Name: Proste utworzenie unaczynionej niszy osteogennej szpiku kostnego za pomocą prefabrykowanych hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) w mikropłytce do obrazowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj metodę tworzenia unaczynionej niszy osteogennej szpiku kostnego z wykorzystaniem hydrożeli PEG i sekwencyjnego nasiewania komórek. Model ten umożliwia badanie interakji komórkowych oraz wpływu czynników wzrostu na rozwój sieci naczyniowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Riccardo Urbanetowi za pomoc techniczną przy urządzeniach do obsługi cieczy oraz Rodi Odabasi za wsparcie przy mikroskopii epifluorescencyjnej. Praca ta została sfinansowana przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (granty o numerach 310030E_202429 i 205321_204318) oraz Ectica Technologies AG.

3D Co-Culture Assay: Vascularized Osteogenic Niches for Cancer Drug Screening

<ol><li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li>
<li>Calvi, L. M., Link, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+complexity+of+the+bone+marrow+hematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Cellular complexity of the bone marrow hematopoietic stem cell niche.</a> Calcified Tissue International. 94 (1), 112-124 (2014).</li>
<li>Behrmann, L., Wellbrock, J., Fiedler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukemia+and+the+bone+marrow+niche-take+a+closer+look%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukemia and the bone marrow niche-take a closer look.</a> Frontiers in Oncology. 8, 444(2018).</li>
<li>Yip, R. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+tumour+cells+remodel+the+bone+marrow+vascular+microenvironment+to+support+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mammary tumour cells remodel the bone marrow vascular microenvironment to support metastasis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6920(2021).</li>
<li>Potente, M., Makinen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+heterogeneity+and+specialization+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Vascular heterogeneity and specialization in development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 477-494 (2017).</li>
<li>Augustin, H. G., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+vasculature%3A+From+descriptive+heterogeneity+to+functional+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organotypic vasculature: From descriptive heterogeneity to functional pathophysiology.</a> Science. 357 (6353), (2017).</li>
<li>Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+angiogenesis+and+osteogenesis+by+a+specific+vessel+subtype+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone.</a> Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).</li>
<li>Barillari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-angiogenic+effects+of+anti-human+immunodeficiency+virus+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">The anti-angiogenic effects of anti-human immunodeficiency virus drugs.</a> Frontiers in Oncology. 10, 806(2020).</li>
<li>Owen, M., Friedenstein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+stem-cells+-+Marrow-derived+osteogenic+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba+Foundation+Symposia%22%5BJournal%5D)">Stromal stem-cells - Marrow-derived osteogenic precursors.</a> Ciba Foundation Symposia. 136, 42-60 (1988).</li>
<li>Sacchetti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewing+osteoprogenitors+in+bone+marrow+sinusoids+can+organize+a+hematopoietic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a hematopoietic microenvironment.</a> Cell. 131 (2), 324-336 (2007).</li>
<li>Traore, M. A., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+the+vascular+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering the vascular tree.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 23 (6), 505-514 (2017).</li>
<li>Bessy, T., Itkin, T., Passaro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+the+bone+marrow+vascular+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioengineering the bone marrow vascular niche.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 645496(2021).</li>
<li>Bray, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+ex+vivo+tri-culture+model+mimics+cell-cell+interactions+between+acute+myeloid+leukemia+and+the+vascular+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional ex vivo tri-culture model mimics cell-cell interactions between acute myeloid leukemia and the vascular niche.</a> Haematologica. 102 (7), 1215-1226 (2017).</li>
<li>Montano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+human+capillaries+in+vitro%3A+The+engineering+of+prevascularized+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Formation of human capillaries in vitro: The engineering of prevascularized matrices.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (1), 269-282 (2010).</li>
<li>Sun, Z. Y., Kemp, S. S., Lin, P. K., Aguera, K. N., Davis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+k-RasV12+expression+induces+capillary+deficiency+attributable+to+marked+tube+network+expansion+coupled+to+reduced+pericytes+and+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endothelial k-RasV12 expression induces capillary deficiency attributable to marked tube network expansion coupled to reduced pericytes and basement membranes.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 42 (2), 205-222 (2022).</li>
<li>Kleinman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement-membrane+complexes+with+biological-activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement-membrane complexes with biological-activity.</a> Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).</li>
<li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+laminin+and+basement-membrane+in+the+morphological-differentiation+of+human-endothelial+cells+into+capillary-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of laminin and basement-membrane in the morphological-differentiation of human-endothelial cells into capillary-like structures.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).</li>
<li>Davis, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+vascular+tube+morphogenesis+and+maturation+in+3D+extracellular+matrices+by+endothelial+cells+and+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1066, 17-28 (2013).</li>
<li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).</li>
<li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+3D+in+vitro+model+for+specificity+of+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone.</a> Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).</li>
<li>Wang, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+anastomosis+between+living+capillary+networks+and+endothelial+cell-lined+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineering anastomosis between living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels.</a> Lab on a Chip. 16 (2), 282-290 (2016).</li>
<li>Phan, D. T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vascularized+and+perfused+organ-on-a-chip+platform+for+large-scale+drug+screening+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications.</a> Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).</li>
<li>Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomaterials+as+instructive+extracellular+microenvironments+for+morphogenesis+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.</a> Nature Biotechnology. 23 (1), 47-55 (2005).</li>
<li>Kyburz, K. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+mimics+of+the+extracellular+matrix%3A+How+simple+is+complex+enough%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Synthetic mimics of the extracellular matrix: How simple is complex enough.</a> Annals of Biomedical Engineering. 43 (3), 489-500 (2015).</li>
<li>Ehrbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+formation+of+modular+cell-instructive+fibrin+analogs+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enzymatic formation of modular cell-instructive fibrin analogs for tissue engineering.</a> Biomaterials. 28 (26), 3856-3866 (2007).</li>
<li>Ehrbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+hydrogels+formed+and+degraded+via+site-specific+enzymatic+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biomolecular hydrogels formed and degraded via site-specific enzymatic reactions.</a> Biomacromolecules. 8 (10), 3000-3007 (2007).</li>
<li>Blache, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+mesenchymal+stem+cells+allows+for+microvascularized+bone+tissue-like+environments+in+PEG+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Dual role of mesenchymal stem cells allows for microvascularized bone tissue-like environments in PEG hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (4), 489-498 (2016).</li>
<li>Blache, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-inducing+hydrogels+reveal+a+perivascular+switch+of+mesenchymal+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Reports%22%5BJournal%5D)">Notch-inducing hydrogels reveal a perivascular switch of mesenchymal stem cell fate.</a> Embo Reports. 19 (8), e45964(2018).</li>
<li>Simona, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+gradients+at+hydrogel+interfaces+for+enhanced+cell+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Density gradients at hydrogel interfaces for enhanced cell penetration.</a> Biomaterials Science. 3 (4), 586-591 (2015).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+hydrogels+featuring+in-depth+surface+density+gradients+for+the+simple+establishment+of+3d+tissue+models+for+screening+applications%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">Soft hydrogels featuring in-depth surface density gradients for the simple establishment of 3d tissue models for screening applications.</a> SLAS Discovery. 22 (5), 635-644 (2017).</li>
<li>Martin, I., Muraglia, A., Campanile, G., Cancedda, R., Quarto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor-2+supports+ex+vivo+expansion+and+maintenance+of+osteogenic+precursors+from+human+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor-2 supports ex vivo expansion and maintenance of osteogenic precursors from human bone marrow.</a> Endocrinology. 138 (10), 4456-4462 (1997).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Carpentier, G., Martinelli, M., Courty, J., Cascone, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+Analyzer+for+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%224th+ImageJ+User+and+Developer+Conference%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis Analyzer for ImageJ.</a> 4th ImageJ User and Developer Conference. , Mondorf-les-Bains, Luxembourg. 198-201 (2012).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li>
<li>Loebel, C., Mauck, R. L., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+nascent+protein+deposition+and+remodelling+guide+mesenchymal+stromal+cell+mechanosensing+and+fate+in+three-dimensional+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Local nascent protein deposition and remodelling guide mesenchymal stromal cell mechanosensing and fate in three-dimensional hydrogels.</a> Nature Materials. 18 (8), 883-891 (2019).</li>
<li>Curtis, M. B., Kelly, N., Hughes, C. C. W., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+stromal+cells+impact+endothelial+cell+transcriptome+in+3D+microvessel+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Organotypic stromal cells impact endothelial cell transcriptome in 3D microvessel networks.</a> Scientific Reports. 12 (1), 20434(2022).</li>
<li>Wust, R., Terrie, L., Muntefering, T., Ruck, T., Thorrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+co-isolation+of+microvascular+endothelial+cells+and+satellite+cell-derived+myoblasts+from+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient co-isolation of microvascular endothelial cells and satellite cell-derived myoblasts from human skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 964705(2022).</li>
</ol>

Ectica Technologies AG jest producentem płytki studzienkowej z hydrożelem 3DProSeed i posiada interesy handlowe. Benjamin R. Simona i Martin Ehrbar są udziałowcami Ectica Technologies AG.

