Name: Przygotowanie ex vivo wycinka rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach ruchowych podczas stymulacji rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Naucz się techniki patch-clamp w preparacie ex vivo rdzenia kręgowego szczura do badania odpowiedzi neuronów ruchowych na stymulację. Metoda umożliwia rejestrację potencjałów czynnościowych z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 and 82301657) oraz China Postdoctoral Science Fund (2022M711833).

Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania zatwierdził wszystkie eksperymenty na zwierzętach, a badania zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt.
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>zwierzęta
	<ol>
		<li>Informacje o pomieszczeniach: Samiec szczura Sprague-Dawley (po urodzeniu 10-14 dni, P10-P14) w specyficznym środowisku wolnym od patogenów. 
		UWAGA: Warunki pokojowe utrzymywano na poziomie 20 °C ± 2 °C, wilgotność: 50%-60%, przy 12-godzinnym cyklu światła/ciemności. Zwierzęta miały swobodny dostęp do pożywienia i wody.</li>
		<li>Oznacz neurony ruchowe wstecz: Wstrzyknij fluoro-złoto (FG) do obustronnego mięśnia piszczelowego przedniego i brzuchatego łydki (2% w sterylnej soli fizjologicznej, 50 μl na mięsień), aby wstecznie oznaczyć neurony ruchowe 2 dni przed ofiarą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwiązania
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór do cięcia: Wymieszaj 120 mM chlorku choliny, 2,6 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 0,5 mM CaCl2, 7 mM MgCl2, 1,3 mM kwasu askorbinowego, 15 mM glukozy. Wstępnie bąbelkować roztwór 95%O2 i 5% CO2 (dostosować do pH 7,4 za pomocą KOH) przez 30 minut przed rozbieraniem i krojeniem. Ostudzić roztwór kruszonym lodem.</li>
		<li>Przygotuj sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF): Wymieszaj 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4; 1,3 mM MgCl2, 2,4 mM CaCl2, 26 mMNaHCO3 i 10 mM glukozy. Wstępnie bąbelkować roztwór z 95%O2 i 5% CO2 przez 30 minut przed inkubacją.</li>
		<li>Przygotuj roztwór wewnątrzkomórkowy: Wymieszaj 126 mM K-glukonianu, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na2ATP, 0,4 mM Na2GTP, 10 mM K-fosfokreatyny i 0,5% neurobiotyny (pH 7,25 i 305 mOsm/kg). Ostudzić roztwór kruszonym lodem.</li>
		<li>Przygotuj niskotopliwy żel agarozowy: Rozpuść 4 g agarozy w 100 ml roztworu tnącego i użyj magnetycznego wirnika mieszającego, aby całkowicie go rozpuścić. W 30 minut przed zatopieniem podgrzej niskotemperaturową agarozę w kuchence mikrofalowej z dużą mocą przez 1 minutę, a następnie przenieś ją do łaźni wodnej o temperaturze 39 °C, aby utrzymać stan ciekły.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie instrumentu
	<ol>
		<li>Umieść kruszony lód na tacy perfuzyjnej (rysunek uzupełniający 1A) na 10 minut przed perfuzją. Umieścić wcześniej na noc tacę anatomiczną (rysunek uzupełniający 1B) i tacę do cięcia (rysunek uzupełniający 1C) z opaską wodną w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Komorę inkubacyjną z siatką nylonową umieścić wcześniej na noc w piekarniku w temperaturze 45 °C.</li>
		<li>Użyj agarozy o niskiej temperaturze topnienia, aby prefabrykować nachylenie 35° i platformę o grubości 2 mm (rysunek uzupełniający 1D). Po zestaleniu żelu umieść je na środku 35-milimetrowej szalki Petriego, aby podeprzeć rdzeń kręgowy w kolejnych nadchodzących zabiegach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja śródsercowa
	<ol>
		<li>Znieczulić szczury 2,5% tribromoetanolem (160 μl/10 g) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Upewnij się, że szczury są w pełni znieczulone, sprawdzając brak reakcji na bodźce zewnętrzne, takie jak delikatne szczypanie palca u nogi.</li>
		<li>Gdy prawidłowe znieczulenie zostanie potwierdzone, ułóż szczury na wznak i unieruchom je na szalce Petriego wypełnionej żelem krzemionkowym.</li>
		<li>Wytnij 5-milimetrowe podłużne nacięcie skóry doogonowo do wyrostka mieczykowatego, a następnie całkowicie rozszerz przestrzeń podskórną. Wytnij 2-centymetrowe podłużne nacięcie skóry wzdłuż brzusznej linii środkowej, aby całkowicie odsłonić zewnętrzną ścianę klatki piersiowej, zaczynając od wyżej wymienionego nacięcia, a kończąc na górnej części klatki piersiowej.</li>
		<li>Użyj pęsety zębatej, aby podnieść mieczyk mieczykowaty (rysunek uzupełniający 2A), a następnie użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć membranę. Przeciąć mostek po obu stronach wyrostka mieczykowatego, aby otworzyć klatkę piersiową i odsłonić serce (rysunek uzupełniający 2B). 
		UWAGA: Uważaj, aby zachować wewnętrzne naczynia piersiowe po obu stronach; W przeciwnym razie może spowodować masywne krwawienie.</li>
		<li>Użyj bezzębnej pęsety, aby podnieść lewą komorę. Wprowadzić igłę 22 G do wierzchołka lewej komory wzdłuż osi podłużnej lewej komory (rysunek uzupełniający 2C). W międzyczasie obserwuj rytmiczne pulsowanie krwi w rurce perfuzyjnej, w przeciwnym razie igła może wbić się w prawą komorę, co może prowadzić do słabego efektu perfuzji. 
		UWAGA: Nie należy używać pęsety zębatej; W przeciwnym razie może to spowodować dodatkowy wyciek krwi z miejsca, w którym trzyma się pęseta.</li>
		<li>Użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć prawy przedsionek (rysunek uzupełniający 2C), a następnie ręcznie wstrzyknij 100 ml lodowatego płynu perfuzującego z szybkością około 2 ml / s w ciągu 1 minuty 
