Proste utworzenie unaczynionej niszy osteogennej szpiku kostnego za pomocą prefabrykowanych hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) w mikropłytce do obrazowania

Większość badań nad unaczynieniem in vitro wykorzystuje matryce pochodzenia naturalnego. Chociaż zazwyczaj bardzo dobrze przewodzą procesom biologicznym, ich nieodłączna aktywność biologiczna komplikuje badanie wpływu pojedynczych parametrów. Tu. Możemy selektywnie dodawać interesujących nas graczy i oceniać, jak zmienia się system.

Sekwencyjne wysiewanie komórek na naszych syntetycznych hydrożelach z czystych łupków umożliwia tworzenie bardzo zdefiniowanych nisz. Tutaj hBM-MSC kolonizują hydrożele i odkładają swoją nieodłączną macierz zewnątrzkomórkową. Stanowi to podłoże dla następnie wysianych komórek śródbłonka.

Ta funkcja nie jest powszechnie spotykana w innych modelach 3D in vitro. Możliwość sekwencyjnego dodawania różnych typów komórek pozwala na tworzenie wysokoprzepustowych, kompatybilnych modeli in vitro o dużej złożoności. Modele te można dostosować do generowania bardziej specyficznych nisz unaczynionych osteogennie oraz do badania funkcji graczy komórkowych i molekularnych.

Na początek weź probówkę hBM-MSC i zagnieźdź je przez odwirowanie. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości podłoża podstawowego. Następnie należy przygotować stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml zawierające wymaganą objętość podłoża podstawowego, uzupełnione odpowiednimi czynnikami wzrostu.

Na koniec dodać hBM-MSCs z roztworu podstawowego w rozcieńczeniu 1:66, 67, aby uzyskać stężenie 1,5 x 10^5 komórek na ml. Usuń polipropylenową folię samoprzylepną pokrywającą 96-dołkową płytkę hydrożelową, aby wysiać płytkę. Ostrożnie zassać bufor magazynowy przykrywający hydrożele, umieszczając końcówkę aspiratora przy ścianie studzienki i powoli przesuwając się w kierunku krawędzi studzienki wewnętrznej.

Podczas wysiewu należy okresowo mieszać zawiesinę komórkową, aby utrzymać jednorodną mieszaninę i dodawać 200 l zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki. Następnie utrzymuj kultury w temperaturze 37 C i 5% dwutlenku węgla w wilgotnej atmosferze. Alternatywnie można użyć automatycznej myjki do płyt z dyszami zasysającymi ustawionymi co najmniej 3,8 mm od nośnika płyt w kierunku krawędzi studzienki i zassać bufor magazynowy.

Wysiewać płytkę, mieszając komórki pipetą serologiczną i dozując równą liczbę komórek do dołka płytki. Monitoruj rozwój kultur za pomocą mikroskopii jasnego pola z obiektywem 5x i uzyskaj obrazy referencyjne około 30 minut po wysiewie, aby ocenić liczbę dodanych komórek. Na początek weź osad GFP-HUVEC wyhodowany do poziomu konfluencji 80 100% i ponownie zawieś komórki w odpowiedniej objętości podłoża podstawowego, aby osiągnąć stężenie 1 x 10^7 komórek na ml roztworu podstawowego.

Przygotować stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml zawierające wymaganą objętość podłoża podstawowego, uzupełnione odpowiednimi czynnikami wzrostu. Dodać GFP-HUVECs z roztworu podstawowego w rozcieńczeniu 1:66, 67 do uzyskania stężenia 1,5 x 10^5 komórek na L. Następnie odessać pożywkę z płytki zawierającej monokulturę zrębu i dodać 200 l na studzienkę przygotowanej zawiesiny GFP-HUVEC. Inkubować w temperaturze 37 C w 5% dwutlenku węgla w wilgotnej atmosferze, zmieniając podłoże co trzy do czterech dni.

Monitoruj rozwój kultury za pomocą mikroskopii jasnego pola i mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu obiektywu 5x. Różnice między kulturami można było zaobserwować na podstawie obrazów jasnego pola i fluorescencji, na których widoczne były tylko GFP-HUVEC. Kultury wydawały się mniej rozwinięte bez żadnego czynnika wzrostu.

Szybszy rozwój zaobserwowano jednak w obecności FGF-2. W przeciwieństwie do tego, zdjęcia w jasnym polu pokazały najgęstsze kultury w obecności BMP-2. Jednak sieci naczyniowe utworzone zarówno w warunkach zawierających czynnik wzrostu, jak i najbardziej rozległe i wzajemnie połączone sieci zostały utworzone z FGF-2.

Po ustaleniu kohodowli komórek śródbłonka zrębu należy uzyskać sygnał GFP z GFP-HUVEC za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z ustawieniami odpowiednimi do oceny ilościowej. Wstępnie przetwórz wszystkie obrazy zrobione tego samego dnia, aby jeszcze bardziej zwiększyć kontrast. Jeśli używasz Fiji lub ImageJ, otwórz wszystkie ulepszone obrazy kanału GFP w tym samym punkcie czasu i otwórz menu jasności i kontrastu.

Wybierz obraz reprezentujący stan pośredni i automatycznie dostosuj kontrast, wybierając opcję auto. Kliknij ustaw i zaznacz opcję propaguj do wszystkich innych otwartych obrazów. Oceń wizualnie, czy automatycznie wybrany zakres pasuje do wszystkich obrazów bieżącego punktu czasowego.

