Name: Mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj mikroskopię ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi in vitro. Ta metoda umożliwia trójwymiarową rekonstrukcję nanostruktur komórkowych przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dolores Campos za pomoc w hodowli komórek Vero i Romnie Manarin za pomoc w hodowli T. cruzi. Prace te były wspierane przez Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva z Argentyny (PICT2019-0526), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (PIBAA 1242) oraz Research Council United Kingdom [MR/P027989/1].

Ultrastructural Expansion Microscopy in In Vitro Life Cycle of Trypanosoma cruzi

<ol><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li>
<li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li>
<li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+%28U-ExM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2018).</li>
<li>Tillberg, P. W., Chen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%3A+Scalable+and+convenient+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy: Scalable and convenient super-resolution microscopy.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 35, 683-701 (2019).</li>
<li>Jurriens, D., van Batenburg, V., Katrukha, E. A., Kapitein, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+neuronal+cytoskeleton+using+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mapping the neuronal cytoskeleton using expansion microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 161, 105-124 (2021).</li>
<li>Alonso, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+expansion+microscopy+%28U-ExM%29+in+Trypanosoma+cruzi%3A+localization+of+tubulin+isoforms+and+isotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) in Trypanosoma cruzi: localization of tubulin isoforms and isotypes.</a> Parasitology Research. 121 (10), 3019-3024 (2022).</li>
<li>Kalichava, A., Ochsenreiter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+expansion+microscopy+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure expansion microscopy in Trypanosoma brucei.</a> Open Biology. 11 (10), 210132(2021).</li>
<li>Amodeo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+novel+mitochondrial+genome+segregation+factor+TAP110+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of the novel mitochondrial genome segregation factor TAP110 in Trypanosoma brucei.</a> Journal of Cell Science. 134 (5), (2021).</li>
<li>Liffner, B., Absalon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+reveals+plasmodium+falciparum+blood-stage+parasites+undergo+anaphase+with+a+chromatin+bridge+in+the+absence+of+mini-chromosome+maintenance+complex+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy reveals plasmodium falciparum blood-stage parasites undergo anaphase with a chromatin bridge in the absence of mini-chromosome maintenance complex binding protein.</a> Microorganisms. 9 (11), 2306(2021).</li>
<li>Dos Santos Pacheco, N., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+auxin-inducible+degron+system+with+ultrastructure+expansion+microscopy+to+accelerate+the+discovery+of+gene+function+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling auxin-inducible degron system with ultrastructure expansion microscopy to accelerate the discovery of gene function in Toxoplasma gondii.</a> Methods in Molecular Biology. 2369, 121-137 (2021).</li>
<li>Lidani, K. C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chagas+disease%3A+From+discovery+to+a+worldwide+health+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Chagas disease: From discovery to a worldwide health problem.</a> Frontiers in Public Health. 7, 166(2019).</li>
<li>Carrea, A., Diambra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+approach+to+model+the+life+cycle+of+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Systems biology approach to model the life cycle of Trypanosoma cruzi.</a> PloS One. 11 (1), e0146947(2016).</li>
<li>Vidal, J. C., De Souza, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVidal%2C+JC+%22Morphological+and+Functional+Aspects+of+Cytoskeleton+of+Trypanosomatids.+Cytoskeleton+-+Structure%2C+Dynamics%2C+Function+and+Disease%22">Morphological and Functional Aspects of Cytoskeleton of Trypanosomatids. Cytoskeleton - Structure, Dynamics, Function and Disease</a>. , InTech. (2017).</li>
<li>Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+expansion+microscopy+to+visualize+and+characterize+the+morphology+of+mitochondrial+cristae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 617(2020).</li>
<li>Laporte, M. H., Klena, N., Hamel, V., Guichard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+native+cellular+organization+by+coupling+cryofixation+with+expansion+microscopy+%28Cryo-ExM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing the native cellular organization by coupling cryofixation with expansion microscopy (Cryo-ExM).</a> Nature Methods. 19 (2), 216-222 (2022).</li>
<li>Sahabandu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+for+the+analysis+of+centrioles+and+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy for the analysis of centrioles and cilia.</a> Journal of Microscopy. 276 (3), 145-159 (2019).</li>
<li>Wen, G., Leen, V., Rohand, T., Sauer, M., Hofkens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+expansion+microscopy%3A+chemical+strategies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Current progress in expansion microscopy: chemical strategies and applications.</a> Chemical Reviews. 123 (6), 3299-3323 (2023).</li>
<li>Trinks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+of+immunological+synapse+formation+between+NK+cells+and+A.+fumigatus+by+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging of immunological synapse formation between NK cells and A. fumigatus by expansion microscopy.</a> Communications Biology. 4 (1), 1151(2021).</li>
<li>White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Lipid expansion microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).</li>
<li>Steib, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TissUExM+enables+quantitative+ultrastructural+analysis+in+whole+vertebrate+embryos+by+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">TissUExM enables quantitative ultrastructural analysis in whole vertebrate embryos by expansion microscopy.</a> Cell Reports Methods. 2 (10), 100311(2022).</li>
<li>Shaib, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+proteins+by+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Visualizing proteins by expansion microscopy.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>M'Saad, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+visualization+of+specific+molecules+in+the+ultrastructural+context+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">All-optical visualization of specific molecules in the ultrastructural context of brain tissue.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej to technika, która pozwala na uzyskanie obrazów próbek biologicznych o wysokiej rozdzielczości poprzez fizyczne rozszerzenie ich do kilkukrotnego rozmiaru pierwotnego. Protokół U-ExM obejmuje kilka krytycznych kroków, które należy starannie wykonać, aby osiągnąć optymalne wyniki4. Najpierw próbka musi zostać utrwalona za pomocą środka CP i osadzona w pęczniejącej matrycy hydrożelowej. Formaldehyd obecny w roztworze CP oddziałuje z wolnymi wiązaniami kowalen...

