Przygotowanie ex vivo wycinka rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach ruchowych podczas stymulacji rdzenia kręgowego
8 września 2023
Ten protokół opisuje metodę wykorzystującą patch-clamp do badania elektrycznych reakcji neuronów ruchowych na stymulację rdzenia kręgowego (SCS) z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną, co może pomóc badaczom poprawić ich umiejętności w rozdzielaniu rdzenia kręgowego i jednoczesnym utrzymywaniu żywotności komórek.
Stymulacja rdzenia kręgowego może pomóc pacjentom przywrócić funkcje lokomocji po urazie. Neurony ruchowe są ostatnią jednostką do wykonywania zachowań sensomotorycznych. Badanie odpowiedzi elektrycznej neuronów ruchowych może pomóc w zrozumieniu logiki leżącej u podstaw rdzeniowej modulacji motorycznej.
Patch-clamp to złoty standard dla komórkowych zapisów elektrofizjologicznych o niezwykle wysokiej rozdzielczości przestrzennej czasowej. Dlatego w niniejszym badaniu opisano metodę wykorzystującą patch-clamp do jednoczesnego rejestrowania różnych charakterystyk bodźców i odpowiedzi komórkowych wielu neuronów w skali pojedynczej komórki. W porównaniu z opaską mózgową, zacisk kołowy rdzenia kręgowego jest trudniejszy, ponieważ rdzeń kręgowy jest dobrze chroniony przez kanał kręgowy o niewielkiej objętości.
Dlatego protokół ten zapewnia szczegóły techniczne w zakresie szybkiego mikropreparowania rdzenia kręgowego i rygorystycznej konserwacji w lodowatym chłodzie w celu uzyskania lepszej żywotności komórek. Patch-clamp pozwala na unikalne zrozumienie transmisji synaptycznych oraz zrozumienie potencjałów czynnościowych i aktywności wzorców kodowania przez stymulację rdzenia kręgowego. Po odsłonięciu serca znieczulonego szczura przetnij prawy przedsionek za pomocą cienkich nożyczek i wstrzyknij 100 mililitrów schłodzonego płynu perfuzującego w tempie około dwóch mililitrów na sekundę w ciągu jednej minuty.
Ustaw szczura w pozycji leżącej, przetnij kręgosłup w przednim górnym odcinku biodrowym kręgosłupa i punkcie zmiany krzywizny kręgosłupa piersiowego. Natychmiast umieść izolowany kręgosłup w natlenionym, lodowatym roztworze perfuzyjnym, aby zmyć resztki krwi i tkanki tłuszczowej. Następnie przenieś izolowany kręgosłup do anatomicznej tacki grzbietową do góry i końcem rostralnym w pobliżu operatora.
Napełnij tacę 50 mililitrami stale natlenionego roztworu do cięcia lodu na zimno. Pod mikroskopem preparacyjnym przetnij szypułki kręgów po obu stronach od końca rostralnego za pomocą mikronożyczek. Następnie delikatnie odetnij oponę twardą wzdłuż jej grzbietowej linii środkowej za pomocą mikronożyczek.
Ostrożnie podnieś rostralną część rdzenia kręgowego i odetnij korzeń nerwowy, pozostawiając około jednego milimetra rezerwowego. Po oddzieleniu rdzenia kręgowego od kanału kręgowego zabezpiecz go brzuszną stroną skierowaną do góry za pomocą dwóch szpilek przeciw owadom. Przytnij nadmierne korzenie nerwowe, pozostawiając około jednego milimetra nienaruszonego.
Następnie oddziel powiększenie odcinka lędźwiowego na długość od sześciu do siedmiu milimetrów za pomocą mikronożyczek. Po wypreparowaniu rdzenia kręgowego i oddzieleniu powiększenia odcinka lędźwiowego, umieść powiększenie lędźwiowe na nachyleniu 35 stopni stroną grzbietową do góry i stroną ogonową do dołu. Nadmiar wody z powierzchni tkanki należy wchłonąć za pomocą chłonnej bibuły filtracyjnej.
Ostrożnie wlej stopiony żel agarozowy na szalkę Petriego zawierającą powiększenie odcinka lędźwiowego. Umieść szalkę Petriego w mieszaninie lodowatej wody, aby zapewnić szybkie schłodzenie żelu. Uformuj żel w sześcian o wymiarach 15 na 10 na 10 milimetrów i zamontuj go na krążku próbki za pomocą super kleju.
