Name: Obrazowanie mtHyPer7, ratiometrycznego biosensora do pomiaru nadtlenku mitochondriów, w żywych komórkach drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj metodę obrazowania nadtlenku wodoru w mitochondriach żywych komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae za pomocą ratiometrycznego biosensora mtHyPer7. Technika ta umożliwia badanie funkcji mitochondrialnych i procesów starzenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Katherine Filpo Lopez za fachową pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health (NIH) (GM122589 i AG051047) dla LP.
W tych badaniach wykorzystano wspólny zasób mikroskopii konfokalnej i specjalistycznej Herbert Irving Comprehensive Cancer Center na Uniwersytecie Columbia, częściowo finansowany przez NIH/NCI Cancer Center Support Grant P30CA013696.

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

W tym protokole opisano metodę wykorzystania mtHyPer7 jako biosensora do oceny mitochondriówH2O2w żywych, pączkujących komórkach drożdży. Bioczujnik został skonstruowany przy użyciu metody opartej na CRISPR i wprowadzony do konserwatywnego, wolnego od genów regionu w genomie drożdży bez użycia selektywnych markerów. W porównaniu z biosensorami plazmidowymi, zintegrowane biosensory ulegają ekspresji we wszystkich komórkach i na stałych poziomach, co zapewnia bardziej wiarygodne wyniki kwantyfikacji. Do generowania komórek wykazujących ekspresję mtHyPer7 nie stosuje się żadnych selektywnych markerów, co pozwala na wykorzystanie szerszego zakresu tła szczepów i ułatwia modyfikację genetyczną komórek wykazujących ekspresję biosensorów. Białko mtHyPer7 jest prawidłowo ukierunkowane na mitochondria bez zauważalnego wpływu na morfologię, funkcję, dystrybucję lub tempo wzrostu mitochondriów. mtHyPer7 wykazuje odpowiedź zależną od dawki na zewnętrznie dodaneH2O2. Co więcej, mtHyPer7 jest w stanie raportować o niejednorodności jakości mitochondriów z rozdzielczością subkomórkową. Wreszcie, użycie mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem, w przeciwieństwie do mikroskopii szerokokątnej do obrazowania bioczujników ukierunkowanych na mitochondria, powoduje mniejsze fotowybielanie fluoroforów i generuje obrazy o wysokiej rozdzielczości do analizy różnic subkomórkowych.
Ograniczenia i alternatywne podejścia Ta metoda nie jest odpowiednia do obrazowania komórek przez okres dłuższy niż 10 minut, ponieważ komórki wyschną pod szkiełkiem nakrywkowym. W przypadku obrazowania długoterminowego lepiej jest użyć metody padów agarowych46 lub unieruchomić komórki w naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem wypełnionym pożywką SC.
Przy wyborze biosensora należy kierować się stężeniem celu w warunkach doświadczalnych. Jeśli czułość HyPer7 jest zbyt wysoka, zalecana jest inna wersja HyPer, taka jak HyPer3 lub HyPerRed47,48. Należy jednak zauważyć, że inne sondy HyPer są bardziej wrażliwe na pH. W przypadku wyższej czułości bardziej odpowiedni może być roGFP na bazie peroksyredoksyny (roGFP2Tsa2ΔCR)27.
Stały stan utlenienia czujnikaH2O2jest powiązany zarówno ze współczynnikami utleniania, jak i redukcji. Szybkość utleniania bioczujników jest spowodowana głównie przezH2O2, ale szybkość redukcji zależy od systemów redukcji przeciwutleniaczy aktywnych w komórce i organellach. Wykazano, że HyPer7 jest głównie redukowany przez układ tioredoksyny w cytozolu drożdży, a jego redukcja jest szybsza niż w przypadku roGFP2Tsa2ΔCR27. W związku z tym przy interpretacji pomiarów biosensorówH2O2należy wziąć pod uwagę różne mechanizmy redukcji i dynamikę odpowiedzi sondy. W szczególności, aby wywnioskować poziomyH2O2z odczytu biosensora, należy założyć, że układ redukcyjny utrzymuje stałą pojemność podczas eksperymentu. Jako alternatywę dla opisanych tutaj skryptów, udostępniono bezpłatnie szereg innych programów do analizy czujników redoks49.
Kroki krytyczne W przypadku każdego biosensora bardzo ważne jest wykazanie, że sam bioczujnik nie wpływa na mierzony proces. Dlatego ważne jest porównanie wzrostu i morfologii mitochondriów szczepów w każdych warunkach eksperymentalnych. W tym przypadku morfologia mitochondriów jest oceniana za pomocą MitoTracker Red, który barwi mitochondria w sposób zależny od potencjału błony. Jednak porównanie mitochondriów w komórkach nieprzekształconych i przekształconych przez biosensory można przeprowadzić poprzez barwienie estrem metylowym tetrametylorodaminy (TMRM), alternatywnym mitochondrialnym barwnikiem witalnym wykrywającym potencjał błonowy, lub MitoTracker Green, który barwi mitochondria niezależnie od potencjału błonowego. Jeśli podejrzewa się szkodliwe skutki, pomocne może być zmniejszenie poziomu wyrażenia lub zmiana witryny integracji.
Walidacja zachowania sondy w zakresie dawka-odpowiedź oraz stosunek sygnału do szumu w technice obrazowania są również niezbędne do uzyskania wiarygodnych wyników. Jeśli zmienność w obrębie grupy przewyższa zmienność między grupami, różnice stają się trudne do wykrycia. Zmienność wewnątrzgrupowa może wynikać z rzeczywistej zmienności populacji lub z szumu w procesie wykrywania. Kluczowymi krokami w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu są akwizycja obrazu (zakres wartości pikseli i szum), odejmowanie tła i progowanie.
Efekty hałasu można również zredukować na etapach obliczeń. Najprostszym podejściem jest obliczenie średniej ważonej intensywności na podstawie pomiarów obrazu współczynnika (Results.csv), gdzie każdy piksel reprezentuje lokalny stosunek między sprawnościami wzbudzenia. W ten sposób uzyskuje się proporcje "pikselowe". Jeśli jednak stosunek sygnału do szumu obrazu jest niski, bardziej wiarygodne wyniki można uzyskać, obliczając średnią ważoną intensywność dla ROI zarówno w kanałach licznika, jak i mianownika, a następnie obliczając stosunek między tymi dwiema średnimi ważonymi (stosunek "regionowy").
Aby wybrać metodę progowania, należy użyć polecenia Fidżi Image | Dostosuj | Funkcja Auto Threshold może być używana do automatycznego wypróbowywania wszystkich wbudowanych metod Fidżi. Aby ocenić segmentację (progowanie), zapisana maska jest przekształcana w zaznaczenie, klikając Edytuj | Selekcja | Utwórz zaznaczenie, dodany do Menedżera ROI (przez naciśnięcie T), a następnie aktywowany w pliku obrazu raw. Jeśli mitochondria nie zostaną odpowiednio wykryte, należy spróbować zastosować inną metodę segmentacji.
Podczas porównywania obrazów ważne jest, aby uzyskać wszystkie obrazy w identycznych warunkach obrazowania, a także wyświetlić wszystkie obrazy z identycznym wzmocnieniem kontrastu.
Podczas optymalizacji warunków obrazowania należy wziąć pod uwagę ruch mitochondriów. Jeśli mitochondria poruszają się znacznie między wzbudzeniem przy 405 a 488 nm, obraz proporcji nie będzie dokładny. Zaleca się utrzymanie czasu naświetlania <500 ms i zmianę wzbudzenia najszybszą dostępną metodą (np. impuls wyzwalający lub akustyczno-optyczny filtr przestrajalny). Podczas przechwytywania stosu Z należy wykonać oba wzbudzenia dla każdego kroku Z przed przejściem do następnego kroku Z.
W celu wyświetlenia wyników, zmiany odcienia (koloru) są bardziej widoczne dla ludzkiego oka niż zmiany intensywności. W związku z tym wartość współczynnika jest konwertowana na skalę kolorów w celu łatwiejszej interpretacji wizualnej. Obrazy kolorowane mogą być niemodulowane, gdzie wszystkie piksele mitochondrialne pojawiają się z tą samą jasnością, lub modulowane intensywnie, gdzie intensywność pikseli w oryginalnym obrazie jest używana do ustawiania intensywności w kolorowym obrazie.
Modyfikacja i rozwiązywanie problemów Jako alternatywę dla potwierdzania funkcji mitochondriów przez prowokację parakwatem, komórki mogą być replikowane lub inokulowane do fermentujących i niefermentujących źródeł węgla.
W przypadku odejmowania tła, odejmowania toczącej się piłki (poprzez przejście do punktu menu Process | Odejmij tło...) może być również używany do usuwania niejednorodności oświetlenia. Należy upewnić się, że obecność komórek nie zmienia odejmowanego tła (zaznaczając opcję Utwórz tło i sprawdzając wynik).
Podsumowując, sonda mtHyPer7 zapewnia spójną, minimalnie inwazyjną metodę powiązania morfologicznego i funkcjonalnego stanu mitochondriów drożdży w żywych komórkach oraz umożliwia badanie ważnego stresora komórkowego i cząsteczki sygnałowej w genetycznie wykonalnym, łatwo dostępnym systemie modelowym.