Mikroskopia ekspansywacyjna (ExM) została opisana po raz pierwszy w 2015 roku przez Boydena i wsp.1. Jest to protokół obrazowania, dzięki któremu konwencjonalny mikroskop może osiągnąć rozdzielczość przestrzenną poniżej limitu dyfrakcji. Ta wyższa rozdzielczość jest uzyskiwana dzięki fizycznemu powiększeniu próbki. Aby to osiągnąć, znakowane fluorescencyjnie cząsteczki są sieciowane w hydrożelu, który jest następnie rozprężany izotropowo z wodą. W wyniku tej ekspansji sygnały są rozdzielone prawie izotropowo we wszystkich trzech wymiarach. Metoda ta wykorzystuje tanie chemikalia i umożliwia rozdzielczość przestrzenną około 65 nm przy użyciu konwencjonalnych (konfokalnych) mikroskopów, co jest około czterokrotnie lepszą rozdzielczością niż standardowa rozdzielczość mikroskopu konfokalnego (około 250 nm)1.
Kolejnym kamieniem milowym, który umożliwił zastosowanie mikroskopii ekspansywnej w wielu dziedzinach biologii, było dostosowanie znakowania immunofluorescencyjnego za pomocą konwencjonalnych przeciwciał2. Kolejną adaptacją pierwotnie opublikowanego protokołu ExM jest powiększona analiza proteomu (MAP)3. W metodzie tej zastosowano wysokie stężenia akrylamidu i paraformaldehydu przed zanurzeniem próbki w hydrożelu, aby zapobiec sieciowaniu wewnątrz- i międzybiałkowemu, co doprowadziło do lepszego zachowania zawartości białka w próbkach i architektury subkomórkowej. Ten alternatywny protokół został zoptymalizowany w celu uzyskania lepszej konserwacji ogólnej ultrastruktury izolowanych organelli poprzez wykorzystanie niższych stężeń środków utrwalających (formaldehydu/paraformaldehydu i akrylamidu); podejście to zostało nazwane mikroskopią ekspansji ultrastrukturalnej (U-ExM)4.
Aby uzyskać jeszcze większą rozdzielczość, połączenie ExM z technikami mikroskopii superrozdzielczej, w tym mikroskopią zubożenia emisji stymulowanej lub mikroskopią lokalizacji pojedynczych cząsteczek, zostało również zgłoszone w celu osiągnięcia rozdzielczości poniżej 20 nm5.
Użycie ExM było szeroko opisywane w dziedzinach neuronauki i badań nad cytoszkieletami6, ale przeprowadzono tylko kilka badań na pasożytniczych protistach. Nasze laboratorium jako pierwsze poinformowało o zastosowaniu U-ExM w T. cruzi7. Protokół podstawowy opiera się głównie na poprzednich raportach U-ExM w Toxoplasma gondii, Plasmodium ssp. i Trypanosoma brucei8,9,10,11.
Jedną z największych zalet ExM jest jego modułowy charakter, który pozwala na dużą elastyczność w dostosowywaniu się do różnych próbek biologicznych. Protokół można podzielić na etapy (takie jak utrwalanie, zapobieganie sieciowaniu lub żelowanie), które użytkownik może łatwo dostosować do swoich wymagań eksperymentalnych. Dodatkowo potok ten może być modyfikowany w celu zwiększenia kompatybilności z organizmem modelowym lub osiągnięcia określonej rozdzielczości. W rezultacie, ExM oferuje ogromny potencjał zarówno dla zaawansowanych, jak i niezaawansowanych systemów optycznych, zapewniając szersze zastosowania w przyszłości.
