Name: Odtwarzalność i harmonizacja w badaniach z wykorzystaniem standardów biologicznych: przykład peptydu kolagenozależnego-związanego z agonistą płytek krwi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Poznaj metodę standaryzacji pomiaru funkcji płytek krwi przy użyciu peptydu CRP-XL i agregometrii transmisyjnej. Protokół poprawia odtwarzalność badań biologicznych poprzez zastosowanie zasad metrologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Krew powinna być pobierana od zdrowych ochotników, którzy wyrazili zgodę, i przetwarzana zgodnie z lokalnymi zasadami. Protokół ten mierzy agregację płytek krwi indukowaną przez agonistów w osoczu bogatopłytkowym (PRP) za pomocą agregegometrii transmisji światła (LTA). ISTH zapewnia ustandaryzowane protokoły, w tym metodę przygotowania PRP z 2013 r. i LTA9. Zbierz pełną krew do 4% cytrynianu sodu zgodnie z zaleceniami ISTH zgodnie z zasadami lokalnej komisji etycznej. Wyklucz dawców, którzy przyjmowali NLPZ w ciągu ostatnich 2 tygodni.
1. Procedura testowa
<ol>
	<li>Pobrać podwielokrotność surowca CRP-XL i rozcieńczyć go w buforze testowym (Tyrodes10) (Tabela 1) do stężenia początkowego, które spowoduje maksymalną agregację (patrz UWAGA poniżej kroku 1.3). 
	UWAGA: W literaturze stężenie 1 μg/ml spowoduje maksymalną agregację, ale niektóre laboratoria potrzebują wyższych stężeń, aby osiągnąć ten sam efekt - odpowiednio dostosuj serię rozcieńczeń</li>
	<li>Wykonać odpowiednią serię rozcieńczeń z wzorcem (patrz UWAGA poniżej kroku 1.3 i <silna klasa="xfig">Rysunek 1) tak, aby stężenia były takie same jak odczynnik testowy.</li>
	<li>Sporządzić serię rozcieńczeń od 6 do 8 punktów dla testu i wzorca, ponownie w buforze testowym, który przyjmuje odpowiedź agregacji od 100% do 0% agregacji. Przykład przedstawiający 8-punktową krzywą stężenia serii rozcieńczeń przedstawiono w tabeli 2. 
	UWAGA: Niektóre laboratoria dodają agonistę w sumie 10% objętości testu, np. 50 μL agonisty na 450 μl płytek krwi, tak aby rozcieńczać 10-krotne stężenie do końcowego stężenia 1x w teście, podczas gdy inne dodają mniejsze (bardziej skoncentrowane) objętości agonisty, np. 5 μl agonisty do 495 μl płytek krwi - po prostu upewnij się, że seria rozcieńczeń jest odpowiednia dla testu, mając na uwadze Jak przemieszczenie objętości wpływa na stężenie płytek krwi - ponownie, bądź konsekwentny. W tym przykładzie 30 μl 10x agonisty dodaje się do 270 μl osocza bogatopłytkowego (PRP).</li>
	<li>Gdy płytki krwi są już odpoczęte i gotowe do użycia, podzielić je na kuwety LTA, dodać mieszadło i pozostawić do osiągnięcia temperatury 37 °C w studzienkach podtrzymujących.</li>
	<li>Po osiągnięciu temperatury umieść kuwetę (kuwety) w agresjometrze i rozpocznij rejestrowanie śladów. Dodać agonistę (mieszając) i zapisać dane.</li>
	<li>Powtórz krok 1.4 dla każdego stężenia w teście i wzorcu, aż do momentu zebrania danych potrzebnych do wykreślenia krzywych (przykładowe krzywe pokazane w <silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Oblicz siłę działania odczynnika testowego w stosunku do siły działania wzorca; ponownie użyj dowolnej metryki - maksymalnej agregacji lub obszaru pod krzywą - o ile istnieje spójność, a model analizy odpowiednio pasuje do danych.</li>
</ol>
2. Sprawdzanie krzywych stężeń
<ol>
	<li>Najpierw sprawdź, czy krzywe stężenie-odpowiedź są równoległe. Istnieje wiele pakietów oprogramowania, które to robią, ale tutaj proces jest opisany dla Graphpad Prism (patrz Rysunek 3).
	<ol>
		<li>Wprowadź dane tak, aby log(stężenie) znajdowało się na osi X, a odpowiedź (maksymalna agregacja %, AUC) znajdowała się na osi Y (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A)</li>
		<li>Transformacja stężeń CRP-XL (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B)</li>
		<li>Wybierz Regresja nieliniowa z funkcji analizy i użyj równania do stymulacji/hamowania dawka-odpowiedź.</li>
		<li>Wybierz logarytm (agonista) a odpowiedź (zmienne nachylenie) - użyj dopasowania 3- lub 4-kierunkowego, w zależności od tego, co jest najlepsze dla danych.</li>
		<li>Określ, czy krzywe są równoległe, korzystając z karty Porównaj (jak pokazano w Rysunek 3C) i kliknij przycisk, aby porównać zestawy danych, aby upewnić się, że nachylenie (nachylenie wzgórza) i asymptoty (góra i dół krzywej) są równoważne. W tym przykładzie nachylenie wzgórza dla testu wynosi 2,279, a nachylenie normy wynosi 2,025, co daje współczynnik 1,125.</li>
		<li>Jeśli nachylenia są równoległe (na przykład kryterium akceptacji współczynnika nachylenia wynosi 0,8-1,25), a asymptoty są równoważne, należy przeprowadzić obliczenia potencji (EC50), wykonując kroki 2.1.3 i 2.1.4. W przedstawionym przykładzie asymptoty zostały ograniczone, ponieważ ocena w kroku 2.1.5 potwierdziła, że asymptoty są równoważne.</li>
		<li>Podziel wartość EC50 wzorca przez wartość testu, aby określić względną moc. W przedstawionym przykładzie test/standard (0,07259/0,1498) = 0,4846, tj. "test" jest o połowę słabszy niż standard.</li>
		<li>Dostosuj stężenia masowe/objętościowe, aby uwzględnić różnicę w sile działania, tj. jeśli wzorzec był używany wcześniej przy 1 μg/ml, nowy materiał zostanie użyty przy 1/0,4846 = 2,063 μg/ml), aby zapewnić porównywalne ilości materiału aktywnego używane w eksperymentach</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Standardizing the Responses to Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