		UWAGA: Kiedy wątroba i łapy szczurów bledną, a krew nie wypływa z prawego przedsionka, można osiągnąć dobrą perfuzję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwarstwienie rdzenia kręgowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
	<ol>
		<li>Umieść szczura w pozycji leżącej i przetnij kręgosłup odpowiednio w przedniej górnej części kręgosłupa biodrowego (około poziomu kręgów L4) i punkcie zmiany krzywizny kręgosłupa piersiowego (około poziomu kręgów T6) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Następnie natychmiast umieść izolowany kręgosłup w natlenionym, lodowatym roztworze perfuzyjnym, aby zmyć resztki krwi i tkanki tłuszczowej; Procedura ta jest korzystna dla utrzymania czystości pola operacyjnego w kolejnych zabiegach. 
		UWAGA: Mięśnie przykręgosłupowe powinny być zarezerwowane, co sprzyja późniejszemu unieruchomieniu kręgosłupa za pomocą szpilki przeciw owadom.</li>
		<li>Natychmiast przenieś izolowany kręgosłup do anatomicznej tacy (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1B) grzbietem do góry i końcem rostralnym blisko operatora. Napełnij anatomiczną tacę 50 ml stale natlenionego roztworu do cięcia na zimno (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B).</li>
		<li>Użyj czterech szpilek do owadów, aby przymocować kręgosłup, penetrując mięśnie przykręgosłupowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym przeciąć szypułki kręgów po obu stronach od końca rostralnego za pomocą mikronożyczek, które można nazwać "laminektomią" (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1C). Uważaj, aby nie uszkodzić rdzenia kręgowego. W międzyczasie użyj pęsety z mikrozębami, aby podnieść przecięty trzon kręgu.</li>
		<li>Po laminektomii nie należy od razu oddzielać rdzenia kręgowego od kanału kręgowego. Zamiast tego użyj mikronożyczek, aby przeciąć oponę twardą wzdłuż grzbietowej linii środkowej, co sprzyja pobieraniu składników odżywczych między komórkami i natlenionemu ACSF (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D). 
		UWAGA: Nigdy nie rozrywaj opony twardej. Dozwolone jest tylko cięcie opony twardej mikronożyczkami; W przeciwnym razie korzeń nerwowy i miąższ rdzeniowy zostaną poważnie uszkodzone!</li>
		<li>Podnieś rostralną część rdzenia kręgowego, a następnie ostrożnie odetnij korzeń nerwowy z zachowaniem około 1 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). Po oddzieleniu rdzenia kręgowego od kanału kręgowego, użyj 2 szpilek przeciw owadom, aby przymocować rdzeń kręgowy brzuszną stroną do góry (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1F).</li>
		<li>Użyj mikronożyczek, aby przeciąć oponę twardą wzdłuż brzusznej linii środkowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F). Odetnij zbędne korzenie nerwowe z zapasem około 1 mm. 
		UWAGA: Nerw jest znacznie bardziej wytrzymały niż rdzeń kręgowy. Jeśli zarezerwowany korzeń nerwowy jest zbyt długi (>1 mm), wibratomizm nie może odciąć korzenia nerwowego, co może prowadzić do poważnego zerwania miąższu kręgosłupa.</li>
		<li>Za pomocą mikronożyczek oddzielić powiększenie odcinka lędźwiowego na długość 6-7 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie w niskotopliwej agarozie
	<ol>
		<li>Umieść powiększenie odcinka lędźwiowego na nachyleniu 35 ° (<silna klasa="xfig">Rysunek 1H) stroną grzbietową do góry i końcem ogonowym do dołu. Użyj chłonnej bibuły filtracyjnej, aby usunąć obfitą ilość wody z powierzchni tkanki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1H).</li>
		<li>Powoli wlej stopiony żel agarozowy na szalkę Petriego zawierającą powiększenie odcinka lędźwiowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1I). 
		UWAGA: Nie nalewaj zbyt szybko, ponieważ w żelu będą gromadzić się bąbelki.</li>
		<li>Umieść powyższą szalkę Petriego w mieszaninie lodowatej wody i wody, aby jak najszybciej schłodzić żel, co sprzyja utrzymaniu aktywności komórek.</li>
		<li>Przytnij żel do kostki o wymiarach 15 mm x 10 mm x 10 mm i zamontuj go na krążku próbki za pomocą kleju superglue (<silna klasa="xfig">Rysunek 1J).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krojenie
	<ol>
		<li>Umieść krążek próbki w wstępnie zamrożonej tacce do cięcia, a następnie wlej lodowaty roztwór do cięcia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1K). Ciągle bąbelkować z 95% CO2 i 5% O2 do tacy do cięcia.</li>
		<li>Ustaw parametry wibratomu: grubość: 350 μm, prędkość: 0,14-0,16 mm/s, amplituda: 1,0 mm, częstotliwość drgań: 85 Hz.</li>
		<li>Zbierz 2-3 odpowiednie plastry na zwierzę. Rejestruj 1-2 zdrowe neurony ruchowe FG+ na plasterek, w zakresie 5-6 komórek na zwierzę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja
	<ol>
		<li>Użyj pęsety do szkiełka do pokrywy, aby przyciąć plasterek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1L) i umieść go w komorze inkubacyjnej wypełnionej stale natlenionym ACSF. Umieścić komorę inkubacyjną w łaźni wodnej o temperaturze 32 °C na 30 minut, a następnie kontynuować inkubację w temperaturze pokojowej (RT) przez kolejne 30 minut przed rejestracją. 