Mitochondria są niezbędnymi eukariotycznymi organellami komórkowymi, znanymi przede wszystkim z funkcji produkcji ATP poprzez fosforylację oksydacyjną i transport elektronów1. Ponadto mitochondria stanowią miejsca magazynowania wapnia, syntezy lipidów, aminokwasów, kwasów tłuszczowych i klastrów żelazowo-siarkowych oraz transdukcji sygnałów2,3. Wewnątrz komórek mitochondria tworzą dynamiczną sieć o charakterystycznej morfologii i rozmieszczeniu, które różnią się w zależności od typu komórki i stanu metabolicznego. Co więcej, choć mitochondria mogą ulegać fuzji i podziałom, nie wszystkie mitochondria w komórce są sobie równoważne. Liczne badania udokumentowały funkcjonalną heterogeniczność mitochondriów w obrębie pojedynczych komórek pod względem takich parametrów jak potencjał błonowy i stan utlenienia4,5,6. Zmienność funkcji mitochondrialnych wynika częściowo z uszkodzeń organelli spowodowanych mutacjami mtDNA (które występują częściej niż w DNA jądrowym) oraz z uszkodzeń oksydacyjnych wywołanych przez reaktywne formy tlenu (ROS) generowane zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz organelli7,8,9. Uszkodzenia organelli są ograniczane przez mechanizmy kontroli jakości mitochondriów, które naprawiają uszkodzenia lub eliminują mitochondria, których nie da się już zregenerować10.
Nadtlenek wodoru (H2O2) jest reaktywną formą tlenu, która stanowi źródło uszkodzeń oksydacyjnych białek komórkowych, kwasów nukleinowych i lipidów. Jednak H2O2 pełni również rolę cząsteczki sygnałowej, która reguluje aktywności komórkowe poprzez odwracalne utlenianie grup tiolowych w białkach docelowych11,12. H2O2 powstaje z elektronów wyciekających z mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów oraz w wyniku działania specyficznych enzymów, takich jak NADPH oksydaza i monoaminooksydazy13,14,15,16,17,18,19,20. Jest on również dezaktywowany przez systemy antyoksydacyjne, w tym te oparte na tioredoksynie i glutationie21,22,23. Zatem analiza poziomu mitochondrialnego H2O2 ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia roli tego metabolitu w prawidłowym funkcjonowaniu mitochondriów i komórek, a także w warunkach stresu oksydacyjnego.
Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykrywanie mitochondrialnego H2O2 przy użyciu genetycznie kodowanego ratiometrycznego biosensora H2O2, HyPer7, który jest kierowany do tego organellum (mtHyPer7). mtHyPer7 jest chimerą składającą się z mitochondrialnej sekwencji sygnałowej z genu ATP9 (presekwencji Su9), cyklicznie permutowanej formy zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) oraz domeny wiążącej H2O2 białka OxyR z Neisseria meningitidis24 (Rysunek 1). W cyklicznie permutowanym GFP końce N- i C- natywnego GFP są ze sobą połączone, a nowe końce formują się w pobliżu chromoforu, co nadaje białku większą mobilność i zwiększa zmienność jego charakterystyki widmowej w porównaniu z natywnym GFP25. Oddziaływanie domeny OxyR białka mtHyPer7 z H2O2 charakteryzuje się wysokim powinowactwem, selektywnością wobec H2O2 i prowadzi do odwracalnego utlenienia konserwowanych reszt cysteiny oraz tworzenia mostków disulfurowych. Zmiany konformacyjne związane z utlenianiem OxyR są przekazywane na cyklicznie permutowane GFP w mtHyPer7, co skutkuje przesunięciem widmowym maksimum pobudzenia chromoforu mtHyPer7 z 405 nm w stanie zredukowanym do&#160;488 nm w stanie utlenionym przez H2O226. Zatem stosunek fluorescencji mtHyPer7 w odpowiedzi na pobudzenie przy 488 nm w stosunku do 405 nm odzwierciedla stopień utlenienia sondy przez H2O2.
W idealnym przypadku biosensor powinien zapewniać rzeczywisty, bezwzględny i ilościowy odczyt cząsteczki docelowej. Niestety w pomiarach przeprowadzanych w rzeczywistych warunkach nie zawsze jest to możliwe. W przypadku czujników utleniania, takich jak mtHyPer7, odczyt w czasie rzeczywistym jest zależny od szybkości redukcji mostka disiarczkowego. Systemy redukcyjne wykorzystywane przez biosensory ROS różnią się od siebie, co może drastycznie zmienić dynamikę odpowiedzi sondy – co wykazano w porównaniu HyPer7, redukowanego przez system tioredoksynowy, oraz roGFP2-Tsa2ΔCR, redukowanego przez glutation, w cytozolu drożdży27. Zatem, aby wyciągnąć wnioski na temat względnego stężenia H2O2 na podstawie stosunków mtHyPer7, należy założyć, że system redukcyjny utrzymuje stałą wydajność podczas eksperymentu. Pomimo tych rozważań, HyPer7 i pokrewne sondy były stosowane w różnych kontekstach w celu uzyskania informacji o H2O2 w żywych komórkach25,28,29.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig01.jpg" /> 
Rycina 1: Projekt, mechanizm molekularny i widma wzbudzenia/emisji biosensora H2O2 mtHyPer7. (A) Sonda mtHyPer7 została opracowana poprzez wstawienie kołowo permutowanego GFP do domeny OxyR-RD z Neisseria meningitidis. Zawiera ona sekwencję kierującą do mitochondriów z podjednostki 9 syntazy ATP z Neurospora crassa (Su9). (B) Ilustracja mechanizmu wykrywania H2O2 przez mtHyPer7. Utlenianie cystein w domenie RD zwiększa emisję fluorescencji przy wzbudzeniu przy 488 nm i zmniejsza emisję powstającą przy wzbudzeniu przy 405 nm. (C) Widma wzbudzenia i emisji HyPer7 w formach utlenionej i zredukowanej. Rycina przedrukowana za zgodą Paka i wsp.24. Skróty: GFP = zielone białko fluorescencyjne; cpGFP = kołowo permutowane GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
To ratiometryczne obrazowanie mtHyPer7 oferuje istotne zalety w zakresie oznaczania ilościowego mitochondrialnego H2O224,27; zapewnia ono wewnętrzną kontrolę stężenia sondy. Ponadto przesunięcie piku wzbudzenia wywołane ekspozycją na H2O2 nie jest całkowite, nawet przy nasycających stężeniach H2O2. W związku z tym obrazowanie ratiometryczne może zwiększyć czułość poprzez uwzględnienie dwóch punktów widmowych w analizie.
Sonda mtHyPer7 zastosowana w niniejszym badaniu wykazuje bardzo wysokie powinowactwo do H2O2 i stosunkowo niską wrażliwość na pH24, a jej celowanie do mitochondriów Caenorhabditis elegans zakończyło się sukcesem30. Białko to było wykorzystywane również w drożdżach27,31. Jednak poprzednie badania opierały się na ekspresji mtHyPer7 z plazmidu, co prowadzi do zmienności poziomu ekspresji sondy między poszczególnymi komórkami27. Ponadto konstrukt opisany w niniejszym protokole został zintegrowany z konserwatywnym, wolnym od genów regionem chromosomu X32 z wykorzystaniem podejścia opartego na CRISPR w celu integracji bezmarkerowej. Ekspresja zintegrowanego genu biosensora jest również kontrolowana przez silny konstytutywny promotor TEF1 (Rycina 2). W rezultacie w populacjach komórek drożdży obserwuje się bardziej stabilną i spójną ekspresję biosensora w porównaniu do ekspresji z plazmidu, a komórki zawierające biosensor mogą być namnażane bez konieczności stosowania pożywek selekcyjnych.
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig02.jpg" /> 
Rycina 2: Generowanie komórek wykazujących ekspresję mtHyPer7 za pomocą CRISPR. Plazmid zawierający Cas9 i sgRNA (YN2_1_LT58_X2site) oraz powielona metodą PCR konstrukcja biosensora zawierająca mtHyPer7 są wprowadzane do komórek drożdży pączkujących poprzez transformację octanem litu. Pozbawione genów miejsce insercji na chromosomie X (X2) jest rozpoznawane i przecinane przez białko Cas9 z sgRNA, a biosensor zostaje zintegrowany z genomem poprzez rekombinację homologiczną. Po zidentyfikowaniu udanych transformantów za pomocą przesiewu mikroskopowego, PCR kolonii i sekwencjonowania, plazmid Cas9 jest usuwany (eliminowany) poprzez hodowlę w mediach nieselekcyjnych. Skróty: sgRNA = pojedynczy prowadzący RNA; TEF = czynnik wzmacniający transkrypcję. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.</a>
Wreszcie, mtHyPer7 oferuje zalety w porównaniu z innymi biosensorami ROS. Na przykład barwniki organiczne stosowane do wykrywania ROS (np. dihydroetydium [DHE]2 i MitoSOX3) mogą powodować nierównomierne lub niespecyficzne barwienie i często są dostarczane w rozpuszczalnikach takich jak etanol lub dimetylosulfotlenek, co wymaga dodatkowych kontroli wpływu rozpuszczalnika. Inną klasą biosensorów ROS są biosensory oparte na transferze energii między fluoroforami (FRET) (np. Redoxfluor do badania stanu redoks komórek4 oraz sensory nadtlenku HSP-FRET5, OxyFRET6 i PerFRET6). Sondy te są kodowane genetycznie i w zasadzie wykazują wysoką czułość, a dzięki dobrze scharakteryzowanym sekwencjom sygnałowym mogą być ilościowo kierowane do mitochondriów. Istnieją jednak trudności w stosowaniu sond opartych na FRET, w tym tło wynikające z wzajemnej ekscytacji i przenikania sygnału (bleed-through) oraz rygorystyczne wymagania dotyczące bliskości i orientacji fluoroforów niezbędne do zajścia FRET33,34. Ponadto sondy FRET składają się z dwóch białek fluorescencyjnych, co wymaga zastosowania większych konstruktów do ekspresji w badanych komórkach w porównaniu z sondami zmieniającymi widmo. Opisany tutaj protokół został opracowany tak, aby wykorzystać mocne strony biosensora opartego na HyPer7 i użyć tej kompaktowej, ratiometrycznej, wysokopowinowatej, kodowanej genetycznie sondy do ilościowego obrazowania nadtlenku w mitochondriach żywych drożdży.