<ol><li>Faya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potency+assignment+of+biotherapeutic+reference+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Potency assignment of biotherapeutic reference standards.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113577(2020).</li>
<li>Morton, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+alpha+2+beta+1-independent+activation+of+platelets+by+simple+collagen-like+peptides%3A+collagen+tertiary+%28triple-helical%29+and+quaternary+%28polymeric%29+structures+are+sufficient+alone+for+alpha+2+beta+1-independent+platelet+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Integrin alpha 2 beta 1-independent activation of platelets by simple collagen-like peptides: collagen tertiary (triple-helical) and quaternary (polymeric) structures are sufficient alone for alpha 2 beta 1-independent platelet reactivity.</a> The Biochemical Journal. 306 (2), 337-344 (1995).</li>
<li>Pugh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+between+platelet+collagen+receptors+defined+using+receptor-specific+collagen-mimetic+peptide+substrata+in+flowing+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Synergism between platelet collagen receptors defined using receptor-specific collagen-mimetic peptide substrata in flowing blood.</a> Blood. 115 (24), 5069-5079 (2010).</li>
<li>Farndale, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-collagen+interactions%3A+the+use+of+peptide+Toolkits+to+investigate+collagen-receptor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Cell-collagen interactions: the use of peptide Toolkits to investigate collagen-receptor interactions.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 2), 241-250 (2008).</li>
<li>Dunster, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+phenotyping+of+platelet+reactivity+for+stratification+of+human+cohorts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Multiparameter phenotyping of platelet reactivity for stratification of human cohorts.</a> Blood Advances. 5 (20), 4017-4030 (2021).</li>
<li>Hubbard, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+WHO+2nd+International+Standard+Factor+V%2C+plasma+%2816%2F374%29%3A+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Establishment of the WHO 2nd International Standard Factor V, plasma (16/374): communication from the SSC of the ISTH.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 695-697 (2019).</li>
<li>Sergaki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+whole+cell+standards+for+the+microbiome+field%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Developing whole cell standards for the microbiome field.</a> Microbiome. 10 (1), 123(2022).</li>
<li>Alessi, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-center+evaluation+of+light+transmission+platelet+aggregation+reagents%3A+Communication+from+the+ISTH+SSC+Subcommittee+on+Platelet+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Multi-center evaluation of light transmission platelet aggregation reagents: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. (23), (2023).</li>
<li>Cattaneo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+standardization+of+light+transmission+aggregometry%3A+A+consensus+of+the+working+party+from+the+platelet+physiology+subcommittee+of+SSC%2FISTH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the standardization of light transmission aggregometry: A consensus of the working party from the platelet physiology subcommittee of SSC/ISTH.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , (2013).</li>
<li>Taylor, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+GPVI+receptor+antagonists+by+structure-based+repurposing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel GPVI receptor antagonists by structure-based repurposing.</a> PLoS One. 9 (6), e101209(2014).</li>
