Name: Noworodkowy heterotopowy model przeszczepu serca szczura do badania przejścia ze śródbłonka do mezenchymów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Poznaj model przeszczepu serca szczura do badania endocardial fibroelastosis i przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego. Ta metoda pozwala analizować mechanizmy fibrozy oraz testować nowe strategie terapeutyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Dodatkowe Przedsięwzięcia - Fundusz Badawczy Pojedynczej Komory (SVRF) i Fundusz Ekspansji Pojedynczej Komory (do I.F.) oraz stypendium Marietty Blau od OeAD-GmbH ze środków dostarczonych przez Austriackie Federalne Ministerstwo Edukacji, Nauki i Badań BMBWFC (do G.G.).

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z National Research Council. 2011. Przewodnik dotyczący opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych: wydanie ósme. Protokoły dotyczące zwierząt zostały przejrzane i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie.
Przed operacją wszystkie narzędzia chirurgiczne są autoklawowane parą wodną, a zmodyfikowany bufor Krebsa-Henseleita, o końcowym stężeniu 22 mmol/L KCl, jest przygotowywany jako roztwór kardioplegiczny (Tabela 1). Roztwór jest sterylizowany filtrem i przechowywany w temperaturze 4 °C przez noc. Mikroskop chirurgiczny (12,5x) jest wymagany do zabiegu heterotopowego przeszczepu serca noworodka szczura.
1. Przygotowanie i znieczulenie
<ol>
	<li>Jako biorców należy użyć samców/samic szczurów rasy Lewis o wadze około 150 g (w wieku 5-6 tygodni).</li>
	<li>Na początek obficie ogol brzuch szczura brzytwą.</li>
	<li>Umieść szczura w komorze izofluranu i włącz przepływ tlenu z prędkością 2 l/min z 2% izofluranem, aż zwierzę zostanie prawidłowo uspokojone, ale nadal spontanicznie oddycha. Wstrzyknąć dootrzewnowo 45 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny (IP), a także 300 j./kg heparyny. Potwierdź prawidłowe znieczulenie za pomocą testu szczypania palca u nogi. 
	UWAGA: Uważnie monitoruj spontaniczny oddech i tętno poprzez badanie palpacyjne klatki piersiowej, aby zapewnić stabilny stan hemodynamiczny podczas całego procesu.</li>
	<li>Do intubacji umieść szczura na ukośnej półce (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), zabezpiecz przednie zęby sznurkiem i połóż głowę skierowaną w stronę chirurga.</li>
	<li>Umieść światło na zewnętrznej stronie szyi w okolicy strun głosowych, chwyć język dwoma palcami i lekko popchnij go w górę i w lewo, aby zapewnić optymalne widzenie podczas intubacji. Użyj kaniuli 18 G, 2 w przypadku szczura o wadze 100-150 g. Zabezpiecz rurkę dotchawiczą taśmą. 
	UWAGA: Do intubacji zalecane są lupy chirurgiczne z 3,5-krotnym powiększeniem.</li>
	<li>Podłącz kaniulę intubacyjną do respiratora dla małych zwierząt i dostosuj ustawienia zgodnie z instrukcjami producenta w zależności od wielkości zwierzęcia. 
	UWAGA: Użyj następujących ustawień dla szczura o wadze 150 g: tryb głośności; częstość oddechów, 55/min; objętość oddechowa, 1,3 ml 50 % stosunek I/E, ale w razie potrzeby można go odpowiednio dostosować. Zapewnić prawidłowy obustronny i równy ruch klatki piersiowej i podawać izofluran w sposób ciągły w stężeniu 0,5%-2% przez respirator.</li>
	<li>Umieść szczura na poduszce grzewczej (aby utrzymać normalną temperaturę ciała) w pozycji leżącej na plecach z ogonem skierowanym w stronę chirurga. Wysterylizuj brzuch trzykrotnie roztworem betadyny i 70% etanolu na przemian. Podaj smar do oczu i przykryj szczura sterylnym obłożeniem chirurgicznym, pozostawiając brzuch odkryty.</li>
</ol>
2. Przygotowanie chirurgiczne i heterotopowe przeszczepienie serca dawcy noworodka u szczura biorcy
<ol>
	<li>Wykonaj laparotomię w linii środkowej za pomocą skalpela z 15 ostrzami do nacięcia skóry i użyj nożyczek, aby otworzyć przednią ścianę brzucha, a następnie odsłonięcie aorty brzusznej zaotrzewnowej i żyły głównej dolnej (IVC) za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką.</li>