W razie potrzeby ręcznie dostosuj i ponownie propaguj zakres do wszystkich obrazów, a następnie zapisz dopasowane obrazy jako pliki TIFF. Następnie zastosuj filtr rozmycia mediany do wszystkich obrazów. Zmniejsz ich rozmiar, łącząc je w kategoryzację i zapisz jako pliki TIFF kolorów RGB w skali szarości w folderze w celu określenia ilościowego.

Można to zrobić ręcznie lub w trybie wsadowym za pomocą makr. Przeanalizuj wszystkie utworzone obrazy przy użyciu trybu procesu wsadowego w analizatorze angiogenezy dla ImageJ. Następnie zweryfikuj wyniki kwantyfikacji, badając nakładki rozpoznanych struktur i oryginalnych obrazów.

Dostosuj parametry przetwarzania wstępnego, ponownie przeanalizuj oryginalne obrazy lub wyklucz problematyczne obszary, jeśli algorytm wykryje sztuczne struktury z niewielką liczbą komórek widocznych na oryginalnym obrazie lub bez nich. Na koniec znormalizuj uzyskane wartości do obszaru 1 mm kwadratowego, mnożąc wartości każdej próbki przez stosunek analizowanego obszaru do 1 mm kwadratowego. Ilościowe parametry sieci GFP-HUVECs wykazały, że całkowita długość sieci była największa w obecności FGF-2 i najniższa przy braku czynników wzrostu.

Liczba węzłów wskazujących punkty rozgałęzień w sieciach wykazywała tę samą tendencję, co długość całkowita. I odwrotnie, oba czynniki wzrostu charakteryzowały się znacznie mniejszą liczbą izolowanych segmentów, co wskazuje na wyższe wzajemne powiązania niż w przypadku stanu bez żadnego czynnika wzrostu. Na początek weź wspólną hodowlę hBM-MSCs i GFP-HUVEC i przemyj raz 200 l na studzienkę PBS.

Dodać roztwór substratu BCIP/NBT i inkubować kultury w temperaturze 37 °C, okresowo monitorując rozwój koloru. Gdy kolor rozwinie się w warunkach nieosteogennych, natychmiast przemyj 200 l na studzienkę PBS. Po utrwaleniu próbek w 4% paraformaldehydzie, uzyskaj kolorowe obrazy barwionych próbek.

Aby określić ilościowo aktywność ALP w lizatach komórkowych, dodaj 200 l na studzienkę 0,25% trypsyny EDTA do kultur przemytych PBS i inkubuj w temperaturze 37 C. Mieszaj kultury co 10 minut, energicznie pipetując w górę iw dół, aby ułatwić trawienie i monitorować morfologię kultury za pomocą standardowego mikroskopu do hodowli komórkowych. Następnie przenieś próbki do probówek o pojemności 2 ml i dodaj 200 l pożywki podstawowej z mezenchymalnych komórek macierzystych w celu zahamowania trypsyny. Po odwirowaniu i odrzuceniu supernatantu, zamrozić granulki w temperaturze 80 C lub przejść bezpośrednio do następnego etapu.

Rozmrozić granulki komórek w 500 l buforu do lizy i inkubować przez 30 minut na lodzie. Następnie odwirować w temperaturze 16, 100 G przez 10 minut w temperaturze 4 °C i utrzymać próbki na lodzie. Nie naruszając żadnych granulowanych zanieczyszczeń, dozować 50 l supernatantu do każdego dołka przezroczystej 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej w dwóch egzemplarzach.

Dodać 50 l przygotowanego odczynnika fosfatazy alkalicznej do studzienek 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Wstrząsnąć krótko płytką i inkubować ją w temperaturze 37 °C przez 10 minut, chroniąc przed światłem. Zatrzymaj reakcję, dodając 100 l 1 molowego wodorotlenku sodu za pomocą pipety wielokanałowej.

Za pomocą czytnika płytek odczytaj gęstość optyczną przy 410 nm. W celu ilościowego określenia DNA rozmrozić zamrożone próbki, odwirować je i umieścić na lodzie. Nie naruszając żadnych granulowanych zanieczyszczeń, dozować 50 l supernatantu lizatu komórkowego do studzienek czarnej 96-dołkowej płytki w dwóch egzemplarzach.

Dodaj wzorce DNA w dwóch egzemplarzach. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 l środka barwiącego DNA, a następnie inkubuj i odczytaj intensywność fluorescencji zgodnie z instrukcjami producenta. Wykorzystaj standardowe wartości krzywej, aby określić i zastosować konwersję zmierzonych wartości intensywności do stężeń DNA.

Na koniec znormalizuj wartości fosfatazy alkalicznej, dzieląc je przez odpowiednie stężenie DNA w każdej próbce. Kwantyfikacja aktywności fosfatazy alkalicznej w celu scharakteryzowania potencjału osteogennego kultur wykazała, że znormalizowana aktywność fosfatazy alkalicznej różniła się znacznie w zależności od warunków, z tendencją do wzrostu aktywności przy wyższych stężeniach BMP-2 i plateau na poziomie 100 ng na ml. Najniższe poziomy aktywności stwierdzono dla stanu zawierającego 50 ng na ml FGF-2.

W obecności BMP-2 zaobserwowano bardziej rozległe i intensywne purpurowe zabarwienie w porównaniu z FGF-2.