<table><tbody><tr><td>Soczewka obiektywowa 100x/1.45 Plan Apo Lambda</td><td>Nikon</td><td>MRD01905</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan adeniny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9126</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Difco</td><td>DF0145170</td> Bacto Peptone BD Difco DF0118170 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Bacto</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>BD Difco</td><td>DF211705</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży Bacto</td><td>BD Difco</td><td></td><td></td>DF0127179</tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144S</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1389</td><td></td></tr><tr><td>Carl Zeiss Immersol Immersion Oil Carl</td><td>Zeiss</td><td>444960</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza (D-(+)-glukoza)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>E. cloni 10G substancja chemiczna kompetentna komórka</td><td>Bioserch Technologies</td><td>60108</td><td></td></tr><tr><td>FIDŻI</td><td>NIH</td><td></td><td>Schindelin i wsp. 2012</td></tr><tr><td>G418 (Geneticin)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisyjny GFP</td><td>Chroma</td><td>525/50</td>Zespół Gibsona <td></td></tr><tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>E2611</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td></tr> <tr><td>H2O2 (stabilny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO</td><td>Pon Lab</td><td>JYE057/EP41</td><td>Liao i in. 20201</td></tr><tr><td>Wytrząsarka do inkubatora</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>E24</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR kit</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA</td><td>KK1006</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek L-argininy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8094</td><td></td></tr><tr><td>laser</td><td>Agilent</td><td></td><td>405 i 488 nm</td></tr><tr><td>Chlorowodorek L-histydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5659</td><td></td></tr><tr><td>L-leucyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8912</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8662</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-fenyloalanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5482</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptofan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8941</td><td></td></tr><tr><td>L-tyrozyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8566</td><td></td></tr><tr><td>plazmid mHyPer7</td><td>To badanie</td><td>JYE116</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe mikroskopu</td><td>ThermoScientific</td><td>3406</td><td>#1.5 (170 &mikro; m grubość)</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>ThermoScientific</td><td>3050</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red CM-H2Xros</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>M7513</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscope oprogramowanie do akwizycji</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Nikon Ti Eclipse</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraquat (hydrat dichlorku metylu wioligogenu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat. 856177&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RStudio</td><td>Posit.co</td><td>Darmowa wersja na komputery stacjonarne</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Beckman</td><td>BU530</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Stagetop</td><td>Tokai Hit</td><td>INU</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>Drożdżowa zasada azotowa (YNB) zawierająca siarczan amonu bez aminokwasów</td><td>BD Difco</td><td>DF0919073</td><td></td></tr><tr><td>YN2_1_ LT58_X2site</td><td>Addgene</td><td>177705</td><td>Pianale i wsp. 2021</td></tr><tr><td>Kamera Zyla 4.2 sCMOS</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie mthyper7, ratiometrycznego biosensora do pomiaru nadtlenku mitochondriów, w żywych komórkach drożdży