	<li>Zmobilizuj jelita (w tym okrężnicę zstępującą) i umieść je w kierunku prawego górnego kwadrantu. Przykryj jelita ciepłą gazą nasączoną solą fizjologiczną. Użyj retraktorów, aby zapewnić optymalną ekspozycję IVC i aorty brzusznej.</li>
	<li>Wykonaj rozwarstwienie IVC podnerkowego i aorty brzusznej w kierunku rozwidlenia. Podwiązać wszystkie rozgałęzione tętnice i żyły podnerkowe (np. tętnicę krezkową dolną i tętnice węzłów chłonnych) za pomocą nylonowego szwu 10-0. 
	UWAGA: Istnieje duża zmienność w anatomii tych bocznych gałęzi. Monitoruj wizualnie puls i tętno aorty, gdy nie jest dostępne żadne inne monitorowanie hemodynamiczne. Oceniaj odpowiednią głębokość znieczulenia co 15 minut za pomocą testu szczypania palców u stóp. Odpowiednio dostosować stężenie izofluranu.</li>
	<li>Po pobraniu serca dawcy od nowonarodzonego szczura, wycięte serce należy dostarczyć w sterylnych warunkach do basenu chirurgicznego zawierającego bufor Krebsa-Henseleita na pole operacyjne. Serce dawcy należy okresowo irygować lodowatym roztworem kardioplegicznym. 
	UWAGA: Gdy dostępny jest drugi chirurg, serce powinno być przygotowane w tym samym czasie, ponieważ drugi chirurg skraca całkowity czas znieczulenia zwierzęcia biorcy i czas niedokrwienia serca dawcy. Gdy drugi chirurg nie jest dostępny, należy pokryć brzuch biorcy ciepłą solą fizjologiczną i monitorować zwierzę podczas procedury zbioru.</li>
	<li>Zastosuj cztery małe atraumatyczne zaciski naczyniowe do dystalnych i proksymalnych odcinków aorty podnerkowej i IVC. W razie potrzeby tymczasowo zamknij niekorzystne naczynie nerkowe szwem jedwabnym 7-0 i zwolnij szew po zabiegu. Umieść nylonowy szew 10-0 pionowo na przedniej ścianie aorty, aby ułatwić aortomię. Wykonaj aortotomię z dwoma małymi poziomymi cięciami (w kształcie klina) za pomocą mikronożyczek, lekko pociągając szew do góry. 
	UWAGA: W celu usunięcia wszelkich skrzepów krwi zaleca się przepłukanie światła aorty heparynizowaną solą fizjologiczną.</li>
	<li>Umieść serce dawcy po lewej stronie (z perspektywy zwierzęcia) aorty i zabezpiecz aortę podnerkową biorcy i aortę wstępującą dawcy koniec do boku w pozycjach godziny 12 i 6 aortomii za pomocą szwów. Kontynuuj z trzecim i czwartym szwem w pozycji godziny 3 i 9, delikatnie przerzucając serce na prawą stronę aorty po trzecim szwie. Uzupełnij zespolenie tętnicze, dodając jeden lub dwa szwy do każdej przestrzeni. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby podczas tworzenia zespolenia nie dotykać kleszczami ani aorty wstępującej dawcy, ani aorty brzusznej biorcy, aby uniknąć uszkodzenia tkanek.</li>
	<li>Obróć szczura w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, z głową skierowaną w stronę lewej ręki chirurga. Przesuń aortę dawcy na lewą stronę aorty brzusznej, aby umożliwić optymalne widzenie na IVC.</li>
	<li>Wykonaj janotomię na IVC, nieco proksymalnie do zespolenia aorty, używając ostrza 11 do nakłucia i mikronożyczek do odpowiedniego dostosowania wielkości w zależności od średnicy pnia płucnego dawcy. Ponownie przepłucz światło wewnątrzkawadalne heparynizowaną solą fizjologiczną.</li>
	<li>Zacznij od zespolenia żylnego między IVC biorcy a pniem płucnym dawcy, co najlepiej osiągnąć poprzez umieszczenie przerwanych szwów nylonowych 11-0 na tylnej ścianie naczynia, zaczynając od pozycji godziny 12 i 6 (w odniesieniu do IVC), a następnie umieść ciągły szew nylonowy 11-0 na przedniej ścianie (od godziny 6 do godziny 12 pozycja).</li>
	<li>Przykryj zespolenia małymi paskami wchłanialnej gąbki żelatynowej i usuń klamry mikronaczyniowe, zaczynając dystalnie. Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby lekko ścisnąć gąbki, aby uzyskać optymalną hemostazę.</li>
	<li>Obserwuj, jak naczynia wieńcowe przeszczepu wypełniają się w momencie uwolnienia dystalnych zacisków mikronaczyniowych i upewnij się, że serce dawcy zaczyna bić natychmiast po zwolnieniu proksymalnego zacisku. 