		UWAGA: Powyższe procedury, od znieczulenia do uzyskania pierwszego wycinka, powinny być zakończone w ciągu 20-30 minut, aby w jak największym stopniu zachować żywotność komórek. Neurony ruchowe w każdym wycinku mogą utrzymać swoją żywotność przez około 6-7 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Nagrywanie patch-clamp za pomocą SCS (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Preparaty
	<ol>
		<li>Napełniać komorę rejestracyjną ciągłym bąbelkowym ACSF z szybkością około 1-2 ml/min. Natężenie przepływu należy regulować indywidualnie za pomocą panelu sterowania na pompie perystaltycznej.</li>
		<li>Umieść plasterek w komorze nagrywania. Użyj platynowego drutu w kształcie litery U z nylonowymi nitkami, aby mocno ustabilizować plasterek na miejscu.</li>
		<li>Użyj mikroskopu kontrastowego z interferencją różnicową w podczerwieni (IR-DIC), aby obserwować wycinek. Pod soczewką obiektywu 4x upewnij się, że długość korzenia grzbietowego wynosi około 1 mm. Znajdź obszar, w którym korzeń grzbietowy wchodzi w miąższ, a następnie przenieś centralne pole widzenia do tego obszaru.</li>
		<li>Podłącz generator impulsów do specjalnie wykonanych elektrod (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja SCS
	<ol>
		<li>Umieść anodę SCS w pobliżu grzbietowej linii środkowej za pomocą systemu mikromanipulacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
		<li>Umieść katodę SCS w pobliżu strefy wejścia korzenia grzbietowego (DREZ) za pomocą systemu mikromanipulacji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Celowanie w komórki i obrazowanie
	<ol>
		<li>Użyj IR-DIC z soczewką obiektywową 10x, z grubsza znajdź grzbietowo-boczny obszar kolumny ruchowej, gdzie znajduje się większość neuronów ruchowych. Następnie przenieś centralne pole widzenia do tego obszaru.</li>
		<li>Przełącz się na soczewkę obiektywową 60x, aby znaleźć zdrowy neuron o gładkiej i jasnej powierzchni oraz niewidocznych jądrach (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C, F).</li>
		<li>Nieznacznie zmniejsz intensywność podczerwieni i włącz fluorescencyjne źródło światła. Przełącz filtr światła na szerokopasmowy filtr wzbudzenia ultrafioletowego (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2D, G), aby wybrać odpowiedni neuron ruchowy FG dodatni (FG+) (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2E, H).</li>
		<li>Użyj elektrod ssących, aby zastosować 1x stymulację progu motorycznego do korzenia grzbietowego. Jeśli w neuronach ruchowych zostanie wykryty wywołany potencjał czynnościowy (ryc. uzupełniający 3), potwierdza to, że aktywność korzenia grzbietowego jest nienaruszona. Jeśli nie, ten plasterek należy wyrzucić.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nagrywanie z zaciskiem krosowym
	<ol>
		<li>Napełnij mikropipetę roztworem wewnątrzkomórkowym i włóż ją do uchwytu elektrody. Użyj systemu do mikromanipulacji, aby opuścić pipetę do kąpieli ACSF. Rezystancja pipety waha się w zakresie 5-8 MΩ.</li>
		<li>Zastosuj niewielką ilość nadciśnienia do pipety, aby zdmuchnąć kurz i resztki komórek.
		<ol>
			<li>Opuść elektrodę, aby zbliżyć się do ogniwa. Gdy pipeta dotknie powierzchni neuronu FG+, na poziomie końcówki widoczne staje się małe wgłębienie błony. Zwolnij nadciśnienie.</li>
			<li>Następnie nanieść niewielką ilość podciśnienia na pipetę za pomocą strzykawki. W ten sposób powstaje niewielka ilość ssania, która przyciąga błonę komórkową do kontaktu ze szklaną pipetą. Zawsze zwracaj uwagę na całkowitą rezystancję interfejsu oprogramowania, dopóki wartość rezystancji nie wzrośnie do gigaomów (>1 GΩ). Następnie formuje się gigaseal.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zacisnąć potencjał membrany przy -70 mV, a następnie nacisnąć przycisk szybkiej kompensacji pojemności na interfejsie oprogramowania wzmacniacza. Delikatnie zastosuj przejściowo ujemne ciśnienie, aby pęknąć błonę komórkową, a następnie naciśnij przycisk kompensacji powolnej pojemności na interfejsie oprogramowania amplifier. W tym momencie uzyskuje się dobrą konfigurację całych komórek.</li>
		<li>Przełącz się w tryb cęgów prądowych, klikając przycisk IC w interfejsie oprogramowania i zarejestruj spoczynkowy potencjał membranowy (RMP).</li>
		<li>Zastosuj SCS przez 1-2 s o amplitudzie 1-10 mA, podczas gdy szerokość i częstotliwość impulsu są ustalone odpowiednio na 210 μs i 40 Hz. Określ próg motoryczny, powoli zwiększając amplitudę stymulacji, aż do zaobserwowania pierwszego AP.</li>
		<li>Rozróżnij opóźnione i natychmiastowe odpalanie neuronów ruchowych za pomocą 5-sekundowego wstrzykiwania prądu depolaryzującego wokół reozasady w trybie cęgów prądowych10,11,12. Natychmiastowe wystrzeliwanie neuronów ruchowych: Niska reozasada może indukować natychmiastowe i powtarzalne odpalanie ze stabilną częstotliwością wypalania; Opóźnione uruchamianie neuronów ruchowych: Wysoka reozasada może wywołać opóźniony początek powtarzalnego odpalania z przyspieszającą szybkością wypalania (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).</li>
		<li>Gdy SCS jest wyłączony, kontynuuj rejestrowanie potencjału membrany do przechwytywania spontanicznych odpalania punktów dostępowych.</li>
		<li>Wykonuj zapisy cęgów napięciowych Zapisy cęgów napięcia dla pobudzającego prądu postsynaptycznego (EPSC), gdy SCS jest włączony i wyłączony. Parametr stymulacji to 1x próg silnika, 210 μs, 2 Hz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Understanding Motor Neuron Responses to Spinal Cord Stimulation

