Name: Hodowla białego motyla kapuścianego (Pieris rapae) w kontrolowanych warunkach: studium przypadku z tolerancją na metale ciężkie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Poznaj metodę hodowli białego motyla kapuścianego Pieris rapae w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Badanie pokazuje wpływ metali ciężkich na rozwój owadów w środowisku miejskim.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie ze strony asystentów podczas wychowania do tej pracy, w szczególności Reginy Kurandiny i Rhei Smykalski. Carolyn Kalinowski pomogła opracować literaturę na temat toksyczności metali u innych Lepidoptera. Praca ta była możliwa dzięki letniemu grantowi badawczemu Wydziału Ekologii, Ewolucji i Zachowania Uniwersytetu Minnesoty.

To badanie zostało przeprowadzone na podstawie zezwolenia USDA APHIS P526P-13-02979.
1. Kolekcja eksperymentalnych motyli
<ol>
	<li>Złap dorosłe samice motyli za pomocą powietrznej siatki na owady. Białka kapusty występują na ogół w otwartych, zakłóconych siedliskach, w których obecne są rośliny nektarowe i rośliny żywicielskie (z rodziny Brassicaceae).
	<ol>
		<li>Szukaj, gdy świeci słońce i jest ciepło. Aby celować w samice, szukaj osobników trzepoczących powoli, blisko ziemi i lądujących na roślinach, aby "bębnić" (smakować) liście przedstopiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw samice w klatkach do zbierania jaj. 
	UWAGA: Samice zebrane w terenie średnio kojarzyły się z jednym lub dwoma samcami12 i powinny zacząć składać płodne jaja wkrótce po schwytaniu. Dziko żyjące samice potrzebują naturalnego światła do składania jaj i łączenia się w pary, więc umieść klatkę w szklarni lub parapecie.</li>
	<li>Samice domowe z rośliną żywicielską do zbierania jaj. 
	UWAGA: Samice zaakceptują różne rośliny żywicielskie, w tym zieloną kapustę, rzodkiewkę, jarmuż, kapustę i rzodkiewnik, ale upewnij się, że rośliny nie zostały potraktowane żadnymi pestycydami.
	<ol>
		<li>Rośliny żywicielskie należy umieszczać w doniczkach lub pojemnikach z wodą, aby utrzymać ciśnienie liści, takie jak łodygi jarmużu w rurkach z wodą kwiatową.</li>
		<li>Jeśli badacz chce zebrać jaja i przenieść je bezpośrednio do diety, najpierw użyj gumki, aby przymocować liść rośliny żywicielskiej do plastikowego kubka z wodą, a następnie rozciągnij kawałek parafilmu wokół krawędzi - samice dotykające liścia złożą jaja na parafilmie (patrz5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Upewnij się, że w klatce znajduje się również coś, co utrzymuje wysoką wilgotność względną, na przykład poprzez codzienne podlewanie rośliny doniczkowej lub moczenie ręcznika, szczególnie w suchych warunkach. Jeśli rośliny doniczkowe są podlewane w klatce, upewnij się, że ręcznik znajduje się pod doniczką, ponieważ motyle mogą utknąć w kałużującej się wodzie.</li>
	<li>Nakarm motyle 10% rozcieńczonym roztworem wody miodowej umieszczonym na żółtej gąbce, której motyle szybko uczą się używać, zwłaszcza jeśli są trzymane z doświadczonymi osobnikami.
	<ol>
		<li>Aby zachęcić motyle do żerowania z gąbek, umieść je bezpośrednio na karmniku, zwłaszcza po lekkim spryskaniu butelką z wodą, co często powoduje wystawianie przez nie trąbki.</li>
		<li>Aby ustawić podajnik, najpierw dokładnie opłucz żółte lub pomarańczowe gąbki, a następnie pokrój je w małe kwadraty, które mieszczą się w plastikowych szalkach Petriego o średnicy 60 mm. Codziennie zmieniaj karmniki i czyść gąbki w łagodnym roztworze wybielacza, a następnie dokładnie spłucz, aby zapobiec rozwojowi pleśni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Tworzenie sztucznych diet
<ol>
	<li>Najpierw skorzystaj z przepisu z Tabeli 1 lub innych odpowiednich źródeł, aby określić odpowiedni przepis do eksperymentu. Dokonać niezbędnych modyfikacji specyficznych dla gatunku głównego lub eksperymentu. Wydrukuj przepis, którego będziesz przestrzegać podczas ważenia składników.</li>
	<li>Zważ wszystkie suche składniki, z wyjątkiem agaru, do jednego pojemnika. Upewnij się, że składniki zostały umieszczone z powrotem w odpowiednim miejscu przechowywania, zwracając uwagę, że kilka składników jest przechowywanych w temperaturze 4°C. Umieść wstępnie zważoną, suchą mieszaninę składników w blenderze z 5 ml oleju lnianego.</li>
	<li>Dla każdej partii diety postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
	<ol>
		<li>Zmieszać 15 g agaru o drobnych oczkach z 400 ml wody destylowanej w zlewce o pojemności co najmniej 1 l. Kuchenkę mikrofalową, aż agar zbliży się do wrzenia, z drobnymi bąbelkami w całej mieszaninie, mieszając mieszaninę co 30-60 s, aby zapobiec wykipieniu.</li>
		<li>Do tej gorącej mieszanki agarowej dodaj 400 ml wody destylowanej o temperaturze kranu, aby doprowadzić ją do odpowiedniej temperatury do wymieszania z suchymi składnikami, ponieważ mieszanina witamin jest wrażliwa na ciepło.</li>
		<li>Dodaj mieszaninę agarową do blendera i dokładnie wymieszaj, w razie potrzeby zeskrobując krawędzie blendera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy agar się nagrzewa, umieść na blacie co najmniej siedemdziesiąt czterouncjowych kubków dietetycznych tak, aby krawędzie się stykały. Po dokładnym wymieszaniu diety przelej mieszaninę z blendera do kubków dietetycznych, upewniając się, że dieta zakrywa dno każdej filiżanki.</li>
	<li>Po ostygnięciu diety umieść pokrywki na kubkach, oznacz kubki dietetyczne rodzajem diety, ułóż je na tacach i przechowuj do 1 miesiąca w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
3. Transfer i hodowla na sztucznych dietach
<ol>
	<li>Liście rośliny żywicielskiej domu z jajami motyla w kubkach delikatesowych o pojemności 30 uncji z siatkową osłoną w komorze klimatycznej o temperaturze 24 °C. Po 1 tygodniu sprawdź kubki, upewniając się, że larwy się wykluły i pod koniec pierwszego lub na początku drugiego stadium rozwojowego, dobry czas na przejście na sztuczną dietę.</li>
	<li>Przenieś larwy na sztuczną dietę za pomocą pędzla, dezynfekując je wybielaczem w sprayu i spłukując wodą między pojemnikami z larwami. Przenieś trzy larwy do każdego kubka o pojemności 4 uncji. Chociaż sztuczna dieta jest gęsta energetycznie i może podtrzymywać duże zagęszczenie larw, unikaj pakowania larw do kubków, ponieważ choroby i pleśń mogą rozprzestrzeniać się w kubkach o dużej gęstości larw.</li>
	<li>Umieść kubki w plastikowym pojemniku po bokach, tak aby frass spadł na dno kubków i z dala od diety, zmniejszając ryzyko pleśni i chorób.
	<ol>
		<li>Przechowuj kubki dietetyczne w kontrolowanych warunkach temperaturowych przy niskim lub umiarkowanym poziomie światła. Monitoruj kubki pod kątem pleśni i chorób co 1-2 dni, zaglądając przez przezroczyste pokrywki kubków.</li>
		<li>Kubki z pleśnią lub chorobą można poddać kwarantannie lub zamrozić, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się na inne kubki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pojawienie się i postępowanie z dorosłymi osobnikami
<ol>
	<li>Pozwól larwom przepoczwarzyć się i wyłonić w kubkach dietetycznych. Kiedy pojawią się dorosłe osobniki, daj im kilka godzin, aby ich skrzydła stwardniały, zanim usuniesz je w celu znakowania. Usuń dorosłe motyle z miseczek czystymi rękami, delikatnie chwytając ich skrzydła, zauważając, że złapanie wszystkich czterech skrzydeł bliżej ich ciała jest bardziej stabilnym chwytem.</li>
	<li>Aby oznaczyć motyle, trzymaj suche osobniki za głowę i klatkę piersiową i użyj ostropestki z cienką końcówką, aby delikatnie zaznaczyć liczbę na ich tylnym skrzydle.
	<ol>
		<li>Samice zazwyczaj mają dwie czarne plamki na grzbietowym przednim skrzydle i ciemniejsze, bardziej żółtawe tylne, podczas gdy samce mają na ogół jedną mniejszą czarną plamkę na grzbietowym przednim skrzydle na jaśniejszym białym tle54.</li>
		<li>Biorąc pod uwagę, że to ubarwienie wykazuje zmienność indywidualną i sezonową, potwierdź płeć za pomocą cech brzusznych - samce mają dwa klamry na dystalnym końcu brzucha i ogólnie węższy brzuch, podczas gdy samice mają pojedynczy otwór na narządy płciowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś dorosłe osoby do woskowych kopert pergaminowych, otwierając kopertę jedną ręką, trzymając motyla za głowę i klatkę piersiową, wsuwając go do koperty i chwytając skrzydełka przez kopertę drugą ręką.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że wszystkie cztery skrzydełka są normalnie zamknięte w kopercie.</li>
		<li>Trzymaj motyle w niskich temperaturach (5-6 °C) przez okres do 1 tygodnia przed eksperymentami, ale po wyjęciu z lodówki odczekaj co najmniej 1 dzień na aklimatyzację.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Miary wydajności
<ol>
	<li>Aby zmierzyć cechy skrzydeł u martwych osobników, usuń skrzydła motyla, trzymając klatkę piersiową w jednej ręce i używając kleszczy, aby usunąć każde skrzydło u podstawy. Umieść skrzydła płasko w lightboxie i zrób zdjęcia do późniejszych pomiarów.</li>
