Mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi in vitro

Protokół ten szczegółowo opisuje metodę mikroskopii ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia in vitro Trypanosoma cruzi, patogenu odpowiedzialnego za chorobę Chagasa. Protokół ten stanowi alternatywę dla obecnych technik obrazowania w super rozdzielczości i mikroskopii elektronowej, a jego zaletą jest kompatybilność z konwencjonalnymi mikroskopami znajdującymi się w większości laboratoriów biologicznych i w głównych obiektach maszynowych. Wykorzystuje techniki typowe dla większości laboratoriów badawczych w celu uzyskania obrazów, które umożliwiają trójwymiarową rekonstrukcję.

Protokół ułatwia badanie struktur w nanoskali u trypanosomatidów, umożliwiając inspekcję populacji komórek i obrazowanie całej objętości komórki będącej przedmiotem zainteresowania w wysokiej rozdzielczości. Jest to szczególnie przydatne w przypadku specyficznych dla nauki typów komórek w przejściowych fazach cyklu komórkowego i różnicowania. Aby uzyskać jeszcze większą rozdzielczość, wykorzystamy połączenie ExM z technikami mikroskopowymi o wysokiej rozdzielczości w celu osiągnięcia rozdzielczości poniżej 20 nanometrów.

Rozpocząć od przygotowania zawiesiny epimastigoty Trypanosoma cruzi z kultury w fazie logarytmicznej w pożywce LIT uzupełnionej 10%FCS. Odwirować zawiesinę o stężeniu 5 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj granulat dwa razy PBS, a następnie ponownie zawieś w 200 mikrolitrach PBS.

Przyklej zawiesinę do okrągłego 12-milimetrowego szkiełka nakrywkowego pokrytego poli-D-lizyną i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 do 20 minut przed zapobieganiem sieciowaniu. Zebrać supernatant z monowarstwy komórek Vero zakażonej trypomastigotami cztery dni po zakażeniu. Za pomocą komory do zliczania komórek Neubauera oznacz stężenie trypomastigotów.

Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 7 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po wypłukaniu i ponownym wymieszaniu komórek w PBS, przenieść zawiesinę komórek do szkiełka nakrywkowego pokrytego lizyną i inkubować szkiełko nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut przed zapobieganiem sieciowaniu. Aby uzyskać amastigoty z zakażonych komórek Vero, połóż sterylne 12-milimetrowe okrągłe szkiełko nakrywkowe na dnie 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.

Następnie przygotuj zawiesinę komórek Vero w DMEM uzupełnioną 2% FCS i wysiew 500 mikrolitrów zawiesiny do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez noc, aby zapewnić przyczepienie komórek. Następnie umyj komórki dwukrotnie 500 mikrolitrami sterylnego PBS.

Dodaj trypomastigoty T.cruzi do komórek i inkubuj jak wcześniej przez sześć godzin. Zacznij od dodania 0,5 mililitra roztworu zapobiegającego sieciowaniu do każdego dołka 24-dołkowej płytki. Następnie zanurz 12-milimetrowe szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną w przylegających pasożytach.

Po napełnieniu pustych studzienek wodą w celu zmniejszenia parowania, uszczelnij płytkę folią uszczelniającą i inkubuj. Aby zżelować próbki, najpierw zmontuj wilgotną komorę na szalce Petriego, umieszczając folię uszczelniającą na bibułce. Następnie zwilż bibułę wodą i inkubuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby ją schłodzić.

Połóż chłodną, wilgotną komorę na lodzie. Następnie, za pomocą trzymililitrowej pipety Pasteura, odessać roztwór zapobiegający sieciowaniu z dołków płytki 24-dołkowej. Teraz użyj pęsety, aby usunąć szkiełka nakrywkowe i umieść je na bibułce pasożytami skierowanymi do góry.

Weź 90 mikrolitrów roztworu monomerycznego do probówki i dodaj po pięć mikrolitrów rozmrożonego TEMED i APS. Mieszaj mieszaninę przez dwie do trzech sekund. Odpipetować 35 mikrolitrów tej mieszaniny na folię uszczelniającą dla każdego szkiełka nakrywkowego i natychmiast użyć pęsety, aby umieścić szkiełka nakrywkowe na kropli z pasożytami skierowanymi w dół.