<li>Coxon, C. H., Longstaff, C., Burns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+the+science+of+measurement+to+biology%3A+Why+bother%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Applying the science of measurement to biology: Why bother.</a> PLoS Biology. 17 (6), e3000338(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Jak pokazano tutaj, proces standaryzacji materiałów jest bardzo prosty. Chociaż ocena nowych partii materiału i/lub sprawdzenie, czy bieżąca partia jest stabilna i nie traci aktywności w czasie, nagrodą jest to, że eksperymenty są powtarzalne za każdym razem i porównywalne przez lata, a nie tylko przez cały okres eksploatacji odczynnika. Oznacza to również, że inni badacze mogą dokładnie odtworzyć warunki testowe i że społeczność jest zharmonizowana na poziomie globalnym. Krytyczne etapy protokołu obejmują pobranie krwi pełnej i przygotowanie PRP9, a także precyzję podczas wykonywania serii rozcieńczeń. Ważne jest również, aby upewnić się, że krzywa testowa i standardowa są równoległe przed przystąpieniem do porównania EC50 . Jeśli linie nie są równoległe lub asymptoty nie są równoważne, może to oznaczać, że materiał testowy i standardowy różnią się w pewnym stopniu.
Każdy, kto pracuje w naukach biologicznych, wie, że testy biologiczne nie zawsze działają spójnie, więc należy o tym pamiętać podczas oceny danych. W pokazanym tutaj przykładzie, mimo że używamy tych samych dawców do pomiaru siły działania dwóch bardzo podobnych, jeśli nie identycznych, materiałów, zbocza wzgórz i asymptoty nie są identyczne. Akceptujemy jednak pewien stopień zmienności i dochodzimy do wniosku, że krzywe są w tym przypadku równoległe, a zatem nadają się do porównywania i dostosowywania mocy. Cząsteczki biologiczne są duże i złożone, a modyfikacje potranslacyjne podczas produkcji mogą wpływać na ich siłę działania w testach biologicznych. Standaryzacja biomolekuł i testów biologicznych nie może być wykonana przy użyciu samej masy lub objętości i musi być wykonana poprzez ilościowe określenie i porównanie aktywności biologicznej w teście biologicznym11. Należy wykorzystać swoje wykształcenie i doświadczenie, aby ocenić dane w kontekście testu.
Ograniczenia tej techniki polegają na tym, że chociaż dane mogą wskazywać na problem z odczynnikami (odczynnikami), nie mogą powiedzieć, na czym polega problem. Konieczne będą dalsze prace, aby ustalić, dlaczego materiały nie są porównywalne. W idealnym świecie każdy materiał krytyczny dla eksperymentu (eksperymentów) i późniejszych wniosków naukowych byłby weryfikowany za pomocą spektroskopii mas, ale nie zawsze jest to możliwe. Jeśli jednak dane nie są porównywalne, dalsze dochodzenie jest nadal uzasadnione w pewnym zakresie. Kolejnym ograniczeniem takiego podejścia jest czas i zasoby potrzebne do jego wykonania. Idealnie byłoby, gdyby test i norma były porównywane u 3-6 dawców, aby zapewnić pewną pewność co do przypisania aktywności biologicznej materiałowi, ale uważamy, że jest to uzasadnione wspieraniem odtwarzalności i wiarygodności. Standaryzacja materiału biologicznego nie jest potrzebna za każdym razem, gdy przeprowadzane są eksperymenty, ale powinna być wykonywana co najmniej dla każdej nowej partii agonistów, najlepiej częściej, w zależności od stabilności i zastosowania. Rzeczywiście, jeśli norma zostanie udostępniona, jest to coś, co międzynarodowe organizacje normalizacyjne mogą zapewnić jasność.
Chociaż przedstawiony tutaj przykład dotyczy CRP-XL w kontekście pomiaru agregacji płytek krwi, protokół porównywania aktywności biologicznej biomolekuł w testach biologicznych ma szerokie zastosowanie w całym sektorze.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65410">Reproducibility and Harmonization in Research using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide</a>. The Authors section was updated from:
Carmen H. Coxon1 
Peter Rigsby1 
1National Institute for Biological Standards and Control
to:
Carmen H. Coxon1 
Peter Rigsby1 
1Medicines and Healthcare products Regulatory Agency