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Dysfunkcja mitochondriów, czyli zmiana funkcjonalna, występuje w wielu chorobach i stanach, w tym w zaburzeniach neurodegeneracyjnych i mięśniowo-szkieletowych, rakach i normalnym starzeniu się. W tym miejscu opisano podejście do oceny funkcji mitochondriów w żywych komórkach drożdży w rozdzielczościach komórkowych i subkomórkowych przy użyciu genetycznie kodowanego, minimalnie inwazyjnego, ratiometrycznego biosensora. Biosensor, HyPer7 (mtHyPer7) ukierunkowany na mitochondria, wykrywa nadtlenek wodoru (H2O2) w mitochondriach. Składa się z mitochondrialnej sekwencji sygnałowej połączonej z koliście permutowanym białkiem fluorescencyjnym i domeną reagującą naH2O2bakteryjnego białka OxyR. Bioczujnik jest generowany i integrowany z genomem drożdży za pomocą systemu wolnego od markerów CRISPR-Cas9, co zapewnia bardziej spójną ekspresję w porównaniu z konstruktami plazmidowymi.
mtHyPer7 jest ilościowo ukierunkowany na mitochondria, nie ma wykrywalnego wpływu na tempo wzrostu drożdży ani morfologię mitochondriów i dostarcza ilościowy odczyt dla mitochondriówH2O2 w normalnych warunkach wzrostu i po ekspozycji na stres oksydacyjny. Protokół ten wyjaśnia, w jaki sposób zoptymalizować warunki obrazowania za pomocą systemu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem i przeprowadzić analizę ilościową przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania. Narzędzia te umożliwiają gromadzenie bogatych informacji czasoprzestrzennych na temat mitochondriów zarówno w obrębie komórek, jak i między komórkami w populacji. Co więcej, opisany tutaj przepływ pracy może być wykorzystany do walidacji innych bioczujników.