W tym miejscu opisujemy protokół tworzenia modelu in vitro wysoce unaczynionych nisz kostnych i szpiku kostnego w pełni syntetycznej i kontrolowanej matrycy 3D opartej na PEG, która ma różnorodne zastosowania w badaniach biologii kości i szpiku kostnego, inżynierii tkankowej i badaniach nad rakiem. Model ten opiera się na syntetycznym hydrożelu na bazie PEG, który jest funkcjonalizowany peptydami RGD i miejscami rozszczepienia MMP i jest odlewany z głębokim gradientem gęstości na 96-dołkowych płytkach obrazowych ze szklanym dnem30. Wykazano, że ta platforma plug-and-play umożliwia tworzenie wysoce połączonych ze sobą sieci komórkowych 3D bez konieczności kapsułkowania komórek w hydrożelu. Podobnie jak w przypadku wcześniej opisanego protokołu enkapsulacji komórek, w tej pracy pokazujemy przebudowę substratu przez ECM28 wbudowany w komórkę w celu stworzenia mikrośrodowiska specyficznego dla typu komórki. Dzięki tej metodzie można łatwo przeprowadzać badania przesiewowe leków i analizy o wysokiej zawartości w wysoce powtarzalnych, organotypowych warunkach hodowli 3D. 96-dołkowe płytki ze szklanym dnem i optycznie przezroczyste hydrożele sprawiają, że platforma jest kompatybilna z automatyzacją obsługi cieczy i mikroskopią o wysokiej przepustowości.
Pierwszym krokiem do wytworzenia osteogennej niszy naczyniowej szpiku kostnego jest wstępna hodowla hBM-MSC na hydrożelu PEG przez co najmniej 3 dni. W tym czasie przyczepiają się do hydrożelu, wnikają w niego i zaczynają nawiązywać kontakty komórka-komórka oraz odkładanie ECM. Przed rozmieszczeniem hBM-MSC należy usunąć bufor magazynu. Ponieważ hydrożel znajduje się wewnątrz wewnętrznej studzienki w standardowej studzience 96-dołkowej płytki obrazowej, można bezpiecznie włożyć końcówkę aspiracyjną wzdłuż boku studzienki, aż dotknie wewnętrznego pierścienia studzienki. Pompa próżniowa może być używana do zasysania, jeśli jest ustawiona na najniższą możliwą siłę ssania. Alternatywnie do zasysania buforu z płytki hydrożelowej można użyć automatycznej myjki płytkowej z wysokością dyszy dostosowaną do co najmniej 0,8 mm powyżej wewnętrznego pierścienia studzienki. Zastosowanie automatyzacji do obsługi cieczy może zminimalizować uszkodzenia powierzchni hydrożelu i prowadzić do większej odtwarzalności powstałych kultur. Małe defekty na powierzchni hydrożelu stają się widoczne, gdy komórki osiądą na hydrożelu i pojawiają się na niższej płaszczyźnie ogniskowania w uszkodzonych obszarach hydrożelu. W związku z tym uzyskanie obrazów referencyjnych w dniu 0 służy jako dobra kontrola jakości jednorodności wysiewu komórek i integralności powierzchni hydrożelu. Podczas gdy małe defekty powierzchni hydrożelu nie wykluczają dalszego korzystania ze studzienki, komórki mają tendencję do gromadzenia się w uszkodzonych obszarach i mogą wyrastać w niereprezentatywne wzory lub szybciej docierać do dolnej szklanki, gdzie rosną w monowarstwę. Artefakty te należy odnotować podczas użytkowania/oceny tych studni. Podobne względy mają zastosowanie do wszelkich zmian pożywki wykonywanych przez cały czas trwania testu.
Drugi etap protokołu polega na dodaniu GFP-HUVEC do wstępnie uformowanej monokultury hBM-MSC (dzień 0 kohodowli). ECM zdeponowany przez hBM-MSC stanowi doskonałe rusztowanie dla wzrostu komórek śródbłonka, które w tej pracy, nawet w obecności pożywki kondycjonowanej hBM-MSC, mogły tworzyć tylko okrągłe skupiska komórek na hydrożelach (nie pokazano). Po wysiewie na kulturach hBM-MSC, HUVEC integrują się i tworzą struktury przypominające mikronaczynia porównywalne do tych obserwowanych w kokulturach generowanych przez enkapsulację komórek27,28. Zazwyczaj dobrze rozwinięte sieci mikrokrążeniowe 3D tworzą się w ciągu 4 dni od kohodowli i można to monitorować wzdłużnie za pomocą HUVEC znakowanych GFP. Struktury te mogą być utrzymywane w hodowli przez co najmniej 7 dni, co oznacza, że jest wystarczająco dużo czasu, aby śledzić zmiany w organizacji sieci naczyniowej w odpowiedzi na leczenie, takie jak badania przesiewowe leków antyangiogennych. Elementy morfologiczne sieci śródbłonka można określić ilościowo w trybie wsadowym poprzez segmentację obrazów GFP przy użyciu dobrze znanych narzędzi, takich jak wtyczka Angiogenesis Analyzer firmy ImageJ33, a ich parametry można wykorzystać do oceny, na przykład, skuteczności leku i farmakodynamiki.
Istotną zaletą opisywanego modelu komórkowego dla wielu potencjalnych zastosowań jest jego plastyczność. Samo uzupełnienie pożywki hodowlanej różnymi czynnikami wzrostu może zmienić wygląd kokultury. Na przykład obecność BMP-2 w okresie mono- i kohodowli tworzy osteogenną niszę naczyniową, wykazując zwiększoną aktywność ALP, zewnątrzkomórkowe odkładanie się wapnia, a także składanie i odkładanie ECM. Wręcz przeciwnie, w obecności FGF-2 markery osteogenne są nieobecne, a kokultura tworzy mniej bocznych asocjacji komórkowych, ale wykazuje wyraźniejszy wzrost komórek 3D. Fakt, że FGF-2 hamuje aktywność ALP, podczas gdy BMP-2 wywołuje silniejszą aktywność ALP w porównaniu z brakiem leczenia czynnikiem wzrostu, jest zgodny z wcześniejszymi obserwacjami27. Jednak pomimo tych dużych różnic w komponencie zrębu hBM-MSC, zakres sieci mikronaczyniowej był bardzo podobny dla dwóch stanów leczonych czynnikiem wzrostu w tej pracy. W kulturach kontrolnych utworzyło się tylko kilka krótkich sieci naczyniowych, reprezentujących być może słabo unaczynioną niszę szpiku kostnego. Sugeruje to, że po prostu zmieniając rodzaj, stężenie i czas dodawania czynników wzrostu do pożywki hodowlanej, można wytworzyć szereg dobrze zdefiniowanych unaczynionych nisz szpiku kostnego, które byłyby wymagane w badaniach porównawczych. Jednakże, aby zapewnić powtarzalne wyniki, ważne jest, aby pamiętać, że progresja i morfologia hodowli mogą się różnić w zależności od historii użytych komórek (np. liczby pasaży i metody oddzielenia zastosowanej podczas rutynowego utrzymywania hodowli) i zaleca się kontrolę takich czynników podczas projektowania testu.
Tutaj, jako pierwsze zastosowanie tego modelu, demonstrujemy wrażliwość zmodyfikowanych sieci mikronaczyniowych na leczenie bewacyzumabem w stężeniu 10 μg/mL. W szczególności ważne jest, aby potwierdzić, że zastosowany algorytm może dokładnie rozpoznać sieć śródbłonka, ponieważ artefakty są często generowane na obrazach ze słabo rozwiniętymi sieciami. W takim przypadku parametry wykorzystywane do przetwarzania obrazu (przed i w trakcie segmentacji) muszą zostać dopracowane, często metodą prób i błędów.
Jako drugie zastosowanie przedstawiamy zaawansowany model kokultury utworzony przez sekwencyjne wysiewanie komórek mezenchymalnych, śródbłonka i nowotworowych. Model ten pozwala na badanie interakcji między komórkami nowotworowymi, zrębem i unaczynieniem szpiku kostnego, które mogą być ważnymi czynnikami podczas przerzutów. Ponadto model ten może być wykorzystywany do badań przesiewowych leków i testowania związków o celach wykraczających poza angiogenezę.
W hodowlach 2D komórki nie odbierają fizjologicznych sygnałów mikrośrodowiskowych, nie nabywają naturalnie występujących morfologii komórek, a w konsekwencji różnicują się inaczej w porównaniu z komórkami w natywnych środowiskach3D 35. Podczas hodowli w zmodyfikowanych hydrożelach 3D, komórki wcześnie osadzają nieodłączny ECM, który zapewnia miejsca adhezji i może być aktywnie przebudowywany 28,36. W tym przypadku, aby stworzyć uproszczony model 3D do zastosowań przesiewowych, komórki tworzące naczynia zostały wysiane na powierzchnię zmodyfikowanych hydrożeli i pozwolono na utworzenie sieci naczyniowych przy braku perfuzji. Oceny oparte na obrazowaniu przeprowadzono na projekcjach 2D komórek śródbłonka przyczyniających się do struktur naczyniowych. Jednak tylko obrazy konfokalne ujawniły mniej wyraźne wrastanie sieci naczyniowych 3D w próbkach stymulowanych przez BMP-2 w porównaniu z próbkami stymulowanymi FGF-2. Sugeruje to, że długość powstałych struktur naczyniowych była niedoszacowana, podczas gdy ich łączność była przeszacowana. Ponadto nie badano interakcji między komórkami okołonaczyniowymi i śródbłonka a tworzeniem światła naczyń. Aspekty te, zwłaszcza w odniesieniu do reakcji na leczenie odwykowe, będą wymagały dalszej uwagi. Wreszcie, pożądane byłyby udoskonalone protokoły, aby najpierw ustanowić rozległe sieci naczyniowe 3D, a dopiero potem indukować ich różnicowanie osteogenne, aby wygenerować więcej fizjologicznych modeli kości i szpiku kostnego.
Ogólnie rzecz biorąc, prezentowany tutaj model jest bardzo wszechstronny i można go łatwo dostosować do konkretnych zastosowań. Na przykład można wykorzystać komórki mezenchymalne i śródbłonka z różnych źródeł. Wiadomo, że MSCs tkanki tłuszczowej i MSCs pępowiny wyrażają różne czynniki angiogenne w porównaniu z BM-MSC i można je łatwo zastąpić jako alternatywny składnik zrębu37. Zamiast HUVEC można również zastosować komórki śródbłonka wyizolowane z już zdefiniowanych nisz szpiku kostnego. Można również ustanowić kokulturę z pochodzącymi od pacjenta, dopasowanymi komórkami mezenchymalnymi i śródbłonka szpiku kostnego do zastosowań w medycynie spersonalizowanej, jak ostatnio zasugerowano w przypadku unaczynionych kokultur mięśniowych38. Dodatkowo konstrukcja płytki hydrożelowej pozwala na wzdłużne monitorowanie hodowli zarówno za pomocą mikroskopii jasnego pola, jak i mikroskopii fluorescencyjnej, oferując w ten sposób użytkownikowi możliwość skrócenia lub wydłużenia czasu hodowli w zależności od zastosowania. Alternatywnie, gęstości komórek używane do wysiewu mogą być odpowiednio dostosowane, aby przyspieszyć lub opóźnić tworzenie się sieci komórkowej, jeśli potrzebne są krótsze lub dłuższe czasy obserwacji niż te w tym protokole. W każdym razie należy zachować ostrożność, aby uniknąć przerostu komórek w struktury przypominające arkusze, co może prowadzić do skurczenia się hydrożelu i ostatecznego oderwania komórek.
Wreszcie, przy użyciu tego modelu można wykonać szeroki zakres testów. Oprócz immunofluorescencji i mikroskopii wykonywanej w żywych lub utrwalonych hodowlach, kultury 3D mogą być trawione enzymatycznie, a komórki mogą być pobierane i poddawane dowolnemu testowi biochemicznemu. Tutaj pokazujemy oznaczanie aktywności ALP i kwantyfikację zawartości DNA w lizatach komórkowych za pomocą testów kolorymetrycznych/fluorometrycznych, ale system jest kompatybilny z wieloma innymi technikami, w tym PCR, RNAseq i proteomiką. Jeśli czułość pożądanego testu nie jest bardzo wysoka, można połączyć próbki z więcej niż jednego dołka, aby zwiększyć ilość próbki dostępnej do testu. Jeśli pożądane zastosowanie wymaga szybszego rozpuszczania żelu, można zastosować wytrząsanie orbitalne płytki w połączeniu z mniejszymi objętościami roztworu trawiennego, aby zapewnić tworzenie się wirów w studzienkach, zakładając, że wszystkie studzienki na płytce zostaną wykorzystane w ten sposób (żywe kultury są wrażliwe na takie ostre obchodzenie się). Podsumowując, przedstawiamy tutaj protokół, który, jeśli zostanie zastosowany zgodnie z opisem, gwarantuje wygenerowanie modelu in vitro , który podsumowuje kluczowe aspekty osteogennych nisz naczyniowych, ale jest również na tyle wszechstronny, że można go modyfikować pod kątem zastosowań dostosowanych do potrzeb klienta.