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65410">Reproducibility and Harmonization in Research using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Reproducibility and Harmonization in Research using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

Wielu z nas używa biologicznych agonistów i antagonistów w naszych eksperymentach, najczęściej w teście biologicznym, który określa ilościowo ich wpływ na funkcjonowanie komórek w określonych warunkach. Opisana tutaj metoda dotyczy usieciowanego peptydu związanego z kolagenem agonisty płytek krwi (CRP-XL), agonisty glikoproteiny VI, który aktywuje płytki krwi i którego aktywność można mierzyć w różnych testach (agregegometria przepuszczalności światła, mikroskopia, cytometria przepływowa, uwalnianie Ca2 + itp.), ale protokół standaryzacji agonisty ma zastosowanie do każdego biologicznego agonisty / antagonisty i / lub testu biologicznego. Nauki fizyczne są dobrze zorientowane w stosowaniu norm w swojej codziennej praktyce zawodowej, a firmy opracowujące leki bioterapeutyczne w sektorze komercyjnym rozumieją wartość korzystania z norm referencyjnych1, jednak pozostają one niedostatecznie wykorzystywane przez wielu naukowców biologicznych, zwłaszcza w akademickiej społeczności badawczej, a ich brak negatywnie wpływa na jakość wyników naukowych.
CRP-XL to specyficzny agonista specyficzny dla GPVI, którego pole płytek krwi używało przez dziesięciolecia od czasu jego opisu w 1995 roku2, pomagając społeczności odróżnić rolę GPVI od innych białek płytek krwi wiążących kolagen3,4. Ten agonista może być pozyskiwany z różnych źródeł komercyjnych lub produkowany we własnym zakresie. Monomer peptydowy można zakupić od dostawcy, a następnie usieciować we własnym zakresie lub może to zrobić dostawca za dodatkową opłatą. Dalsze oszczędności można osiągnąć poprzez zmniejszenie wymaganej czystości przy dostawie (na przykład 70% w porównaniu z 95%). Nie ma również zgody co do tego, jak należy przechowywać CRP-XL, przy czym niektórzy decydują się na krioprzechowywanie, a inni chłodzenie, niektórzy utrzymują materiał liofilizowany do czasu użycia, a inni przechowują go w roztworze (wodzie lub buforze, w zależności od preferencji). W związku z tym jakość i skład zasobów laboratoryjnych są nieustandaryzowane lub zharmonizowane. Ponieważ ten agonista jest stosowany w określonym stężeniu (masa/objętość), a nie w jednostkach aktywności, siła działania CRP-XL w jednym laboratorium, np. przy 1 μg/ml, nie będzie taka sama jak w innym. Warto zauważyć, że inni agoniści płytek krwi stosowani w tej dziedzinie są już standaryzowani (np. trombina, która jest dostarczana i stosowana w jednostkach aktywności, a nie masa/objętość), więc przejście od masy/objętości do jednostek biologicznych nie powinno być zbyt trudne dla społeczności. Należy również zauważyć, że reakcje pacjentów na agonistów płytek krwi, w tym CRP-XL, są zmienne pod względem ich wrażliwości na agonistów, a także ich zdolności do odpowiedzi (zakresu odpowiedzi)5, dlatego tym ważniejsze jest stosowanie stałych ilości aktywności agonistycznej w testach.
Jeśli agoniści płytek krwi mogą być zharmonizowani poprzez użycie ich przy określonej aktywności, a nie wadze/objętości, można zapewnić, że eksperyment w jednym laboratorium jest bezpośrednio porównywalny z tym w innych laboratoriach i może być dokładnie odtworzony z pewnością. Do czasu, gdy teren osiągnie porozumienie w sprawie sposobu przechowywania i standaryzacji aktywności CRP-XL, konieczne jest przeprowadzanie regularnych kontroli materiału, aby zapewnić jego spójność przez miesiące/lata, w których jest używany.
Przypisywanie wartości aktywności dla standardów biologicznych musi być wykonane poprzez wspólne, wieloośrodkowe badania (na przykład6,7) i wymagać specjalistycznej wiedzy. Potrzeba ustalonych standardów biologicznych dla agonistów płytek krwi została niedawno podkreślona przez wspólne wieloośrodkowe badanie8 wspierane przez Międzynarodowe Towarzystwo Zakrzepicy i Hemostazy (ISTH); Dopóki nie będzie dostępna międzynarodowa norma CRP-XL, naukowcy mogą standaryzować swój własny materiał lokalnie, aby zapewnić spójność w czasie oraz to, że nowy materiał pozyskiwany komercyjnie lub wewnętrznie ma porównywalną aktywność z poprzednimi preparatami, a także z pozostałymi preparatami.