Aby potwierdzić, że mtHyPer7 jest odpowiednią sondą do oceny mitochondrialnego H2O2, oceniono lokalizację mtHyPer7 oraz jego wpływ na mitochondria drożdży i kondycję komórek. W celu oceny ukierunkowania mtHyPer7, mitochondria w kontrolnych komórkach drożdży oraz w drożdżach wykazujących ekspresję mtHyPer7 barwiono żywymi, specyficznymi dla mitochondriów barwnikiem MitoTracker Red. Dzięki barwieniu MitoTracker Red mitochondria widoczne były jako długie struktury rurkowe, które układały się wzdłuż osi matka-pączek i gromadziły się w wierzchołku pączka oraz w wierzchołku komórki matki po przeciwnej stronie pączka41. Morfologia mitochondriów była podobna w komórkach kontrolnych i komórkach wykazujących ekspresję mtHyPer7. Ponadto mtHyPer7 kolokalizował z mitochondriami zabarwionymi MitoTracker Red (Rycyna 3A). Zatem mtHyPer7 został wydajnie i ilościowo skierowany do mitochondriów bez wpływu na ich normalną morfologię lub rozmieszczenie.
Następnie przeprowadzono dodatkowe eksperymenty walidacyjne w celu oceny wpływu mtHyPer7 na kondycję komórkową oraz wrażliwość na stres oksydacyjny w mitochondriach. Tempo wzrostu komórek wykazujących ekspresję mtHyPer7 w bogatych lub syntetycznych pośrodkach opartych na glukozie (odpowiednio YPD lub SC) jest zbliżone do tempa wzrostu nieprzekształconych komórek typu dzikiego (Rycyna 3B,D). Aby ocenić możliwe skutki dla stresu oksydacyjnego w mitochondriach, drożdże kontrolne oraz wykazujące ekspresję mtHyPer7 poddano działaniu niskich stężeń parakwatu – aktywniej redoks małej cząsteczki, która kumuluje się w mitochondriach i prowadzi do podwyższenia poziomu anionorodnika ponadtlenkowego w tym organellum24,27. Gdyby ekspresja mtHyPer7 indukowała stres oksydacyjny w mitochondriach lub chroniła mitochondria przed stresem oksydacyjnym, komórki wykazujące ekspresję mtHyPer7 powinny odpowiednio wykazywać zwiększoną lub zmniejszoną wrażliwość na działanie parakwatu. Leczenie niskimi stężeniami parakwatu spowodowało spadek tempa wzrostu drożdży. Co więcej, tempo wzrostu komórek typu dzikiego i komórek wykazujących ekspresję mtHyPer7 w obecności parakwatu było podobne (Rycyna 3C,E). Zatem ekspresja biosensora nie wywołała istotnego stresu komórkowego w komórkach drożdży pączkujących ani nie zmieniła wrażliwości drożdży na mitochondrialny stres oksydacyjny.
Biorąc pod uwagę dowody na to, że mtHyPer7 nadaje się do badania mitochondrialnego H2O2 u drożdży pączkujących, sprawdzono, czy mtHyPer7 może wykrywać mitochondrialny&#160;H2O2 w drożdżach typu dzikiego w środkowej fazie logarytmicznej oraz zmiany w poziomie mitochondrialnego H2O2 wywołane przez zewnętrznie dodany H2O2. Przeprowadzono eksperyment miareczkowania H2O2 i zmierzono w mitochondriach średni stosunek formy utlenionej do zredukowanej (O/R) mtHyPer7.
Zautomatyzowane skrypty analityczne wygenerowały kilka plików wyjściowych.
Obraz stosunku (ratio.tif): stos Z składający się ze stosunku stosów 488 nm i 405 nm po korekcie tła i zastosowaniu progu. Stos ten można przeglądać w programie Fiji bez dodatkowej obróbki; zaleca się jednak zwiększenie kontrastu i/lub kolorowanie obrazu zgodnie z opisem w kroku protokołu 4.3 lub 5.6 przed analizą.
Obraz maski (mask.tif): stos Z składający się z obszarów mitochondrialnych po zastosowaniu progu, wykorzystywany do analizy. Obraz ten należy wykorzystać do oceny dokładności procesu progowania.
Obszary zainteresowania (ROI) użyte do analizy (ROIs.zip): Po otwarciu tego pliku w programie Fiji wraz z obrazem źródłowym, ROI są nakładane na obraz w celu zestawienia tabeli wyników z obrazem źródłowym. Każdy obszar ROI został przemianowany, przypisując mu numer komórki oraz numer ROI.
Tabele pomiarowe (NumResults.csv, DenomResults.csv, Results.csv) zawierające powierzchnię, średnią wartość oraz gęstość zintegrowaną progowych mitochondriów dla każdego przekroju w obrazach licznika, mianownika i stosunku, odpowiednio. W przekrojach, w których mitochondria były nieobecne lub znajdowały się poza ogniskową, zapisano wartość NaN.
Plik dziennika (Log.txt) dokumentujący opcje użyte do korekcji tła i szumu, progowania oraz obliczania stosunku.
Stosunek O/R w przypadku mtHyPer7 wykazał odpowiedź zależną od dawki stężenia H2O2, która osiągnęła plateau przy 1-2 mM zewnętrznie dodanego H2O2 (Rycina 7). Co zaskakujące, stosunek HyPer7 był niższy w komórkach eksponowanych na 0,1 mM H2O2 niż w komórkach kontrolnych, choć różnica ta nie była istotna statystycznie. Jednym z wyjaśnień tego zjawiska może być odpowiedź hormetyczna, w której ekspozycja na niski poziom stresora może indukować odpowiedzi stresowe, takie jak mechanizmy antyoksydacyjne, co z kolei obniża ilość ROS wykrywalną przez sondę. Wyższe poziomy stresorów mogą natomiast przełamać wewnętrzne odpowiedzi stresowe i skutkować wyższym odczytem z HyPer7.
<img alt="Rysunek 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig07.jpg" /> 
