteczki laboratoryjnej spryskanej 70% etanolem, aby wyczyścić zmielone szklane połączenia komór i zaślepek czujników, a następnie użyj świeżej chusteczki, aby usunąć pozostały etanol. Następnie umieść na dnie komory centymetrowy kawałek bawełnianej rolki nasączonej oczyszczoną wodą, aby stworzyć stabilne środowisko wilgotności.

Dodaj tyle wody, aby utworzyć skromną kałużę u podstawy bawełnianej rolki. Upewnij się, że złącze komory jest suche, wycierając rozlaną wodę. Ostrożnie przenieś muchy do oznakowanych rurek polipropylenowych za pomocą lejka i zatkaj rurki bawełnianą rolką.

Teraz dodaj wentylowaną rurkę zawierającą muchy do każdej komory respirometru. Napełnij wkłady z wapnem sodowym i umieść je w górnej części rurki zawierającej muchy wewnątrz komory. Następnie napełnij generatory tlenu nasyconym roztworem siarczanu miedzi, upewniając się, że poziom pozostaje poniżej otworów wentylacyjnych.

Podłącz napełniony generator tlenu do dwupinowego złącza znajdującego się na wtyczce czujnika. Umieść dwie małe krople przezroczystego smaru silikonowego po przeciwnych stronach szklanego złącza z uziemieniem wtyczki czujnika. Włóż korek do komory i delikatnie obracaj go z umiarkowanym naciskiem, aby równomiernie rozprowadzić smar w złączu.

Zetrzyj nadmiar tłuszczu za pomocą chusteczki laboratoryjnej. Następnie zabezpiecz zaślepki komory, zatrzaskując się na plastikowych zaciskach Keck. Umieść zmontowane komory w stojaku w łaźni wodnej, upewniając się, że kurki są otwarte.

Utrzymuj kurki w pozycji otwartej i pozwól komorom zrównoważyć się przez około 30 minut. Upewnij się, że przełączniki dostarczające prąd do generatorów tlenu są wyłączone. Podłącz sterowniki do komór respirometru za pomocą sześciu przewodów i sprawdź, czy wyświetlacze organicznych diod elektroluminescencyjnych na sterownikach aktywnie wyświetlają parametry środowiskowe.

Teraz aktywuj generatory tlenu za pomocą przełącznika na sterowniku. Gdy wartość prądu wzrośnie od zera do poziomu od 35 do 55 miliamperów, sterownik i komora są gotowe do eksperymentów. Po wyłączeniu generatorów tlenu zidentyfikuj porty komunikacyjne, z których korzystają sterowniki.

Otwórz oprogramowanie PuTTY na pulpicie i skonfiguruj plik dziennika dla każdego kanału respirometru, wybierając port komunikacyjny dla kontrolera, wprowadzając numer tego portu w polu linii szeregowej. Następnie kliknij przycisk Rejestrowanie. Wybierz dane wyjściowe do wydrukowania w rejestrowaniu sesji, a następnie pod nazwą pliku dziennika kliknij przycisk Przeglądaj.

W wybranym folderze utwórz nazwę pliku zawierającą informacje opisowe, a następnie kliknij przycisk Zapisz. Kliknij przycisk Otwórz, a otworzy się okno z rejestrowanymi danymi rozdzielanymi przecinkami. Powtórz ten proces dla wszystkich innych używanych kontrolerów.

Każde wejście portu komunikacyjnego zostanie wyświetlone w osobnym oknie. Po wyrównaniu komór przez 30 minut należy je uszczelnić, zamykając kurki. Przykryj wannę i komory pojemnikiem z pianki polistyrenowej, aby stworzyć stabilne środowisko i równoważyć przez godzinę.

Zainicjuj prąd do generatora tlenu w każdej komorze za pomocą przełącznika znajdującego się na skrzynce sterownika. Po aktywacji generatorów tlenu sprawdź, czy ciśnienie wzrasta do wstępnie zdefiniowanego ciśnienia wyłączenia. Po eksperymencie wyłącz generatory tlenu na wszystkich sterownikach i otwórz kurki, aby rozszczelnić komory.

Pozwól, aby okna PuTTY pozostały otwarte przez pięć do 15 minut, aby ustalić ostateczną linię bazową, a następnie zakończ nagrywanie, zamykając okno PuTTY dla każdego kontrolera. Odłącz czujniki od i przetransportuj komory do suchego stojaka. Jeden po drugim wyjmij zaślepki czujników z komór, odłącz generatory tlenu i ostrożnie umieść je w stojaku na probówki.

Następnie zetrzyj smar z wtyczki czujnika i umieść go z powrotem w stojaku. Oczyść smar ze złączy komory i usuń rurki zawierające muchy i wapno sodowane. Na koniec zapisz wagę i liczbę much dla każdej rurki.

Ilościowe dane dotyczące zużycia tlenu dla much z mutacją typu dzikiego i CASK delta 18 wykazały, że masowe jednostkowe zużycie tlenu nie różniło się znacząco między kontrolami typu dzikiego i mutantami CASK delta 18. Zużycie tlenu analizowane w przeliczeniu na muchę wykazało, że zużycie tlenu było znacznie zmniejszone w CASK delta 18 w porównaniu z kontrolami typu dzikiego. Jednak średnia masa much CASK delta 18 była niższa niż w przypadku kontroli typu dzikiego.