Choroba Chagasa, zwana także trypanosomatozą amerykańską, jest endemiczną chorobą w Ameryce Łacińskiej wywoływaną przez Trypanosoma cruzi, pasożyta pierwotniaka. Cykl życiowy pasożyta jest złożony i obejmuje dwa etapy rozwojowe u ssaków i dwa u żywiciela owada (członka rodziny Triatominidae), który jest biologicznym wektorem tej choroby. Choroba Chagasa należy do grupy zaniedbanych chorób tropikalnych wymienionych przez Światową Organizację Zdrowia i stanowi poważny problem gospodarczy i społeczny w Ameryce Łacińskiej. Badania epidemiologiczne szacują, że 8 milionów ludzi na całym świecie żyje z chorobą Chagasa i ponad 10 000 zgonów rocznie. Liczby te ilustrują znaczenie choroby Chagasa jako problemu zdrowia publicznego na całym świecie. Rozmieszczenie geograficzne choroby Chagasa zmieniło się w ostatnich dziesięcioleciach, a wiele zarażonych osób mieszka obecnie w dużych obszarach miejskich na całym świecie z powodu zwiększonych migracji, w przeciwieństwie do głównie wiejskich obszarów Ameryki Łacińskiej, gdzie pierwotnie została znaleziona12.
Etapy rozwoju T. cruzi różnią się w całym cyklu życia, który może być całkowicie odtworzony in vitro. Epimastigoty są formami replikacyjnymi w wektorze owada i mają kuliste jądro w centralnym obszarze ciała komórki i kinetoplast w kształcie pręta (struktura zawierająca mitochondrialne DNA unikalną dla kinetoplastydów) w przedniej części względem jądra, z wolną wicią. Trypomastigoty są infekcyjną, niereplikacyjną formą i mają wydłużone jądro, zaokrąglony tylny kinetoplast i wić przyczepioną do błony plazmatycznej na całej długości pasożyta. Amastigoty są wewnątrzkomórkową formą replikacyjną; Mają jądro w centralnej części, kinetoplast w kształcie pręcika w przedniej części ciała komórki i zredukowaną wić. Zdolność przystosowania się pasożyta do różnych środowisk jest odzwierciedleniem tych zmian morfologicznych. Warto również wspomnieć, że ten cykl życia obejmuje symetryczny podział i różne przejściowe etapy rozwoju13. Podczas różnicowania cytoszkielet trypanosomatydów odgrywa kluczową rolę. Struktura ta jest utworzona przez gorset mikrotubul podbłonkowych ułożonych w uporządkowany układ stabilnych mikrotubul poniżej błony plazmatycznej. W organizmach tych występuje również pręt paraflagellar, który jest strukturą przypominającą siatkę, która biegnie równolegle i jest dołączona do aksonemu wiciowego14. Precyzyjna organizacja cytoszkieletu i zmiany strukturalne jądra wzdłuż etapów cyklu komórkowego obejmują unikalne mechanizmy regulacji genów specyficzne dla trypanosomatydów, co czyni je interesującymi modelami do badań biologii komórki.
Biorąc pod uwagę mały rozmiar T. cruzi i innych pasożytów pierwotniaków, U-ExM stanowi doskonałe narzędzie do analizy cech strukturalnych tych ważnych patogenów. Jak wspomniano wcześniej, zastosowanie tej techniki na T. cruzi zostało po raz pierwszy potwierdzone przez Dr. Alonso7. Raport ten szczegółowo opisuje kompletny protokół U-ExM, z naciskiem na immunolokalizację białek cytoszkieletu podczas różnych etapów cyklu życiowego T. cruzi. Zoptymalizowaliśmy również użycie estru N-hydroksysukcynimidu (NHS), znacznika pan-proteomu, który umożliwia nam oznaczanie różnych struktur pasożytniczych. Ponadto opisano metodologię in vitro pozwalającą na uzyskanie trzech etapów pasożyta.