<ol><li>Rowald, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+spinal+cord+neuromodulation+rapidly+restores+trunk+and+leg+motor+functions+after+complete+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis.</a> Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).</li>
<li>Kathe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurons+that+restore+walking+after+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The neurons that restore walking after paralysis.</a> Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).</li>
<li>Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+distribution+of+calcium+signals+in+squid+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals.</a> The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).</li>
<li>Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+transmitter+release+at+the+squid+giant+synapse+by+presynaptic+delayed+rectifier+potassium+current%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current.</a> The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).</li>
<li>Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraterminal+injection+of+synapsin+I+or+calcium%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II+alters+neurotransmitter+release+at+the+squid+giant+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).</li>
<li>Formento, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+spinal+cord+stimulation+must+preserve+proprioception+to+enable+locomotion+in+humans+with+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury.</a> Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).</li>
<li>Hari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+facilitates+spike+propagation+through+branch+points+of+sensory+axons+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preparation+of+oblique+spinal+cord+slices+for+ventral+root+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525(2016).</li>
<li>Sharples, S. A., Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+persistent+and+hyperpolarization-activated+inward+currents+shapes+the+differential+activation+of+motoneuron+subtypes+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development.</a> Elife. 10, e71385(2021).</li>
<li>Bhumbra, G. S., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+excitation+between+motoneurones+propagates+across+segments+and+is+purely+glutamatergic%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic.</a> PLoS Biology. 16 (3), e2003586(2018).</li>
<li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+intrinsic+hyperexcitability+does+not+contribute+to+motoneuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Elife. 3, 04046(2014).</li>
<li>Tahir, R. A., Pabaney, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+hypothermia+and+ischemic+stroke%3A+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Neurology+International%22%5BJournal%5D)">Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review.</a> Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+intractable+pain+in+patients+with+implanted+spinal+cord+stimulation+devices+during+the+COVID-19+pandemic+using+a+remote+and+wireless+programming+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 594696(2020).</li>
<li>Yao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+epidural+electrical+stimulation+in+combination+with+serotonin+agonists+improves+intraspinal+metabolism+in+spinal+cord+injury+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromodulation%22%5BJournal%5D)">Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats.</a> Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).</li>
<li>Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+terminal+polarization+induced+by+weak+uniform+dc+electric+fields%3A+a+modeling+study%5BTitle%5D)+AND+%222012+Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study.</a> 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).</li>
<li>Espino, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%28V%291.1+is+essential+for+proprioceptive+signaling+and+motor+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors.</a> Elife. 11, e79917(2022).</li>
<li>Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+rheostat%3A+Kv2.1+currents+maintain+or+suppress+repetitive+firing+in+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons.</a> The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).</li>
<li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+R-type+human+Ca%28v%292.3+channel+reveal+conformational+crosstalk+of+the+intracellular+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments.</a> Nature Communications. 13 (1), 7358(2022).</li>
<li>Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+multimodal+neural+transmission+suggests+that+adult+spinal+networks+maintain+an+intrinsic+state+of+readiness+to+execute+sensorimotor+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors.</a> Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).</li>
<li>Manuel, M., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+intracellular+recording+of+a+lumbar+motoneuron+and+the+force+produced+by+its+motor+unit+in+the+adult+mouse+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312(2012).</li>
<li>Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhomogeneous+volume+conduction+effects+affecting+needle+electromyography%3A+an+analytical+and+simulation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Measurement%22%5BJournal%5D)">Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study.</a> Physiological Measurement. 42 (11), (2021).</li>
<li>Barra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidural+electrical+stimulation+of+the+cervical+dorsal+roots+restores+voluntary+upper+limb+control+in+paralyzed+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys.</a> Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).</li>
<li>Powell, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidural+stimulation+of+the+cervical+spinal+cord+for+post-stroke+upper-limb+paresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis.</a> Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).</li>
<li>Wenger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+neuromodulation+therapies+engaging+muscle+synergies+improve+motor+control+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury.</a> Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).</li>
<li>Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+longitudinal+lumbar+spinal+cord+preparations+to+study+sensory+and+recurrent+motor+microcircuits+of+juvenile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice.</a> Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).</li>
<li>Moraud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+the+neuromodulation+of+spinal+circuits+for+correcting+gait+and+balance+deficits+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury.</a> Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).</li>
<li>Capogrosso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+model+for+epidural+electrical+stimulation+of+spinal+sensorimotor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits.</a> Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).</li>
</ol>