Kość i szpik kostny są strukturalnie i funkcjonalnie złożonymi organami, kluczowymi dla ludzkiego zdrowia. Znajduje to odzwierciedlenie w istnieniu odrębnych nisz, które regulują hematopoezę i utrzymanie kości1. Obecnie powszechnie przyjmuje się, że w zdrowym szpiku kostnym utrzymanie i ekspansja hematopoetycznych i szkieletowych komórek macierzystych, a także ich potomstwa, są kontrolowane przez odrębne nisze. Nisze te obejmują różne typy komórek, w tym komórki osteolineage, mezenchymalne komórki macierzyste, komórki śródbłonka i okołonaczyniowe, komórki neuronalne i glejowe, adipocyty, osteoklasty, makrofagi i neutrofile2. Nic dziwnego, że te nisze, głównie związane z układem krwionośnym, są również zaangażowane w rozwój różnych typów białaczki3 i są miejscem przerzutów dla różnych nowotworów4. Ze względu na swoje specyficzne role w tworzeniu, przebudowie i utrzymaniu kości (szpiku), unaczynienie związane z kośćmi ma odrębne wyspecjalizowane struktury, różniące się od naczyń krwionośnych występujących w innych częściach ciała5,6,7. Tak więc leki antyangiogenne lub modulujące naczynia krwionośne stosowane ogólnoustrojowo mogą mieć różne efekty w tych wyspecjalizowanych środowiskach8. W związku z tym wysoce pożądane są modele do badania mechanizmów molekularnych związanych z utrzymaniem fizjologicznych właściwości kości i szpiku kostnego, regeneracją kości i szpiku kostnego oraz odpowiedziami na leczenie terapeutyczne.
Klasyczne dwuwymiarowe (2D) hodowle tkanek oraz badania in vivo z wykorzystaniem modeli zwierzęcych dostarczyły nieocenionego wglądu w role różnych komórek i graczy molekularnych zaangażowanych w rozwój kości i szpiku kostnego9,10. Modele, które pozwalają na wysokoprzepustowe eksperymenty z odpowiednimi komórkami ludzkimi, mogą poszerzyć naszą wiedzę na temat modulowania wybranych parametrów w tych wysoce złożonych systemach.
W ciągu ostatniej dekady, zasady wywodzące się z inżynierii tkankowej zostały wykorzystane do generowania modeli tkanek 3D11,12. Opierały się one głównie na enkapsulacji komórek istotnych dla tkanek w biomateriałach w celu ustanowienia mono- lub kokultur 3D13. Do najczęściej używanych biomateriałów należą fibrin14, collagen15 i Matrigel16,17, z których wszystkie są wysoce biokompatybilne i zapewniają odpowiednie warunki do wzrostu wielu typów komórek. Te biomateriały mają zdolność generowania modeli in vitro, które podsumowują kluczowe aspekty różnych nisz naczyniowych znalezionych in vivo18. Co więcej, zastosowanie urządzeń mikroprzepływowych do generowania perfundowanych modeli naczyń krwionośnych kości i szpiku kostnego przyczyniło się do wygenerowania modeli in vitro o większej złożoności19,20,21,22.
Trudność w kontrolowaniu składu i inżynierii właściwości naturalnie występujących biomateriałów zainspirowała rozwój syntetycznych analogów, które można racjonalnie zaprojektować z przewidywalnymi właściwościami fizycznymi, chemicznymi i biologicznymi23,24. Opracowaliśmy w pełni syntetyczne hydrożele na bazie usieciowanego poli(glikolu etylenowego) (PEG) czynnika XIII (FXIII), które są funkcjonalizowane peptydami RGD i miejscami rozszczepienia metaloproteazy matrycy (MMP), aby ułatwić przyłączanie i przebudowę komórek25,26. Modułowa konstrukcja tych biomateriałów została z powodzeniem wykorzystana do optymalizacji warunków tworzenia unaczynionych modeli 3D kości i szpiku kostnego27,28.
Do testowania większej liczby różnych warunków hodowli i nowych terapii, wymagane są modele o większej przepustowości. Niedawno wykazaliśmy, że sieciowanie FXIII naszego hydrożelu PEG może być kontrolowane za pomocą procesu elektrochemicznego, tak że powstaje głęboki gradient sztywności hydrożelu29. Kiedy komórki są dodawane do takich hydrożeli, migrują one w kierunku wnętrza i stopniowo przekształcają się w wysoce połączone sieci komórkowe 3D30. Eliminacja konieczności kapsułkowania komórek w hydrożelu, który jest zwykle obecny w innych rusztowaniach 3D, nie tylko upraszcza projekt eksperymentalny, ale także umożliwia sekwencyjne dodawanie różnych typów komórek w różnych punktach czasowych w celu wygenerowania złożonych systemów kohodowli. Hydrożele te są dostępne w postaci wstępnie odlanej na 96-dołkowych płytkach obrazowych ze szklanym dnem, dzięki czemu tworzenie kultur 3D jest osiągalne zarówno za pomocą ręcznych, jak i automatycznych protokołów wysiewu komórek. Przezroczystość optyczna hydrożeli PEG sprawia, że platforma jest kompatybilna z mikroskopią.
Tutaj prezentujemy prostą metodę generowania i charakteryzowania unaczynionych nisz osteogennych w ramach tej gotowej do użycia, syntetycznej platformy plug-and-play. Pokazujemy, że rozwój sieci naczyniowych może być stymulowany przez czynnik wzrostu powszechnie stosowany do indukowania osteogenezy in vitro, białko morfogenetyczne kości-2 (BMP-2), podczas gdy różnicowaniu osteogennemu można zapobiec poprzez suplementację czynnikiem wzrostu fibroblastów 2 (FGF-2)27,31. Utworzone sieci różnią się od sieci stymulowanych FGF-2 pod względem ogólnego wyglądu, a także dystrybucji komórek i ECM. Ponadto monitorowaliśmy indukcję osteogenną przy użyciu fosfatazy alkalicznej jako markera. Wykazujemy zwiększoną ekspresję tego markera w czasie i porównujemy ekspresję z ekspresją w sieciach stymulowanych FGF-2 przy użyciu metod jakościowych i ilościowych. Na koniec pokazujemy przydatność wygenerowanych wnęk tego modelu do dwóch potencjalnych zastosowań. Po pierwsze, przeprowadziliśmy test wrażliwości na lek potwierdzający słuszność koncepcji, dodając bewacyzumab do wstępnie uformowanych nisz i monitorując degradację sieci naczyniowych w jego obecności. Po drugie, dodaliśmy komórki raka piersi MDA-MB-231 i kostniakomięsaka U2OS do wstępnie utworzonych nisz osteogennych, pokazując, że nisze można wykorzystać do badania interakcji między komórkami rakowymi a ich środowiskiem.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>2 ml mikroprobówki</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>2-amino-2-metylo-1-propanol</td><td>Sigma</td><td>A9199</td><td></td></tr><tr><td>3DProSeed hydrożelowa płytka studzienkowa</td><td>Ectica Technologies</td><td>ECT. PS1.001.096</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodna sól disodowa fosforanu 4-nitrofenylu</td><td>Sigma</td><td>71768</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>Sigma</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało antykolagenowe IV</td><td>Abcam</td><td>ab6311</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Laminin 1 + 2</td><td>Abcam</td><td>ab7463</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczna myjka do płyt</td><td>Agilent Biotek</td><td>EL&chi; 50</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczna myjka/dozownik</td><td>Agilent Biotek</td><td>MULTIFLO FX wyposażony w pompę perystaltyczną Kaseta</td><td></td>5uL</tr><tr><td>Bevacizumab</td><td>Identyfikator dowodowy</td><td>PS-E07-2019-00119 A009</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2</td><td>Peprotech</td><td>120-02C</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>AppliChem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td>Do wirowania probówek 2 ml przy 16100 x g podczas analizy ALP</td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Leica</td><td>Stellaris 5</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe 50 ml</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 649 Przeciwciało anty-królicze IgG (minimalna reaktywność x) Osioł</td><td>Biolegend</td><td>406406</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 649 Przeciwciało anty-mysie IgG (minimalna reaktywność x) Koza</td><td>Biolegend</td><td>405312</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna (IST-9)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-59826</td><td></td></tr><tr><td>GFP-HUVECs</td><td>PELOBiotech</td><td>PB-CAP-0001GFP</td><td></td></tr><tr><td>hBM-MSCs</td> <td>-</td><td></td> <td>izolowany w Szpitalu Uniwersyteckim w Bazylei; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, i wsp. Ekspansja ludzkich mezenchymalnych komórek zrębu ze świeżego szpiku kostnego w systemie opartym na rusztowaniu 3D pod bezpośrednią perfuzją. PLoS jeden. 2014; 9(7):e102359</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Zeiss</td><td>200M</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 linia komórkowa raka piersi</td> <td>-</td><td></td> <td>Uprzejmie uzyskana od J Massagu i ostrego; w Memorial Sloan-Kettering Cancer Center</td></tr><tr><td>MEM&alpha;</td><td>Gibco</td><td>22571-038</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik obrazowania wielomodowego</td><td>Agilent Biotek</td><td>Cytation 1</td><td>Do automatycznego obrazowania</td></tr><tr><td>Czytnik obrazowania wielomodowego - fluorescencja i absorbancja</td><td>Agilent Biotek</td><td>Cytation 5</td><td>Do pomiaru absorbancji i intensywności fluorescencji dzięki analizie ALP</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Artechemis</td><td>US 040</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Faloidyna-rodamina</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Picro-Sirius Red Solution</td><td>Abcam</td><td>ab246832</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Zestaw do oznaczania</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane przeciwciało anty-kolagenowe I</td><td>Abcam</td><td>ab260043</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST BCIP/NBT</td><td>Sigma</td><td>B5655-25TAB</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>1064981000</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy, bezwodny</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy, monohydrat</td><td>Merck</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>AppliChem</td><td>Linia komórkowa kostniakomięsaka A4974</td><td></td></tr><tr><td>U2OS</td> <td>-</td><td></td> <td>Uprzejmie uzyskana od J Snedekera w Instytucie Biomechaniki w Zurychu&nbsp;</td></tr><tr><td>&alfa;-trehaloza dwuwodna</td><td>Sigma</td><td>90208</td><td></td></tr></tbody></table>