<table><tbody><tr><td>4% cytrynian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td>Antykoagulant rozpuszczony w wodzie9</td></tr><tr><td>4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy kwas (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>CRP-XL</td><td>Peptide Protein Research Ltd.</td><td></td><td>Usieciowany, potrójnie helisowy peptyd2,4 o sekwencji GCP*(GPP*)GCP*G (jednoliterowy kod aminokwasu: P* = hydroksyprolina został uzyskany na zamówienie niestandardowe od Peptide Protein Research Ltd.</td></tr><tr><td>Kuwety i mieszadła</td><td>Stago</td><td>86921</td><td>Materiały eksploatacyjne do agresgometru</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; P5405</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp; </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania do analizy</td><td>wykresów</td><td></td><td>pryzmatycznych</td></tr><tr><td>Płytki krwi osocze</td><td></td><td></td> bogate <td>Izolowane z krwi pełnej od zdrowych ochotników wolne od niesteroidowych leków przeciwzapalnych przez minimum 10 dni8.</td></tr></tbody></table>

odtwarzalność i harmonizacja w badaniach z wykorzystaniem standardów biologicznych: przykład peptydu kolagenozależnego-związanego z agonistą płytek krwi

Reproducibility and Harmonization in Research Using Biological Standards: The Example of Platelet Agonist Collagen-Related Peptide

Metrologia - nauka o pomiarach - to temat, o którym niewielu biologów uczy się podczas szkolenia na ich niekorzyść; zastosowanie prostych procesów standaryzacji w codziennej pracy daje pewność danych i powtarzalność na odległość i czas.
Ta metoda pokazuje, jak ustandaryzować podstawowy eksperyment laboratoryjny szeroko stosowany w badaniach nad hemostazą i praktyce klinicznej, w szczególności mierząc odpowiedzi na peptyd kolagenowy agonisty receptora kolagenu płytkowego (glikoproteiny [GP]VI), usieciowany krzyżowo (CRP-XL) przez agregegometrię transmisji światła (LTA). Zastosowanie tego podejścia zapewni odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjną i harmonizację między laboratoriami, niezależnie od materiału agonisty lub dostawcy. Co ważne, metoda ta ma zastosowanie do innych agonistów płytek krwi, a także do wielu innych cząsteczek biologicznych i testów biologicznych.
Proces opisany poniżej polega na wykonaniu serii 6-8 punktowych rozcieńczeń 'standardu' i 'testu' (materiału, który sprawdzasz) i uruchomieniu ich obok siebie w wybranym teście (w tym przypadku LTA). CRP-XL stosuje się w stężeniach masowych/objętościowych, ale nie każdy materiał daje taką samą aktywność biologiczną przy danym stężeniu, dlatego wykonuje się serię rozcieńczeń w celu porównania materiału wzorcowego i badanego oraz określenia, jakie stężenie jest potrzebne do uzyskania równoważnej aktywności. Szereg rozcieńczeń musi obejmować agregację 0-100%. Dane są wykreślane przy użyciu regresji nieliniowej i określana jest wartość EC50 dla każdej próbki (wzorca i testu). Aby przypisać aktywność, podziel wartość EC50 wzorca przez wartość testu, aby określić, o ile jest ona bardziej lub mniej silna i odpowiednio dostosuj stężenie. Takie podejście zapewni, że ta sama "aktywność" biologiczna będzie wielokrotnie dodawana do testu.