	<li>Aby uzyskać szacunkową wartość płodności, należy umieścić dorosłe osobniki w klatkach godowych, pozostawiając co najmniej 1 dzień na dojrzewanie reprodukcyjne samców i 1 dzień na krycie. Składaj w ofierze samice w określonych punktach czasowych w celu zliczenia jaj poprzez sekcję lub zbieraj jaja każdego dnia na roślinach żywicielskich.</li>
	<li>Aby oszacować obciążenie jajami, usuń brzuch samicy, umieść go w buforze 1x PBS i wytnij szczelinę wzdłuż strony brzusznej.
	<ol>
		<li>Użyj kleszczy, aby oddzielić wnętrzności od naskórka, a następnie odciągnij jajniki od jelita, tchawicy i innej zawartości brzucha.</li>
		<li>Rozwiń cztery zwinięte jajniki w każdym z dwóch jajników, zwracając uwagę na to, gdzie dojrzałe, żółtkowe i oskorupione jaja przechodzą w niedojrzałe pęcherzyki. Użyj licznika, aby pomóc zliczyć całkowite dojrzałe jaja, zwykle w zakresie od 0 do 200 jaj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby określić stan krycia wypreparowanej samicy, otwórz kopulatrix kaletki i oddziel w niej spermatofory. Gdy spermatofory są trawione, na ogół rozwijają "ogon" i są zagnieżdżone w sobie.</li>
</ol>
6. Studium przypadku
UWAGA: Dorosłe samice białych motyli kapuścianych zostały zebrane z natury w 2014 roku, aby stworzyć eksperymentalne populacje. Dorosłe samice pochodziły z okolic Davis w Kalifornii (N = 8 samic założycielskich).
<ol>
	<li>Schronienie dla motyli
	<ol>
		<li>Samice trzyma się w siatkowych klatkach "BugDorm" (61 cm x 61 cm x 61 cm) w naturalnym świetle w szklarni. Zapewnij organiczny liść kapusty rośliny żywicielskiej (Brassica oleracea) do składania jaj.</li>
		<li>Aby utrzymać wilgotność w klatkach, dołącz małą roślinę doniczkową (Cosmos), podlewaną codziennie, umieszczoną na ręczniku w każdej klatce.</li>
		<li>Zbieraj jaja codziennie, przenosząc liście z nowymi jajami do plastikowych kubków o pojemności 473 ml z otworami w pokrywie i umieść w komorze klimatycznej.</li>
		<li>Zapewnij motylom ad libitum dostęp do 10% roztworu wody z miodem (sporządzonego przez rozcieńczenie organicznego miodu wodą destylowaną), dostępnego przez żółtą gąbkę na małej szalce Petriego, która jest codziennie zmieniana.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowywanie sztucznych diet
	<ol>
		<li>Przygotuj sztuczne diety dla larw białej kapusty, korzystając z modyfikacji wcześniej opracowanych diet Lepidoptera4. Jedna partia diety zawierała 50 g kiełków pszenicy, 27 g kazeiny, 10 g celulozy, 24 g sacharozy, 15 g mąki kapuścianej, 9 g mieszanki soli Wesson, 12 g drożdży Torula, 3,6 g cholesterolu, 10,5 g mieszanki witamin Vanderzant, 1,1 g metyloparabenu, 1,5 g kwasu sorbinowego, 3 g kwasu askorbinowego i 0,175 g streptomycyny (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Wstępnie zważ suche składniki dla wielu partii diety (Tabela 1) i dokładnie wymieszaj, aby zwiększyć jednorodność wszystkich rodzajów diety, zanim zostaną podzielone na oddzielne partie w celu zmieszania z roztworami metali.</li>
		<li>Umieść suche składniki w blenderze z olejem lnianym i odpowiednią mieszanką metali. 
		UWAGA: Olej lniany został użyty w obecnym eksperymencie, ponieważ był sprzedawany przez byłego dostawcę diet dla owadów. Obecnie stosuje się wyłącznie organiczny olej lniany, który jest wytwarzany z tej samej rośliny, ale jest mniej prawdopodobne, że zawiera jakiekolwiek dodatki, jak komercyjni dostawcy oleju lnianego.</li>
		<li>Wlej przygotowaną dietę do 118 ml (4 uncje) plastikowych kubków delikatesowych. Używaj rozpuszczalnych soli metali, aby dodać metale ogniskowe do sztucznej diety. Dąż do koncentracji metali w oparciu o wcześniejsze obserwacje zawartości metalu w roślinach (np. akumulacja niklu55,56,57 lub zanieczyszczenie roślin na poboczu drogi58,59,60) oraz tolerancja metali w innych Lepidoptera49,50,51.</li>
		<li>Rozpuść sole metali w 500-1000 ml wody destylowanej przed przyjęciem odpowiednich ilości, które zostaną dodane do sztucznej diety. Na przykład, aby przygotować dietę 100 ppm niklu, dodaj 317,6 ml 1 M roztworu NiCl2 do sztucznej diety przed zmiksowaniem, aby uzyskać końcowe stężenie w diecie 100 mg / g suchej masy Ni (około 53 mg / g mokrej masy). Ilość ta przekłada się na średnie zmierzone stężenie 109,6 ppm (Tabela 2) w oparciu o atomową spektroskopię emisyjną ze wzbudzeniem w plazmie sprzężonej indukcyjnie. 
		UWAGA: Poziomy metali zostały oszacowane przez Laboratoria Analityczne Uniwersytetu Minnesoty na podstawie sześciu próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>konserwacja
	<ol>
		<li>Jaja zebrane na roślinach żywicielskich należy utrzymywać w komorze klimatycznej w temperaturze 23 °C w fotoperiodach o godzinie 14:10 przez 7 dni. Następnie przenieś wczesne larwy drugiego stadium do sztucznej diety.</li>
		<li>Podczas przenoszenia należy równomiernie podzielić larwy z danej rośliny na cztery rodzaje diety, aby uniknąć pomylenia partii larw z typem diety. Przenieś larwy (N = łącznie 346) jako dwa osobniki na kubek diety o pojemności 118 ml, aby zmniejszyć częstość występowania choroby z powodu przeludnienia i zapewnić wystarczającą ilość miejsca dla dorosłych, aby ostatecznie się zamknęły.</li>
		<li>Przebij otwory (po trzy na pokrywkę) w pokrywkach kubków hodowlanych. Umieść kubki w plastikowych pojemnikach wielkości pudełka po butach do hodowli, z różnymi dietami przeplatanymi w celu uniknięcia systematycznych skutków lokalizacji w komorze hodowlanej.</li>
		<li>Umieść kubki larw w komorach klimatycznych w temperaturze 23 °C w godzinach 14:10 (z pojemnikami na wodę na dnie komory, aby utrzymać wilgotność na poziomie około 50%-60%, monitorowanymi za pomocą domowego czujnika wilgotności). W przypadku, gdy kubki spleśniały (łącznie około ośmiu kubków w tym studium przypadku), wyjmij kubki z komory i usuń te osoby z eksperymentu.</li>
		<li>Pozwolić larwom przepoczwarzyć się i wyłonić w kubkach hodowlanych (N = 162 ogółem). 
		UWAGA: W przypadku warunków chowu w tym badaniu, czas rozwoju od zebrania jaj do pojawienia się dorosłego osobnika wynosił średnio około 25-30 dni (w zakresie od 20 do 40 dni, np. 25,28).</li>
		<li>Gdy poczwarki zbliżają się do pojawienia się dorosłego osobnika, codziennie sprawdzaj kubki pod kątem nowo zamkniętych osobników i usuwaj dorosłe osobniki z wysuszonymi skrzydłami. Oznacz dorosłe osobniki na ich tylnych skrzydłach odpowiednim indywidualnym numerem (przypisanym przy przenoszeniu larw) za pomocą czarnego sharpie z cienką końcówką. Określ płeć każdego osobnika i zaznacz na kopercie szklanej wraz z ich liczbą i datą pojawienia się. Dorosłe motyle umieścić w szklanych kopertach i przechowywać w temperaturze -20°C do czasu dalszej obróbki. 
		UWAGA: Niewielka część wyłaniających się dorosłych osobników wykazuje deformacje skrzydeł, które zakłócają lot i przeżycie dorosłego osobnika (5%-8%); Osoby te są wykluczone z analiz przeżycia w tych eksperymentach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar i analiza danych
	<ol>
		<li>Zmierz przeżywalność jako przeżycie od drugiego stadium rozwoju (kiedy gąsienice zostały poddane diecie) do pojawienia się dorosłego osobnika. 
		UWAGA: Niniejsze badanie koncentrowało się na czasie przeżycia i rozwoju jako miarach wydajności na różnych dietach.</li>
		<li>Zmierz czas rozwoju jako liczbę dni między przejściem na dietę a pojawieniem się dorosłego osobnika w komorze klimatycznej.</li>
		<li>Na potrzeby analizy danych uruchom dwa zestawy modeli, które obejmowały interakcje między metalem a stężeniem. 
		UWAGA: Ponieważ obie interakcje były istotne (F2,194 = 4,56, p = 0,01 dla czasu rozwoju i X2 = 12,1, p = 0,002 dla przeżycia), badanie kontynuowano oddzielną analizą każdego metalu.</li>
		<li>Aby przeanalizować przeżywalność, przeprowadź testy chi-kwadrat dla każdego metalu, aby przetestować wpływ dawki metalu (traktowanej jako cztery kategorie) na przeżycie do dorosłości z całkowicie nienaruszonymi skrzydłami.</li>
		<li>Po wykryciu znaczącego wpływu dawki należy wykonać kontrolne badanie chi-kwadrat, aby porównać każdy poziom z dietą kontrolną. Aby przeanalizować czas rozwoju (od momentu przeniesienia do pojawienia się jako osoba dorosła), przetestuj wpływ płci na czas rozwoju. 
		UWAGA: Ponieważ nie stwierdzono wpływu płci na czas rozwoju (p > 0,10) dla żadnego metalu w tym eksperymencie, pominęliśmy go z rozważań w modelu.</li>
		<li>Uruchom oddzielną ANOVA dla każdego metalu, aby przetestować wpływ czterech stężeń na czas rozwoju. Dodatkowo należy przeprowadzić testy t dla każdego stężenia w stosunku do kontroli, aby określić minimalne stężenie, w którym obserwuje się wpływ na wydajność. 
		UWAGA: W tym badaniu do wszystkich analiz użyto JMP v16. Wszystkie surowe dane są dostępne na stronie Mendeley61.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Artificial Rearing and Heavy Metal Tolerance in Cabbage White Butterflies