proste utworzenie unaczynionej niszy osteogennej szpiku kostnego za pomocą prefabrykowanych hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (peg) w mikropłytce do obrazowania

Simple Establishment of a Vascularized Osteogenic Bone Marrow Niche Using Pre-Cast Poly(ethylene Glycol) (PEG) Hydrogels in an Imaging Microplate

Kość i szpik kostny są wysoce unaczynionymi i strukturalnie złożonymi organami, i są miejscami powstawania raka i przerzutów. Modele in vitro podsumowujące funkcje specyficzne dla kości i szpiku kostnego, w tym unaczynienie, które są zgodne z badaniami przesiewowymi leków, są wysoce pożądane. Takie modele mogą wypełnić lukę między uproszczonymi, strukturalnie nieistotnymi dwuwymiarowymi (2D) modelami in vitro a droższymi, etycznie wymagającymi modelami in vivo. W artykule opisano kontrolowany trójwymiarowy (3D) test współhodowli oparty na zmodyfikowanych matrycach poli(glikolu etylenowego) (PEG) do generowania unaczynionych, osteogennych nisz szpiku kostnego. Konstrukcja matrycy PEG umożliwia rozwój kultur komórkowych 3D poprzez prosty etap wysiewu komórek, który nie wymaga enkapsulacji, umożliwiając w ten sposób rozwój złożonych systemów kohodowli. Co więcej, matryce są przezroczyste i wstępnie odlane na 96-dołkowych płytkach obrazowych ze szklanym dnem, dzięki czemu system nadaje się do mikroskopii. W opisanym tutaj teście ludzkie mezenchymalne komórki zrębu pochodzące ze szpiku kostnego (hBM-MSC) są najpierw hodowane, aż do uformowania się wystarczająco rozwiniętej sieci komórkowej 3D. Następnie dodaje się ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej wykazujące ekspresję GFP (HUVEC). Rozwój kultury jest śledzony przez mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną. Obecność sieci hBM-MSC sprzyja tworzeniu się struktur podobnych do naczyń krwionośnych, które inaczej nie powstałyby i pozostają stabilne przez co najmniej 7 dni. Zakres powstawania sieci podobnych do naczyń krwionośnych można łatwo określić ilościowo. Model ten można dostroić do osteogennej niszy szpiku kostnego poprzez uzupełnienie pożywki hodowlanej białkiem morfogenetycznym kości 2 (BMP-2), które sprzyja osteogennemu różnicowaniu hBM-MSC, co oceniano na podstawie zwiększonej aktywności fosfatazy alkalicznej (ALP) w 4. i 7. dniu kohodowli. Ten model komórkowy może być wykorzystany jako platforma do hodowli różnych komórek nowotworowych i badania, w jaki sposób oddziałują one z niszami naczyniowymi specyficznymi dla kości i szpiku kostnego. Co więcej, nadaje się do automatyzacji i analiz o wysokiej zawartości, co oznacza, że umożliwi badania przesiewowe leków przeciwnowotworowych w wysoce powtarzalnych warunkach hodowli.

