Odtwarzalność i harmonizacja w badaniach z wykorzystaniem standardów biologicznych: przykład peptydu kolagenozależnego-związanego z agonistą płytek krwi
August 4th, 2023
Tutaj prezentujemy metodę standaryzacji usieciowanego peptydu kolagenowego agonisty płytek krwi (CRP-XL) za pomocą agregegometrii przepuszczalności światła. Chociaż protokół jest ukierunkowany na funkcję płytek krwi, proces eksperymentalny można zastosować do większości cząsteczek biologicznych i testów biologicznych, aby zapewnić rygor naukowy i odtwarzalność.
Naukowcy z MHRA South Mimms Laboratories od ponad 60 lat opracowują standardy biologiczne produkcji, a te odczynniki referencyjne są stosowane w celu zapewnienia jakości, spójności i bezpieczeństwa leków biologicznych i diagnostyki. Standardy NIBSC opracowane przez MHRA wspierają tłumaczenie najnowocześniejszych produktów terapeutycznych, a także kontrolę uznanych leków. W MHRA South Mimms Laboratories wykorzystujemy najnowocześniejsze technologie do produkcji materiałów, które wspierają rozwój i regulację nowatorskich innowacji terapeutycznych.
Standardy biologiczne są nadal niedostatecznie wykorzystywane przez naukowców zajmujących się naukami biologicznymi ze względu na brak wymiany wiedzy. Wpływa to negatywnie na jakość badań i przyczynia się do kryzysu odtwarzalności. Standaryzacja biologiczna zapewnia, że eksperymenty są powtarzalne, niezależnie od miejsca i czasu ich wykonywania.
Brak odpowiedniej wiedzy w zakresie podstawowych zasad metrologicznych i szkolenia narusza dyscyplinę naukową i negatywnie wpływa na odtwarzalność. Chociaż nasz protokół koncentruje się na standaryzacji pomiaru funkcji płytek krwi, praktyka ta może być zastosowana do każdego systemu biologicznego. Zastosowanie standaryzacji biologicznej w praktykach badawczych nie tylko ustandaryzuje eksperymenty biologiczne, ale także pomoże rozwiązać problem niespójności i braku harmonizacji, które podważają badania.
Aby rozpocząć test, używając agonisty receptora płytkowego, usieciowanego peptydu związanego z kolagenem lub CR-PXL, należy rozcieńczyć odpowiednią ilość zapasu CR-PXL w buforze testowym do stężenia odpowiedniego do wywołania maksymalnej agregacji płytek krwi. Wynik w roztworze będzie odtąd określany jako standard. Następnie, zaczynając od tych samych najwyższych przygotowanych stężeń, należy kolejno wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia zarówno dla wzorca, jak i odczynnika testowego.
Przygotuj serię rozcieńczeń od sześciu do ośmiu punktów zarówno dla testu, jak i wzorca w buforze testowym, który generuje odpowiedzi agregacji od 100% do 0%Gdy osocze bogatopłytkowe lub PRP jest gotowe do użycia, dodaj podwielokrotność PRP do kuwety agregometrii przepuszczalności światła. Pozwól próbkom ogrzać się do 37 stopni Celsjusza w studzienkach przez kilka minut. Po odpowiednim podgrzaniu umieść kuwety w agresjometrze, aby rozpocząć rejestrowanie śladów.
Ciągle mieszając, dodaj agonistę i zapisz dane. Przeprowadzić gromadzenie danych dla każdego przygotowanego rozcieńczenia wzorca i odczynnika testowego. Użyj GraphPad Prism lub dowolnego odpowiedniego pakietu oprogramowania, aby sprawdzić, czy krzywe stężenia dla wzorca i testu są równoległe.
Wprowadzić dane w taki sposób, aby oś X zawierała stężenia, a oś Y zawierała odpowiedzi wskazane przez procent maksymalnej agregacji lub powierzchnię pod krzywą. Następnie przekształć wartości stężeń na odpowiednie logarytmy lub logarytmy stężenia. Wybierz opcję Regresja nieliniowa z funkcji analizy i użyj równania do stymulacji odpowiedzi na dawkę.
Wybierz opcję logarytmu agonisty a odpowiedź Zmienne nachylenie i użyj dopasowania trzy- lub czterokierunkowego, w zależności od tego, co jest najlepsze dla danych. Określ, czy wygenerowane krzywe są równoległe, klikając kartę Porównaj i porównując zestawy danych.
Upewnij się, że nachylenie i asymptoty badania oraz krzywe standardowe są równoważne. Jeśli te warunki są spełnione, przystąp do obliczania potencji lub EC50 przy użyciu dopasowania krzywej regresji nieliniowej. Obliczyć względną siłę działania, dzieląc wartość EC50 wzorca przez wartość testu.