Informacja ruchowa modulowana przez SCS jest ostatecznie zbieżna z neuronami ruchowymi. W związku z tym, przyjęcie neuronów ruchowych jako celu badawczego może uprościć projekt badania i ujawnić mechanizm neuromodulacji SCS w bardziej bezpośredni sposób. Aby jednocześnie rejestrować różne charakterystyki bodźców i odpowiedzi komórkowych, dobrym sposobem badania cech elektrofizjologicznych w skali pojedynczej komórki jest patch-clamp. Jednak nadal istnieją pewne trudności, w tym jak utrzymać żywotność komórek, jak szybko ...

Stymulacja rdzenia kręgowego (SCS) może skutecznie przywrócić funkcje lokomotoryczne po urazie rdzenia kręgowego (SCI). Andreas Rowald i wsp. stwierdzili, że SCS umożliwia funkcjonowanie lokomotoryczne i tułowia kończyn dolnych w ciągu jednego dnia1. Badanie biologicznego mechanizmu SCS w celu odzyskania zdolności lokomotorycznych jest kluczowym i trendowym obszarem badawczym dla opracowania bardziej precyzyjnej strategii SCS. Na przykład zespół Grégoire'a Courtine'a wykazał, że pobudzające interneurony Vsx2 i neurony Hoxa10 w rdzeniu kręgowym są kluczowymi neuronami reagującymi na SCS, a neuromodulacja specyficzna dla komórek jest możliwa do przywrócenia zdolności chodzenia szczura po SCI2. Jednak niewiele badań koncentruje się na mechanizmie elektrycznym SCS w skali pojedynczej komórki. Chociaż powszechnie wiadomo, że ponadprogowy bodziec prądu stałego może wywołać potencjały czynnościowe (AP) w klasycznym eksperymencie z kałamarnicami3,4,5, nadal nie jest jasne, w jaki sposób impulsowa naprzemienna stymulacja elektryczna, taka jak SCS, wpływa na generowanie sygnału motorycznego.
Biorąc pod uwagę złożoność wewnątrzrdzeniowych obwodów neuronowych, odpowiedni wybór populacji komórek jest ważny dla zbadania elektrycznego mechanizmu SCS. Chociaż SCS przywraca funkcje motoryczne poprzez aktywację szlaku proprioceptywnego6, neurony ruchowe są ostatnią jednostką, która wykonuje polecenie motoryczne, pochodzące z integracji informacji propriocepcyjnych aferentnych wejściowych7. Dlatego bezpośrednie badanie charakterystyki elektrycznej neuronów ruchowych za pomocą SCS może pomóc nam zrozumieć logikę leżącą u podstaw rdzeniowej modulacji motorycznej.
Jak wiemy, patch-clamp to złoty standard dla komórkowego zapisu elektrofizjologicznego z niezwykle wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną8. Dlatego w niniejszym badaniu opisano metodę wykorzystującą zacisk krosowy do badania odpowiedzi elektrycznych neuronów ruchowych na SCS. W porównaniu z klamrą mózgową9, zacisk do rdzenia kręgowego jest trudniejszy z następujących powodów: (1) Rdzeń kręgowy jest chroniony przez kanał kręgowy o małej objętości, który wymaga bardzo drobnej mikromanipulacji i rygorystycznej konserwacji w lodowatym stanie, aby uzyskać lepszą żywotność komórek. (2) Ponieważ rdzeń kręgowy jest zbyt cienki, aby można go było zamocować na tacy do cięcia, należy go zanurzyć w agarozie o niskiej temperaturze topnienia i przyciąć po zestaleniu.
Stąd, ta metoda dostarcza szczegółów technicznych w zakresie preparowania rdzenia kręgowego i jednoczesnego utrzymania żywotności komórek, tak aby płynnie badać mechanizm elektryczny SCS na neuronach ruchowych i uniknąć niepotrzebnych prób i błędów.