Kultury nisz naczyniowych utworzono poprzez sekwencyjne wysiewanie hBM-MSCs i GFP-HUVECs na prefabrykowane hydrożele na bazie PEG z gradientem sztywności w 96-dołkowej płytce do obrazowania (Rysunek 1). Kultury monitorowano podłużnie za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej żywych komórek i dodatkowo charakteryzowano w wybranych punktach czasowych. Przedział pozakomórkowy oceniano za pomocą bezpośrednich barwień kolorystycznych oraz barwień przeciwciałami. Aktywność ALP określono ilościowo po odzyskaniu i lizowaniu komórek z wytworzonych nisz. Ponadto wykazano przydatność tej platformy do testów wrażliwości na leki antyangiogenne oraz jako podstawę do modeli kokultur nowotworowych.
Współuprawy hBM-MSCs i HUVECs wykazujących ekspresję GFP utworzono poprzez wysianie 3 x 104 komórek/dołek w warunkach bez czynników wzrostu lub w obecności FGF-2 bądź BMP-2 w stężeniu 50 ng/mL, zgodnie z opisem w protokole. Już we wczesnym punkcie czasowym można było zaobserwować różnice między kulturami zarówno na obrazach w świetle przechodzącym, jak i fluorescencyjnych, przedstawiających wyłącznie GFP-HUVECs (Rycina 2A). Dzięki podłużnej obserwacji tych samych obszarów odnotowano różnice w rozwoju kultur, takie jak szybszy rozwój w obecności FGF-2. Generalnie kultury wydawały się mniej rozwinięte w przypadku braku czynników wzrostu, co objawiało się mniejszą liczbą rozprzestrzeniających się komórek obu typów oraz obecnością obszarów acelularnych. Z kolei obrazy w świetle przechodzącym wykazały największą gęstość kultur w obecności BMP-2. Niemniej jednak sieci o charakterze naczyniowym uformowały się w obu warunkach z dodatkiem czynników wzrostu, przy czym najbardziej rozbudowane i połączone sieci powstały przy zastosowaniu FGF-2. Zaobserwowane różnice można było również skwantyfikować za pomocą wtyczki Angiogenesis Analyzer dla programu ImageJ. Rzeczywiście, całkowita długość sieci była najwyższa w obecności FGF-2 i najniższa w warunkach bez czynników wzrostu (Rycina 2B). Liczba połączeń wskazująca na punkty rozgałęzień w sieciach wykazywała ten sam trend co całkowita długość (Rycina 2C). Odwrotnie, w obu warunkach z dodatkiem czynników wzrostu odnotowano znacznie mniej izolowanych segmentów niż w warunkach bez czynników wzrostu, co wskazuje na wyższy stopień połączoności sieci (Rycina 2D). Dodatkowo obrazowanie konfokalne 3D ujawniło silniejszą penetrację komórek śródbłonka w głąb struktury w warunkach stymulowanych FGF-2 (Rycina 2E).
Współkultury hBM-MSC/GFP-HUVEC utrzymywano przez 7 dni w obecności FGF-2 lub BMP-2 przed utrwaleniem i barwieniem na składniki ECM. Barwienia immunocytochemiczne z następującą po nich konfokalną mikroskopią laserową wykazały uderzające różnice w morfologii kultury w zależności od rodzaju suplementacji czynnika wzrostu (Rycina 3A). W przypadku FGF-2 kultura była zorganizowana w skondensowane struktury przypominające naczynia mikrokrążeniowe, w których występowało duże zagęszczenie komórek śródbłonkowych i mezenchymalnych, natomiast w obecności BMP-2 komórki hBM-MSC zajmowały znacznie większy obszar, co wynikało z rozległych obszarów dodatnich dla F-aktyny i ujemnych dla GFP. Białka ECM, fibronektyna i kolagen I, lokalizowały się w podobny sposób, podczas gdy laminina i kolagen IV były bardziej skoncentrowane wokół struktur śródbłonkowych. Jednakże zwiększone stężenie wokół struktur śródbłonkowych było znacznie bardziej wyraźne w obecności FGF-2 niż w obecności BMP-2. Oprócz barwień opartych na przeciwciałach, wykonano bezpośrednie barwienia kolorystyczne w celu oceny ogólnego stanu włóknienia ECM (barwienie czerwienią Picrosirius; Rycina 3B) oraz odkładania Ca w ECM (Rycina 3C) utworzonych nisz (barwienie czerwienią Alizaryną). Barwienie czerwienią Picrosirius było silniejsze i bardziej rozległe w niszach hodowanych z BMP-2, a barwienie czerwienią Alizaryną wykazywało ten sam trend.
Następnie scharakteryzowano hodowle pod kątem ich potencjału osteogennego poprzez ocenę aktywności ALP jako wczesnego markera osteogenicznego. W 4. i 7. dniu współhodowli komórki odzyskano z nisz poprzez trawienie hydrożeli trypsyną. Aby ilościowo ocenić aktywność ALP, odzyskane komórki poddano lizie, a następnie przeprowadzono test pNPP. Uzyskane wartości znormalizowano względem całkowitej zawartości DNA dla każdej próbki, aby uwzględnić potencjalne różnice w liczbie komórek pomiędzy poszczególnymi wariantami. Rzeczywiście zaobserwowano niewielkie różnice w zawartości DNA między wariantami, a najmniejsza liczba komórek została odzyskana z wariantu bez dodatku czynników wzrostu (nie pokazano). Znormalizowana aktywność ALP wykazywała jednak znaczne różnice między wariantami, z tendencją do wzrostu aktywności przy wyższych stężeniach BMP-2 i osiągnięciem plateau przy 100 ng/mL (Rycina 4A,B). Najniższe poziomy aktywności odnotowano dla wariantu zawierającego 50 ng/mL FGF-2. Choć podobne trendy zaobserwowano dla obu ocenianych punktów czasowych, wszystkie wartości znacząco wzrosły w czasie hodowli od 4. do 7. dnia. Oprócz analizy ilościowej aktywność ALP można było zwizualizować jakościowo za pomocą bezpośredniego barwienia kolorystycznego opartego na konwersji substratu BCIP/NBT. W obecności BMP-2 zaobserwowano bardziej rozległe i intensywniejsze fioletowe barwienie w porównaniu do FGF-2 (Rycina 4C).
Aby zademonstrować dwa potencjalne zastosowania scharakteryzowanych nisz osteogennych, przeprowadzono badanie typu proof-of-concept dotyczące wrażliwości na lek oraz kokultury nowotworowe. W teście wrażliwości na lek do pożywki hodowlanej zawierającej świeży BMP-2 dodano bevacizumab lub roztwór kontrolny składający się z rozpuszczalnika formulacji bevacizumabu. W 4. dniu, gdy w obecności 50 ng/mL BMP-2 utworzyły się ugruntowane sieci, podczas rutynowej wymiany pożywki dodano albo roztwór kontrolny, albo pożywkę zawierającą bevacizumab, a hodowle monitorowano za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Dodanie 10 µg/mL bevacizumabu doprowadziło do retrakcji lub ablacji wcześniej utworzonej sieci, podczas gdy w warunkach kontrolnych 2 dni po wymianie pożywki nadal występowały rozległe sieci (Rycina 5A,B). Zmiany te można było również ilościowo ocenić, śledząc całkowitą długość sieci za pomocą narzędzia Angiogenesis Analyzer dla ImageJ na obrazach fluorescencyjnych pozyskiwanych codziennie (Rycina 5C). Alternatywnie, bevacizumab lub jakikolwiek inny związek można dodać od początku kokultury, aby ocenić ich wpływ na tworzenie sieci. W przypadku bevacizumabu całkowicie zahamowało to tworzenie się sieci śródbłonkowych (nie pokazano).