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

W tym badaniu białe motyle kapuściane (Pieris rapae) były hodowane na sztucznej diecie w celu zbadania różnic w toksyczności metali ciężkich. W ten sposób badanie to dostarcza ogólnych metod hodowli i badań laboratoryjnych tego łatwego do manipulowania systemu motyli. W tej dyskusji najpierw rozważa się bardziej ogólne pytania dotyczące recenzowanych tutaj metod, następnie dokonuje się przeglądu naszych ustaleń naukowych, a kończy się refleksjami na temat składników sztucznej diety.
Recenzowany tutaj protokół zawiera kroki ogólnej metody hodowli białych motyli kapuścianych, ale jest wiele punktów w tym protokole, które można dostosować. Na przykład, podczas gdy przedstawione tutaj studium przypadku wykorzystuje gąbki do karmienia, inni badacze mieli szczęście z dentystycznymi i jedwabnymi kwiatami wypełnionymi wodą z miodem5. Podczas gdy obecne badanie wykorzystuje wodę miodową jako pożywienie, inni badacze używali roztworów cukru, a nawet Gatorade. Jeśli poczwarki muszą zostać zważone lub przeniesione do innych warunków do pojawienia się (np. wywołanie diapauzy i konieczność przechowywania w chłodni przez 1 miesiąc), badacz może łatwo usunąć je z kubków, spryskując je wodą, aby zwilżyć ich jedwabne nasadki i chwycić je kleszczami do piór, a następnie ponownie zawiesić je za pomocą taśmy dwustronnej. Jeśli naukowcy potrzebują większej elastyczności w kwestii tego, kiedy dorosłe motyle są przenoszone do klatek w celu zachowania dorosłych, mogą być trzymane w lodówce przez kilka tygodni, ale muszą być karmione. Co kilka dni motyle należy wyjmować, aby karmić je rozcieńczonym roztworem wody z miodem. Przy oświetleniu wewnętrznym można to zrobić za pomocą szpilki do rozwinięcia trąbki do żywności. Jeśli chodzi o wydajność dorosłych, można podjąć szeroki zakres działań fitness na białych motylach kapustnych. Wielkość ciała może być mierzona jako mokra lub sucha masa larw w pewnych stadiach, poczwarek lub dorosłych osobników (ofiarowanych lub trzymanych w szklanych otoczkach) lub poprzez pomiar długości skrzydeł w programie ImageJ (patrz 12,24,25,28). Płodność samic w ciągu całego życia można zmierzyć za pomocą codziennych zbiorów jaj na roślinach żywicielskich 25,69,70, a wielkość określonych cech można zmierzyć jako miarę wydajności; Na przykład masa lub objętość mózgu lub poszczególnych obszarów mózgu 62,71,72 lub masa lub zawartość białka w klatce piersiowej lub mięśniu lotu 62,70. Wreszcie, dorośli mogą być wykorzystywani w badaniach behawioralnych do testowania dowolnej liczby pytań badających wpływ manipulacji dietą na wybór żerowania lub składania jaj 27,73.
Jeśli protokół hodowli nie działa zgodnie z oczekiwaniami, istnieje kilka aspektów, które należy rozwiązać. Po pierwsze, można zapytać, czy poziom światła jest wystarczająco wysoki, aby wywołać normalne zachowanie dorosłych. Podczas gdy przystosowane do laboratorium linie Pieris będą składać jaja w świetle fluorescencyjnym, jedynym sztucznym światłem, które działa w przypadku linii typu dzikiego, są potężne światła szklarniowe o szerokim spektrum. Naturalne światło w szklarniach, na parapetach lub na zewnątrz najlepiej sprawdza się w wywoływaniu zachowań godowych i składania jaj. Po drugie, jeśli jaja się nie wykluwają lub jeśli larwy umierają na wczesnym etapie rozwoju, należy wziąć pod uwagę kilka rzeczy. Materiał roślinny żywiciela musi być organiczny, zauważając, że "organiczne" rośliny ze sklepów są czasami traktowane chemikaliami, które mogą zabijać larwy, więc hodowla własnych roślin żywicielskich jest często najlepsza. Jeśli wskaźnik akceptacji żywiciela jest niższy, można spróbować wyhodować młodsze liście o wyższej zawartości azotu, prezentując rośliny doniczkowe zamiast pojedynczych liści i zapewniając krycie samic. Samice zaakceptują wysiew kapustnych, nawet małych kiełków w wieku 2 tygodni. Metoda parafinowa dobrze sprawdza się w przenoszeniu jaj do różnych warunków, ale należy zauważyć, że wskaźnik akceptacji jest zwykle niższy niż w przypadku całych roślin. Po trzecie, wszystkie składniki diety muszą być wysokiej jakości i nie mogą być przeterminowane. Olej lniany należy wymieniać co roku i przechowywać w lodówce24,25. Kiełki pszenicy, mieszanka witamin i antybiotyki również powinny być przechowywane w chłodzie. Po czwarte, można rozważyć dostosowanie konfiguracji kubka dietetycznego. Do hodowli można użyć dowolnej liczby jednorazowych plastikowych kubków, od 1 uncji do 15 uncji. Odkryliśmy, że 4 uncje to dobry rozmiar, aby umożliwić pojawienie się dorosłego osobnika i ładnie pakuje się do naszych komór klimatycznych. Otwory wbite w pokrywki umożliwiają przepływ powietrza, ale zbyt wiele otworów może wysuszyć dietę w warunkach niskiej wilgotności, więc liczba ta może wymagać dostosowania. Po piąte, może zaistnieć potrzeba dostosowania warunków panujących w komorze klimatycznej w połączeniu z warunkami panującymi w miseczce. Jeśli warunki są zbyt suche, rośliny żywicielskie z jajami mogą wyschnąć, zanim larwy będą mogły zostać przeniesione, a kubki z dietą mogą wyschnąć przed pojawieniem się motyli. Z drugiej strony, jeśli warunki są zbyt mokre, kubki mogą być siedliskiem pleśni i chorób. Naukowcy mogą być zmuszeni do dostosowania przepływu powietrza w kubkach za pomocą siateczkowych pokrywek lub mniej lub bardziej otworów w pokrywkach. Innym częstym problemem są światła komór, które są wystarczająco jasne, aby powodować wahania temperatury w kubkach i gromadzenie się kondensacji; Używanie przyciemnianych świateł jest łatwą opcją do hodowli larw.