Rysunek 7: Odpowiedź mtHyPer7 na zewnętrznie dodany H2O2. (A)&#160;Maksymalna projekcja obrazów wzbudzanych przy 405 nm i 488 nm oraz średnia projekcja intensywności obrazów ratiometrycznych mtHyPer7 w komórkach w środkowej fazie logarytmicznej wystawionych na działanie różnych stężeń H2O2. Kolory pseudobarwne wskazują stosunek utlenionego do zredukowanego mtHyPer7 (skala na dole). Pasek skali = 1 µm. Obrys komórki pokazano w kolorze białym; n &#62; 100 komórek na warunek. (B)&#160;Ilościowe oznaczenie stosunku utlenionego do zredukowanego mtHyPer7 w komórkach drożdży pączkujących traktowanych różnymi stężeniami H2O2. Przedstawiono średnie z pięciu niezależnych prób, przy czym każda próba jest oznaczona symbolem o innym kształcie i kolorze. Średnia ± SEM stosunku utlenionego do zredukowanego mtHyPer7: 1,794 ± 0,07627 (brak traktowania), 1,357 ± 0,03295 (0,1 mM), 2,571 ± 0,3186 (0,5 mM), 6,693 ± 0,5194 (1 mM), 7,017 ± 0,1197 (2 mM). p &#60; 0,0001 (jednoczynnikowa ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya). Wartości p oznaczono jako: ****p &#60; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wreszcie, wcześniejsze badania wykazały, że zdrowsze mitochondria, które są bardziej zredukowane i zawierają mniej ponadtlenku, są preferencyjnie dziedziczone przez komórki potomne drożdży4, a katalazy cytozolowe są transportowane do komórek potomnych drożdży i tam aktywowane42,43,44,45. Badania te dokumentują asymetryczne dziedziczenie mitochondriów podczas podziału komórek drożdży oraz rolę tego procesu w kondycji i długości życia komórek potomnych, a także w asymetrii wieku między komórką macierzystą a potomną. Aby sprawdzić, czy istnieją różnice w poziomie H2O2 między komórkami macierzystymi a pączkami, zmierzono poziom mtHyPer7 w pączkach i komórkach macierzystych. W obrębie komórek drożdży zaobserwowano różnice w poziomie mitochondrialnego H2O2 i wykryto niewielki, ale statystycznie istotny spadek odczytu biosensora H2O2 w mitochondriach pączka w porównaniu do mitochondriów w komórce macierzystej (Rysunek 8). Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi ustaleniami, według których mitochondria w pączku są lepiej chronione przed stresem oksydacyjnym. Stanowią one również dowód na to, że mtHyPer7 może dostarczyć ilościowego odczytu poziomu mitochondrialnego H2O2 z rozdzielczością komórkową i subkomórkową u drożdży pączkujących.
<img alt="Rysunek 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig08.jpg" /> 
Rysunek 8: Poziom mitochondrialnego H2O2 jest niższy w komórce potomnej. (A)&#160;Maksymalna projekcja obrazu ratiometrycznego mtHyPer7 w reprezentatywnej komórce. Kolor pseudobarwny wskazuje stosunek utlenionego do zredukowanego mtHyPer7 (skala na dole). Widoczne są różnice wewnątrzkomórkowe w tym stosunku (groty strzałek). Pasek skali = 1 µm. Obrys komórki: biały.&#160;(B) Różnica między stosunkiem mtHyPer7 w pączku a komórką macierzystą. Dla każdej pojedynczej komórki od wartości stosunku w pączku odjęto wartość stosunku w komórce macierzystej i naniesiono jako punkt. n = 193 komórki z pięciu niezależnych eksperymentów, przedstawione za pomocą symboli w różnych kolorach dla każdego eksperymentu. Średnia ± SEM różnicy między stosunkiem mtHyPer7 w pączkach a komórkach macierzystych: -0,04297 ± 0,01266. p = 0,0008 (test t dla prób zależnych) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela uzupełniająca S1: Szczepy użyte w niniejszym badaniu. Lista użytych szczepów drożdży. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental Table 1 Strains used in this study-R2.xls" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca S2: Plasmidy użyte w tej badaniu. Lista użytych plazmidów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/Supplemental Table 2 Plasmids used in this study-R2.xls" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca S3: Startery użyte w niniejszym badaniu. Lista użytych starterów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental Table 3 Primers used in this study-R2.xls" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 1: Protokół konstrukcji plazmidu biosensora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Yang et al Supp Protocol 2023.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2:&#160;Skrypty do zautomatyzowanej analizy. Dla każdego skryptu dostarczono przykładowe pliki wejściowe i wyjściowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/biosensor-supplemental-coding-files.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Nadtlenek wodoru (H2O2) jest zarówno źródłem uszkodzeń oksydacyjnych, jak i cząsteczką sygnałową. Protokół ten opisuje, jak mierzyć mitochondrialneH2O2za pomocą ukierunkowanego na mitochondria HyPer7 (mtHyPer7), genetycznie kodowanego biosensora ratiometrycznego, u żywych drożdży. Szczegółowo opisuje, jak zoptymalizować warunki obrazowania i przeprowadzić ilościową analizę komórkową i subkomórkową przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania.