<table><tbody><tr><td>Sól magnezowa adenozyno5'-trifosforanu</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek choliny</td><td>Sigma</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta do prowadnic do pokryw</td><td>VETUS</td><td>36A-SA</td><td>Przytnij plasterek</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td> EGTA Sigma E4378 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki</td><td>RWD Life Science</td><td>S12006-10</td><td>Wytnij membranę</td></tr><tr><td>Fluorescencyjne źródło światła</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>U-HGLGPS</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-Gold</td><td>Fluorochrome</td><td>Fluorochrome</td><td>Oznacz neuron ruchowy</td></tr><tr><td>Guanozyna 5 i trifosforan soli sodowej hydrat Sigma</td><td></td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr> kamera <tr><td>CCD na podczerwień</td><td>Dage-MTI</td><td>IR-1000E</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>K-glukonian</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Mikromanipulator Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Instrument Suttera&nbsp;</td><td>MP-200</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Instrument Sutter</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki&nbsp;</td><td>Jinzhong</td><td>wa1020</td> Mikroskop <td>laminektomii</td></tr><tr><td>do anatomii</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>Mikroskop SZX10</td><td></td></tr><tr><td>do ekletrozjologii</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta mikrozębna</td><td>RWD Life Science</td><td>F11008-09</td><td>Podnoszenie przeciętego trzonu kręgu</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>V900182</td><td></td></tr><tr><td>Na-Phosphocreatine</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka obiektywowa do ekletrozjologii</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>LUMPLFLN60XW</td><td>odległość robocza 2 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Osmometr&nbsp;</td><td>Zaawansowane&nbsp;</td><td>FISKE 210</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz krosowo-cęgowy&nbsp;</td><td>Axon&nbsp;</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer z zaciskiem krosowym</td><td>Axon&nbsp;</td>pH-metr <td>Digidata 1550B</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>METTLER TOLEDO&nbsp;</td><td>FE28</td><td></td></tr><tr><td>Slice Anchor</td><td>System wielokanałowy</td><td>SHD-27H</td><td></td></tr><tr><td>Stymulator rdzenia kręgowego</td><td>PINS</td><td>T901</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta zębata</td><td>RWD Life Science</td><td>F13030-10</td><td>Podnieś</td></tr><tr><td>wibratom</td> mieczykowaty <td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Szerokopasmowy filtr wzbudzenia ultrafioletowego</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>U-MF2</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie ex vivo wycinka rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach ruchowych podczas stymulacji rdzenia kręgowego

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Stymulacja rdzenia kręgowego (SCS) może skutecznie przywrócić funkcje lokomotoryczne po urazie rdzenia kręgowego (SCI). Ponieważ neurony ruchowe są ostatnią jednostką do wykonywania zachowań sensomotorycznych, bezpośrednie badanie reakcji elektrycznych neuronów ruchowych za pomocą SCS może pomóc nam zrozumieć logikę leżącą u podstaw rdzeniowej modulacji ruchowej. Aby jednocześnie rejestrować różne charakterystyki bodźców i odpowiedzi komórkowych, dobrym sposobem badania cech elektrofizjologicznych w skali pojedynczej komórki jest patch-clamp. Jednak nadal istnieją pewne złożone trudności w osiągnięciu tego celu, w tym utrzymanie żywotności komórek, szybkie oddzielenie rdzenia kręgowego od struktury kostnej i wykorzystanie SCS do skutecznej indukcji potencjałów czynnościowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wykorzystujący patch-clamp do badania odpowiedzi elektrycznych neuronów ruchowych na SCS z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną, co może pomóc badaczowi poprawić swoje umiejętności w zakresie oddzielania rdzenia kręgowego i utrzymania żywotności komórki w tym samym czasie, aby płynnie badać mechanizm elektryczny SCS na neuronach ruchowych i uniknąć niepotrzebnych prób i błędów.

Dzięki rygorystycznemu utrzymywaniu niskiej temperatury podczas precyzyjnych operacji (Supplementary Figure 1, Supplementary Figure 2 oraz Figure 1), żywotność komórek była wystarczająca do przeprowadzenia kolejnych rejestracji elektrofizjologicznych. Aby w jak największym stopniu zasymulować scenariusz kliniczny, zastosowano mikromanipulację w celu umieszczenia katody i anody SCS odpowiednio w pobliżu linii środkowej grzbietowej i DREZ (Figure 2</strong...

Ten protokół opisuje metodę wykorzystującą patch-clamp do badania elektrycznych reakcji neuronów ruchowych na stymulację rdzenia kręgowego (SCS) z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną, co może pomóc badaczom poprawić ich umiejętności w rozdzielaniu rdzenia kręgowego i jednoczesnym utrzymywaniu żywotności komórek.

Przygotowanie ex vivo wycinka rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach ruchowych podczas stymulacji rdzenia kręgowego

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...