W odniesieniu do pytań badawczych zawartych w tym artykule, badanie to wykazało, że białka kapusty były stosunkowo bardziej wrażliwe na miedź niż na nikiel czy. Miedź miała znaczący negatywny wpływ na czas rozwoju w stężeniach tak niskich jak 50 ppm (Rysunek 3 i Tabela 3) oraz na przeżycie przy 500 ppm (Rysunek 4, Tabela 4). Nie stwierdzono natomiast negatywnego wpływu niklu na przeżywalność (do 500 ppm; Rysunek 3) lub negatywny wpływ na czas wywoływania przy 100 ppm (rysunek 4). Białka kapusty były dość tolerancyjne na, z efektami przeżycia obserwowanymi tylko przy 1000 ppm (ryc. 3) i negatywnym wpływem na czas rozwoju zaczynającym się od 100 ppm (ryc. 4). Na podstawie stosunkowo większych stężeń w tkance motyla i gorczycy (ich roślinie żywicielskiej; Rysunek 1) spodziewano się, że zaobserwuje się stosunkowo większą tolerancję na. Jednak wrażliwość na miedź i tolerancja niklu były nieco nieoczekiwane, biorąc pod uwagę bardzo niski poziom niklu w tkance motyla (ryc. 1) i konieczność stosowania miedzi jako mikroelementu. Te nieoczekiwane odkrycia zostały omówione poniżej po rozważeniu tolerancji tych metali u innych motyli i ciem.
Aby porównać obecne dane z wrażliwością metalu mierzoną u innych Lepidoptera, zestawiono dane z istniejących badań dotyczących minimalnego stężenia, w którym metale ciężkie negatywnie wpływały na przeżycie 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68; badania te koncentrowały się na, zwłaszcza gatunkach szkodników (Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp.). Wszystkie zmierzone wartości czułości w tym badaniu mieszczą się w zakresie zbliżonym do zakresu zmierzonego dla tych innych gatunków (ryc. 5). Jednak miara tolerancji niklu w tym badaniu wydaje się być wyższa niż oczekiwano - podczas gdy nie było znaczącego wpływu na przeżycie przy 500 ppm, poprzednie badanie na Pieris rapae wykazało również bardzo wysoką tolerancję na nikiel (znaczące efekty rozpoczynające się od 1000 ppm56), pomimo niskich poziomów w ich tkance naturalnie (ryc. 1). Miara wrażliwości miedzi w tym badaniu również wydaje się być na niskim poziomie w badaniach nad Lepidoptera. Podczas gdy stosowanie sztucznej diety pozwala na wygodne i kontrolowane porównanie względnej wrażliwości na metale, ważne jest, aby pamiętać, że składniki diety mogą zmienić pomiar bezwzględnej wrażliwości na metale. Na przykład witamina C w diecie może zrównoważyćstres oksydacyjny wywołany przez metale, a antybiotyki w diecie mogą zmienić wpływ drobnoustrojów na przetwarzanie metali75. Interesującym kierunkiem przyszłych badań byłoby systematyczne manipulowanie takimi składnikami diety w celu zbadania wpływu na toksyczność metali, zwłaszcza biorąc pod uwagę pytania o funkcjonalną rolę mikroorganizmów jelitowych lepidoptera76,77 i składników nektaru, które mogą mieć właściwości przeciwutleniające78. Ponadto różnice w wymaganiach żywieniowych różnych gatunków mogą utrudniać porównania międzygatunkowe, a metody oparte na sztucznej diecie powinny być uzupełnione manipulacjami roślinami żywicielskimi.
Motyle te są szczególnie tolerancyjne na nikiel i wrażliwe na miedź. Wcześniejsze badania wykazały, że wiele roślin z rodziny gorczycowatych, do której należą rośliny preferowane przez Pieridae, nadmiernie akumuluje nikiel jako mechanizm obronny przeciwko roślinożercom 55,56,63,79,80,81. Ta hiperakumulacja wynosi ponad 1000 ppm w tkance roślinnej, czyli o rzędy wielkości więcej niż to, co obserwuje się w większości roślin (ryc. 1). Możliwe, że Pieris mają szczególnie wysoką tolerancję na nikiel ze względu na wcześniejszą selekcję przez takie akumulatory niklu, jak wcześniej spekulowano26. Chociaż miedź była rzadziej badana jako mikroelement w diecie owadów, istnieją pewne dowody na to, że odgrywa ona niewielką rolę w reprodukcji i odporności, chociaż głównie u owadów żywiących się krwią (np. 82,83). Możliwe, że miedź odgrywa mniej ważną rolę fizjologiczną u motyli niż u innych zwierząt 84,85,86, co jest zgodne z ostatnimi pracami podkreślającymi, że miedź może być tak samo niepokojącym zanieczyszczeniem dla owadów jak ołów, kadm i rtęć (np. 87,88,89). Podczas gdy wykazano, że Pieris unika zanieczyszczenia miedzią na niskich poziomach90, mobilność miedzi w roślinach (np. przemieszczanie się do liści i kwiatów) również oznaczyła ją jako zanieczyszczenie metalami budzące obawy91.
Chociaż wyniki te dostarczają interesujących danych na temat względnej toksyczności tych metali dla białych motyli kapusty, niniejszy artykuł ma również na celu ogólne zastosowanie jako szczegółowa ilustracja wizualna metod hodowli tego potężnego systemu. Białka kapusty są łatwe do hodowli i manipulowania nimi w kontrolowanych eksperymentach laboratoryjnych 4,5 ułatwiając badania nad poszukiwaniem żywiciela 6,7,8, żerowaniem 9,10,11 i doborem płciowym 12,13,14. Zdolność do hodowania tych motyli na sztucznej diecie jest kluczem do tworzenia wspólnych warunków ogrodowych do porównań i manipulowania składnikami odżywczymi, toksynami, a nawet nowymi roślinami żywicielskimi. Należy jednak zauważyć, że ta sztuczna dieta niekoniecznie jest optymalną sztuczną dietą dla tego gatunku i prawdopodobnie może zostać ulepszona za pomocą przyszłych manipulacji. Na przykład mieszanka soli w tej diecie (i innych dietach lepidoptera) została pierwotnie opracowana dla kręgowców i ma wyższy poziom wapnia niż to, czego potrzebuje większość owadów92,93. W związku z tym niektóre z naszych wysiłków hodowlanych stworzyły niestandardowe mieszanki soli o niższym poziomie wapnia (np. 62), a inne wykorzystują "mieszankę soli Becka", która może być bardziej odpowiednia dla wielu gatunków owadów94. W naszych własnych manipulacjach odkryliśmy również, że motyle radziły sobie lepiej ze stosunkowo mniejszą ilością kiełków pszenicy i stosunkowo większą ilością celulozy w porównaniu z pierwotnymi stężeniami4. Jednym z obszarów wymagających dalszej uwagi jest źródło i stężenie lipidów w diecie. Na przykład wcześniejsze prace wykazały, że przejście z oleju lnianego (używanego w tym badaniu) na fosfolipidy zwiększyło tempo krycia i tempo wzrostu Pieris na sztucznej diecie95. Suplementacja określonych kwasów tłuszczowych w dietach sztucznych może mieć dodatkowe pozytywne efekty 96,97. Optymalizacja sztucznej diety Pieris98,99 stwarza możliwości odpowiedzi na interesujące pytania dotyczące ekologii żywieniowej 100,101,102, ekologii ewolucyjnej i ekotoksykologii. Te podejścia do sztucznej diety pozwalają naukowcom odpowiedzieć na pytania dotyczące roli określonych lipidów w ewolucji poznawczej103, wstępnej adaptacji do toksyn28, składników diety, które zmniejszają toksyczność zanieczyszczeń104 lub interakcji stechiometrycznych między składnikami odżywczymi105.