Rysunek 1 przedstawia schemat serii rozcieńczeń i ma na celu podkreślenie, że seria rozcieńczeń jest niezbędna zarówno dla wzorca, jak i dla próbki badawczej. Rysunek 2A pokazuje krzywe agregacji dla wzorca, natomiast dane dla próbki badawczej przedstawiono na Rysunku 2B. Przy stężeniu 0,075 µg/mL widoczna jest wyraźna odpowiedź na wzorzec, podczas gdy dla próbki badawczej odpowiadające jej stężenie (0,075 µg/mL) jest płaskie, co oznacza brak odpowiedzi. Dane te służą do wykreślenia kolejnych wykresów w celu wyznaczenia EC50. W przedstawionym tutaj przykładzie do wykreślenia krzywej zależnośc odpowiedzi od stężenia i wyznaczenia EC50, jak pokazano na Rysunku 3, przyjęto 100% maksymalnej agregacji.
<img alt="Schemat rozcieńczeń seryjnych, pokazujący stopniową redukcję stężenia próbek przy użyciu pipet i probówek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65410/65410fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Graficzny opis dwóch serii rozcieńczeń dla próby (po lewej) i wzorca (po prawej). Zaczynając od najwyższego stężenia (sugerowane stężenie: 10 µg/mL CRP-XL), wykonuje się równolegle sekwencyjne rozcieńczenia 1:2 w 8 punktach (&gt;3 jednostki logarytmiczne). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65410/65410fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy kinetyki agregacji porównujące roztwory standardowe i testowe; czas względem procentu agregacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65410/65410fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Krzywe agregacji dla serii rozcieńczeń standardowych (lewa) i testowych (prawa). W miarę postępu agregacji płytek krwi (oś x), ilość światła przechodzącego przez próbkę i docierającego do czujnika wzrasta (oś y). (A) Standard. (B) Test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65410/65410fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Nieliniowa analiza regresji; tabele dopasowania parametrycznego, porównanie zestawów danych, wykres obliczania EC50." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65410/65410fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wprowadzanie i analiza danych. (A) Wprowadzanie danych, (B) transformacja oraz (C,D) analiza pod kątem paralelizmu (wykorzystanie oprogramowania do oceny, czy nachylenia krzywych Hilla i asymptoty są porównywalne [C]). (E) Jeśli krzywe są równoległe, wyznaczenie potencji (EC50) za pomocą nieliniowego dopasowania regresji krzywej. (F) Wykres przekształconych danych. Szczegóły znajdują się w opisie metody. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65410/65410fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">bufor Tyrodesa9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Składniki</td>
			<td>Stężenie</td>
			<td>Komentarze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>134 mM </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>0,34 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,9 mM </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO33</td>
			<td>12 mM </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)</td>
			<td>20 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukoza</td>
			<td>5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl₂2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>pH 7,3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład buforu Tyrodesa.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">8-stopniowa seria rozcieńczeń</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozcieńczenie 1</td>
			<td>10 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozcieńczenie 2</td>
			<td>5 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozcieńczenie 3</td>
			<td>2.5 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozcieńczenie 4</td>
			<td>1.25 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozcieńczenie 5</td>
			<td>0.625 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozcieńczenie 6</td>
			<td>0.3125 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozcieńczenie 7</td>
			<td>0.15625 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozcieńczenie 8</td>
			<td> 0.073125 µg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Przykład przedstawiający 8-punktową serię rozcieńczeń.

Tutaj prezentujemy metodę standaryzacji usieciowanego peptydu kolagenowego agonisty płytek krwi (CRP-XL) za pomocą agregegometrii przepuszczalności światła. Chociaż protokół jest ukierunkowany na funkcję płytek krwi, proces eksperymentalny można zastosować do większości cząsteczek biologicznych i testów biologicznych, aby zapewnić rygor naukowy i odtwarzalność.

Odtwarzalność i harmonizacja w badaniach z wykorzystaniem standardów biologicznych: przykład peptydu kolagenozależnego-związanego z agonistą płytek krwi

Metrology - the science of measure - is a subject few biological scientists are taught about in their training to their detriment; the application of ...