W drugim zastosowaniu do 4-dniowych kokultur dodano komórki raka piersi MDA-MB-231 lub komórki osteosarcoma U2OS z gęstością 1,5 x 103 komórek/dołek w świeżej pożywce hodowlanej zawierającej 50 ng/mL BMP-2. Aby odróżnić je od oznakowanych GFP HUVEC oraz nieoznakowanych hBM-MSC, komórki nowotworowe inkubowano z barwnikiem CellTrace FarRed bezpośrednio przed wysianiem na nisze osteogenne. Hodowle monitorowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; początkowo większość komórek nowotworowych lokalizowała się w pobliżu powierzchni podłoża, lecz po 2 dniach można je było znaleźć w bliższym sąsiedztwie warstw zawierających kokultury naczyniowe. W związku z tym dzień 2 wybrano jako punkt wyjściowy dla mikroskopii time-lapse, aby zobrazować dynamikę oddziaływań między komórkami nowotworowymi a komórkami w obrębie niszy naczyniowej. Co ciekawe, zaobserwowano, że komórki MDA-MB-231 zarówno zbliżały się, jak i oddalały od struktur śródbłonkowych, co sugeruje, że mogły one badać lub przebudowywać swoje otoczenie (Rycina 5D). Dzięki zastosowaniu CellTrace FarRed jako markera komórek nowotworowych, GFP jako markera HUVEC oraz dodatkowemu barwieniu na F-aktynę, wszystkie typy komórek można było rozróżnić przy użyciu konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej (Rycina 5E).
<img alt="Schemat 3D kokultury stromalno-śródbłonkowej; mikroskopia dla odkładania ECM; analiza sieci śródbłonkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Proste podejście do niezawodnej generacji unaczynionych nisz osteogennych. Wstępnie odlane syntetyczne hydrożele z gradientem sztywności w głąb umożliwiają tworzenie kultur 3D poprzez sekwencyjne wysiewanie komórek bez konieczności bezpośredniej enkapsulacji. hBM-MSCs są hodowane wstępnie przez 3 dni przed dodaniem HUVECs wykazujących ekspresję GFP. Kultury są monitorowane poprzez podłużną akwizycję sygnałów w polu jasnym oraz sygnałów GFP. W wybranych punktach czasowych nisze są dodatkowo oceniane pod kątem odkładania ECM oraz stanu osteogennego. Aktywność fosfatazy alkalicznej ocenia się za pomocą bezpośredniego barwienia kolorystycznego oraz poprzez odzyskiwanie komórek z nisz i przeprowadzanie testu pNPP na lizatach komórkowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Angiogeneza in vitro, obrazy mikroskopowe, wykresy; wpływ FGF-2 i BMP-2 na HUVEC w ciągu 6 dni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Stymulacja sieci przypominających naczynia krwionośne za pomocą FGF-2 lub BMP-2. (A) Obrazy w polu jasnym i fluorescencyjne (GFP) wykonano w 2., 4. i 6. dniu kokultury komórek hodowanych bez czynników wzrostu lub w obecności FGF-2 lub BMP-2, oba w stężeniu 50 ng/mL. Pasek skali: 400 µm. (B-D) Ilościowe parametry sieci GFP-HUVEC obrazowanych w 4. dniu kokultury, analizowane przy użyciu narzędzia Angiogenesis Analyzer dla ImageJ. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą programu GraphPad Prism 9.5.1. Zastosowano zwykłą jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z testem wielu porównań Dunnetta przy n ≥ 4; * P &lt; 0,05; ** P &lt; 0,01; *** P &lt; 0,001. (E) Rekonstrukcje trójwymiarowe wygenerowane ze stosów konfokalnych (całkowita wysokość: 547,5 µm; krok z: 2,5 µm) sygnałów GFP i aktyny F dla warunków stymulowanych FGF-2 (górny rząd) i BMP-2 (dolny rząd). Pasek skali: 300 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna macierzy komórkowych w traktowaniach FGF-2 i BMP-2; analiza ECM, kolagenu i białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Indukcja rozproszonego rozprzestrzeniania się hBM-MSC i depozycji ECM przez BMP-2. (A-C) 7-dniowe kokultury hodowane w obecności FGF-2 lub BMP-2 poddano (A) immunofluorescencji lub (B,C) bezpośredniemu barwieniu kolorystycznemu. (A) Kultury barwiono pod kątem obecności F-aktyny oraz białek ECM: fibronektyny, lamininy, kolagenu I i kolagenu IV. Obrazy przedstawiają maksymalne projekcje intensywności stosów konfokalnych (całkowita wysokość: 100 µm; krok z: 5 µm). Pasek skali: 200 µm. (B,C) Kultury barwiono przy użyciu (B) Picrosirius Red oraz (C) Alizarin Red. Górny rząd przedstawia zszyte panoramy całych studni uzyskane przy powiększeniu 2,5x (pasek skali: 1 000 µm), natomiast dolny rząd przedstawia jedno pole widzenia uzyskane przy powiększeniu 5x (pasek skali: 400 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy i wyniki mikroskopowe analizy normalizacji ALP czynnikami wzrostu FGF-2 i BMP-2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Ocena biochemiczna aktywności ALP indukowanej przez BMP-2 za pomocą bezpośredniego barwienia kolorystycznego. (A,B) Aktywność ALP określono w lizatach komórkowych kultur hodowlanych w obecności czynników wzrostu: bez czynników wzrostu, w obecności BMP-2 w różnych stężeniach lub FGF-2 w stężeniu 50 ng/mL przez (A) 4 dni lub (B) 7 dni współhodowli. Aktywność ALP przedstawiono po normalizacji do zawartości DNA każdej próbki lizatu. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. Analizę statystyczną wykonano przy użyciu programu GraphPad Prism 9.5.1. Przeprowadzono jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z testem wielokrotnych porównań Dunnetta przy n = 5; **** P &lt; 0.0001. (C) Bezpośrednie barwienie kolorystyczne aktywności ALP w niszach hodowanych w obecności 50 ng/mL FGF-2 lub BMP-2 przez 7 dni współhodowli. Obrazy po lewej stronie przedstawiają złożone panoramy całych studni uzyskane przy powiększeniu 2,5x (pasek skali: 1 000 µm), natomiast obrazy po prawej stronie przedstawiają jedno pole widzenia uzyskane przy powiększeniu 5x (pasek skali: 400 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig04large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Badanie hamowania angiogenezy; mikroskopia fluorescencyjna; GFP-HUVECs; efekt bevacizumabu; test nowotworowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Wykorzystanie osteogennych, unaczynionych nisz w zaawansowanych modelach nowotworowych. (A) Sygnały GFP z kultur hodowanych w obecności BMP-2 obrazowano w 4. dniu współhodowli przed dodaniem roztworu kontrolnego (lewo) lub bevacizumabu w stężeniu 10 µg/mL (prawo) na okres 2 dni, po czym kultury obrazowano ponownie (6. dzień współhodowli). Pasek skali: 600 µm. (B) Przedstawiono obrazy przy większym powiększeniu kultur traktowanych bevacizumabem pokazanych w A. Pasek skali: 250 µm. (C) Całkowitą długość sieci endotelialnych pokazanych w A ilościowo określono za pomocą wtyczki Angiogenesis Analyzer dla ImageJ na podstawie obrazów pozyskiwanych codziennie; n ≥ 3. (D) Komórki raka piersi MDA-MB-231 znakowane CellTrace FarRed dodano do 4-dniowych współhodowli hodowanych w obecności BMP-2, a obrazy time-lapse pozyskiwano zaczynając od 2 dni po dodaniu komórek nowotworowych. Pasek skali: 100 µm. (E) Maksymalne projekcje intensywności stosów konfokalnych (całkowita wysokość: 70 µm; krok z: 2,4 µm) potrójnych współhodowli przygotowanych zgodnie z opisem w D, utrwalonych i barwionych na F-aktynę. Lewo: nisze zawierające komórki raka piersi MDA-MB-231; prawo: nisze zawierające komórki osteosarcoma U2OS. Paski skali dla obrazów po lewej: 200 µm; paski skali dla obrazów po prawej: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Model in vitro niszy naczyniowej szpiku kostnego jest tworzony przez wysiewanie komórek mezenchymalnych i śródbłonka na prefabrykowane hydrożele PEG 3D. Sieci śródbłonka, komponenty ECM i aktywność ALP w niszach różnią się w zależności od zastosowanego czynnika wzrostu. Platforma może być wykorzystywana do zaawansowanych modeli nowotworów.