Obrazowanie mtHyPer7, ratiometrycznego biosensora do pomiaru nadtlenku mitochondriów, w żywych komórkach drożdży

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Mitochondria to organelle w komórkach, które ułatwiają mobilizację energii, centralny metabolizm, produkcję ważnych makrocząsteczek, magazynowanie wapnia i transdukcję sygnału. W rezultacie odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu komórek, sprawności i kontroli długości życia. Nasze badania koncentrują się na zbadaniu wpływu mitochondriów na starzenie się, wykorzystując pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae jako organizm modelowy.Obrazowanie żywych komórek jest naszym najlepszym narzędziem do obserwacji zmienności funkcji mitochondriów. Tutaj opisujemy metodę, która wykorzystuje genetycznie zakodowany, ratiometryczny, zmiennospektralny bioczujnik o nazwie mitochondrialny HyPer 7. MtHyPer 7 wykrywa nadtlenek wodoru, reaktywną formę tlenu, która może uszkadzać składniki komórkowe, ale działa również jako cząsteczka sygnałowa w mitochondriach żywych komórek.MtHyPer 7 ma wysokie powinowactwo do nadtlenku wodoru i niską wrażliwość na pH. Jest zintegrowany z genomem drożdży, co skutkuje stabilną i spójną ekspresją w populacjach komórek drożdży. Wreszcie, jest ilościowo ukierunkowany na mitochondria i nie ma wykrywalnego wpływu na funkcję komórek lub mitochondriów lub ich przydatność.Bioczujniki, takie jak mtHyPer 7, mają kluczowe znaczenie dla badania funkcji mitochondriów w rozdzielczości subkomórkowej, znajdowania mechanizmów leżących u podstaw kontroli jakości mitochondriów oraz badania, jak ten proces wpływa na sprawność, los i długość życia komórek. mtHyPer 7 zapewnia spójne oznakowanie w przeciwieństwie do barwników organicznych stosowanych do wykrywania reaktywnych form tlenu. W porównaniu z czujnikami opartymi na FRET, mtHyPer 7 jest bardziej kompaktowy i pozwala uniknąć problemów, takich jak wzbudzenie krzyżowe i przebijanie, a także precyzyjne pozycjonowanie i wymagania dotyczące orientacji dla FRET.Na początek weź jeden mililitr pączkującej kultury komórek drożdży w środkowej fazie logarytmicznej z ekspresją HyPer 7 ukierunkowanej na mitochondria. Odwirować komórki przy 6 000 G przez 30 sekund i usunąć supernatant, pozostawiając 10 do 20 mikrolitrów w probówce. Ponownie zawiesić osad komórkowy, delikatnie mieszając go z pozostałymi mediami za pomocą mikropipety.Następnie użyj dmuchawy powietrza lub niestrzępiącej się chusteczki do czyszczenia szklanego szkiełka mikroskopowego i dodaj 1,8 mikrolitra zawiesiny komórek do szkiełka. Na koniec przykryj komórki szklanym szkiełkiem nakrywkowym o numerze 1,5, opuszczając je powoli pod kątem, aby uniknąć wprowadzenia bąbelków. Następnie umieść szkiełko na stoliku mikroskopu.Aby zobrazować komórki, ustaw warunki akwizycji, aby zapewnić wykrywalny sygnał i akceptowalną rozdzielczość w każdym kanale fluorescencyjnym. Na przykład w mikroskopie konfokalnym z obracającym się dyskiem z kamerą sCMOS użyj binningu dwa na dwa, mocy lasera od 20% do 40% i naświetlania od 200 do 600 milisekund. Następnie sprawdź histogram obrazu.W przypadku obrazu 12-bitowego upewnij się, że całkowity zakres dynamiczny wartości pikseli wynosi co najmniej kilkaset poziomów szarości bez nasycenia. Dodatkowo upewnij się, że zakres jest o jeden rząd wielkości wyższy niż poziom hałasu. Aby obliczyć poziom szumu, zmierz odchylenie standardowe wartości pikseli w obszarze obrazu wolnym od komórek.Następnie zbierz obrazy poklatkowe bez opóźnień między akwizycjami, aby ocenić wpływ warunków obrazowania na stabilność sygnału i stres oksydacyjny w mitochondriach. Korzystając z oprogramowania do akwizycji mikroskopu, czyli ImageJ, zmierz średnią wartość piksela w każdym kanale fluorescencji, aby zapewnić stabilność sygnału. Jeśli eksperyment nie obejmuje obrazowania poklatkowego, upewnij się, że fluorescencja jest stabilna na dwóch lub trzech powtarzających się stosach Z.Uzyskuj obrazy z odstępem Z wynoszącym 0,5 mikrometra i całkowitą głębokością stosu wynoszącą sześć mikrometrów dla pączkujących drożdży. W przypadku zbierania stosów Z upewnij się, że interwał Z jest taki sam dla wszystkich obrazów w zestawie danych i obejmuje całą komórkę. Pobieraj również obrazy w świetle przechodzącym, aby udokumentować granice komórek.Aby rozpocząć, otwórz wielokanałowy obraz stosu Z na Fidżi i otwórz żądany plik skryptu analizy biosensora. Kliknij przycisk Uruchom w oknie edytora skryptów, aby uruchomić skrypt. Następnie wprowadź wymagane informacje w wyświetlonym oknie dialogowym.Wybierz numery kanałów licznika i mianownika do obliczenia stosunku. W przypadku HyPer 7 ukierunkowanego na mitochondria licznikiem jest kanał wzbudzony przy 488 nanometrach, a mianownik to kanał wzbudzony przy 405 nanometrach. Wybierz numer kanału obrazu w świetle przechodzącym, jeśli jest obecny, lub zero, jeśli go nie ma.Następnie wybierz żądaną metodę odejmowania tła. Jeśli tło jest jednolite, kliknij opcję Wybierz obszar obrazu, aby zmierzyć poziom tła na obrazie. Następnie wybierz żądaną metodę odejmowania szumów, aby zmniejszyć losowe zmiany w odczycie detektora.Kliknij opcję Wybierz obszar obrazu. Wybierz opcję stałej wartości, aby wprowadzić wcześniej zmierzony poziom szumu, który zwykle działa dobrze, jeśli warunki obrazowania są utrzymywane na stałym poziomie. Aby uzyskać dokładne i spójne wykrywanie mitochondriów, wybierz algorytm progowania, taki jak O2 lub maksymalna entropia.Użyj tego samego algorytmu dla wszystkich obrazów w eksperymencie, ale upewnij się, że mitochondria są dokładnie rozpoznane. Następnie wybierz liczbę obszarów zainteresowania w komórce. Na przykład, jeśli mierzysz różnice między pąkami macierzystymi, wybierz dwa.Wybierz folder wyjściowy, w którym zostaną zapisane obrazy pomiarów i proporcji. Aby uzyskać korekcję tła lub szumu, wybierz opcję Wybierz obszar obrazu, postępuj zgodnie z instrukcjami, aby narysować obszar tła za pomocą narzędzia ROI prostokąta, a następnie kliknij przycisk W porządku. Analizując poszczególne komórki lub regiony subkomórkowe, narysuj obszary zainteresowania na podstawie obrazu jasnego pola.Zwrot z inwestycji nie musi dokładnie odpowiadać konturowi komórki, ponieważ mierzone będą tylko mitochondria progowe w obrębie ROI. Po utworzeniu każdego ROI naciśnij T, aby dodać wybrany ROI do Menedżera ROI. Zaznacz opcję Pokaż wszystko w menedżerze ROI, aby udokumentować zaznaczone komórki.Każdy dodany region pojawi się jako numerowany element na liście menedżera ROI. Jeśli analizujesz więcej niż jeden zwrot z inwestycji na komórkę, zaznacz zwrot z inwestycji w tej samej kolejności dla każdej analizowanej komórki. Po dodaniu wszystkich żądanych ROI do menedżera ROI kliknij przycisk OK w oknie dialogowym Zaznacz komórki.Następnie wybierz format tabeli pomiarów. W oknie dialogowym z wieloma miarami zaznacz opcje Zmierz wszystkie wycinki i Jeden wiersz na wycinek, aby utworzyć tabelę o żądanym formacie. Skorzystaj z ProcessMultiROITables.Skrypt języka R do przetwarzania tabel utworzonych za pomocą opcji Jeden wiersz na wycinek. Nie zaznaczaj opcji Dołącz wyniki. Zapisz pliki wyjściowe w wybranym folderze za pomocą skryptu.Teraz otwórz obraz proporcji Z-Stack na Fidżi, aby wygenerować obraz o pokolorowanych proporcjach. Następnie otwórz colorize_ratio_image. ijm script i kliknij Uruchom w oknie Script Editor (Edytor skryptów).Pojawi się okno dialogowe z prośbą o wprowadzenie wymaganych informacji. W opcji Niemodulowane wszystkie piksele mitochondrialne pojawiają się przy tej samej jasności. Niektóre obrazy mogą wydawać się zaszumione, ponieważ przyciemnione i jasne piksele przyczyniają się do proporcji obrazu.Użyj opcji Intensywność modulowana, aby zredukować szum. W metodzie minimalnych i maksymalnych wyświetlanych wartości wybierz wartości zbliżone do średnich wartości minimalnych i maksymalnych zaobserwowanych w eksperymencie. Aby zapewnić spójność, wszystkie obrazy należy uzyskać w tych samych warunkach obrazowania i wyświetlić wszystkie obrazy przy użyciu tych samych wartości minimalnych i maksymalnych.Następnie wybierz tryb projekcji, aby wyświetlić stos Z i pokazać całą populację mitochondriów przed kolorowaniem. Aby uzyskać projekcję maksymalnej intensywności, wybierz opcję Maksimum. Aby utworzyć projekcję średniej intensywności, wybierz opcję Średnia.Na koniec wybierz folder, w którym chcesz zapisać pokolorowane obrazy. Jeśli zaznaczona jest opcja Bez modulacji, wybierz schemat kolorów w wyświetlonym oknie dialogowym. Wykorzystaj tabele przeglądowe Fire lub Rainbow RGB wbudowane w Fidżi lub dowolną żądaną tabelę przeglądową w formacie LUT ImageJ.Użyj skryptu, aby zapisać pliki wyjściowe w wybranym folderze. Utleniony, zredukowany stosunek znakowanego mitochondriami HyPer 7 wykazywał zależną od dawki reakcję na stężenie nadtlenku wodoru, które osiągnęło plateau przy jednym do dwóch milimolowych zewnętrznie dodanych nadtlenkach wodoru. W komórkach drożdży zaobserwowano różnice w mitochondrialnym nadtlenku wodoru.Statystycznie istotny spadek odczytu biosensora nadtlenku wodoru wykryto w mitochondriach w zarodku w porównaniu z komórką macierzystą.

