Odtwarzalność i harmonizacja w badaniach z wykorzystaniem standardów biologicznych: przykład peptydu kolagenozależnego-związanego z agonistą płytek krwi
4 sierpnia 2023
Tutaj prezentujemy metodę standaryzacji usieciowanego peptydu kolagenowego agonisty płytek krwi (CRP-XL) za pomocą agregegometrii przepuszczalności światła. Chociaż protokół jest ukierunkowany na funkcję płytek krwi, proces eksperymentalny można zastosować do większości cząsteczek biologicznych i testów biologicznych, aby zapewnić rygor naukowy i odtwarzalność.
Naukowcy z MHRA South Mimms Laboratories od ponad 60 lat opracowują standardy biologiczne produkcji, a te odczynniki referencyjne są stosowane w celu zapewnienia jakości, spójności i bezpieczeństwa leków biologicznych i diagnostyki. Standardy NIBSC opracowane przez MHRA wspierają tłumaczenie najnowocześniejszych produktów terapeutycznych, a także kontrolę uznanych leków. W MHRA South Mimms Laboratories wykorzystujemy najnowocześniejsze technologie do produkcji materiałów, które wspierają rozwój i regulację nowatorskich innowacji terapeutycznych.
Standardy biologiczne są nadal niedostatecznie wykorzystywane przez naukowców zajmujących się naukami biologicznymi ze względu na brak wymiany wiedzy. Wpływa to negatywnie na jakość badań i przyczynia się do kryzysu odtwarzalności. Standaryzacja biologiczna zapewnia, że eksperymenty są powtarzalne, niezależnie od miejsca i czasu ich wykonywania.
Brak odpowiedniej wiedzy w zakresie podstawowych zasad metrologicznych i szkolenia narusza dyscyplinę naukową i negatywnie wpływa na odtwarzalność. Chociaż nasz protokół koncentruje się na standaryzacji pomiaru funkcji płytek krwi, praktyka ta może być zastosowana do każdego systemu biologicznego. Zastosowanie standaryzacji biologicznej w praktykach badawczych nie tylko ustandaryzuje eksperymenty biologiczne, ale także pomoże rozwiązać problem niespójności i braku harmonizacji, które podważają badania.
Aby rozpocząć test, używając agonisty receptora płytkowego, usieciowanego peptydu związanego z kolagenem lub CR-PXL, należy rozcieńczyć odpowiednią ilość zapasu CR-PXL w buforze testowym do stężenia odpowiedniego do wywołania maksymalnej agregacji płytek krwi. Wynik w roztworze będzie odtąd określany jako standard. Następnie, zaczynając od tych samych najwyższych przygotowanych stężeń, należy kolejno wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia zarówno dla wzorca, jak i odczynnika testowego.
Przygotuj serię rozcieńczeń od sześciu do ośmiu punktów zarówno dla testu, jak i wzorca w buforze testowym, który generuje odpowiedzi agregacji od 100% do 0%Gdy osocze bogatopłytkowe lub PRP jest gotowe do użycia, dodaj podwielokrotność PRP do kuwety agregometrii przepuszczalności światła. Pozwól próbkom ogrzać się do 37 stopni Celsjusza w studzienkach przez kilka minut. Po odpowiednim podgrzaniu umieść kuwety w agresjometrze, aby rozpocząć rejestrowanie śladów.
Ciągle mieszając, dodaj agonistę i zapisz dane. Przeprowadzić gromadzenie danych dla każdego przygotowanego rozcieńczenia wzorca i odczynnika testowego. Użyj GraphPad Prism lub dowolnego odpowiedniego pakietu oprogramowania, aby sprawdzić, czy krzywe stężenia dla wzorca i testu są równoległe.
Wprowadzić dane w taki sposób, aby oś X zawierała stężenia, a oś Y zawierała odpowiedzi wskazane przez procent maksymalnej agregacji lub powierzchnię pod krzywą. Następnie przekształć wartości stężeń na odpowiednie logarytmy lub logarytmy stężenia. Wybierz opcję Regresja nieliniowa z funkcji analizy i użyj równania do stymulacji odpowiedzi na dawkę.
Wybierz opcję logarytmu agonisty a odpowiedź Zmienne nachylenie i użyj dopasowania trzy- lub czterokierunkowego, w zależności od tego, co jest najlepsze dla danych. Określ, czy wygenerowane krzywe są równoległe, klikając kartę Porównaj i porównując zestawy danych.
Upewnij się, że nachylenie i asymptoty badania oraz krzywe standardowe są równoważne. Jeśli te warunki są spełnione, przystąp do obliczania potencji lub EC50 przy użyciu dopasowania krzywej regresji nieliniowej. Obliczyć względną siłę działania, dzieląc wartość EC50 wzorca przez wartość testu.
Dostosować stężenie masowe na objętość badanego odczynnika, aby uwzględnić różnicę w sile działania w stosunku do wzorca. Ślady agregacji płytek krwi dla wzorca i odczynnika testowego ujawniły różnicę między dwiema odpowiedziami agregacji. Przy 0,075 mikrograma na mililitr pojawiła się wyraźna odpowiedź na normę, podczas gdy w przypadku testu odpowiednie stężenie nie wykazało żadnej odpowiedzi.