Mały biały motyl kapusty (Pieris rapae, dalej "kapusta biała") to kosmopolityczny gatunek szkodnika upraw gorczycy, takich jak kapusta, brokuły i rzepak1,2,3. Jednocześnie biała kapusta jest potężnym systemem do badań w biologii i powszechnie używanym modelem motyla, ponieważ można je łatwo hodować i manipulować nimi w kontrolowanych eksperymentach laboratoryjnych4,5. Badania nad białymi motylami kapusty dostarczyły krytycznych informacji na temat wyszukiwania gospodarzy6,7,8, wykorzystanie zasobów nektarowych9,10,11, wybór partnera i selekcja płciowa12,13,14, wzór skrzydła Rozwój i ewolucja15,16,17, oraz odpowiedzi na nowe i zmieniające się środowiska18,19. Wiele z tych spostrzeżeń opiera się na fakcie, że białka kapusty mogą być hodowane na sztucznych dietach4,20,21, które można precyzyjnie zmanipulować, aby odzwierciedlić złe warunki żywieniowe22,23, ekologicznie istotne poziomy zanieczyszczeń24,25,26,27, lub przejście do nowych roślin żywicielskich28,29. W niniejszym badaniu wykorzystano eksperyment dotyczący narażenia na metale ciężkie w celu zilustrowania podstawowych metod hodowli białych motyli kapuścianych na sztucznej diecie w laboratorium oraz kluczowych wskaźników wydajności larw i osobników dorosłych. Wiele aspektów tych metod odnosi się do innych motyli30,31 i moths32,33,34, które mogą być hodowane na sztucznej diecie.
W tym artykule, eksperyment dotyczący tolerancji metalu jest używany do zilustrowania ogólnych metod hodowli białych motyli kapuścianych. Metale ciężkie są powszechnym zanieczyszczeniem antropogenicznym wynikającym z degradacji produktów stosowanych przez ludzi, procesów przemysłowych i zanieczyszczeń powstałych w wyniku historycznego stosowania w pestycydach, farbach i innych produktach35,36,37,38. Wiele metali ciężkich, w tym ołów, miedź, i nikiel, może przedostać się z gleby i wody do tkanki roślinnej39,40,41,42, a metale w pyle mogą osadzać się na liściach roślin43,44,45, co skutkuje wieloma drogami narażenia na larwy owadów fitofagowych. Narażenie na metale ciężkie we wczesnym okresie życia może mieć negatywny wpływ na rozwój zwierząt, zwłaszcza na tkankę nerwową, a wysoki poziom może być śmiertelny35,36,46,47,48. Liczne badania wykazały negatywny wpływ narażenia na metale na rozwijające się owady, w tym zarówno szkodniki, jak i owady pożyteczne49,50,51. Duża liczba zanieczyszczeń metalami ciężkimi oraz fakt, że często współwystępują one w środowisku ludzkim 52, oznacza, że potrzebne są precyzyjne metody laboratoryjne, w których naukowcy mogą wystawić rozwijające się owady na różne poziomy i kombinacje różnych metali, aby zrozumieć i złagodzić ich wpływ na środowisko.
Niniejsza praca porównuje wpływ zwykłych metali na przetrwanie i rozwój białej kapusty, skupiając się na miedzi (Cu), (Zn) i niklu (Ni), trzech powszechnych zanieczyszczeniach w środowisku ludzkim. Na przykład materiały z wiejskich poboczy dróg w Minnesocie zawierają do 71 ppm Zn, 28 ppm Cu i 5 ppm Ni53. W tym eksperymencie manipuluje się poziomami tych metali w sztucznej diecie białych motyli kapusty na poziomach odpowiadających i przekraczających poziomy obserwowane w środowisku. Sztuczna dieta jest stosowana w celu skontrastowania względnej toksyczności tych metali, przewidując, że białka kapusty będą bardziej wrażliwe na zanieczyszczenia metalami, które nie są integralną częścią ich fizjologii (nikiel) w porównaniu z tymi, które występują, choć w niewielkich stężeniach, w enzymach i tkankach (miedź i; <silna klasa="xfig">Rysunek 1). W całym tekście tym przedstawiono szczegóły metodologiczne i towarzyszące im wizualizacje wideo, aby zilustrować metody hodowli i badań tego ważnego systemu modeli motyli.

<table><tbody><tr><td>Zlewka Pyrex 1 l</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-250-059</td><td></td></tr><tr><td>Butla z podziałką 500 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-007-43</td><td></td></tr><tr><td>60-milimetrowa plastikowa pokrywka na szalkę Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Frontier</td><td>6015</td><td></td></tr><tr><td>Blender</td><td>Amazon - Sklep Ninja</td><td>BL610 Professional</td><td></td></tr><tr><td>Mąka kapuściana</td><td>Frontier</td><td>1086</td><td></td></tr><tr><td>Kazeina</td><td>Frontier</td><td>1100</td><td></td></tr><tr><td>Celluose</td><td>Frontier</td><td>3425</td><td></td></tr><tr><td>Cholsterol</td><td>Sigma</td><td>C3045</td><td></td></tr><tr><td>Kubki do hodowli (4 uncje)</td><td>Wasserstrom</td><td>6094583</td><td>zakupu z pasującymi pokrywkami</td></tr><tr><td>Agar o drobnych oczkach</td><td>Olej</td> lniany Sigma <td></td><td></td>o drobnych oczkach</tr><tr><td></td><td>amazon</td><td>B004R63VI6</td><td></td></tr><tr><td>Rurki wodne z kwiatami, 2.8 x 0.8 cala</td><td>Amazon - Yimaa Bezpośrednie</td><td>B08BZ969DK</td><td></td></tr><tr><td>Koperty pergaminowe (1 3/4 x 2 7/8 cala)</td><td>Amazon - Czarodziejskie klatki</td><td></td> siatkowe B0045FG90G <td></td>monet</tr><tr><td>(15.7 x 15.7 x 23.6")</td><td>Przenośna waga Amazon</td><td>B07SK6P94S</td><td></td></tr><tr><td>Methyl Paraben</td><td>Frontier</td><td>7685</td><td></td></tr><tr><td>Ohaus</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-112-228</td><td></td></tr><tr><td>Organiczny miód</td><td>Amazon</td><td>B07DHQQFGM</td><td></td></tr><tr><td>Przenośny lightbox do studia fotograficznego</td><td>Amazon</td><td>B07T6TNYJ1</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy kosz, rozmiar pudełka po butach</td><td>Amazon</td><td>B09L3B3V1R</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe jednorazowe pipety transferowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-50</td><td></td></tr><tr><td>Kwas sorbowy</td><td>Sigma</td><td>S1626</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułki</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Target</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Torula Drożdże</td><td>Frontier</td><td>1720</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka witamin Vanderzant</td><td>Frontier</td><td>F8045</td><td></td></tr><tr><td>Łodzie do ważenia</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-549-750</td><td></td></tr><tr><td>Wesson Salt Mix</td><td>Frontier</td><td>F8680</td><td></td></tr><tr><td>Kiełki pszenicy</td><td>Frontier</td><td>G1659</td><td></td></tr><tr><td>Siatka na motyle z drewnianą rączką, obręcz 12"</td><td>Amazon - Nauka</td> edukacyjna <td>B00O5JDLVC</td><td></td></tr><tr><td>Żółte gąbki</td><td>Amazon-Celox</td><td>B0B8HTHY5B</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla białego motyla kapuścianego (pieris rapae) w kontrolowanych warunkach: studium przypadku z tolerancją na metale ciężkie