<table><tbody><tr><td>0,22 mikrometra sterylne filtry strzykawkowe PES</td><td>Roztwory membranowe</td><td>SFPES030022S</td><td></td></tr><tr><td>1 l zlewka</td><td>Schott Duran</td><td>10005227</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikroprobówka wirówkowa SPINWIN</td><td>Tarson</td><td>T38-500010</td><td></td></tr><tr><td>10 ml jednorazowa sterylna symutka</td><td>NP</td><td>66-32</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipeta serologiczna sterylna</td><td>Jet Biofil</td><td>GSP211010</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 12 mm</td><td>Merienfeld GmbH</td><td>01 115 20</td><td>Szkiełka nakrywkowe okrągłe</td></tr><tr><td>Płytki 12-dołkowe</td><td>Jet Biofil</td><td>TCP011012</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 22 mm</td><td>Corning</td><td>2845-22</td><td>Szkiełka nakrywkowe kwadratowe</td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Jet Biofil</td><td>TCP-011-024</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka 250 ml</td><td>Schott Duran</td><td>C108.1</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Pasteur pipeta</td><td>Deltalab</td><td>200037</td><td></td></tr><tr><td>35-milimetrowe naczynia ze szklanym dnem</td><td>Szkło Matsunami ind</td><td>D11130H</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidine-2&prime;-phenylindol dichlorowodorek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>5 ml pipeta serologiczna sterylna</td><td>Jet Biofil</td><td>GSP010005</td><td></td></tr><tr><td>płytki 6-dołkowe</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>BioRad</td><td>1610101</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td>APS</td></tr><tr><td>ATTO 647 NHS ester</td><td>BOC Sciences</td><td>F10-0107</td><td>Do znakowania pan-proteomu</td></tr><tr><td>Szafka bezpieczeństwa</td><td>Telstar</td><td>Bio II A/P</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sodu bydlęcego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>BSA</td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-15A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe Tarsony Petridish</td><td>460095</td><td></td><td>średnicy 90 mm</td></tr><tr>DMEM, <td>Thermo Fisher Cientific</td><td>12100046</td><td>Powder</td>o<td>wysokiej zawartości glukozy</td></tr><tr><td>Elektroniczna suwmiarka cyfrowa</td><td>Radar</td><td>RADAR-SLIDE-CALIPER</td><td></td></tr><tr><td>Etanol Absolute</td><td>Supelco</td><td>1,00,98,31,000</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Internegocios SA</td><td>FCS FRA 500</td><td>Sterylny i inaktywowany termicznie</td></tr><tr><td>pakiet do przetwarzania obrazu Fidżi</td><td>ImageJ</td><td></td><td>doi:10.1038/nmeth.2019</td></tr><tr><td>Formaldehyd 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>FA</td></tr><tr><td>Glass Petridish</td><td>Marienfeld Superior</td><td>PM-3400300</td><td>średnica 60 mm</td></tr><tr><td>Glukoza D(+)</td><td>Cicarelli</td><td></td><td></td>716214</tr><tr><td>Aldehyd glutarowy 70%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>G7776</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG Przeciwciało wtórne FICT</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-095-003</td><td></td></tr><tr><td>Cylinder z podziałką</td><td>Nalgene</td><td>3663-1000</td><td></td></tr><tr><td>Szklana kolba</td> <td>z podziałkąGlassco</td><td>GL-274.202.01</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>IBR</td><td></td><td>Made in house</td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Frontier Scientific</td><td>H651-9</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny 36,8-38,0%</td> <td>Ciccarelli</td><td>918110</td><td></td></tr><tr><td>Wiadro na lód</td><td>Inkubator Corning</td><td>1167U68</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tecno Dalvo</td><td>TOC130</td><td></td></tr><tr><td>Napar z wątroby</td><td>Difco</td><td>226920</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne i grzałka</td><td>Towarzysz laboratoryjny</td><td>HP-3000</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka metalowa</td><td>SALTTECH</td><td>200MM</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta metalowa</td><td>Marienfeld Superior</td><td>PM-6633002</td><td></td></tr><tr><td>Metanol absolut</td><td>Cicarelli</td><td>897110</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówki 1,5 ml</td><td>Tarson</td><td>500010-N</td><td></td></tr><tr><td>Papier mikroskopowy KimWipes Kimtech</td><td>Science</td><td>B0013HT2QW</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q sistem wodny</td><td>Merk Millipore</td><td>IQ-7003</td><td></td></tr><tr><td>mysi klon anty-alfa tubuliny DM1A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9026</td><td></td></tr><tr><td>mysie przeciwciała anty-PFR</td><td>Oczyszczone Podarowane</td><td></td><td>przez Dr. Ariel Silber (USP</td></tr><tr><td>)N,N&acute;-metylenobisakryloamid</td><td>ICN</td><td>193997</td><td>Bis</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Cicarelli</td><td>834214</td><td></td></tr><tr><td>komora Neubauera</td><td>Pipeta Boeco</td><td>BOE 01</td><td></td></tr><tr><td>p1000</td><td>końcówki</td> do pipet Gilson <td>PIPETMAN P1000</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Pipeta</td><td>Tarson</td><td>TAR-521020B</td><td></td></tr><tr><td>p20</td> pipeta <td>Gilson</td><td>PIPETMAN P20</td><td></td></tr><tr><td>p20 końcówki do pipet</td><td>Tarson</td><td>TAR-527108</td><td></td></tr><tr><td>p200 pipeta</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAN P200</td><td></td></tr><tr><td>p200 końcówki do pipet</td><td>Tarson</td><td>TAR-521010Y</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>pH / ORP / &deg; Miernik C</td><td>HANNA Instruments</td><td>HI 2211</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna 0,1%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Cicarelli</td><td>867212</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Printex</td><td>BS 2982:1992</td><td></td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca "Parafilm M"</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Akrylan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408220-25G</td><td>SA</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Cicarelli</td><td>929211</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Cicarelli</td><td>750214</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>BioRad</td><td>1610302</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Merk</td><td>1-06498</td><td>Wirówka NaOH</td></tr><tr><td>Sorvall ST 16</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004380</td><td></td></tr><tr><td>Kolby T-25</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła</td><td>Elite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triptose</td><td>Merck</td><td>1106760500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioRad</td><td>1610719</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Biopack</td><td>2003-07</td><td>Polisorbat 20</td></tr><tr><td>Pompa</td> <td>próżniowaOgniwa Silfab</td><td>N33-A</td><td></td></tr><tr><td>Vero</td><td>ATCC</td><td>CRL-1587</td><td></td></tr><tr><td>Vortex MIxer</td><td>Dragon Lab</td><td>MX-S</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia trypanosoma cruzi in vitro