	UWAGA: Żywotność przeszczepu można śródoperacyjnie ocenić w skali od 0 do 4 zgodnie ze zmodyfikowanym wynikiem Stanforda19, aby potwierdzić odpowiednią funkcję przeszczepu.</li>
	<li>Umieść jelita z powrotem w jamie brzusznej, uważając, aby nie zniekształcić zespolenia tętniczego i żylnego.</li>
	<li>Meloksykam (1 mg/kg) i ethiqa XR (0,65 mg/kg) należy podawać podskórnie, podczas gdy zwierzę jest w pełni znieczulone w celu ustalenia analgezji pooperacyjnej. Następnie zamknij ścianę brzucha ciągłym wchłanialnym szwem wikrylowym 5-0, a następnie zamknij skórę wchłanialnym szwem wikrylowym 6-0 śródskórnie. 
	UWAGA: Wskazówki dotyczące typowych awarii i rozwiązywania problemów przedstawiono w Tabeli 2.</li>
</ol>
3. Pobieranie serca od dawcy noworodka
<ol>
	<li>Umieścić nowonarodzonego szczura-dawcę w komorze z wdmuchiwaniem izofluranu (2%) w celu uspokojenia. Ketaminę (75 mg/kg) i ksylazynę (5 mg/kg) oraz heparynę (300 j./kg) podawać dootrzewnowo.</li>
	<li>Potwierdź głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi i ułóż szczura w pozycji leżącej z ogonem skierowanym w twoją stronę. Sterylizuj całą klatkę piersiową i ścianę brzucha betadyną i 70% etanolem trzy razy na przemian. Przykryj szczura sterylną obłożeniem chirurgicznym.</li>
	<li>Za pomocą 12,5-krotnego mikroskopu chirurgicznego usuń całą przednią ścianę klatki piersiowej, zaczynając od poziomego nacięcia za pomocą skalpela z 15 ostrzami na ksyloidzie, a następnie pionowych nacięć bocznie aż do pach po obu stronach nożyczkami. Przednia ściana klatki piersiowej może być następnie usunięta, kontynuując kolejne poziome nacięcie tuż pod szyją.</li>
	<li>Wypreparuj nożyczkami IVC, prawą i lewą żyłę główną górną oraz naczynia płucne, a następnie okrąż i podwiąż wszystkie naczynia za pomocą jedwabnego szwu 7-0. Podaj 3 ml lodowatego, modyfikowanego roztworem Krebsa-Henseleita o wysokiej zawartości potasu do prawego przedsionka, nakłuwając IVC igłą 30 G i lekko dociskając membranę kleszczami.</li>
	<li>Przetnij nożyczkami IVC, SVC, naczynia płucne i aortę. Przeciąć tętnice płucne tak daleko, jak to możliwe, a aortę dystalnie do pnia ramienno-głowowego, aby zapewnić odpowiednią długość, używając skalpela z 11 ostrzami.</li>
	<li>Oddziel pień płucny i aortę wstępującą za pomocą mikronożyczek i przepłucz serce lodowatym roztworem kardioplegicznym za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml.</li>
</ol>
4. Odzyskiwanie biorcy i monitorowanie przeszczepu
<ol>
	<li>Po operacji daj szczurowi wystarczająco dużo czasu na przebudzenie, co zwykle następuje w ciągu 15 minut, i pozwól mu dojść do siebie na poduszce grzewczej. 
	UWAGA: Ze względu na bardzo niskie ryzyko infekcji i aby nie narażać na szwank modelu eksperymentalnego, nie są konieczne żadne antybiotyki, a także nie stosuje się żadnych ograniczeń dotyczących jedzenia i wody.</li>
	<li>Po przeszczepieniu należy codziennie monitorować czynność przeszczepu poprzez badanie palpacyjne przeszczepionego serca, ale należy pamiętać, że czasami może to być trudne do oceny ze względu na nakładkę jelita. 
	UWAGA: Echokardiografia jamy brzusznej może dokładniej zmierzyć żywotność przeszczepu. W przypadku echokardiografii należy lekko uspokoić szczura izofluranem (1-2%) wdychanym przez stożek nosowy i umieścić go na poduszce grzewczej. Echokardiografia jest zwykle wykonywana w dniu pooperacyjnym (POD) 1, POD 7 i POD 14. Aby umożliwić ocenę częstości akcji serca i kurczliwości, można łatwo uzyskać widoki długo- i krótkoosiowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A, B). Aby ocenić zespolenia, użyj echokardiografii dopplerowskiej (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 3A) i potwierdź tworzenie się tkanki EFE, jak widać jako jasną warstwę wsierdzia w lewej komorze (<silna klasa = "xfig">Figura 3B, C).</li>
</ol>