Proste utworzenie unaczynionej niszy osteogennej szpiku kostnego za pomocą prefabrykowanych hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) w mikropłytce do obrazowania

The bone and bone marrow are highly vascularized and structurally complex organs, and are sites for cancer and metastasis formation. In vitro models ...

Większość badań nad unaczynieniem in vitro wykorzystuje matryce pochodzenia naturalnego. Chociaż zazwyczaj bardzo dobrze przewodzą procesom biologicznym, ich nieodłączna aktywność biologiczna komplikuje badanie wpływu pojedynczych parametrów. Tu. Możemy selektywnie dodawać interesujących nas graczy i oceniać, jak zmienia się system.Sekwencyjne wysiewanie komórek na naszych syntetycznych hydrożelach z czystych łupków umożliwia tworzenie bardzo zdefiniowanych nisz. Tutaj hBM-MSC kolonizują hydrożele i odkładają swoją nieodłączną macierz zewnątrzkomórkową. Stanowi to podłoże dla następnie wysianych komórek śródbłonka.Ta funkcja nie jest powszechnie spotykana w innych modelach 3D in vitro. Możliwość sekwencyjnego dodawania różnych typów komórek pozwala na tworzenie wysokoprzepustowych, kompatybilnych modeli in vitro o dużej złożoności. Modele te można dostosować do generowania bardziej specyficznych nisz unaczynionych osteogennie oraz do badania funkcji graczy komórkowych i molekularnych.Na początek weź probówkę hBM-MSC i zagnieźdź je przez odwirowanie. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości podłoża podstawowego. Następnie należy przygotować stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml zawierające wymaganą objętość podłoża podstawowego, uzupełnione odpowiednimi czynnikami wzrostu.Na koniec dodać hBM-MSCs z roztworu podstawowego w rozcieńczeniu 1:66, 67, aby uzyskać stężenie 1,5 x 10^5 komórek na ml. Usuń polipropylenową folię samoprzylepną pokrywającą 96-dołkową płytkę hydrożelową, aby wysiać płytkę. Ostrożnie zassać bufor magazynowy przykrywający hydrożele, umieszczając końcówkę aspiratora przy ścianie studzienki i powoli przesuwając się w kierunku krawędzi studzienki wewnętrznej.Podczas wysiewu należy okresowo mieszać zawiesinę komórkową, aby utrzymać jednorodną mieszaninę i dodawać 200 l zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki. Następnie utrzymuj kultury w temperaturze 37 C i 5% dwutlenku węgla w wilgotnej atmosferze. Alternatywnie można użyć automatycznej myjki do płyt z dyszami zasysającymi ustawionymi co najmniej 3,8 mm od nośnika płyt w kierunku krawędzi studzienki i zassać bufor magazynowy.Wysiewać płytkę, mieszając komórki pipetą serologiczną i dozując równą liczbę komórek do dołka płytki. Monitoruj rozwój kultur za pomocą mikroskopii jasnego pola z obiektywem 5x i uzyskaj obrazy referencyjne około 30 minut po wysiewie, aby ocenić liczbę dodanych komórek. Na początek weź osad GFP-HUVEC wyhodowany do poziomu konfluencji 80 100% i ponownie zawieś komórki w odpowiedniej objętości podłoża podstawowego, aby osiągnąć stężenie 1 x 10^7 komórek na ml roztworu podstawowego.Przygotować stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml zawierające wymaganą objętość podłoża podstawowego, uzupełnione odpowiednimi czynnikami wzrostu. Dodać GFP-HUVECs z roztworu podstawowego w rozcieńczeniu 1:66, 67 do uzyskania stężenia 1,5 x 10^5 komórek na L. Następnie odessać pożywkę z płytki zawierającej monokulturę zrębu i dodać 200 l na studzienkę przygotowanej zawiesiny GFP-HUVEC. Inkubować w temperaturze 37 C w 5% dwutlenku węgla w wilgotnej atmosferze, zmieniając podłoże co trzy do czterech dni.Monitoruj rozwój kultury za pomocą mikroskopii jasnego pola i mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu obiektywu 5x. Różnice między kulturami można było zaobserwować na podstawie obrazów jasnego pola i fluorescencji, na których widoczne były tylko GFP-HUVEC. Kultury wydawały się mniej rozwinięte bez żadnego czynnika wzrostu.Szybszy rozwój zaobserwowano jednak w obecności FGF-2. W przeciwieństwie do tego, zdjęcia w jasnym polu pokazały najgęstsze kultury w obecności BMP-2. Jednak sieci naczyniowe utworzone zarówno w warunkach zawierających czynnik wzrostu, jak i najbardziej rozległe i wzajemnie połączone sieci zostały utworzone z FGF-2.Po ustaleniu kohodowli komórek śródbłonka zrębu należy uzyskać sygnał GFP z GFP-HUVEC za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z ustawieniami odpowiednimi do oceny ilościowej. Wstępnie przetwórz wszystkie obrazy zrobione tego samego dnia, aby jeszcze bardziej zwiększyć kontrast. Jeśli używasz Fiji lub ImageJ, otwórz wszystkie ulepszone obrazy kanału GFP w tym samym punkcie czasu i otwórz menu jasności i kontrastu.Wybierz obraz reprezentujący stan pośredni i automatycznie dostosuj kontrast, wybierając opcję auto. Kliknij ustaw i zaznacz opcję propaguj do wszystkich innych otwartych obrazów. Oceń wizualnie, czy automatycznie wybrany zakres pasuje do wszystkich obrazów bieżącego punktu czasowego.W razie potrzeby ręcznie dostosuj i ponownie propaguj zakres do wszystkich obrazów, a następnie zapisz dopasowane obrazy jako pliki TIFF. Następnie zastosuj filtr rozmycia mediany do wszystkich obrazów. Zmniejsz ich rozmiar, łącząc je w kategoryzację i zapisz jako pliki TIFF kolorów RGB w skali szarości w folderze w celu określenia ilościowego.Można to zrobić ręcznie lub w trybie wsadowym za pomocą makr. Przeanalizuj wszystkie utworzone obrazy przy użyciu trybu procesu wsadowego w analizatorze angiogenezy dla ImageJ. Następnie zweryfikuj wyniki kwantyfikacji, badając nakładki rozpoznanych struktur i oryginalnych obrazów.Dostosuj parametry przetwarzania wstępnego, ponownie przeanalizuj oryginalne obrazy lub wyklucz problematyczne obszary, jeśli algorytm wykryje sztuczne struktury z niewielką liczbą komórek widocznych na oryginalnym obrazie lub bez nich. Na koniec znormalizuj uzyskane wartości do obszaru 1 mm kwadratowego, mnożąc wartości każdej próbki przez stosunek analizowanego obszaru do 1 mm kwadratowego. Ilościowe parametry sieci GFP-HUVECs wykazały, że całkowita długość sieci była największa w obecności FGF-2 i najniższa przy braku czynników wzrostu.Liczba węzłów wskazujących punkty rozgałęzień w sieciach wykazywała tę samą tendencję, co długość całkowita. I odwrotnie, oba czynniki wzrostu charakteryzowały się znacznie mniejszą liczbą izolowanych segmentów, co wskazuje na wyższe wzajemne powiązania niż w przypadku stanu bez żadnego czynnika wzrostu. Na początek weź wspólną hodowlę hBM-MSCs i GFP-HUVEC i przemyj raz 200 l na studzienkę PBS.Dodać roztwór substratu BCIP/NBT i inkubować kultury w temperaturze 37 °C, okresowo monitorując rozwój koloru. Gdy kolor rozwinie się w warunkach nieosteogennych, natychmiast przemyj 200 l na studzienkę PBS. Po utrwaleniu próbek w 4% paraformaldehydzie, uzyskaj kolorowe obrazy barwionych próbek.Aby określić ilościowo aktywność ALP w lizatach komórkowych, dodaj 200 l na studzienkę 0,25% trypsyny EDTA do kultur przemytych PBS i inkubuj w temperaturze 37 C. Mieszaj kultury co 10 minut, energicznie pipetując w górę iw dół, aby ułatwić trawienie i monitorować morfologię kultury za pomocą standardowego mikroskopu do hodowli komórkowych. Następnie przenieś próbki do probówek o pojemności 2 ml i dodaj 200 l pożywki podstawowej z mezenchymalnych komórek macierzystych w celu zahamowania trypsyny. Po odwirowaniu i odrzuceniu supernatantu, zamrozić granulki w temperaturze 80 C lub przejść bezpośrednio do następnego etapu.Rozmrozić granulki komórek w 500 l buforu do lizy i inkubować przez 30 minut na lodzie. Następnie odwirować w temperaturze 16, 100 G przez 10 minut w temperaturze 4 °C i utrzymać próbki na lodzie. Nie naruszając żadnych granulowanych zanieczyszczeń, dozować 50 l supernatantu do każdego dołka przezroczystej 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej w dwóch egzemplarzach.Dodać 50 l przygotowanego odczynnika fosfatazy alkalicznej do studzienek 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Wstrząsnąć krótko płytką i inkubować ją w temperaturze 37 °C przez 10 minut, chroniąc przed światłem. Zatrzymaj reakcję, dodając 100 l 1 molowego wodorotlenku sodu za pomocą pipety wielokanałowej.Za pomocą czytnika płytek odczytaj gęstość optyczną przy 410 nm. W celu ilościowego określenia DNA rozmrozić zamrożone próbki, odwirować je i umieścić na lodzie. Nie naruszając żadnych granulowanych zanieczyszczeń, dozować 50 l supernatantu lizatu komórkowego do studzienek czarnej 96-dołkowej płytki w dwóch egzemplarzach.Dodaj wzorce DNA w dwóch egzemplarzach. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 l środka barwiącego DNA, a następnie inkubuj i odczytaj intensywność fluorescencji zgodnie z instrukcjami producenta. Wykorzystaj standardowe wartości krzywej, aby określić i zastosować konwersję zmierzonych wartości intensywności do stężeń DNA.Na koniec znormalizuj wartości fosfatazy alkalicznej, dzieląc je przez odpowiednie stężenie DNA w każdej próbce. Kwantyfikacja aktywności fosfatazy alkalicznej w celu scharakteryzowania potencjału osteogennego kultur wykazała, że znormalizowana aktywność fosfatazy alkalicznej różniła się znacznie w zależności od warunków, z tendencją do wzrostu aktywności przy wyższych stężeniach BMP-2 i plateau na poziomie 100 ng na ml. Najniższe poziomy aktywności stwierdzono dla stanu zawierającego 50 ng na ml FGF-2.W obecności BMP-2 zaobserwowano bardziej rozległe i intensywne purpurowe zabarwienie w porównaniu z FGF-2.