Rearing the Cabbage White Butterfly (Pieris rapae) in Controlled Conditions: A Case Study with Heavy Metal Tolerance

Biały motyl kapuściany (Pieris rapae) jest ważnym systemem dla stosowanych badań nad zwalczaniem szkodników i podstawowych badań w zakresie ekologii behawioralnej i żywieniowej. Białka kapusty mogą być łatwo hodowane w kontrolowanych warunkach na sztucznej diecie, co czyni je modelowym organizmem świata motyli. W niniejszej pracy wykorzystano manipulację narażeniem na metale ciężkie w celu zilustrowania podstawowych metod hodowli tego gatunku. Ogólny protokół ilustruje, w jaki sposób motyle mogą być łapane na polu, nakłaniane do składania jaj w klatkach szklarniowych i przenoszone jako larwy na sztuczną dietę. Metody pokazują, w jaki sposób motyle mogą być oznaczane, mierzone i badane pod kątem różnych pytań badawczych. Reprezentatywne wyniki dają wyobrażenie o tym, w jaki sposób sztuczne diety, które różnią się składnikami, mogą być wykorzystywane do oceny wydajności motyli w porównaniu z dietą kontrolną. Mówiąc dokładniej, motyle były najbardziej tolerancyjne na nikiel i najmniej tolerancyjne na miedź, z tolerancją gdzieś pośrodku. Omówiono możliwe wyjaśnienia tych wyników, w tym nadmierną akumulację niklu w niektórych roślinach żywicielskich gorczycy oraz niedawne dowody u owadów, że miedź może być bardziej toksyczna, niż wcześniej sądzono. Wreszcie, dyskusja najpierw omawia zmiany w protokole i wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów z tymi metodami, a następnie rozważa, w jaki sposób przyszłe badania mogą jeszcze bardziej zoptymalizować sztuczną dietę zastosowaną w tym badaniu. Ogólnie rzecz biorąc, zapewniając szczegółowy przegląd wideo hodowli i pomiaru białek kapusty na sztucznych dietach, protokół ten stanowi źródło informacji na temat wykorzystania tego systemu w szerokim zakresie badań.

Przegląd 
Sztuczna dieta może być wykorzystana do hodowli bielinka kapustnika w standardowych warunkach w celu przetestowania wpływu poszczególnych składników diety na kondycję motyli. W niniejszej pracy zastosowano sztuczne diety do badania toksyczności różnych metali występujących w roślinach żywicielskich rosnących na terenach zanieczyszczonych (Rycina 1). Larwy hodowano na dietach zawierających zwiększające się stężenia trzech różnych metali (Rycina 2; szczegółowe informacje metodologiczne przedstawiono w sekcji 6 protokołu). Przeżywalność i rozwój motyli były w największym stopniu zaburzone przez miedź i cynk, a w najmniejszym przez nikiel (Rycina 3 i Rycina 4), przy wrażliwości porównywalnej z innymi badaniami nad motylami i ćmami hodowanymi na sztucznych dietach (Rycina 5).
Przeżywalność 
Larwy motyli przeniesiono na sztuczne pożywki zawierające miedź, nikiel, cynk lub pożywkę kontrolną, przy czym stężenie każdego metalu zróżnicowano na trzech poziomach (Tabela 3). Reprezentatywny obraz larw przy zwiększającej się dawce toksyny przedstawiono na Rysunku 2. W przypadku niklu nie stwierdzono wpływu stężenia metalu na przeżywalność, natomiast w przypadku miedzi i cynku efekt ten był istotny (Tabela 3 i Rysunek 3). Porównania post-hoc z użyciem testu chi-kwadrat wykazały, że w przypadku cynku spadek przeżywalności względem pożywki kontrolnej nastąpił jedynie przy najwyższym poziomie cynku (1,000 ppm, porównanie post-hoc X12 = 8.41, p = 0.004; Rysunek 1). Miedź również wykazała istotny spadek przeżywalności tylko przy najwyższych zastosowanych poziomach (500 ppm, X12 = 7.00, p = 0.008), choć przy dwóch najniższych poziomach (50 ppm i 100 ppm) zaobserwowano nieistotny statystycznie wzrost przeżywalności (Rysunek 3).
Czas rozwoju 
Stwierdzono istotny wpływ stężenia miedzi i cynku na czas rozwoju (Tabela 4 i Rycina 4). Wraz ze wzrostem stężenia miedzi obserwowano wydłużenie czasu rozwoju, przy czym istotne odchylenie od grupy kontrolnej zaczynało się od 50 ppm (p = 0.027; Rycina 3). Wraz ze wzrostem stężenia cynku również odnotowano wydłużenie czasu rozwoju, a istotne odchylenie od kontroli występowało od 100 ppm (p = 0.03; Rycina 4). Zaobserwowano tendencję, zgodnie z którą zwiększenie zawartości niklu prowadziło do dłuższego czasu rozwoju (p = 0.08; Tabela 4), a porównania każdej diety z grupą kontrolną wykazały istotne efekty począwszy od 100 ppm (p = 0.022; Rycina 4).
<img alt="Analiza stężenia metali, wykres słupkowy; miedź, nikiel, cynk; wyniki badania wpływu na środowisko." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Obserwowane poziomy wybranych metali w tkankach motyli i roślinach żywicielskich. (Dane z62.) Przedstawiono poziomy miedzi, niklu i cynku w tkankach motyli z rodzaju Pieris (hodowanych w laboratorium na kapuście pak choi) oraz w dziko rosnących gorczycach (Bertorea sp.). Ikony samochodów wskazują poziomy zaobserwowane w liściach roślin wzdłuż dróg o dużym natężeniu ruchu53. Poziomy metali w dietach sztucznych stosowanych w niniejszym badaniu przedstawiono w Tabeli 1; punkty reprezentują wartości średnie, a słupki błędu reprezentują błąd standardowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wzrost gąsienic na dietach o różnym stężeniu; wyniki eksperymentu; analiza wpływu żywienia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Zdjęcie larw bielinka kapustnika przeniesionych w tym samym dniu na sztuczne diety o zwiększającym się stężeniu toksyny. Zdjęcie przedstawia larwy z badania zależności dawka-odpowiedź (opisanego w 28 z wykorzystaniem wysuszonego materiału roślinnego toksycznej rośliny Aristolochia). Zdjęcie wykonane przez ESR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Współczynniki przeżywalności w zależności od stężeń miedzi, niklu i cynku; wykres słupkowy; analiza toksyczności; wpływ biologiczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Zmienność przeżywalności w zależności od diet z metalami o rosnących stężeniach. Gwiazdki oznaczają istotne odchylenie przeżywalności w stosunku do diety kontrolnej. Dokładne stężenia metali w dietach wymieniono w Tabeli 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres czasu rozwoju w funkcji stężenia; miedź, nikiel, cynk; słupki błędów; ppm; wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4: Wpływ stężenia metali na czas rozwoju. Gwiazdki wskazują najniższe stężenie metalu, dla którego występuje istotna różnica w stosunku do kontroli (przy użyciu testu t). Dokładne stężenia metali w dietach wymieniono w Tabeli 2. Punkty reprezentują średnie, a słupki błędów reprezentują błąd standardowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres przeżywalności w obecności toksycznych metali; poziomy Cd, Cu, Ni, Pb, Zn a efekt przeżywalności, wykres słupkowy ppm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Podsumowanie tolerancji metali u innych Lepidoptera. Przedstawiono złożone dane dotyczące przeżywalności wykreślone na podstawie 11 istniejących badań49,50,51,56,63,64,65,66,67,68. Zmienną odpowiedzią jest poziom (w ppm) stężenia metalu, przy którym po raz pierwszy zaobserwowano negatywne efekty dla przeżywalności. Motyle wskazują wyniki z niniejszego badania, przy czym zauważono, że wartości tolerancji dla niklu były wyższe niż te zmierzone w tym badaniu. Punkty reprezentują średnie, a słupki błędów reprezentują błąd standardowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig05large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Składnik</td>
			<td>Odważić</td>
			<td>g</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zarodek pszenicy</td>
			<td>składniki sypkie</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celuloza</td>
			<td>składniki sypkie</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mąka z kapusty</td>
			<td>składniki sypkie</td>
			<td>15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kazeina</td>
			<td>składniki sypkie</td>
			<td>27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacharoza</td>
			<td>składniki sypkie</td>
			<td>24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mieszanka soli Wessona</td>
			<td>składniki sypkie</td>
			<td>9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drożdże Torula</td>
			<td>składniki sypkie</td>
			<td>12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>składniki suche</td>
			<td>3.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mieszanka witaminowa</td>
			<td>składniki sypkie</td>
			<td>10.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metyloparaben</td>
			<td>składniki sypkie</td>
			<td>0.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas sorbowy</td>
			<td>składniki sypkie</td>
			<td>1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas askorbinowy</td>
			<td>składniki sypkie</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycyna</td>
			<td>składniki sypkie</td>
			<td>0.175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olej lniany</td>
			<td>składniki mokre</td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar </td>
			<td>agar</td>
			<td>15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Receptura pożywki sztucznej. Przedstawiono masy (i objętości) składników dla jednej partii pożywki dla bielaka kapustnika. Składniki suche (oraz olej lniany) przygotowuje się oddzielnie od mieszaniny agaru (rozpuszczonego w 400 mL wrzącej wody, a następnie schłodzonego poprzez dodanie 400 mL wody o temperaturze pokojowej).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Typ diety</td>
			<td >Miedź (ppm)</td>
			<td >Nikiel (ppm)</td>
			<td >Cynk (ppm)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Miedź-„100 ppm”</td>
			<td >96.1</td>
			<td >1.75</td>
			<td >69.9</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nikiel-„100 ppm”</td>
			<td >7.29</td>
			<td >109.6</td>
			<td >68.9</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cynk-„100 ppm”</td>
			<td >7.96</td>
			<td >1.06</td>
			<td >186.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cynk-„500 ppm”</td>
			<td >6.51</td>
			<td >1.16</td>
			<td >708</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kontrola</td>
			<td >5.89</td>
			<td >0.59</td>
			<td >59.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Pomiary zawartości metali w dietach. Przedstawiono średnie poziomy miedzi, niklu i cynku w podzbiorze diet sztucznych wykorzystanych w badaniu. Nazwa diety („typ” w analizie) znajduje się po lewej stronie, a wartości w cudzysłowie to poziomy obliczone. Docelowe stężenie wskazano w cudzysłowie. Przeanalizowano podzbiór diet stosowanych w badaniu, aby upewnić się, że wartości obliczone są zgodne z wartościami faktycznymi; należy zaznaczyć, że często występuje niewielki stopień zmienności w składzie komponentów diety, a każda raportowana linia reprezentuje tylko jeden powtórz). 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>JatSztuczna inteligencja</td>
			<td>Pearson X32</td>
			<td>P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miedź (N = 118)</td>
			<td>17.82</td>
			<td>0.0005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikiel (N = 152)</td>
			<td>3.45</td>
			<td>0.33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cynk (N = 152)</td>
			<td>12.52</td>
			<td>0.006</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Wpływ stężenia metali na przeżywalność.Przedstawiono wyniki testu chi-kwadrat dla każdego metalu, porównując trzy stężenia metalu z dietą kontrolną.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Metal</td>
			<td >F</td>
			<td >P</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Miedź (N = 61)</td>
			<td >F3,57 = 9.84</td>
			<td >&lt;0.0001</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Nikiel (N = 75)</td>
			<td >F3,71 = 2.35</td>
			<td >0.079</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Cynk (N = 64)</td>
			<td >F3,60 = 3.79</td>
			<td >0.015</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 4: Wpływ stężenia metali na czas rozwoju. Przedstawiono wyniki poszczególnych analiz ANOVA dla każdego metalu.
Dostępność danych:
Wszystkie dane są dostępne w serwisie Mendeley61.