In Vivo Heart Transplantation to Study Endothelial-to-Mesenchymal Transition

<ol><li>Lurie, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+concepts+of+endocardial+fibroelastosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiology+in+the+Young%22%5BJournal%5D)">Changing concepts of endocardial fibroelastosis.</a> Cardiology in the Young. 20 (2), 115-123 (2010).</li>
<li>Crucean, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+hypoplastic+left+heart+syndrome+from+a+developmental+and+morphological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+Journal+of+Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of hypoplastic left heart syndrome from a developmental and morphological perspective.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 12 (1), 138(2017).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+fibroelastosis+is+caused+by+aberrant+endothelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Endocardial fibroelastosis is caused by aberrant endothelial to mesenchymal transition.</a> Circulation Research. 116 (5), 857-866 (2015).</li>
<li>Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+atrioventricular+valvuloseptal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis.</a> Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).</li>
<li>Illigens, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+prevents+endothelial-to-mesenchymal+transition+in+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor prevents endothelial-to-mesenchymal transition in hypertrophy.</a> Annals of Thoracic Surgery. 104 (3), 932-939 (2017).</li>
<li>Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+kidney+fibrosis+emerge+via+endothelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2282-2287 (2008).</li>
<li>Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+endothelial+to+mesenchymal+transition+as+a+source+for+carcinoma-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts.</a> Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).</li>
<li>Souilhol, C., Harmsen, M. C., Evans, P. C., Krenning, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerosis.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 565-577 (2018).</li>
<li>Zeisberg, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-mesenchymal+transition+contributes+to+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis.</a> Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).</li>
<li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-induced+endothelial-to-mesenchymal+transition%3A+A+novel+mechanism+of+intestinal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Inflammation-induced endothelial-to-mesenchymal transition: A novel mechanism of intestinal fibrosis.</a> American Journal of Pathology. 179 (5), 2660-2673 (2011).</li>
<li>Johnson, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxia+as+a+cause+of+endocardial+fibroelastosis+in+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22AMA+Archives+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Anoxia as a cause of endocardial fibroelastosis in infancy.</a> AMA Archives of Pathology. 54 (3), 237-247 (1952).</li>
<li>Shimada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distention+of+the+immature+left+ventricle+triggers+development+of+endocardial+fibroelastosis%3A+An+animal+model+of+endocardial+fibroelastosis+introducing+morphopathological+features+of+evolving+fetal+hypoplastic+left+heart+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Distention of the immature left ventricle triggers development of endocardial fibroelastosis: An animal model of endocardial fibroelastosis introducing morphopathological features of evolving fetal hypoplastic left heart syndrome.</a> Biomedical Research. 2015, 462-469 (2015).</li>
<li>Weixler, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+disturbances+and+the+development+of+endocardial+fibroelastosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Flow disturbances and the development of endocardial fibroelastosis.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (2), 637-646 (2020).</li>
<li>Purevjav, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nebulette+mutations+are+associated+with+dilated+cardiomyopathy+and+endocardial+fibroelastosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Nebulette mutations are associated with dilated cardiomyopathy and endocardial fibroelastosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 56 (18), 1493-1502 (2010).</li>
<li>Friehs, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+model+of+endocardial+fibroelastosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">An animal model of endocardial fibroelastosis.</a> Journal of Surgical Research. 182 (1), 94-100 (2013).</li>
<li>Emani, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staged+left+ventricular+recruitment+after+single-ventricle+palliation+in+patients+with+borderline+left+heart+hypoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Staged left ventricular recruitment after single-ventricle palliation in patients with borderline left heart hypoplasia.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60 (19), 1966-1974 (2012).</li>
<li>Hickey, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+left+ventricular+outflow+tract+obstruction%3A+The+disproportionate+impact+of+biventricular+repair+in+borderline+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Critical left ventricular outflow tract obstruction: The disproportionate impact of biventricular repair in borderline cases.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 134 (6), 1429-1436 (2007).</li>
<li>Oh, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+flow+conditions+promote+endocardial+fibroelastosis+via+endothelial-to-mesenchymal+transition%2C+which+is+responsive+to+losartan+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+Basic+to+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Abnormal flow conditions promote endocardial fibroelastosis via endothelial-to-mesenchymal transition, which is responsive to losartan treatment.</a> JACC: Basic to Translational Science. 6 (12), 984-999 (2021).</li>
<li>Blanchard, J. M., Pollak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+perfusion+and+storage+of+heterotopic+heart+transplants+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Techniques for perfusion and storage of heterotopic heart transplants in mice.</a> Microsurgery. 6 (3), 169-174 (1985).</li>
<li>Kokudo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snail+is+required+for+TGFbeta-induced+endothelial-mesenchymal+transition+of+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Snail is required for TGFbeta-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells.</a> Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li>
<li>Clark, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+endocardial+fibroelastosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">A mouse model of endocardial fibroelastosis.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (6), 388-394 (2015).</li>
<li>Kovacic, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+to+mesenchymal+transition+in+cardiovascular+disease%3A+JACC+state-of-the-art+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Endothelial to mesenchymal transition in cardiovascular disease: JACC state-of-the-art review.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (2), 190-209 (2019).</li>
<li>Derynck, R., Zhang, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad-dependent+and+Smad-independent+pathways+in+TGF-beta+family+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling.</a> Nature. 425 (6958), 577-584 (2003).</li>
<li>Daugherty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendation+on+design%2C+execution%2C+and+reporting+of+animal+atherosclerosis+studies%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recommendation on design, execution, and reporting of animal atherosclerosis studies: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).</li>
</ol>