Dostosuj ustawienia wibratomu do grubości 350 mikrometrów, prędkości od 0,14 do 0,16 milimetra na sekundę, amplitudy jednego milimetra i częstotliwości wibracji 85 herców. Teraz użyj pęsety do szkiełka do pokrywy, aby przyciąć plasterek i umieścić go w komorze inkubacyjnej wypełnionej stale natlenionym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Na początek umieść przygotowany wycinek rdzenia kręgowego w komorze nagrywającej.
Następnie umieść anodę systemu mikromanipulacji w pobliżu grzbietowej linii środkowej, a katodę blisko strefy wejścia korzenia grzbietowego, aby zapewnić prawidłowe umiejscowienie stymulatora rdzenia kręgowego. Teraz przełącz się na soczewkę obiektywową 60X, aby zidentyfikować zdrowy neuron, o gładkiej i jasnej powierzchni bez widocznych jąder. Nieznacznie zmniejsz intensywność podczerwieni, włącz fluorescencyjne źródło światła i dostosuj filtr światła do opcji szerokopasmowego wzbudzenia ultrafioletowego.
Teraz wybierz odpowiedni fluoro-złoty dodatni neuron ruchowy i stopniowo obniżaj elektrodę, aż znajdzie się w pobliżu neuronu. Gdy pipeta zetknie się z powierzchnią, poszukaj małego wgłębienia membrany na poziomie końcówki i uwolnij wcześniej zastosowane nadciśnienie. Następnie zastosuj podciśnienie do pipety za pomocą strzykawki i poczekaj, aż wartość rezystancji na interfejsie oprogramowania wzrośnie do gigaomów.
Zacisnąć potencjał membrany przy minus 70 miliwoltach. Naciśnij przycisk szybkiej kompensacji pojemności na amplifier interfejs oprogramowania. Następnie zastosuj krótkie podciśnienie, aby rozerwać błonę komórkową i naciśnij przycisk powolnej kompensacji pojemności na interfejsie oprogramowania wzmacniacza.
Zastosuj stymulację rdzenia kręgowego przez jedną do dwóch sekund, utrzymując amplitudę od jednego do 10 miliamperów. Określ próg motoryczny, stopniowo zwiększając amplitudę stymulacji, aż do zaobserwowania pierwszego potencjału czynnościowego. Rozróżnij opóźnione i natychmiastowe odpalanie neuronów ruchowych za pomocą pięciosekundowego wstrzykiwania prądu depolaryzującego wokół reozasady w trybie cęgowania prądu.
Po wyłączeniu stymulacji rdzenia kręgowego kontynuuj rejestrowanie potencjałów błonowych, aby uchwycić spontaniczne wyzwalanie potencjałów czynnościowych. Gdy amplituda stymulacji rdzenia kręgowego została zwiększona, potencjał błonowy został zwiększony, a potencjały czynnościowe były wyzwalane co 10 do 20 impulsów. Po wyłączeniu stymulacji rdzenia kręgowego, neuron wystrzelił serię spontanicznych potencjałów czynnościowych przez krótki okres czasu.
Następnie spoczynkowy potencjał błony powrócił do minus 65 miliwoltów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie wprowadza protokół wykorzystujący technikę patch-clamp do badania elektrycznych odpowiedzi neuronów ruchowych po stymulacji rdzenia kręgowego (SCS) z wysoką rozdzielczością przestrzenno-czasową. Metoda ta umożliwia jednoczesne rejestrowanie różnych cech stymulacji i odpowiedzi komórkowych w skali pojedynczych komórek, co jest kluczowe dla poszerzenia rozumienia modulacyjnych funkcji rdzenia kręgowego.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Funkcja neuronów ruchowych
Tło
- Wiadomo, że stymulacja rdzenia kręgowego (SCS) pomaga w odzyskaniu lokomocji po urazie.
- Neurony ruchowe są niezbędne do wykonywania zachowań sensomotorycznych.
- Technika patch-clamp zapewnia precyzyjne komórkowe elektrofizjologiczne rejestracje.
- Badanie odpowiedzi neuronów ruchowych może ujawniać mechanizmy modulacji ruchowej rdzenia kręgowego.
Cel badania
- Zdetalizowanie metody efektywnego rejestrowania patch-clamp z neuronów ruchowych rdzenia kręgowego.