simple-establishment-vascularized-osteogenic-bone-marrow-niche-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Tutaj opisujemy zoptymalizowany, wysoce powtarzalny protokół izolacji mezodermalnych komórek progenitorowych (MPC) od ludzkiego szpiku kostnego (hBM). MPC scharakteryzowano za pomocą cytometrii przepływowej i ekspresji gniazdyny. Wykazali oni zdolność do tworzenia wykładniczo rosnących kultur komórkowych podobnych do MSC, przy jednoczesnym zachowaniu ich potencjału angiogennego.

Izolowanie mezangiogennych komórek progenitorowych (MPC) z ludzkiego szpiku kostnego

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym na rusztowaniach 3D za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Angiogenezę w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniach badano w mysim modelu krytycznego ubytku kości kalwarycznej. W grupie leczonej wykryto więcej nowych naczyń krwionośnych niż w grupie kontrolnej.

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

Przedstawiono metodę tworzenia i obrazowania na żywo różnych humanizowanych nisz szpiku kostnego u myszy. W oparciu o niszę podporową utworzoną przez ludzkie komórki mezenchymalne, dodanie ludzkich komórek śródbłonka indukuje tworzenie ludzkich naczyń, podczas gdy dodanie rhBMP-2 indukuje tworzenie chimerycznej tkanki kostnej ludzko-mysi.

Bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo

Model kostnoszkieletowego mięsaka (BEM) dla kostniakomięsaka (OS) jest dobrze znany i pokazany tutaj. Może być używany jako odpowiednie rusztowanie do naśladowania wzrostu guza pierwotnego in vitro i stanowi idealny model do badania histologicznej i cytogennej heterogeniczności OS.

Trójwymiarowy model macierzy zewnątrzkomórkowej kości dla kostniakomięsaka

Ten protokół opisuje technikę druku 3D polegającą na wytwarzaniu struktur przypominających kości poprzez umieszczanie tuszu fosforanu wapnia w granulowanym podłożu na bazie żelatyny. Wydrukowane analogi kości są osadzane w dowolnym kształcie, z elastycznością umożliwiającą bezpośrednie zbieranie odcisku lub sieciowanie w żywej macierzy komórkowej w celu uzyskania konstruktów wielofazowych.

Ceramiczny biodruk dookólny w zawiesinach komórkowych do wytwarzania analogów kostnych

Tutaj ustanowiliśmy in vivo osteo-organoidy uruchamiane przez morfogenetyczne rusztowania żelatynowe z białkiem 2 w celu pobrania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych w celu odbudowy uszkodzonego układu krwiotwórczego i odpornościowego. Ogólnie rzecz biorąc, takie podejście może stanowić obiecujące źródło komórek w terapiach komórkowych.

Podejście osteoorganoidowe in vivo do pozyskiwania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych

Ten protokół opisuje wytwarzanie 3D konstrukcji kostnych z wykorzystaniem ludzkich osteocytów osadzanych w żelach metacrylanowych żelatyny (GelMA) uzupełnionych o decelularyzowaną macierz pozakomórkową. Metoda ta jest nisko kosztowa, skalowalna i kompatybilna z podstawowym sprzętem laboratoryjnym, zapewniając platformę translacyjną do badania procesów chorobowych układu mięśniowo-szkieletowego.

Platforma hodowli kości 3D z wykorzystaniem ludzkich osteocytów i decellularyzowanej macierzy pozakomórkowej do modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego

Poniższy protokół dostarcza techniki kapsułkowania komórek β trzustki w hydrożelach peptydowych PEG powstałych w wyniku reakcji fotoklikania tiolowo-enowego. Ta platforma materiałowa nie tylko oferuje cytokompatybilne mikrośrodowisko do enkapsulacji komórek, ale także umożliwia kontrolowane przez użytkownika szybkie odzyskiwanie struktur komórkowych utworzonych w hydrożelach.

Wytwarzanie i odzyskiwanie sferoid β-komórkowych z hydrożeli peptydowych PEG o skokowym wzroście

Do tej pory, grube ubytki tkanek są zazwyczaj rekonstruowane za pomocą autologicznych płatów tkankowych lub tkanek zmodyfikowanych. W niniejszym protokole przedstawiamy nową metodę inżynierii unaczynionego płata tkankowego z autologiczną szypułką, która ma służyć jako substytut płatów autologicznych.

Zaprojektowana unaczyniona płat mięśniowa

Samoorganizujące się kompleksy polielektrolitowe (PEC) wykonane z heparyny i protaminy zostały osadzone na kulkach alginianowych, aby uwięzić i regulować uwalnianie osteogennych czynników wzrostu. Ta strategia dostarczania umożliwia 20-krotne zmniejszenie dawki BMP-2 w zastosowaniach związanych z usztywnieniem kręgosłupa. Niniejszy artykuł ilustruje korzyści płynące z zastosowania PEC i jego wytwarzanie.

Kompleks polielektrolitowy do dostarczania osteogennego czynnika wzrostu w domenie wiążącej heparynę

Poznaj metodę tworzenia unaczynionej niszy osteogennej szpiku kostnego z wykorzystaniem hydrożeli PEG i sekwencyjnego nasiewania komórek. Model ten umożliwia badanie interakji komórkowych oraz wpływu czynników wzrostu na rozwój sieci naczyniowej.

Proste utworzenie unaczynionej niszy osteogennej szpiku kostnego za pomocą prefabrykowanych hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) w mikropłytce do obrazowania (Wideo) | JoVE Journal

Proste utworzenie unaczynionej niszy osteogennej szpiku kostnego za pomocą prefabrykowanych hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) w mikropłytce do obrazowania

Przeglądaj więcej filmów