Ten zwierzęcy model heterotopowego przeszczepu serca szczura od noworodka dawcy do brzucha biorcy stwarza możliwość badania zwłóknienia pochodzącego od EndMT poprzez szczegółową ocenę histologiczną tkanki, identyfikację regulacyjnych szlaków sygnałowych i testowanie opcji leczenia. Ponieważ EndMT jest mechanizmem leżącym u podstaw chorób zwłóknieniowych serca, model ten ma ogromną wartość w dziedzinie kardiochirurgii dziecięcej i nie tylko. W tym modelu wiele czynników może negatywnie wpłynąć na wynik zabiegu. Tak więc, ...

Fibroelastoza wsierdzia (EFE), definiowana przez nagromadzenie włókien kolagenowych i elastycznych w tkance podwsierdziowej, przedstawia się jako perłowe lub nieprzezroczyste pogrubione wsierdzie; EFE ulega najbardziej aktywnemu wzrostowi w okresie płodowym i we wczesnym okresie niemowlęcym1. W badaniu autopsyjnym 70% przypadków z zespołem niedorozwoju lewego serca (HLHS) było związanych z obecnością EFE2.
Komórki wyrażające markery dla fibroblastów są główną populacją komórek w EFE, ale te komórki również jednocześnie wyrażają markery śródbłonka wsierdzia, co wskazuje na pochodzenie tych komórek EFE. Nasza grupa wcześniej ustaliła, że mechanizm leżący u podstaw powstawania EFE obejmuje fenotypową zmianę komórek śródbłonka wsierdzia w fibroblasty poprzez przejście śródbłonka do mezenchymalnego (EndMT)3. EndMT można wykryć za pomocą podwójnego barwienia immunohistochemicznego dla markerów śródbłonka, takich jak klaster różnicowania (CD) 31 lub markery śródbłonka naczyniowego (VE)-kadheryny (CD144) i fibroblastów (np. alfa-aktyna mięśni gładkich, α-SMA). Co więcej, wcześniej ustaliliśmy regulacyjną rolę szlaku TGF-ß w tym procesie z aktywacją czynników transkrypcyjnych SLUG, SNAIL i TWIST3.
EndMT to proces fizjologiczny, który zachodzi podczas rozwoju embrionalnego serca i prowadzi do powstania przegród i zastawek z poduszek wsierdziowych4, ale powoduje również zwłóknienie narządów w niewydolności serca, zwłóknieniu nerek lub raku i odgrywa kluczową rolę w miażdżycy tętnic naczyniowych5,6,7,8. EndMT w zwłóknieniu serca jest głównie regulowany przez szlak TGF-β, jak my i inni zgłosiliśmy3,9. Opisano różne bodźce wywołujące EndMT: inflammation10, hipoksja11, zmiany mechaniczne12 oraz zaburzenia przepływu, w tym zmiany wewnątrzjamowego przepływu krwi13, a EndMT może być również konsekwencją choroby genetycznej14.
Ten model zwierzęcy został opracowany przy użyciu kluczowych elementów rozwoju EFE serca, którymi są niedojrzałość i zmiany w wewnątrzjamowym przepływie krwi, a konkretnie stagnacja przepływu. Niedojrzałość została zaspokojona przez użycie nowonarodzonych szczurzych serc jako dawców, ponieważ wiadomo, że nowonarodzone szczury są niedojrzałe rozwojowo zaraz po urodzeniu. Heterotopowe przeszczepienie serca zapewniło ograniczenie przepływu wewnątrzjamowego15.
Z klinicznego punktu widzenia, ten model zwierzęcy pozwala na dokładniejsze zbadanie wpływu EndMT na rosnącą lewą komorę (LV). Ograniczenie wzrostu nałożone na serce płodu i noworodka przez indukowane przez EndMT tworzenie EFE16 wyklucza pacjentów z niedrożnością drogi odpływu lewej komory (LVOTO), taką jak wrodzone krytyczne zwężenie zastawki aortalnej i zespół niedorozwoju lewego serca (HLHS), z leczniczej anatomicznej dwukomorowej naprawy chirurgicznej17. Ten model zwierzęcy ułatwia badanie mechanizmów komórkowych i regulację tworzenia tkanek za pomocą EndMT i pozwala na testowanie opcji leczenia farmakologicznego3,18.
Echokardiografia przezbrzuszna służy do monitorowania żywotności przeszczepu, kurczliwości i drożności zespoleń. Po eutanazji powstawanie EFE można zaobserwować makroskopowo w ciągu 3 dni po przeszczepieniu. Tkanka EFE wykazuje takie same cechy histopatologiczne jak ludzka tkanka EFE pobrana od pacjentów z LVOTO.
Stąd, ten model zwierzęcy, choć opracowany do użytku pediatrycznego w spektrum HLHS, może być stosowany podczas badania różnych chorób w oparciu o molekularny mechanizm EndMT.