Wartości EC50 wzorca i odczynnika testowego obliczono, wykreślając krzywą stężenie-odpowiedź.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę standaryzacji agonisty płytek krwi, sieciowanego peptydu związanego z kolagenem (CRP-XL), z wykorzystaniem agregometrii transmisyjnej. Protokół ten, choć skupia się na funkcji płytek krwi, może zostać zastosowany do różnych cząsteczek biologicznych i testów biologicznych w celu zwiększenia rygoru naukowego oraz odtwarzalności wyników.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Pomiar funkcji płytek krwi
- Standaryzacja biologiczna
- Agregometria z pomiarem transmisji światła
Wprowadzenie
- Standardy biologiczne zapewniają jakość i bezpieczeństwo leków biologicznych.
- Standaryzacja jest kluczowa dla powtarzalności badań.
- Wśród pracowników naukowych brakuje wymiany wiedzy na temat standardów biologicznych.
- Niewłaściwe przeszkolenie z zasad metrologicznych może naruszyć rygor naukowy.
Cel badania
- Ustandaryzowanie pomiaru funkcji płytek krwi przy użyciu CRP-XL.
- Promowanie stosowania standaryzacji biologicznej w praktyce badawczej.
- Wyeliminowanie niespójności w eksperymentach biologicznych.
Zastosowane metody
- Rozcieńczenie CRP-XL w buforze do testu w celu wywołania agregacji płytek krwi.
- Przygotowanie serii rozcieńczeń dla odczynników standardowych oraz testowych.
- Wykorzystanie agregometrii transmisyjnej do rejestracji odpowiedzi agregacyjnej płytek krwi.
- Analiza danych z użyciem regresji nieliniowej w celu określenia siły działania (EC50).
Główne wyniki
- Wyraźna odpowiedź agregacyjna zaobserwowana przy stężeniu 0,075 µg/mL dla standardu.
- Brak odpowiedzi dla odczynnika testowego przy odpowiadającym mu stężeniu.
- Obliczone wartości EC50 zarówno dla standardu, jak i odczynników testowych.
- Względna aktywność określona poprzez porównanie wartości EC50.
Wnioski
- Standaryzacja poprawia odtwarzalność w eksperymentach biologicznych.
- Odpowiednie przeszkolenie w zakresie metrologii jest niezbędne dla zachowania rygoru naukowego.
- Zastosowanie protokołu może podnieść jakość badań w różnych systemach biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Standaryzacja z wykorzystaniem biologicznych materiałów referencyjnych jest kluczowa dla zapewnienia powtarzalności i harmonizacji w ramach procesów badawczych w fazie odkryć oraz badań translacyjnych. Zastosowanie zasad metrologicznych w testach agonistów płytek krwi, takich jak CRP-XL w agregometrii transmisyjnej, bezpośrednio odpowiada na kryzys powtarzalności i wspiera solidną porównywalność danych między ośrodkami i w czasie. Możliwość ta ugruntowuje zaufanie do wyników wczesnych faz odkryć i umożliwia wiarygodne podejmowanie decyzji międzyfunkcyjnych w portfelach B+R branży biofarmaceutycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczne porównanie aktywności biologicznej między odczynnikami testowymi a wzorcowymi w celu walidacji celu molekularnego.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez ilościowe określenie różnic w sile działania z wykorzystaniem wartości EC50.
- Zwiększa pewność prognostyczną w analizie szlaków sygnałowych i wynikach testów funkcjonalnych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych serii rozcieńczeń dla powtarzalnych wyników testu.
- Standaryzuje odczyty ilościowe, zapewniając porównywalność testów między partiami i ośrodkami.
- Umożliwia niezawodne zestawienie nowych agonistów lub materiałów testowych z uznanymi standardami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Sprzyja harmonizacji danych z bioanaliz w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej od etapu odkrywania do badań przedklinicznych.
- Wspiera postępy w badaniach z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez dostarczanie wiarygodnych oznaczeń potencji dla cząsteczek kandydackich.
- Niweluje zmienność między laboratoriami, wzmacniając podstawy dopasowania biomarkerów i modelowania przedklinicznego.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół standaryzacyjny integruje etapy wczesnego odkrywania, opracowywania testów oraz badań translacyjnych, stanowiąc podstawę do niezawodnej identyfikacji związków wiodących i walidacji przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez umożliwienie bezpośrednich porównań potencji.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki w celu oceny gotowości testów i ewaluacji związków.
- Analityka: Zapewnia pomiary oparte na EC50 oraz weryfikację równoległości w celu zapewnienia integralności danych.
- Badania translacyjne: Ułatwia zachowanie ciągłości przypisywania aktywności biologicznej pomiędzy poszczególnymi fazami badań.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy reużywalne ramy dla standaryzacji różnorodnych testów biologicznych wykraczających poza funkcje płytek krwi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niepewność mechanistyczną w testach funkcjonalnych.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację, powtarzalność i harmonizację testów pomiędzy zespołami i ośrodkami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie portfelem pod kątem kapitałowym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów w fazie odkrywania i badań translacyjnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu metrologii, projektowania analiz oraz nieliniowej analizy regresji.
- Wymaga dostępu do walidowanych materiałów odniesienia oraz aparatury analitycznej do agregometrii.
- Wymaga uzgodnienia protokołów standaryzacji i schematów analizy danych pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych systemów biologicznych i platform analitycznych po przeprowadzeniu odpowiedniej walidacji.
- Zależność od systematycznego szkolenia i wymiany wiedzy w celu maksymalizacji korzyści z powtarzalności.