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół hodowli białego motyla kapuścianego w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych z zastosowaniem sztucznej diety, co pozwala na precyzyjne manipulacje odżywiania we wczesnym okresie życia i ekspozycji na toksyny. Reprezentatywne wyniki pokazują, w jaki sposób można oznaczyć toksyczność metali ciężkich za pomocą tego protokołu.

Hodowla białego motyla kapuścianego (Pieris rapae) w kontrolowanych warunkach: studium przypadku z tolerancją na metale ciężkie

The cabbage white butterfly (Pieris rapae) is an important system for applied pest control research and basic research in behavioral and nutritional ...

W tym badaniu jesteśmy zainteresowani zrozumieniem, w jaki sposób organizmy radzą sobie ze środowiskami antropogenicznymi, takimi jak miasta, pobocza dróg i pola uprawne. Używamy białych motyli kapuścianych jako systemu, ponieważ łatwo nimi manipulować eksperymentalnie. Na przykład badamy nietolerancję zmienności genetycznej na zanieczyszczenia miejskie.Zbieramy próbki z różnych miejsc i populacji, aby badać zmienność na przestrzeni gatunków lub przestrzeni. Siatki, chłodziarki i koperty to nasze główne narzędzia w terenie. Cechy motyli są mierzone za pomocą mikroskopii, a ICPMS jest najlepszą metodą pomiaru stężeń metali ciężkich w małych próbkach.Jednym z obecnych wyzwań eksperymentalnych jest badanie zmienności między gatunkami w ich dostosowaniu rozwojowym do środowiska ludzkiego. Główna trudność polega na hodowli różnych gatunków w kontrolowanych warunkach doświadczalnych. Podczas gdy białe motyle kapusty są łatwe w hodowli, znalezienie odpowiedniej analogicznej diety dla 10 lub 20 różnych gatunków, które żywią się różnymi roślinami, stanowi poważne wyzwanie z perspektywy eksperymentalnej.Jesteśmy zainteresowani ograniczeniem narażenia na toksyny miejskie, badane są interwencje ekologiczne, które mogłyby zmniejszyć toksyczność metali ciężkich i innych zanieczyszczeń miejskich, takich jak mikroplastiki. Ponadto naszym celem jest zbadanie, w jaki sposób projektować enklawy siedlisk w przestrzeniach miejskich, aby wspierać zdrowie żyjących tam roślin i zwierząt, w tym ludzi. Na początek zbierz dorosłe samice motyli za pomocą powietrznej siatki na owady i umieść je w klatce, aby zebrać jaja.Umieść rośliny żywicielskie w doniczkach lub pojemnikach z wodą, aby utrzymać nacisk liści. W przypadku bezpośredniego zbierania jaj i przenoszenia do diety, przymocuj liść rośliny żywicielskiej do plastikowego kubka z wodą za pomocą gumki. Następnie rozciągnij kawałek paraformy wokół krawędzi kubka, tak aby samice dotykające liścia złożyły jaja na paraformie.Spryskaj klatkę wodą, aby utrzymać wysoką wilgotność względną w klatce. Jeśli rośliny doniczkowe są podlewane w klatce, umieść ręcznik pod doniczką, aby zapobiec gromadzeniu się wody i chronić motyle przed uwięzieniem. Przygotuj 10% wodę z miodem do karmienia motyli.Następnie, aby ustawić karmnik, dokładnie opłucz żółte lub pomarańczowe gąbki wodą z kranu i pokrój je w małe kwadraty. Umieść gąbki na 60-milimetrowych plastikowych szalkach Petriego i dodaj do nich wodę z miodem. Codziennie zmieniaj karmniki i czyść gąbki w łagodnym roztworze wybielacza.Następnie dokładnie spłucz wodą z kranu, aby zapobiec rozwojowi pleśni. Wydrukuj przepis zawierający składniki ważące do przygotowania sztucznej diety, w którym wszystkie suche składniki z wyjątkiem agaru znajdują się w jednym pojemniku. Umieść mieszankę suchych składników w blenderze i dodaj pięć mililitrów oleju lnianego do mieszanki składników.Wymieszaj 15 gramów agaru o drobnych oczkach dla każdej partii diety z 400 mililitrami wody destylowanej w jednolitrowej zlewce. Podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej, aż agar będzie bliski wrzenia z drobnymi bąbelkami w całej mieszance. Po ugotowaniu dodaj 400 mililitrów wody destylowanej o temperaturze forcer, aby obniżyć temperaturę i wymieszać się z suchymi składnikami.Następne miejsce, kubki dietetyczne o pojemności 74 uncji na ladzie z krawędziami stykającymi się. Dodaj mieszaninę agarową do blendera i dokładnie wymieszaj. Po wymieszaniu przelej mieszanki do kubków dietetycznych, upewniając się, że dieta pokrywa dno każdej filiżanki.Po ostygnięciu diety umieść pokrywki na kubkach. Oznacz kubki typem diety i ułóż je na tacach. Liście roślin żywicielskich z jajami motyli w kubkach delikatesowych o pojemności 30 uncji z siateczkową pokrywą w komorze klimatycznej o temperaturze 24 stopni Celsjusza.Po tygodniu sprawdź miseczki pod kątem późnych larw pierwszego lub wczesnego drugiego stadium rozwojowego. Za pomocą pędzla przenieś larwy na sztuczną dietę. Umieść trzy larwy w każdym kubku o pojemności czterech uncji.Umieść kubki na bokach w plastikowym pojemniku, pozwalając frass spaść na dno i z dala od diety, zmniejszając ryzyko pleśni i chorób. Przechowuj kubki dietetyczne w kontrolowanych warunkach temperaturowych przy niskim lub umiarkowanym poziomie światła. Monitoruj kubki pod kątem pleśni lub chorób co jeden do dwóch dni, sprawdzając przez przezroczyste pokrywki kubków.Pozwól larwom przepoczwarzyć się i wyłonić w kubkach dietetycznych. Ostrożnie wyjmij dorosłe motyle z miseczek czystymi rękami, chwytając wszystkie cztery skrzydła blisko ich ciała, aby zapewnić stabilne trzymanie. Aby oznaczyć motyle, przytrzymaj suche osobniki za głowę i klatkę piersiową, a następnie za pomocą cienkiej końcówki zaznacz liczbę na tylnym skrzydle.Określ płeć motyli, łącząc oznaczenia skrzydeł i badanie narządów płciowych. Następnie chwyć dorosłego człowieka jedną ręką za głowę i klatkę piersiową, a drugą ręką otwórz woskową kopertę nabłyszczającą. Następnie przenieś dorosłego osobnika do koperty i zabezpiecz skrzydełka przez kopertę.Utrzymuj motyle w temperaturze od pięciu do sześciu stopni Celsjusza przez okres do tygodnia przed eksperymentami. W tym studium przypadku wzrost stężenia niklu nie miał wpływu na przeżywalność motyli, ale miał znaczący wpływ zarówno w przypadku miedzi, jak i. Na tempo rozwoju motyli wpływ miały miedź i.Wraz ze wzrostem stężenia miedzi nastąpił wzrost czasu rozwoju, przy znacznym odchyleniu od kontroli zaczynającej się od 50 PPM. Wraz ze wzrostem stężenia nastąpił wzrost czasu rozwoju, przy czym odchylenie istotności od kontroli zaczynało się od 100 PPM. Aby zmierzyć cechy skrzydeł martwych motyli, trzymaj klatkę piersiową w jednej ręce i za pomocą kleszczy usuń każde skrzydło u podstawy.Umieść skrzydła w kasecie świetlnym i zrób zdjęcia do pomiarów. Aby zmierzyć aspekty reprodukcji, dorosłe motyle należy umieścić w klatkach godowych, pozwalając na jeden dzień na dojrzewanie reprodukcyjne samców i jeden dzień na krycie. Aby oszacować, albo składaj ofiary samice w celu zliczenia jaj poprzez sekcję w określonych punktach czasowych, albo zbieraj jaja codziennie na roślinach żywicielskich.Aby oszacować obciążenie jajami, usuń brzuch, umieść go w PBS i wykonaj nacięcie wzdłuż strony brzusznej. Za pomocą kleszczy oddziel je od naskórka i wyciągnij jajniki z jelita, tchawicy i innej zawartości brzucha. Ostrożnie rozwiń cztery jajniki w każdym jajniku i obserwuj przejście od dojrzałych, żółtkowych i oskorupionych jaj do niedojrzałych pęcherzyków.Następnie użyj licznika, aby policzyć całkowitą liczbę dojrzałych jaj. Aby ocenić stan krycia wypreparowanej samicy, otwórz kopulatrix kaletki i oddziel spermatofory.