<table><tbody><tr><td>Zaawansowany system wentylacji dla gryzoni, SAR-1000</td><td>CWE, Inc.</td><td>12-03100</td><td>respirator dla małych zwierząt</td></tr><tr><td>aSMA</td><td>Sigma</td><td>A2547</td><td>Przeciwciało do immunohistochemii</td></tr><tr><td>Axio obserwator Z1&nbsp;</td><td>Mikroskop odwrócony</td> <td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Betadine&nbsp; Rozwiązanie</td><td>Avrio Health L.P.</td><td></td><td></td>367618150092</tr><tr><td>CD31</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-80069</td><td>Przeciwciało do immunohistochemii</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Przeciwciało do immunohistochemii</td></tr><tr><td>DemeLON Nylon 10-0</td><td>DemeTECH</td><td>NL76100065F0P</td><td>10-0 Nylonowy szew</td></tr><tr><td>ETFE IV Cewnik 18G x 2</td><td>TERUMO SURFLO</td><td>SR-OX1851CA</td><td>kaniula intubacyjna</td></tr><tr><td>Micro Klips 8mm</td><td>Roboz Instrument chirurgiczny Co.</td><td>RS-6471</td><td>zaciski mikronaczyniowe</td></tr><tr><td>Nylon monofilament 11-0</td><td>SURGICAL SPECIALTIES CORP</td><td>AA0130</td><td>11-0 Nylon</td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Podłoże do zatapiania do zamrożonej próbki tkanki</td></tr><tr><td>p-SMAD2/3</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-110155</td><td>Przeciwciało do immunohistochemii</td></tr><tr><td>gryzonia, uchylny stojak</td><td>roboczy Hallowell EMC.</td><td>000A3467</td><td>skośna półka do intubacji</td></tr><tr><td>Nici jedwabne, niewchłanialne, 7-0</td><td>Braintree Scientific</td><td>NC9201231</td><td>Jedwabny szew</td></tr><tr><td>Ślimak / ślimak</td><td>Abcam</td><td>ab180714</td><td>Przeciwciało do immunohistochemii</td></tr><tr><td>Niebarwiony powlekany Vicryl 5-0 P-3 18"</td><td>Ethicon</td><td>J493G</td><td>5-0 Vicryl</td></tr><tr><td>Niebarwiony powlekany Vicryl 6-0 P-3 18"</td><td>Ethicon</td><td>J492G</td><td>6-0 Vicryl</td></tr><tr><td>VE-Cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab231227</td><td>Przeciwciało do immunohistochemii</td></tr><tr><td>Zeiss OPMI 6-SFR</td><td>Mikroskop chirurgiczny</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Zen, Blue Edition, 3.6</td><td>Zen&nbsp;</td><td></td><td>Oprogramowanie do mikroskopu odwróconego</td></tr></tbody></table>

noworodkowy heterotopowy model przeszczepu serca szczura do badania przejścia ze śródbłonka do mezenchymów

A Neonatal Heterotopic Rat Heart Transplantation Model for the Study of Endothelial-to-Mesenchymal Transition