Stymulacja rdzenia kręgowego może pomóc pacjentom przywrócić funkcje lokomocji po urazie. Neurony ruchowe są ostatnią jednostką do wykonywania zachowań sensomotorycznych. Badanie odpowiedzi elektrycznej neuronów ruchowych może pomóc w zrozumieniu logiki leżącej u podstaw rdzeniowej modulacji motorycznej.Patch-clamp to złoty standard dla komórkowych zapisów elektrofizjologicznych o niezwykle wysokiej rozdzielczości przestrzennej czasowej. Dlatego w niniejszym badaniu opisano metodę wykorzystującą patch-clamp do jednoczesnego rejestrowania różnych charakterystyk bodźców i odpowiedzi komórkowych wielu neuronów w skali pojedynczej komórki. W porównaniu z opaską mózgową, zacisk kołowy rdzenia kręgowego jest trudniejszy, ponieważ rdzeń kręgowy jest dobrze chroniony przez kanał kręgowy o niewielkiej objętości.Dlatego protokół ten zapewnia szczegóły techniczne w zakresie szybkiego mikropreparowania rdzenia kręgowego i rygorystycznej konserwacji w lodowatym chłodzie w celu uzyskania lepszej żywotności komórek. Patch-clamp pozwala na unikalne zrozumienie transmisji synaptycznych oraz zrozumienie potencjałów czynnościowych i aktywności wzorców kodowania przez stymulację rdzenia kręgowego. Po odsłonięciu serca znieczulonego szczura przetnij prawy przedsionek za pomocą cienkich nożyczek i wstrzyknij 100 mililitrów schłodzonego płynu perfuzującego w tempie około dwóch mililitrów na sekundę w ciągu jednej minuty.Ustaw szczura w pozycji leżącej, przetnij kręgosłup w przednim górnym odcinku biodrowym kręgosłupa i punkcie zmiany krzywizny kręgosłupa piersiowego. Natychmiast umieść izolowany kręgosłup w natlenionym, lodowatym roztworze perfuzyjnym, aby zmyć resztki krwi i tkanki tłuszczowej. Następnie przenieś izolowany kręgosłup do anatomicznej tacki grzbietową do góry i końcem rostralnym w pobliżu operatora.Napełnij tacę 50 mililitrami stale natlenionego roztworu do cięcia lodu na zimno. Pod mikroskopem preparacyjnym przetnij szypułki kręgów po obu stronach od końca rostralnego za pomocą mikronożyczek. Następnie delikatnie odetnij oponę twardą wzdłuż jej grzbietowej linii środkowej za pomocą mikronożyczek.Ostrożnie podnieś rostralną część rdzenia kręgowego i odetnij korzeń nerwowy, pozostawiając około jednego milimetra rezerwowego. Po oddzieleniu rdzenia kręgowego od kanału kręgowego zabezpiecz go brzuszną stroną skierowaną do góry za pomocą dwóch szpilek przeciw owadom. Przytnij nadmierne korzenie nerwowe, pozostawiając około jednego milimetra nienaruszonego.Następnie oddziel powiększenie odcinka lędźwiowego na długość od sześciu do siedmiu milimetrów za pomocą mikronożyczek. Po wypreparowaniu rdzenia kręgowego i oddzieleniu powiększenia odcinka lędźwiowego, umieść powiększenie lędźwiowe na nachyleniu 35 stopni stroną grzbietową do góry i stroną ogonową do dołu. Nadmiar wody z powierzchni tkanki należy wchłonąć za pomocą chłonnej bibuły filtracyjnej.Ostrożnie wlej stopiony żel agarozowy na szalkę Petriego zawierającą powiększenie odcinka lędźwiowego. Umieść szalkę Petriego w mieszaninie lodowatej wody, aby zapewnić szybkie schłodzenie żelu. Uformuj żel w sześcian o wymiarach 15 na 10 na 10 milimetrów i zamontuj go na krążku próbki za pomocą super kleju.Dostosuj ustawienia wibratomu do grubości 350 mikrometrów, prędkości od 0,14 do 0,16 milimetra na sekundę, amplitudy jednego milimetra i częstotliwości wibracji 85 herców. Teraz użyj pęsety do szkiełka do pokrywy, aby przyciąć plasterek i umieścić go w komorze inkubacyjnej wypełnionej stale natlenionym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Na początek umieść przygotowany wycinek rdzenia kręgowego w komorze nagrywającej.Następnie umieść anodę systemu mikromanipulacji w pobliżu grzbietowej linii środkowej, a katodę blisko strefy wejścia korzenia grzbietowego, aby zapewnić prawidłowe umiejscowienie stymulatora rdzenia kręgowego. Teraz przełącz się na soczewkę obiektywową 60X, aby zidentyfikować zdrowy neuron, o gładkiej i jasnej powierzchni bez widocznych jąder. Nieznacznie zmniejsz intensywność podczerwieni, włącz fluorescencyjne źródło światła i dostosuj filtr światła do opcji szerokopasmowego wzbudzenia ultrafioletowego.Teraz wybierz odpowiedni fluoro-złoty dodatni neuron ruchowy i stopniowo obniżaj elektrodę, aż znajdzie się w pobliżu neuronu. Gdy pipeta zetknie się z powierzchnią, poszukaj małego wgłębienia membrany na poziomie końcówki i uwolnij wcześniej zastosowane nadciśnienie. Następnie zastosuj podciśnienie do pipety za pomocą strzykawki i poczekaj, aż wartość rezystancji na interfejsie oprogramowania wzrośnie do gigaomów.Zacisnąć potencjał membrany przy minus 70 miliwoltach. Naciśnij przycisk szybkiej kompensacji pojemności na amplifier interfejs oprogramowania. Następnie zastosuj krótkie podciśnienie, aby rozerwać błonę komórkową i naciśnij przycisk powolnej kompensacji pojemności na interfejsie oprogramowania wzmacniacza.Zastosuj stymulację rdzenia kręgowego przez jedną do dwóch sekund, utrzymując amplitudę od jednego do 10 miliamperów. Określ próg motoryczny, stopniowo zwiększając amplitudę stymulacji, aż do zaobserwowania pierwszego potencjału czynnościowego. Rozróżnij opóźnione i natychmiastowe odpalanie neuronów ruchowych za pomocą pięciosekundowego wstrzykiwania prądu depolaryzującego wokół reozasady w trybie cęgowania prądu.Po wyłączeniu stymulacji rdzenia kręgowego kontynuuj rejestrowanie potencjałów błonowych, aby uchwycić spontaniczne wyzwalanie potencjałów czynnościowych. Gdy amplituda stymulacji rdzenia kręgowego została zwiększona, potencjał błonowy został zwiększony, a potencjały czynnościowe były wyzwalane co 10 do 20 impulsów. Po wyłączeniu stymulacji rdzenia kręgowego, neuron wystrzelił serię spontanicznych potencjałów czynnościowych przez krótki okres czasu.Następnie spoczynkowy potencjał błony powrócił do minus 65 miliwoltów.

