Działanie adiuwantowe Mycobacterium paratuberculosis w zwiększaniu immunogenności autoantygenów podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Badaliśmy patogenezę kilku chorób neurologicznych za pomocą nowych technik opracowanych przez naszych ekspertów w celu poprawy leczenia pacjentów z zaburzeniami ruchowymi, którzy są chorobami interaktywnymi. Część naszych badań koncentruje się na roli patogenów w etiologii nowych chorób zapalnych, takich jak stwardnienie rozsiane czy NMOSD, które charakteryzują się złożoną wzajemną oddziaływaniem czynników genetycznych i środowiskowych. Z tymi chorobami wiąże się różne patogeny, chociaż ich rola jest niejasna.

Odkryliśmy, że antygenowe składniki paratuberkulozy gatunków Mycobacterium avion cell mogą wywoływać silną odpowiedź ramienną i komórkową u pacjenta ze skoliozą mnogą. Ponadto wykazaliśmy, że prątki zapewniają potencjał encefalitogenny, działając na oś immunologiczną jelitowo-mózgową w modelu EAE. Zidentyfikowaliśmy Mycobacterium paratuberculosis jako silnego kandydata na adiuwant w indukcji aktywnego EAE, co skutkowało cięższą chorobą niż ta wywołana przez inaktywowaną gruźlicę drobnoustrojową.

Różnica ta może wynikać z tego, że Mycobacterium paratuberculosis wytwarza antygen lipopentapeptydowy na powierzchni ściany komórkowej zamiast lipidów glikopeptydowych. Cóż, celem naszych przyszłych badań jest wzajemne oddziaływanie między odpowiedzią immunologiczną obwodowego i ośrodkowego układu nerwowego oraz zrozumienie mechanizmu zapalenia nerwów za pośrednictwem infekcji. W tym celu opracowywaliśmy unikalny model genetyczny zapalenia nerwów.

Zacznij od hodowli szczepu Mycobacterium paratuberculosis K10 w kolbach T25 zawierających wzbogaconą pożywkę przez dwa tygodnie w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Regularnie oceniaj wzrost kolonii poprzez oględziny. Hodować 200 mililitrów kultury wzbogacającej w 500-mililitrowej kolbie Erlenmeyera w inkubatorze z wytrząsaniem przez tydzień.

Umieść zawiesiny bakteryjne w temperaturze 70 stopni Celsjusza na pięć do 10 minut, aby je dezaktywować, i odwiruj je w temperaturze 3 000 G przez 10 minut. Umyj granulki w 20 mililitrach PBS dwukrotnie i odwiruj zawiesinę. Przenieś granulat do sterylnego pojemnika i zamroź go ciekłym azotem.

Zamrożony granulat należy natychmiast przenieść do komory liofilizatora. Po liofilizacji przenieś go na ławkę do czyszczenia biologicznego. Za pomocą szpatułki ze stali nierdzewnej usuń wysuszone grudki MAP, przylegające do wewnętrznych ścianek pojemnika, i sproszkowaj je na drobny proszek.

Zważyć sproszkowane komórki i ręcznie umieścić je w aseptycznej fiolce o pojemności 10 mililitrów. Zacznij od zmielenia 10 miligramów liofilizowanego Mycobacterium paratuberculosis na drobny proszek za pomocą moździerza i tłuczka. Dodać pięć mililitrów niekompletnego adiuwanta Freunda, aby uzyskać 10 miligramów na mililitr roztworu podstawowego.

Przechowuj wywar w temperaturze minus czterech stopni Celsjusza. Przed szczepieniem rozcieńczyć roztwór podstawowy. Następnie rozcieńczyć peptyd MOG 35-55 do dwóch miligramów na mililitr i przechowywać go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Wymieszać równe objętości MOG 35-55 z adiuwantem w pięciomililitrowej probówce z homogenizatorem, aż do uzyskania gęstej emulsji. Po każdych 10 sekundach mieszania umieść roztwór na lodzie na 20 sekund i zakręć rurką, aby odzyskać cały roztwór. Przenieś emulsję do jednomililitrowej strzykawki, upewniając się, że jest wolna od pęcherzyków powietrza, a następnie wyposaż ją w igłę o rozmiarze 27.

Podskórnie wstrzyknąć 200 mikrolitrów emulsji w dolną część pleców znieczulonej myszy. Następnie wstrzyknąć dootrzewnowo dawkę toksyny krztuścowej w dniu zero i dwa po szczepieniu. Wszystkie myszy wykazywały ostrą chorobę monofazową charakteryzującą się pojedynczym szczytem niepełnosprawności obserwowanym po 14 do 17 dniach, po którym następowało częściowe ustąpienie objawów w ciągu następnych 10 dni.

Myszy zaszczepione M. paratuberculosis wykazywały wcześniejszy początek po szczepieniu i większe nasilenie w ostrej fazie. Obie grupy wykazywały podobną masę ciała. Test proliferacji z miareczkowaną inkorporacją tymidyny przeprowadzony na komórkach śledziony myszy EAE wykazał silną odpowiedź proliferacyjną na peptyd MOG 35-55, ale nie na albuminę jaja kurzego.

Analiza cytofluorometryczna wykazała zwiększoną liczbę limfocytów T, komórek dendrytycznych i monocytów w śledzionie myszy EAE uodpornionych na M. paratuberculozę w porównaniu z myszami zaszczepionymi CFA. Analiza tkanek hematoksyliny i eozyny ujawniła typowy jednojądrzasty naciek zapalny w mózgu i rdzeniu kręgowym w obrębie naczyń naczyniowych i opon mózgowych.