Ultrastructural Expansion Microscopy in Three In Vitro Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi

Opisujemy tutaj zastosowanie mikroskopii rozszerzania ultrastruktury (U-ExM) w Trypanosoma cruzi, techniki, która pozwala zwiększyć rozdzielczość przestrzenną komórki lub tkanki do obrazowania mikroskopowego. Odbywa się to poprzez fizyczne rozszerzenie próbki za pomocą gotowych chemikaliów i zwykłego sprzętu laboratoryjnego.
Choroba Chagasa jest powszechnym i palącym problemem zdrowia publicznego spowodowanym przez T. cruzi. Choroba jest powszechna w Ameryce Łacińskiej i stała się poważnym problemem w regionach nieendemicznych ze względu na zwiększoną migrację. Przenoszenie T. cruzi odbywa się za pośrednictwem hematofagicznych wektorów owadów należących do rodzin Reduviidae i Hemiptera. Po zakażeniu amastigoty T. cruzi namnażają się w organizmie ssaka i różnicują się w trypomastigoty, niereplikacyjną formę krwi. W wektorze owada trypomastigoty przekształcają się w epimastigoty i namnażają się poprzez rozszczepienie binarne. Różnicowanie między etapami cyklu życia wymaga rozległego przegrupowania cytoszkieletu i może być całkowicie odtworzone w laboratorium przy użyciu różnych technik hodowli komórkowych. 
Opisujemy tutaj szczegółowy protokół zastosowania U-ExM w trzech etapach cyklu życia in vitro Trypanosoma cruzi, koncentrując się na optymalizacji immunolokalizacji białek cytoszkieletu. Zoptymalizowaliśmy również użycie estru N-hydroksysukcynimidu (NHS), znacznika pan-proteomu, który umożliwił nam znakowanie różnych struktur pasożytów.