Inkubuj wilgotną komorę na lodzie przez pięć minut, a następnie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Zacznij od odpipetowania dwóch mililitrów roztworu denaturacyjnego do każdej studzienki płytki sześciodołkowej. Przenieść żelowane szkiełka nakrywkowe zawierające pasożyty Trypanosoma cruzi do roztworu denaturacyjnego i inkubować z delikatnym mieszaniem.

Aby zachęcić do odklejania żelu. Za pomocą metalowej szpatułki ostrożnie przenieś żel do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówki zawierającej jeden mililitr roztworu denaturacyjnego. Inkubuj probówkę z zabezpieczoną nasadką na bloku grzewczym.

Za pomocą pipety P1000 odessać roztwór denaturacyjny z probówek do mikrowirówek. Za pomocą metalowej szpatułki przenieś żel na szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów ultraczystej wody i pozostaw na 30 minut. Za pomocą trzymililitrowej jednorazowej pipety Pasteura wlej ultraczystą wodę do naczynia, pozostawiając żel zanurzony na noc w temperaturze pokojowej.

Następnego dnia zmierz średnicę żelu suwmiarką, aby obliczyć rozszerzalność. Próbki były widoczne jako płaski i półprzezroczysty żel, który rozszerzał się od 4 do 4,5 razy w wodzie. Znakowanie fluorescencyjne należy rozpocząć od przemycia rozszerzonych kręgów żelowych zawierających pasożyty PBS.

Użyj żyletki, aby wyciąć kółka pośrodku na kwadraty o wymiarach 10 na 10 milimetrów. Teraz przenieś każdy kwadrat na 12-dołkową płytkę i inkubuj go w 500 mikrolitrach pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego w 2% PBS i BSA, wstrząsając. Następnie inkubować kwadraty żelu na sześciodołkowej płytce zawierającej dwa mililitry PBS z 0,1% polisorbatem 20 przez 10 minut, wstrząsając.

Po przeniesieniu żelu na płytkę 12-dołkową dodać 500 mikrolitrów przeciwciała drugorzędowego w PBS z DAPI i 10 mikrogramów na mililitr estru NHS sprzężonego z pożądanym fluoroforem. Inkubować żel przez 2,5 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod delikatnym mieszaniem. Po trzykrotnym umyciu żelu w polisorbacie PBS 20 jak poprzednio, przenieść żel na szalkę Petriego z ultraczystą wodą i inkubować przez 30 minut.

Umieść kwadrat kawałka ekspandowanego żelu o wymiarach 10 na 10 milimetrów na naczyniu o grubości 35 milimetrów. Sprawdź orientację pasożytów przy 10 lub 20-krotnym powiększeniu. Zobrazuj próbki w mikroskopie konfokalnym z obiektywem zanurzeniowym 63X z olejkiem o aperturze numerycznej 1,4.

W razie potrzeby uzyskaj stosy Z, szerokość każdego kroku Z i empirycznie określony czas ekspozycji na piksel, a następnie uzyskaj intensywność sygnału i optymalizację czasu akwizycji za pomocą zoomu skanowania w celu uzyskania efektywnego powiększenia, jeśli to konieczne. Otwórz stos Z za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu i pogrupuj ułożone obrazy za pomocą opcji projektu grupy Z dla każdego kanału. Następnie wybierz projekcję maksymalnej intensywności.

Scalanie obrazów za pomocą narzędzia Scal kanały. Wybierz kolor każdego kanału i dodaj pasek skali za pomocą narzędzia Podziałka liniowa w oprogramowaniu do przetwarzania. Ekspansja pierwotna zapewniała efektywną rozdzielczość 70 nanometrów, podczas gdy ekspansja wtórna wykazywała współczynniki ekspansji około 4,5.

Barwienie wszystkich trzech etapów cyklu życiowego T. cruzi in vitro markerami cytoszkieletu wykazało gorset mikrotubularny i lokalizację aksonemu wiciowego białka. Kondensacja chromatyny była wyraźnie zaznaczona po zabarwieniu DAPI. Immunolokalizacja markerów alfa tubuliny nałożyła się na znakowanie proteomu pan w epimastigotach wykazała, że ciało podstawowe zabarwione anty-alfa-tubuliną i FITC uległo podziałowi.

Znakowanie proteomu Pan pomogło zidentyfikować różne struktury pasożytów na wszystkich etapach cyklu życia.