Fibroelastoza wsierdzia (EFE), definiowana przez nagromadzenie tkanki podwsierdziowej, ma duży wpływ na rozwój lewej komory (LV) i wyklucza pacjentów z wrodzonym krytycznym zwężeniem zastawki aortalnej i zespołem hipoplazji lewego serca (HLHS) z leczniczej anatomicznej dwukomorowej naprawy chirurgicznej. Resekcja chirurgiczna jest obecnie jedyną dostępną opcją terapeutyczną, ale EFE często dochodzi do nawrotów, czasami z jeszcze bardziej naciekającym wzorcem wzrostu do sąsiedniego mięśnia sercowego.
Aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw EFE i zbadać strategie terapeutyczne, opracowano model zwierzęcy odpowiedni do testów przedklinicznych. Model zwierzęcy uwzględnia fakt, że NNKT jest chorobą niedojrzałego serca i wiąże się z zaburzeniami przepływu, co potwierdzają obserwacje kliniczne. Tak więc heterotopowe przeszczepienie serca nowonarodzonych szczurów dawców jest podstawą tego modelu.
Serce noworodka szczura jest przeszczepiane do brzucha dorastającego szczura i połączone z aortą podnerkową biorcy i żyłą główną dolną. Podczas gdy perfuzja tętnic wieńcowych zachowuje żywotność serca dawcy, zastój przepływu w lewej komorze indukuje wzrost EFE w bardzo niedojrzałym sercu. Podstawowym mechanizmem powstawania EFE jest przejście komórek śródbłonka wsierdzia do komórek mezenchymalnych (EndMT), co jest dobrze opisanym mechanizmem wczesnego rozwoju zarodkowego zastawek i przegród, ale także główną przyczyną zwłóknienia w niewydolności serca. Powstawanie EFE można zaobserwować makroskopowo w ciągu kilku dni po przeszczepie. Echokardiografia przezbrzuszna służy do monitorowania żywotności przeszczepu, kurczliwości i drożności zespoleń. Po eutanazji pobierana jest tkanka EFE, która wykazuje takie same cechy histopatologiczne jak ludzka tkanka EFE od pacjentów z HLHS.
Ten model in vivo pozwala na badanie mechanizmów rozwoju EFE w sercu i testowanie opcji leczenia zapobiegających tworzeniu się tej patologicznej tkanki oraz daje możliwość bardziej uogólnionego badania zwłóknienia wywołanego przez EndMT.

Żywotność i skurcze przeszczepu 
W niniejszej pracy żywotność przeszczepu oceniano wizualnie po usunięciu wszystkich zacisków, pozostawiając brzuch otwarty przez około 10-15 min w celu obserwacji reperfuzji przeszczepu. Ten sam system punktacji służący do obiektywnej weryfikacji żywotności przeszczepu zastosowano podczas oceny wizualnej pod koniec operacji oraz podczas echokardiografii w 1., 7. i 14. dobie po operacji (POD 1, POD 7 i POD 14).
0 = brak funkcji narządu; 1 = (...

Ta praca przedstawia zwierzęcy model zwłóknienia wywołanego przejściem śródbłonka do mezenchymalnego, obserwowanego w wrodzonych wadach serca, takich jak krytyczne zwężenie zastawki aortalnej lub zespół niedorozwoju lewego serca, co pozwala na szczegółową ocenę tkanki histologicznej, identyfikację regulacyjnych szlaków sygnałowych i testowanie opcji leczenia.

Noworodkowy heterotopowy model przeszczepu serca szczura do badania przejścia ze śródbłonka do mezenchymów

Endocardial fibroelastosis (EFE), defined by subendocardial tissue accumulation, has major impacts on the development of the left ventricle (LV) and ...

Włóknienie wsierdzia hamuje wzrost lewej komory i uniemożliwia dwukomorową naprawę chirurgiczną u pacjentów z wrodzonym krytycznym zwężeniem zastawki aortalnej i zespołem niedorozwoju lewego serca. Podczas gdy resekcja chirurgiczna jest obecnie jedyną dostępną opcją leczenia, EFE często dochodzi do nawrotów. Dlatego naszym celem jest zbadanie mechanizmów stojących za EFE i opracowanie nowych strategii terapeutycznych z wykorzystaniem modelu zwierzęcego.Główne osiągnięcia w dziedzinie badań NDMT ograniczają się do modeli kultur komórkowych. Które mają nieodłączne ograniczenia, a badania są utrudnione z powodu braku modeli in vivo. Nasza grupa ustaliła wcześniej, że mechanizm leżący u podstaw powstawania EFE polega na fenotypowej zmianie komórek śródbłonka wsierdzia na fibroblasty.Proces zwany przejściem śródbłonkowym do mezenchymalnym. Ten model zwierzęcy pozwala na bardziej uogólnione badanie zwłóknienia serca wywołanego NDMT. Podczas gdy inne modele są zaprojektowane do indukowania NDMT poprzez modyfikacje genetyczne, nadciśnienie lub ograniczenia dietetyczne.Ponieważ EFE często nawraca po pierwotnej resekcji, czasami z jeszcze bardziej naciekającym wzorcem wzrostu, jesteśmy szcze

a-neonatal-heterotopic-rat-heart-transplantation-model-for-study

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W niniejszym filmie zaprezentowano model ortotopowego przeszczepu aorty jako prosty model do badania rozwoju waskulopatii przeszczepu (TVP) u szczurów. <br...