Jeśli protokół został wykonany prawidłowo (Rycina 1), próbki będą widoczne jako płaski i przezroczysty żel, który można rozszerzyć w wodzie do 4-4,5x (Rycina 3A). Rozszerzenie to zapewniło efektywną rozdzielczość wynoszącą około 70 nm, co może się różnić w zależności od końcowego stopnia rozszerzenia oraz zastosowanego systemu obrazowania. Po drugim procesie rozszerzenia i akwizycji obrazów w mikroskopie konfokalnym zaobserwowaliśmy stopnie rozszerzenia wynosząc...

To badanie pokazuje szczegółowy protokół do przeprowadzenia mikroskopii ekspansji ultrastruktury w trzech etapach cyklu życia in vitro Trypanosoma cruzi, patogenu odpowiedzialnego za chorobę Chagasa. Uwzględniamy zoptymalizowaną technikę białek cytoszkieletu i znakowania pan-proteomu.

Mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi in vitro

We describe here the application of ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) in Trypanosoma cruzi, a technique that allows increasing the spatial ...

Protokół ten szczegółowo opisuje metodę mikroskopii ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia in vitro Trypanosoma cruzi, patogenu odpowiedzialnego za chorobę Chagasa. Protokół ten stanowi alternatywę dla obecnych technik obrazowania w super rozdzielczości i mikroskopii elektronowej, a jego zaletą jest kompatybilność z konwencjonalnymi mikroskopami znajdującymi się w większości laboratoriów biologicznych i w głównych obiektach maszynowych. Wykorzystuje techniki typowe dla większości laboratoriów badawczych w celu uzyskania obrazów, które umożliwiają trójwymiarową rekonstrukcję.Protokół ułatwia badanie struktur w nanoskali u trypanosomatidów, umożliwiając inspekcję populacji komórek i obrazowanie całej objętości komórki będącej przedmiotem zainteresowania w wysokiej rozdzielczości. Jest to szczególnie przydatne w przypadku specyficznych dla nauki typów komórek w przejściowych fazach cyklu komórkowego i różnicowania. Aby uzyskać jeszcze większą rozdzielczość, wykorzystamy połączenie ExM z technikami mikroskopowymi o wysokiej rozdzielczości w celu osiągnięcia rozdzielczości poniżej 20 nanometrów.Rozpocząć od przygotowania zawiesiny epimastigoty Trypanosoma cruzi z kultury w fazie logarytmicznej w pożywce LIT uzupełnionej 10%FCS. Odwirować zawiesinę o stężeniu 5 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj granulat dwa razy PBS, a następnie ponownie zawieś w 200 mikrolitrach PBS.Przyklej zawiesinę do okrągłego 12-milimetrowego szkiełka nakrywkowego pokrytego poli-D-lizyną i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 do 20 minut przed zapobieganiem sieciowaniu. Zebrać supernatant z monowarstwy komórek Vero zakażonej trypomastigotami cztery dni po zakażeniu. Za pomocą komory do zliczania komórek Neubauera oznacz stężenie trypomastigotów.Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 7 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po wypłukaniu i ponownym wymieszaniu komórek w PBS, przenieść zawiesinę komórek do szkiełka nakrywkowego pokrytego lizyną i inkubować szkiełko nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut przed zapobieganiem sieciowaniu. Aby uzyskać amastigoty z zakażonych komórek Vero, połóż sterylne 12-milimetrowe okrągłe szkiełko nakrywkowe na dnie 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.Następnie przygotuj zawiesinę komórek Vero w DMEM uzupełnioną 2% FCS i wysiew 500 mikrolitrów zawiesiny do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez noc, aby zapewnić przyczepienie komórek. Następnie umyj komórki dwukrotnie 500 mikrolitrami sterylnego PBS.Dodaj trypomastigoty T.cruzi do komórek i inkubuj jak wcześniej przez sześć godzin. Zacznij od dodania 0,5 mililitra roztworu zapobiegającego sieciowaniu do każdego dołka 24-dołkowej płytki. Następnie zanurz 12-milimetrowe szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną w przylegających pasożytach.Po napełnieniu pustych studzienek wodą w celu zmniejszenia parowania, uszczelnij płytkę folią uszczelniającą i inkubuj. Aby zżelować próbki, najpierw zmontuj wilgotną komorę na szalce Petriego, umieszczając folię uszczelniającą na bibułce. Następnie zwilż bibułę wodą i inkubuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby ją schłodzić.Połóż chłodną, wilgotną komorę na lodzie. Następnie, za pomocą trzymililitrowej