- Zachowanie żywotności komórek podczas sekcji rdzenia kręgowego.
- Zgłębienie wiedzy na temat transmisji synaptycznych i potencjałów czynnościowych.
Stosowane metody
- Badanie stosuje metodę patch-clamp.
- Zastosowanym modelem biologicznym są neurony ruchowe z tkanki rdzenia kręgowego szczura.
- Kluczowe kroki obejmują mikrosekcję rdzenia kręgowego i utrzymywanie warunków lodowato-zimnych.
- Neurony są rejestrowane poprzez obciążenie na -70 mV podczas stymulacji o różnych amplitudach.
- Dostarczono szczegółowe protokoły dotyczące przygotowania preparatu i pozycjonowania elektrod.
Główne wyniki
- Metoda skutecznie rejestruje różnorodne reakcje komórkowe na SCS.
- Zostały zarejestrowane potencjały czynnościowe, które wykazują natychmiastowe i opóźnione cechy wyładowań.
- Po stymulacji obserwuje się samoistne potencjały czynnościowe, co wskazuje na pobudliwość neuronów.
- Wyniki te poszerzają rozumienie funkcji neuronów ruchowych w warunkach stymulacji.
Konkluzje
- Ten protokół zwiększa zdolność do badania zachowania neuronów ruchowych i ich odpowiedzi na stymulację rdzenia kręgowego.
- Wyniki dostarczają wglądu w mechanizmy neuronalne leżące u podstaw odzyskiwania funkcji lokomocyjnych.
- Zrozumienie tych mechanizmów jest niezbędne do opracowywania strategii terapeutycznych w przypadku urazów rdzenia kręgowego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Direct ex vivo patch-clamp recording of motor neurons during spinal cord stimulation (SCS) provides a high-resolution platform for interrogating the mechanisms underlying spinal motor modulation. This approach enables precise quantification of neuronal responses to defined stimulation parameters, supporting predictive confidence in early-stage target validation for neuromodulation therapies. The method addresses a critical inflection point in neurotherapeutic discovery by linking stimulus characteristics to functional motor neuron outputs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of motor neuron electrophysiology in response to SCS, clarifying mechanistic pathways.
- Supports biological de-risking by distinguishing immediate and delayed firing patterns in motor neurons.
- Facilitates predictive confidence in target engagement through quantitative action potential thresholds.
- Provides a platform for functional validation of neuromodulation strategies at the cellular level.
Screening & Assay Development
- Establishes validated spinal cord slice preparations for reproducible electrophysiological assays.
- Delivers quantitative outputs such as action potential frequency and membrane potential changes for compound or device screening.
- Enables standardization of stimulation parameters and readouts across experimental runs.
- Prepares robust assay systems for downstream pharmacological or device evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns ex vivo neuronal responses with disease-relevant models of spinal cord injury.
- Supports translational continuity by linking cellular electrophysiology to functional recovery endpoints.
- Informs risk-adjusted advancement of neuromodulation candidates based on mechanistic data.
- Provides predictive de-risking for preclinical development of spinal cord therapies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic interrogation through assay development and preclinical validation for neuromodulation programs.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of motor neuron activation and pathway modulation by SCS.
- Screening: Provides reproducible, quantitative electrophysiological readouts for candidate evaluation.
- Analytics: Supports statistical comparison of stimulation thresholds, firing patterns, and membrane potential dynamics.
- Translational Research: Bridges ex vivo findings to in vivo models of spinal cord injury and recovery.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, reusable platform for diverse neuromodulation and neuropharmacology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuromodulation target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible electrophysiological assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust mechanistic data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of neuromodulation and neurorepair candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection, patch-clamp electrophysiology, and spinal cord anatomy.
- Demands specialized instrumentation including vibratome, patch-clamp rig, and oxygenation systems.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of tissue preparation and recording protocols.
- Adaptation across species or injury models may require protocol optimization.
- Cell viability and access are limited by the spinal cord's protective structure and technical complexity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introdution
1:53
Spinal Cord Dissection for the Whole‐Cell Patch‐Clamp Recording in Motor Neurons
3:26
Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole‐Cell Patch‐Clamp Recording in Motor Neurons
4:30
Patch‐Clamp Recording to Study the Electrical Responses of Motor Neurons to Spinal Cord Stimulation