rearing-cabbage-white-butterfly-pieris-rapae-controlled-conditions

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Odporność roślin na gryzące owady roślinożerne można testować na kilka sposobów. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak zaplanować eksperyment z wyborem oraz bez wyboru, wykorzystując roślinę modelową Arabidopsis thaliana, aby zidentyfikować odporność na szkodnika z gatunku Pieris rapae.

Testy z wyborem i bez wyboru w celu zbadania odporności A. thaliana na owady gryzące

Opisano doustną i wewnątrzhemokoliczną infekcję larw mchowca dużego Galleria mellonella. Owad ten może być wykorzystywany do badania czynników wirulencji bakterii entomopatogennych, a także oportunistycznych bakterii ssaków. Opisano hodowlę owadów, metody infekcji oraz przykłady analiz in vivo.

Owad Galleria mellonella jako potężny model infekcji do badania patogenezy bakteryjnej

W tej pracy opisujemy ostry, przewlekły i wielopokoleniowy test biologiczny, aby zbadać wpływ pojedynczych i połączonych stresorów na turkusową karpię Nothobranchius furzeri. Protokół ten ma na celu badanie cech historii życia (śmiertelność, wzrost, płodność, waga) i krytycznego maksimum termicznego.

Protokół badania ostrej i przewlekłej ekotoksyczności turkusowej Killifish Nothobranchius furzeri

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół wystawiania gatunków z rodzaju Drosophila na zanieczyszczenia w celu zbadania wpływu ekspozycji na szereg wyników fenotypowych w różnych stadiach rozwoju i dla więcej niż jednego pokolenia.

Protokół doświadczalny wykorzystania Drosophila jako modelowego systemu bezkręgowców do badań toksyczności w laboratorium

Trans- i wielopokoleniowe skutki trwałych chemikaliów są niezbędne do oceny ich długoterminowych konsekwencji dla środowiska i zdrowia ludzkiego. Udostępniamy nowatorskie szczegółowe metody badania efektów trans- i wielopokoleniowych z wykorzystaniem wolno żyjących nicieni Caenorhabditis elegans.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badania trans- i wielopokoleniowych skutków substancji toksycznych

Tutaj prezentujemy protokoły dotyczące 1) laboratoryjnego rozmnażania zagrożonego wyginięciem motyla niebieskiego motyla z Miami (Cyclargus thomasi bethunebakeri) oraz 2) oceny podstawowych informacji o historii życia, takich jak czas niedojrzałego rozwoju i liczba stadiów larwalnych. Obie metody mogą być dostosowane do stosowania z innymi programami ochrony ex situ.

Programy rozmnażania zagrożonych motyli w niewoli w celu poszerzenia wiedzy na temat historii życia i skutecznych technik ochrony ex situ

Tutaj opisany jest tani, dostępny protokół do oceny regeneracji motyli po szoku zimna w warunkach otoczenia.

Test fizjologii termicznej w terenie: odzyskiwanie po szoku zimna w warunkach otoczenia

Tutaj prezentujemy prosty protokół nieinwazyjnego pobierania próbek genetycznych populacji motyli na podstawie zbierania w terenie resztek jaj. Może być używany do potwierdzania tożsamości gatunku i ilościowego określania zmienności genetycznej. Protokół ten można łatwo dostosować do szerszych grup w celu zaangażowania społeczności w naukę.

Rozmieszczenie naukowców w celu przeprowadzenia nieniszczących próbek genetycznych rzadkich populacji motyli

Protokół testu biologicznego z oderwanymi liśćmi został opracowany dla masowej hodowli wciornastków chili przy użyciu zmodyfikowanej metody oderwanych liści w szklanych pojemnikach zawierających agar, zapewniając wysoką przeżywalność i zsynchronizowany rozwój. System ten umożliwia skuteczne badania przesiewowe zjadliwości grzybów entomopatogenicznych przeciwko larwom w drugimstadium rozwojowym i zapewnia niezawodne dostarczanie wciornastków do ocen laboratoryjnych, szklarniowych i terenowych.

Ustanowienie systemu hodowli wciornastków chili (Scirtothrips dorsalis hood) do badań przesiewowych zjadliwości grzybów entomopatogenicznych

Testowanie wrażliwości wizualnej u jaszczurek przy operant paradygmat klimatyzacji, która zatrudnia odtwarzania wideo losowych punktów, kinematograms i generowanych komputerowo bezkręgowców.

Badania wizualne Wrażliwość na prędkość i kierunek ruchu w Jaszczurki

Poznaj metodę hodowli białego motyla kapuścianego Pieris rapae w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Badanie pokazuje wpływ metali ciężkich na rozwój owadów w środowisku miejskim.

Hodowla białego motyla kapuścianego (Pieris rapae) w kontrolowanych warunkach: studium przypadku z tolerancją na metale ciężkie

Przeglądaj więcej filmów