pipety Pasteura, odessać roztwór zapobiegający sieciowaniu z dołków płytki 24-dołkowej. Teraz użyj pęsety, aby usunąć szkiełka nakrywkowe i umieść je na bibułce pasożytami skierowanymi do góry.Weź 90 mikrolitrów roztworu monomerycznego do probówki i dodaj po pięć mikrolitrów rozmrożonego TEMED i APS. Mieszaj mieszaninę przez dwie do trzech sekund. Odpipetować 35 mikrolitrów tej mieszaniny na folię uszczelniającą dla każdego szkiełka nakrywkowego i natychmiast użyć pęsety, aby umieścić szkiełka nakrywkowe na kropli z pasożytami skierowanymi w dół.Inkubuj wilgotną komorę na lodzie przez pięć minut, a następnie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Zacznij od odpipetowania dwóch mililitrów roztworu denaturacyjnego do każdej studzienki płytki sześciodołkowej. Przenieść żelowane szkiełka nakrywkowe zawierające pasożyty Trypanosoma cruzi do roztworu denaturacyjnego i inkubować z delikatnym mieszaniem.Aby zachęcić do odklejania żelu. Za pomocą metalowej szpatułki ostrożnie przenieś żel do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówki zawierającej jeden mililitr roztworu denaturacyjnego. Inkubuj probówkę z zabezpieczoną nasadką na bloku grzewczym.Za pomocą pipety P1000 odessać roztwór denaturacyjny z probówek do mikrowirówek. Za pomocą metalowej szpatułki przenieś żel na szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów ultraczystej wody i pozostaw na 30 minut. Za pomocą trzymililitrowej jednorazowej pipety Pasteura wlej ultraczystą wodę do naczynia, pozostawiając żel zanurzony na noc w temperaturze pokojowej.Następnego dnia zmierz średnicę żelu suwmiarką, aby obliczyć rozszerzalność. Próbki były widoczne jako płaski i półprzezroczysty żel, który rozszerzał się od 4 do 4,5 razy w wodzie. Znakowanie fluorescencyjne należy rozpocząć od przemycia rozszerzonych kręgów żelowych zawierających pasożyty PBS.Użyj żyletki, aby wyciąć kółka pośrodku na kwadraty o wymiarach 10 na 10 milimetrów. Teraz przenieś każdy kwadrat na 12-dołkową płytkę i inkubuj go w 500 mikrolitrach pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego w 2% PBS i BSA, wstrząsając. Następnie inkubować kwadraty żelu na sześciodołkowej płytce zawierającej dwa mililitry PBS z 0,1% polisorbatem 20 przez 10 minut, wstrząsając.Po przeniesieniu żelu na płytkę 12-dołkową dodać 500 mikrolitrów przeciwciała drugorzędowego w PBS z DAPI i 10 mikrogramów na mililitr estru NHS sprzężonego z pożądanym fluoroforem. Inkubować żel przez 2,5 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod delikatnym mieszaniem. Po trzykrotnym umyciu żelu w polisorbacie PBS 20 jak poprzednio, przenieść żel na szalkę Petriego z ultraczystą wodą i inkubować przez 30 minut.Umieść kwadrat kawałka ekspandowanego żelu o wymiarach 10 na 10 milimetrów na naczyniu o grubości 35 milimetrów. Sprawdź orientację pasożytów przy 10 lub 20-krotnym powiększeniu. Zobrazuj próbki w mikroskopie konfokalnym z obiektywem zanurzeniowym 63X z olejkiem o aperturze numerycznej 1,4.W razie potrzeby uzyskaj stosy Z, szerokość każdego kroku Z i empirycznie określony czas ekspozycji na piksel, a następnie uzyskaj intensywność sygnału i optymalizację czasu akwizycji za pomocą zoomu skanowania w celu uzyskania efektywnego powiększenia, jeśli to konieczne. Otwórz stos Z za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu i pogrupuj ułożone obrazy za pomocą opcji projektu grupy Z dla każdego kanału. Następnie wybierz projekcję maksymalnej intensywności.Scalanie obrazów za pomocą narzędzia Scal kanały. Wybierz kolor każdego kanału i dodaj pasek skali za pomocą narzędzia Podziałka liniowa w oprogramowaniu do przetwarzania. Ekspansja pierwotna zapewniała efektywną rozdzielczość 70 nanometrów, podczas gdy ekspansja wtórna wykazywała współczynniki ekspansji około 4,5.Barwienie wszystkich trzech etapów cyklu życiowego T. cruzi in vitro markerami cytoszkieletu wykazało gorset mikrotubularny i lokalizację aksonemu wiciowego białka. Kondensacja chromatyny była wyraźnie zaznaczona po zabarwieniu DAPI. Immunolokalizacja markerów alfa tubuliny nałożyła się na znakowanie proteomu pan w epimastigotach wykazała, że ciało podstawowe zabarwione anty-alfa-tubuliną i FITC uległo podziałowi.Znakowanie proteomu Pan pomogło zidentyfikować różne struktury pasożytów na wszystkich etapach cyklu życia.