Naukowcy z MHRA South Mimms Laboratories od ponad 60 lat opracowują standardy biologiczne produkcji, a te odczynniki referencyjne są stosowane w celu zapewnienia jakości, spójności i bezpieczeństwa leków biologicznych i diagnostyki. Standardy NIBSC opracowane przez MHRA wspierają tłumaczenie najnowocześniejszych produktów terapeutycznych, a także kontrolę uznanych leków. W MHRA South Mimms Laboratories wykorzystujemy najnowocześniejsze technologie do produkcji materiałów, które wspierają rozwój i regulację nowatorskich innowacji terapeutycznych.Standardy biologiczne są nadal niedostatecznie wykorzystywane przez naukowców zajmujących się naukami biologicznymi ze względu na brak wymiany wiedzy. Wpływa to negatywnie na jakość badań i przyczynia się do kryzysu odtwarzalności. Standaryzacja biologiczna zapewnia, że eksperymenty są powtarzalne, niezależnie od miejsca i czasu ich wykonywania.Brak odpowiedniej wiedzy w zakresie podstawowych zasad metrologicznych i szkolenia narusza dyscyplinę naukową i negatywnie wpływa na odtwarzalność. Chociaż nasz protokół koncentruje się na standaryzacji pomiaru funkcji płytek krwi, praktyka ta może być zastosowana do każdego systemu biologicznego. Zastosowanie standaryzacji biologicznej w praktykach badawczych nie tylko ustandaryzuje eksperymenty biologiczne, ale także pomoże rozwiązać problem niespójności i braku harmonizacji, które podważają badania.Aby rozpocząć test, używając agonisty receptora płytkowego, usieciowanego peptydu związanego z kolagenem lub CR-PXL, należy rozcieńczyć odpowiednią ilość zapasu CR-PXL w buforze testowym do stężenia odpowiedniego do wywołania maksymalnej agregacji płytek krwi. Wynik w roztworze będzie odtąd określany jako standard. Następnie, zaczynając od tych samych najwyższych przygotowanych stężeń, należy kolejno wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia zarówno dla wzorca, jak i odczynnika testowego.Przygotuj serię rozcieńczeń od sześciu do ośmiu punktów zarówno dla testu, jak i wzorca w buforze testowym, który generuje odpowiedzi agregacji od 100% do 0%Gdy osocze bogatopłytkowe lub PRP jest gotowe do użycia, dodaj podwielokrotność PRP do kuwety agregometrii przepuszczalności światła. Pozwól próbkom ogrzać się do 37 stopni Celsjusza w studzienkach przez kilka minut. Po odpowiednim podgrzaniu umieść kuwety w agresjometrze, aby rozpocząć rejestrowanie śladów.Ciągle mieszając, dodaj agonistę i zapisz dane. Przeprowadzić gromadzenie danych dla każdego przygotowanego rozcieńczenia wzorca i odczynnika testowego. Użyj GraphPad Prism lub dowolnego odpowiedniego pakietu oprogramowania, aby sprawdzić, czy krzywe stężenia dla wzorca i testu są równoległe.Wprowadzić dane w taki sposób, aby oś X zawierała stężenia, a oś Y zawierała odpowiedzi wskazane przez procent maksymalnej agregacji lub powierzchnię pod krzywą. Następnie przekształć wartości stężeń na odpowiednie logarytmy lub logarytmy stężenia. Wybierz opcję Regresja nieliniowa z funkcji analizy i użyj równania do stymulacji odpowiedzi na dawkę.Wybierz opcję logarytmu agonisty a odpowiedź Zmienne nachylenie i użyj dopasowania trzy- lub czterokierunkowego, w zależności od tego, co jest najlepsze dla danych. Określ, czy wygenerowane krzywe są równoległe, klikając kartę Porównaj i porównując zestawy danych.Upewnij się, że nachylenie i asymptoty badania oraz krzywe standardowe są równoważne. Jeśli te warunki są spełnione, przystąp do obliczania potencji lub EC50 przy użyciu dopasowania krzywej regresji nieliniowej. Obliczyć względną siłę działania, dzieląc wartość EC50 wzorca przez wartość testu.Dostosować stężenie masowe na objętość badanego odczynnika, aby uwzględnić różnicę w sile działania w stosunku do wzorca. Ślady agregacji płytek krwi dla wzorca i odczynnika testowego ujawniły różnicę między dwiema odpowiedziami agregacji. Przy 0,075 mikrograma na mililitr pojawiła się wyraźna odpowiedź na normę, podczas gdy w przypadku testu odpowiednie stężenie nie wykazało żadnej odpowiedzi.Wartości EC50 wzorca i odczynnika testowego obliczono, wykreślając krzywą stężenie-odpowiedź.

reproducibility-harmonization-research-using-biological-standards

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Kaskada adhezji płytek krwi zachodzi w warunkach przepływu ścinającego, co jest czynnikiem pomijanym w konwencjonalnych (statycznych) testach na płytkach wielodołkowych. Niniejszy artykuł opisuje test agregacji płytek krwi wykorzystujący mikrofluidyczny format płytki wielodołkowej w celu emulacji fizjologicznych warunków przepływu ścinającego.