imaging-mthyper7-ratiometric-biosensor-for-mitochondrial-peroxide

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy użycie dwóch ratiometrycznych, genetycznie kodowanych biosensorów, które są oparte na GFP, do monitorowania mitochondrialnego stanu redoks i poziomów ATP w rozdzielczości subkomórkowej w żywych komórkach drożdży.

Biosensory ratiometryczne, które mierzą mitochondrialny stan redoks i ATP w żywych komórkach drożdży

Szybkie techniki wizualizacji coraz unieruchomionych komórek drożdży, tutaj stosowane do świetlówek dziennikarzom w cichej krycia loci HML i...

Szybkie Technika Wizualizacja żywo unieruchomionych komórek drożdży

Wczesny rozwój muszki owocówki, Drosophila melanogaster, charakteryzuje się szeregiem zmian kształtu komórek, które są bardzo odpowiednie dla metod obrazowania. Niniejszy artykuł opisze podstawowe narzędzia i metody niezbędne do konfokalnego obrazowania zarodków Drosophila na żywo, koncentrując się na procesie zmiany kształtu komórek zwanym cellularizacją.

Obrazowanie zmian kształtu komórek w żywych zarodkach Drosophila

Ratiometryczne dwumolekularne latarnie (RBMB) mogą być używane do obrazowania pojedynczych transkryptów RNA w żywych komórkach. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i oczyszczanie RBMB, dostarczanie RBMB do komórek za pomocą mikroporacji i obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych transkryptów RNA w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych

Pojedyncze fluorofory mogą być lokalizowane z nanometrową precyzją za pomocą FIONA. W tym miejscu przedstawiono podsumowanie techniki FIONA oraz opisano sposób przeprowadzania eksperymentów FIONA.

Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością jednego nanometra (FIONA)

Uszkodzenia nerek spowodowane nefrotoksynami, które obejmują różne leki, od antybiotyków po chemioterapeutyki, mogą powodować złożone zaburzenia, których patogeneza pozostaje nie do końca poznana. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób danio pręgowany może być wykorzystany do modelowania chorób tych stanów, co można zastosować do identyfikacji środków renoprotekcyjnych.

Mikroiniekcja nefrotoksyny u danio pręgowanego w celu modelowania ostrego uszkodzenia nerek

Szczegółowo opisano protokoły hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), przejściowej transfekcji znakowanych fluorescencyjnie markerów wzrostu mikrotubul, obrazowania żywych komórek i automatycznej analizy dynamiki wzrostu mikrotubul międzyfazowych.

Obrazowanie poklatkowe w wysokiej rozdzielczości i automatyczna analiza dynamiki mikrotubul w żywych ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej

Mitochondria mogą wykorzystywać potencjał elektrochemiczny w swojej wewnętrznej błonie (ΔΨm) do sekwestracji wapnia (Ca2+), co pozwala im kształtować cytozolową sygnalizację Ca2+ w komórce. Opisano metodę jednoczesnego pomiaru wychwytu Ca2+ i ΔΨm w mitochondriach w żywych komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Prezentujemy oprogramowanie do półautomatycznego śledzenia względnego stężenia białka na całej długości dynamicznych wypukłości komórkowych.

Graficzny interfejs użytkownika do wspomaganego programowo śledzenia stężenia białka w dynamicznych wypukłościach komórkowych

Protokół opisuje specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych za pomocą komercyjnie dostępnego barwnika żelowego DNA, akwizycję serii poklatkowych żywych znakowanych komórek za pomocą super-rozdzielczej mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SR-SIM) oraz automatyczne śledzenie ruchu nukleoidów.

Specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych dla poklatkowej mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Poznaj metodę obrazowania nadtlenku wodoru w mitochondriach żywych komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae za pomocą ratiometrycznego biosensora mtHyPer7. Technika ta umożliwia badanie funkcji mitochondrialnych i procesów starzenia.

Obrazowanie mtHyPer7, ratiometrycznego biosensora do pomiaru nadtlenku mitochondriów, w żywych komórkach drożdży

Przeglądaj więcej filmów