the-ex-vivo-preparation-spinal-cord-slice-for-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym filmie przedstawiono proces rejestracji metodą voltage clamp w całej komórce (whole-cell) w skrawku siatkówki wodnego salamandry tygrysiej. Demonstrujemy przygotowanie skrawka oraz sposób przeprowadzania rejestracji metodą patch clamp podczas stymulacji wizualnej siatkówki.

Rejestracja w konfiguracji whole-cell pobudzeniowych prądów synaptycznych wywołanych światłem w skrawku siatkówki

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania i utrzymania preparatu przekroju nowokory w kulturze organotypowej w celu wykonania rejestracji elektrycznej z neuronów piramidowych.

Rejestracja całokomórkowa z organotypowego preparatu skrawka neokory

Ten film demonstruje procedurę wykonywania zapisów elektrofizjologicznych w neuronach istoty żelowej (SG) wycinków rdzenia kręgowego, przy użyciu technik całokomórkowych kropek do analizy wzorców uruchamiania neuronów. Metoda ta pozwala na badanie reakcji neuronalnych na bodźce w neuronach SG rdzenia kręgowego.

Zapis klamry krosowej całej komórki w neuronie istoty żelatynowej wycinka rdzenia kręgowego

Ten film demonstruje badanie pobudliwości neuronów czuciowych w zwojach korzenia grzbietowego za pomocą techniki zacisku łatkowego do pomiaru potencjału reozasady i błony, analizując reakcje neuronów na przyrostowe wstrzyknięcia prądu.

Nagrania klamry krosowej całej komórki na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego szczura

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Pokazujemy, jak przygotować ukośne wycinki rdzenia kręgowego u młodych myszy. Preparat ten pozwala na stymulację korzeni brzusznych.

Przygotowanie skośnych wycinków rdzenia kręgowego do stymulacji korzeni brzusznych

W tym artykule omawiamy trzy preparaty mózgowe używane do rejestracji klamer z całych komórek w celu zbadania obwodu siatkówkowego kijanek Xenopus laevis. Każdy preparat, z własnymi specyficznymi zaletami, przyczynia się do eksperymentalnej wykonalności kijanki Xenopus jako modelu do badania funkcji obwodów neuronalnych.

Preparaty i protokoły do rejestracji całych komórek w postaci klamry krosowej neuronów tektalnych Xenopus laevis

Tutaj opisujemy podstawowe kroki dla zapisów całokomórkowych krosówek z neuronów istoty żelowej (SG) w przekroju rdzenia kręgowego in vitro. Metoda ta pozwala na badanie wewnętrznych właściwości błony, przekaźnictwa synaptycznego i charakterystyki morfologicznej neuronów SG.

Przygotowanie wycinków ostrego rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach istoty żelatynowej

Ten protokół opisuje in vivo wewnątrzkomórkowy zapis neuronów lędźwiowych szczura z jednoczesną przezrdzeniową stymulacją prądem stałym. Metoda ta pozwala na pomiar właściwości błony i rejestrację rytmicznego odpalania neuronów ruchowych przed, w trakcie i po anodowej lub katodowej polaryzacji rdzenia kręgowego.

Wewnątrzkomórkowy zapis in vivo zidentyfikowanych typów neuronów rdzeniowych szczura podczas transrdzeniowej stymulacji prądem stałym

Ten protokół opisuje przygotowanie całej tkanki nerwowej rwy kulszowej szczura do elektrofizjologicznej stymulacji ex vivo i zapis w regulowanej środowiskowo, dwukomorowej, perfundowanej kąpieli solankowej.

Przygotowanie nerwu kulszowego szczura do neurofizjologii ex vivo

Naucz się techniki patch-clamp w preparacie ex vivo rdzenia kręgowego szczura do badania odpowiedzi neuronów ruchowych na stymulację. Metoda umożliwia rejestrację potencjałów czynnościowych z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Przygotowanie ex vivo wycinka rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach ruchowych podczas stymulacji rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie ex vivo wycinka rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach ruchowych podczas stymulacji rdzenia kręgowego

Przeglądaj więcej filmów