Badania przesiewowe kanałów jonowych w komórkach nowotworowych

Funkcja kanałów jonowych jest kluczowa w biologii komórki i znacząco wpływa na wzrost raka. Nasz zespół koncentruje się na celowaniu w kanały jonowe, aby wspomóc leczenie raka. Naukowcy z tej dziedziny uzyskali ostatnio lepsze zrozumienie mikrośrodowiska guza i tego, w jaki sposób komórki rakowe gromadzą się w zdrowych tkankach, podkreślając znaczenie kanałów jonowych w raku.

Jednym z największych wyzwań w obecnym eksperymencie jest dostępność immunokompetentnego modelu zwierzęcego, który może skutecznie testować terapie. Ustaliliśmy, że receptor GABAA jest podatny terapeutycznie na różne nowotwory i zidentyfikowaliśmy nową klasę aktywatorów receptora GABAA, które skutecznie upośledzają komórki rakowe. Kanały jonowe odgrywają kluczową rolę w regulacji zachowania komórek rakowych i mają ogromny potencjał jako cel leczenia raka.

Nasze badania pokazały, w jaki sposób uznana klasa leków może być stosowana do skutecznego leczenia raka. Na początek utrzymuj komórki w kolbie hodowlanej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych. Odessać pożywkę hodowlaną i przepłukać komórki PBS bez wapnia i magnezu.

Następnie dodaj dwa mililitry 0,25% trypsyny-EDTA, aby odłączyć komórki przylegające. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach pożywki. Następnie zbierz komórki z kolby do 15-mililitrowej probówki wirówkowej, odwiruj w 480G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i odessaj pożywkę.

Ponownie zawiesić komórki w pięciu do 10 mililitrach pożywki w oparciu o pierwotne zbieganie się kultury. Usuń 100 mikrolitrów komórek i dodaj do 1,5 mililitrowej probówki ze 100 mikrolitrami 0,4% błękitu trypanowego. Dodaj komórki do hemocytometru i policz je, obserwując pod mikroskopem i używając ręcznego licznika zliczeń.

Rozcieńczyć komórki do trzech razy 10 czwartych komórek na mililitr w pożywce hodowlanej bez czerwieni fenolowej. Dodaj 2,5 mililitra zawiesiny komórek do każdego dołka sześciodołkowej płytki z szkiełkiem nakrywkowym pokrytym poli-D-lizyną zgodnie ze wskazówkami producenta. Hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w nawilżonym inkubatorze, aby umożliwić przymocowanie komórek do szkiełka nakrywkowego.

Następnego dnia zbadaj przyczep komórek pod odwróconym mikroskopem za pomocą 20-krotnego obiektywu. Przygotować roztwory podstawowe do traktowania o pożądanych stężeniach i utworzyć kontrolę tylko dla pożywki, kontrolę tylko dla nośnika o stężeniu odpowiadającym badanemu związkowi oraz kontrolę z jonoforem FCCP i związkami badanymi. Pracując z jednym szkiełkiem nakrywkowym na raz, dodaj do komórek 1,8 mililitra pożywki dla badanego stanu.

Inkubować komórki potraktowane związkiem kontrolnym lub testowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnym środowisku przez żądany czas. Po okresie leczenia dodaj do komórek 200 mikrolitrów 10x TMRE. Inkubować przez 15 do 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku nawilżonym 5% dwutlenkiem węgla.

Delikatnie zassaj pożywkę i przepłucz komórki dwa razy PBS, aby zminimalizować zakłócenia tła. Następnie odwróć szkiełko nakrywkowe na szkiełko mikroskopowe oznaczone warunkami zabiegu. Wyobraź sobie, że komórki żyją przy wzbudzeniu 549 nanometrów i emisji 575 nanometrach.

Wykorzystaj mikroskop konfokalny, aby uchwycić kilka pól stosu Z z szybkim przechwytywaniem obrazu, zanim integralność komórki zostanie utracona. Zapisz i zapisz plik obrazu do późniejszej analizy. Komórki z aktywnymi mitochondriami zachowały barwienie TMRE i wykazały wysoką fluorescencję.

Zdepolaryzowane lub nieaktywne mitochondria mają zmniejszony potencjał błonowy, nie zatrzymują TMRE i wykazują niski sygnał fluorescencyjny. Na początek umieść komórki w 75 mikrolitrach na studzienkę pożywki wolnej od antybiotyków bez buforu HEPES, aby określić IC 50. Drugiego dnia przygotować roztwór kontrolny i roztwory testowe, wykonując seryjne rozcieńczenia roztworów podstawowych o wysokim stężeniu.

Po dodaniu roztworów kontrolnych i testowych do komórek, inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnym środowisku przez 48 godzin. Rozpocznij test proliferacji komórek, najpierw wirując odczynnik MTS, aby całkowicie rozpuścić wytrącony odczynnik przed użyciem w trzecim dniu eksperymentu. Przenieś rozmrożone odczynniki MTS do sterylnego zbiornika na odczynniki o pojemności 25 mililitrów.

Odpipetować 20 mikrolitrów odczynnika MTS do każdego dołka z 96-dołkowej płytki zawierającej próbki i 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnym środowisku przez jedną do czterech godzin. Następnie odwirować płytkę w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, które mogą zakłócać odczyt absorbancji.

Zmierzyć absorbancję przy 490 nanometrach za pomocą czytnika mikropłytek lub spektrofotometru. Przedstawiono 96-dołkową płytkę przedstawiającą wyniki kolorymetryczne testu MTS przy rosnących stężeniach leku. Krzywa odpowiedzi na dawkę wykazała, że badany czynnik upośledza żywotność komórek nowotworowych w sposób zależny od dawki.