Dostosować stężenie masowe na objętość badanego odczynnika, aby uwzględnić różnicę w sile działania w stosunku do wzorca. Ślady agregacji płytek krwi dla wzorca i odczynnika testowego ujawniły różnicę między dwiema odpowiedziami agregacji. Przy 0,075 mikrograma na mililitr pojawiła się wyraźna odpowiedź na normę, podczas gdy w przypadku testu odpowiednie stężenie nie wykazało żadnej odpowiedzi.
Wartości EC50 wzorca i odczynnika testowego obliczono, wykreślając krzywą stężenie-odpowiedź.
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia metodę standaryzacji peptydopodobnego kolagenowego agoniście płytkowym, skrzyżowanego (CRP-XL) z wykorzystaniem agregometrii transmisyjnej światła. Protokół, choć skupiony na funkcji płytek krwi, może być stosowany do różnych cząsteczek biologicznych i bioodczynników w celu zwiększenia rygoru naukowego i odtwarzalności.
Kluczowe elementy badania
Dział obszaru nauki
- Pomiar funkcji płytek krwi
- Standaryzacja biologiczna
- Agregometria transmisyjna światła
Tło
- Standardy biologiczne zapewniają jakość i bezpieczeństwo w lekach biologicznych.
- Standaryzacja jest kluczowa dla odtwarzalności w badaniach.
- Brak jest wymiany wiedzy na temat standardów biologicznych wśród akademików.
- Nieprawidłowe szkolenie z zakresu zasad metrologicznych może naruszyć rygor naukowy.
Cel badania
- Standaryzacja pomiaru funkcji płytek krwi z wykorzystaniem CRP-XL.
- Promowanie zastosowania standaryzacji biologicznej w praktykach badawczych.
- Rozwiązanie niespójności w eksperymentach biologicznych.
Wykorzystane metody
- Rozcieńczanie CRP-XL w buforze odczynnika w celu wywołania agregacji płytek krwi.
- Przygotowanie szeregu rozcieńczeń dla odczynników standardowych i testowych.
- Wykorzystanie agregometrii transmisyjnej światła do rejestrowania odpowiedzi agregacji płytek krwi.
- Analiza danych z wykorzystaniem nielinearnej regresji w celu określenia mocy (EC50).
Główne wyniki
- Obserwowano wyraźną odpowiedź agregacyjną przy 0,075 mikrogramów na mililitr dla standardu.
- Brak odpowiedzi dla odczynnika testowego przy odpowiadającym stężeniu.
- Wartości EC50 obliczono dla standardu i odczynnika testowego.
- Określono względną moc poprzez porównanie wartości EC50.
Wnioski
- Standaryzacja poprawia odtwarzalność w eksperymentach biologicznych.
- Właściwe szkolenie z zakresu metrologii jest niezbędne dla rygoru naukowego.
- Zastosowanie protokołu może poprawić jakość badań w różnych systemach biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardization using biological reference materials is critical for ensuring reproducibility and harmonization across discovery and translational research pipelines. The application of metrological principles to platelet agonist assays, such as CRP-XL in light transmission aggregometry, directly addresses the reproducibility crisis and supports robust data comparability across sites and time. This capability underpins confidence in early discovery findings and enables reliable cross-functional decision-making in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous comparison of biological activity between test and standard reagents for target validation.
- Reduces mechanistic ambiguity by quantifying potency differences using EC50 values.
- Supports predictive confidence in pathway interrogation and functional assay outputs.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated dilution series for reproducible assay performance.
- Standardizes quantitative readouts, ensuring assay comparability across batches and sites.
- Enables reliable benchmarking of new agonists or test materials against established standards.
Translational & Preclinical Research
- Promotes harmonization of bioassay data for translational continuity from discovery to preclinical studies.
- Supports risk-adjusted advancement by providing robust potency assignments for candidate molecules.
- Addresses inter-lab variability, strengthening the foundation for biomarker alignment and preclinical modeling.
Pipeline & Workflow Integration
This standardization protocol integrates at the interface of early discovery, assay development, and translational research, providing a foundation for reliable lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by enabling direct potency comparisons.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides EC50-based measurements and parallelism checks to ensure data integrity.
- Translational Research: Facilitates continuity of biological activity assignments across research phases.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable framework for standardizing diverse bioassays beyond platelet function.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in functional assays.
- Operational Value: Drives assay standardization, reproducibility, and harmonization across teams and sites.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in metrology, assay design, and nonlinear regression analysis.
- Needs access to validated reference materials and analytical instrumentation for aggregometry.
- Demands cross-team agreement on standardization protocols and data analysis workflows.
- Adaptable to various biological systems and assay platforms with appropriate validation.
- Dependent on consistent training and knowledge exchange to maximize reproducibility benefits.