ultrastructural-expansion-microscopy-three-vitro-life-cycle-stages

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym protokole, fluorescencyjnie znakowane T. cruzi zostały wstrzyknięte do przezroczystych larw danio pręgowanego, a ruchliwość pasożyta zaobserwowano in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego.

Ustanowienie larw danio pręgowanego jako modelu zwierzęcego do badania ruchliwości Trypanosoma cruzi in vivo

Czynnik choroby Chagasa wywołany przez Trypanosoma cruzi powoduje długotrwałe, bezobjawowe infekcje, które nagle przekształcają się w klinicznie rozpoznaną patologię. Poniższy protokół badawczy opisuje krótkoterminowe rodzinne badanie epidemiologiczne mające na celu rozwikłanie infekcji T. cruzi przenoszonej drogą płciową z rodzica na potomstwo.

Przenoszenie płciowe amerykańskich trypanosomów z samców i samic na naiwnych partnerów

Tutaj opisujemy protokół wprowadzania nokautu genu do zewnątrzkomórkowego amastigotu Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9. Fenotyp wzrostu może być śledzony albo przez liczenie komórek w aksenowej kulturze amastigotów, albo przez proliferację wewnątrzkomórkowych amastigotów po inwazji komórek gospodarza.

Wprowadzenie nokautu genu bezpośrednio do stadium amastigoty Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9

Opisujemy wysokoprzepustowy test kolorymetryczny mierzący aktywność β-galaktozydazy w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi, czynnika wywołującego chorobę Chagasa. Ten test może być używany do identyfikacji związków trypanobójczych w łatwy, szybki i powtarzalny sposób.

In vitro Badania przesiewowe leków przeciwko wszystkim etapom cyklu życia Trypanosoma cruzi przy użyciu pasożytów eksprymujących β-galaktozydazę

Obecny protokół opisuje mikroskopię fluorescencyjną z użyciem arkuszy świetlnych oraz zautomatyzowane metody wspomagane oprogramowaniem, aby wizualizować i precyzyjnie określać ilościowo proliferujące i uśpione pasożyty Trypanosoma cruzi oraz limfocyty T w nienaruszonych, oczyszczonych organach i tkankach. Techniki te zapewniają wiarygodny sposób oceny wyników leczenia i oferują nowe informacje na temat interakcji pasożyt-gospodarz.

Ilościowe obrazowanie 3D komórek zakażonych Trypanosoma cruzi, uśpionych amastigotów i limfocytów T w nienaruszonych, oczyszczonych narządach

Protokół tutaj opisuje szczegółowe kroki do przeprowadzenia badań skuteczności leków w bioluminescencyjnym modelu zakażenia Trypanosoma cruzi, z naciskiem na pozyskiwanie, analizę i interpretację danych. Dostępne są również procedury rozwiązywania problemów i kontroli jakości w celu zminimalizowania problemów technicznych.

Demistyczne obrazowanie bioluminescencyjne in vivo mysiego modelu choroby Chagasa do badań skuteczności leków

MamA jest unikalnym białkiem powiązanym z magnetosomami, o którym wykazano, że bierze udział w ich aktywacji. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół oczyszczania mutanta z delecją MamA (MamAΔ41) z M. magneticum AMB-1.

Oczyszczanie białka MamAΔ41 związanego z magnetosomami szczepu AMB-1 M. magneticum

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Ten manuskrypt opisuje łatwą w użyciu i tanią metodę kriofiksacji do wizualizacji komórek zawiesinowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Poznaj mikroskopię ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi in vitro. Ta metoda umożliwia trójwymiarową rekonstrukcję nanostruktur komórkowych przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów.

Mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi in vitro

Przeglądaj więcej filmów