Adhezja i agregacja płytek krwi w warunkach przepływu z wykorzystaniem mikrofluidycznych komór przepływowych

Ten film pokazuje analizę mętnościową w celu oceny indukowanej kolagenem agregacji płytek krwi w wstępnie potraktowanych, umytych ludzkich płytkach krwi. Studzienki kontrolne wykazują agregację indukowaną kolagenem, podczas gdy wysokie stężenie inhibitorów blokuje kanały Pannexin-1, hamując w ten sposób agregację płytek krwi indukowaną kolagenem, widoczną niezmienionym zmętnieniem.

Analiza turbidymetryczna w celu monitorowania indukowanej kolagenem agregacji wstępnie leczonych ludzkich płytek krwi

Transfuzja płytek krwi i hemostaza były modelowane za pomocą komór do rekonstytucji krwi i przepływu mikroprzepływowego w celu zbadania funkcji płytek krwi bankujących. Dane wskazują na wpływ zmian spichrzających płytki krwi na hemostazę in vitro.

Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro

Opisujemy prostą metodę izolacji umytych płytek krwi od ludzkiej krwi, a następnie pomiary agregacji płytek krwi wywołanej przez agonistę za pomocą mętności. Jako przykład stosujemy tę metodę do badania odpowiedzi agregacyjnej ludzkich płytek krwi na kolagen po wstępnej inkubacji z inhibitorem kanału Pannexin1 Brilliant Blue FCF.

Zmętnienie na ludzkich płukanych płytkach krwi: wpływ inhibitora pannexin1 Brilliant Blue FCF na agregację indukowaną kolagenem

Opisujemy metodę w roztworze, polegającą na zastosowaniu równomiernego ścinania do receptorów powierzchni płytek krwi za pomocą wiskozymetrii stożko-płytkowej. Metoda ta może być również stosowana w szerszym zakresie do stosowania ścinania do innych typów komórek i fragmentów komórek i nie musi być ukierunkowana na określoną parę ligand-receptor.

Jednolity test ścinania dla ludzkich receptorów płytkowych i komórkowych za pomocą wiskozymetrii stożkowo-płytkowej

Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.

Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Strategia genetyki molekularnej w celu znalezienia mutacji de novo powodujących powszechne zaburzenia, takie jak autyzm i schizofrenia.

Strategia identyfikacji mutacji de novo w powszechnych zaburzeniach, takich jak autyzm i schizofrenia

Celem tej techniki jest ocena funkcji neurotransmitera serotoniny (5-HT) u żywego, oddychającego swobodnie zwierzęcia z wykorzystaniem farmakologicznego obrazowania rezonansem magnetycznym (phMRI) oraz dożylnego podania fluoksetyny, będącej selektywnym inhibitorem zwrotnego wychwytu serotoniny (SSRI).

Zastosowanie fMRI z wyzwaniem farmakologicznym w badaniach przedklinicznych: aplikacja do układu 5-HT

Opisujemy technikę badawczą bronchoskopii światłowodowej i płukania oskrzelowo-pęcherzykowego za pomocą odsysania niskociśnieniowego. Technika ta służy do pobierania komórek odpornościowych z powierzchni oskrzelowo-pęcherzykowych płuc. Stosuje się znieczulenie miejscowe i łagodną świadomą sedację (midazolam). Badani dobrze tolerują zabieg i odczuwają minimalne skutki uboczne.

płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) do badań; Uzyskanie odpowiedniej wydajności próbki

Poznaj metodę standaryzacji pomiaru funkcji płytek krwi przy użyciu peptydu CRP-XL i agregometrii transmisyjnej. Protokół poprawia odtwarzalność badań biologicznych poprzez zastosowanie zasad metrologicznych.

Odtwarzalność i harmonizacja w badaniach z wykorzystaniem standardów biologicznych: przykład peptydu kolagenozależnego-związanego z agonistą płytek krwi (Wideo) | JoVE Journal

Odtwarzalność i harmonizacja w badaniach z wykorzystaniem standardów biologicznych: przykład peptydu kolagenozależnego-związanego z agonistą płytek krwi

Przeglądaj więcej filmów