Ortotopowy przeszczep aorty: model szczurzy do badania rozwoju przewlekłej waskulopatii

Model przeszczepu mysiego serca szyjnego doskonale nadaje się do badań immunologicznych i niedokrwiennych uszkodzeń reperfuzyjnych. Zmodyfikowaliśmy procedurę przy użyciu techniki mankietu bez szwów i przeprowadziliśmy ponad 1000 udanych przeszczepów przy użyciu tego podejścia. Niniejszym podajemy dodatkowe szczegóły tej techniki, aby uzupełnić film.

Mysi model przeszczepu szyjki macicy przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietowej

Aby zrozumieć komórkowe i molekularne mechanizmy leżące u podstaw powstawania nowotworów i rozwoju zwężeń w zastawkach serca z inżynierii tkankowej, opracowano mysi model heterotopowego przeszczepu zastawki serca. Zastawkę płucną serca przeszczepiono biorcy przy użyciu techniki heterotopowego przeszczepiania serca.

Przeszczepienie zastawki płucnej z wykorzystaniem mysiego modelu heterotopowego przeszczepienia serca

Opisujemy model heterotopowego przeszczepu serca w jamie brzusznej u szczurów, sugerując modyfikacje obecnych strategii, które prowadzą do uproszczonego podejścia chirurgicznego. Dodatkowo opisujemy nowatorski model odrzucania przeszczepu poprzez wstrzyknięcie do ucha ważnych komórek mięśnia sercowego, co pozwala na dalsze analizy immunologiczne przeszczepu u szczurów.

Model immunologiczny do heterotopowego przeszczepu komórek serca i mięśnia sercowego u szczurów

Ten protokół opisuje prostą i efektywną metodę przeszczepiania płatków zastawki aortalnej pod torebkę nerkową, aby umożliwić badanie alloreaktywności zastawek serca.

Uproszczony model heterotopowego przeszczepu zastawki serca u gryzoni

Obecny protokół opisuje kaniulację aorty i wsteczną perfuzję mysiego serca ex-vivo.  Strategia dwuosobowa, wykorzystująca mikroskop preparacyjny i igłę o małym grubym rozmiarze, pozwala na niezawodną kaniulację. Kwantyfikacja podłużnego napięcia skurczowego uzyskuje się za pomocą przetwornika siły podłączonego do wierzchołka lewej komory.

Zmodyfikowana technika wykorzystania mysich serc noworodków w preparacie Langendorffa

W obecnym protokole, model przeszczepu serca myszy jest używany do badania mechanizmu odrzucania przeszczepu alloprzeszczepu serca. W tym heterotopowym modelu przeszczepu serca poprawia się efektywność operacji, a przeżycie przeszczepów serca jest zapewnione dzięki zespoleniu implantacji serca w szyjce macicy od końca do końca przy użyciu zmodyfikowanej techniki Cuff.

Zmodyfikowana technika mankietowa dla heterotopowego modelu przeszczepu szyjki macicy serca u myszy

To badanie demonstruje powtarzalną technikę heterotopowego przeszczepu serca w jamie brzusznej u szczurów, którą początkujący mogą nauczyć się i wykonywać. Dodatkowo, nowy model niedomykalności zastawki aortalnej u szczurów jest generowany poprzez wykonanie heterotopowego przeszczepu serca w jamie brzusznej i uszkodzenie zastawki aortalnej dawcy za pomocą prowadnika po pobraniu.

Zmodyfikowany heterotopowy przeszczep serca w jamie brzusznej i nowy model niedomykalności zastawki aortalnej u szczurów

Tutaj prezentujemy protokół oceny heterotopowo wszczepionego serca po normotermicznym zachowaniu ex situ w modelu szczurzym.

Szczurzy model normomicznego heterotopowego przeszczepu serca z perfuzją ex-situ

Ten protokół przedstawia uproszczoną technikę anastomozy szwu końcowo-bocznego do przeszczepu serca szyjnego u myszy, zapewniając solidny i możliwy do powtórzenia model do badania immunologii przeszczepów.

Przeszczepienie heterotopowe serca mysiego w okolicy szyjnej z zastosowaniem techniki anastomozy końca z boku w celu badania immunologii przeszczepów

Poznaj model przeszczepu serca szczura do badania endocardial fibroelastosis i przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego. Ta metoda pozwala analizować mechanizmy fibrozy oraz testować nowe strategie terapeutyczne.

Noworodkowy heterotopowy model przeszczepu serca szczura do badania przejścia ze śródbłonka do mezenchymów

Przeglądaj więcej filmów