Obrazowanie mtHyPer7, ratiometrycznego biosensora do pomiaru nadtlenku mitochondriów, w żywych komórkach drożdży

Mitochondria to organelle w komórkach, które ułatwiają mobilizację energii, centralny metabolizm, produkcję ważnych makrocząsteczek, magazynowanie wapnia i transdukcję sygnału. W rezultacie odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu komórek, sprawności i kontroli długości życia. Nasze badania koncentrują się na zbadaniu wpływu mitochondriów na starzenie się, wykorzystując pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae jako organizm modelowy.

Obrazowanie żywych komórek jest naszym najlepszym narzędziem do obserwacji zmienności funkcji mitochondriów. Tutaj opisujemy metodę, która wykorzystuje genetycznie zakodowany, ratiometryczny, zmiennospektralny bioczujnik o nazwie mitochondrialny HyPer 7. MtHyPer 7 wykrywa nadtlenek wodoru, reaktywną formę tlenu, która może uszkadzać składniki komórkowe, ale działa również jako cząsteczka sygnałowa w mitochondriach żywych komórek.

MtHyPer 7 ma wysokie powinowactwo do nadtlenku wodoru i niską wrażliwość na pH. Jest zintegrowany z genomem drożdży, co skutkuje stabilną i spójną ekspresją w populacjach komórek drożdży. Wreszcie, jest ilościowo ukierunkowany na mitochondria i nie ma wykrywalnego wpływu na funkcję komórek lub mitochondriów lub ich przydatność.

Bioczujniki, takie jak mtHyPer 7, mają kluczowe znaczenie dla badania funkcji mitochondriów w rozdzielczości subkomórkowej, znajdowania mechanizmów leżących u podstaw kontroli jakości mitochondriów oraz badania, jak ten proces wpływa na sprawność, los i długość życia komórek. mtHyPer 7 zapewnia spójne oznakowanie w przeciwieństwie do barwników organicznych stosowanych do wykrywania reaktywnych form tlenu. W porównaniu z czujnikami opartymi na FRET, mtHyPer 7 jest bardziej kompaktowy i pozwala uniknąć problemów, takich jak wzbudzenie krzyżowe i przebijanie, a także precyzyjne pozycjonowanie i wymagania dotyczące orientacji dla FRET.

Na początek weź jeden mililitr pączkującej kultury komórek drożdży w środkowej fazie logarytmicznej z ekspresją HyPer 7 ukierunkowanej na mitochondria. Odwirować komórki przy 6 000 G przez 30 sekund i usunąć supernatant, pozostawiając 10 do 20 mikrolitrów w probówce. Ponownie zawiesić osad komórkowy, delikatnie mieszając go z pozostałymi mediami za pomocą mikropipety.

Następnie użyj dmuchawy powietrza lub niestrzępiącej się chusteczki do czyszczenia szklanego szkiełka mikroskopowego i dodaj 1,8 mikrolitra zawiesiny komórek do szkiełka. Na koniec przykryj komórki szklanym szkiełkiem nakrywkowym o numerze 1,5, opuszczając je powoli pod kątem, aby uniknąć wprowadzenia bąbelków. Następnie umieść szkiełko na stoliku mikroskopu.

Aby zobrazować komórki, ustaw warunki akwizycji, aby zapewnić wykrywalny sygnał i akceptowalną rozdzielczość w każdym kanale fluorescencyjnym. Na przykład w mikroskopie konfokalnym z obracającym się dyskiem z kamerą sCMOS użyj binningu dwa na dwa, mocy lasera od 20% do 40% i naświetlania od 200 do 600 milisekund. Następnie sprawdź histogram obrazu.

W przypadku obrazu 12-bitowego upewnij się, że całkowity zakres dynamiczny wartości pikseli wynosi co najmniej kilkaset poziomów szarości bez nasycenia. Dodatkowo upewnij się, że zakres jest o jeden rząd wielkości wyższy niż poziom hałasu. Aby obliczyć poziom szumu, zmierz odchylenie standardowe wartości pikseli w obszarze obrazu wolnym od komórek.

Następnie zbierz obrazy poklatkowe bez opóźnień między akwizycjami, aby ocenić wpływ warunków obrazowania na stabilność sygnału i stres oksydacyjny w mitochondriach. Korzystając z oprogramowania do akwizycji mikroskopu, czyli ImageJ, zmierz średnią wartość piksela w każdym kanale fluorescencji, aby zapewnić stabilność sygnału. Jeśli eksperyment nie obejmuje obrazowania poklatkowego, upewnij się, że fluorescencja jest stabilna na dwóch lub trzech powtarzających się stosach Z.

Uzyskuj obrazy z odstępem Z wynoszącym 0,5 mikrometra i całkowitą głębokością stosu wynoszącą sześć mikrometrów dla pączkujących drożdży. W przypadku zbierania stosów Z upewnij się, że interwał Z jest taki sam dla wszystkich obrazów w zestawie danych i obejmuje całą komórkę. Pobieraj również obrazy w świetle przechodzącym, aby udokumentować granice komórek.

Aby rozpocząć, otwórz wielokanałowy obraz stosu Z na Fidżi i otwórz żądany plik skryptu analizy biosensora. Kliknij przycisk Uruchom w oknie edytora skryptów, aby uruchomić skrypt. Następnie wprowadź wymagane informacje w wyświetlonym oknie dialogowym.

Wybierz numery kanałów licznika i mianownika do obliczenia stosunku. W przypadku HyPer 7 ukierunkowanego na mitochondria licznikiem jest kanał wzbudzony przy 488 nanometrach, a mianownik to kanał wzbudzony przy 405 nanometrach. Wybierz numer kanału obrazu w świetle przechodzącym, jeśli jest obecny, lub zero, jeśli go nie ma.

Następnie wybierz żądaną metodę odejmowania tła. Jeśli tło jest jednolite, kliknij opcję Wybierz obszar obrazu, aby zmierzyć poziom tła na obrazie. Następnie wybierz żądaną metodę odejmowania szumów, aby zmniejszyć losowe zmiany w odczycie detektora.

Kliknij opcję Wybierz obszar obrazu. Wybierz opcję stałej wartości, aby wprowadzić wcześniej zmierzony poziom szumu, który zwykle działa dobrze, jeśli warunki obrazowania są utrzymywane na stałym poziomie. Aby uzyskać dokładne i spójne wykrywanie mitochondriów, wybierz algorytm progowania, taki jak O2 lub maksymalna entropia.

Użyj tego samego algorytmu dla wszystkich obrazów w eksperymencie, ale upewnij się, że mitochondria są dokładnie rozpoznane. Następnie wybierz liczbę obszarów zainteresowania w komórce. Na przykład, jeśli mierzysz różnice między pąkami macierzystymi, wybierz dwa.

Wybierz folder wyjściowy, w którym zostaną zapisane obrazy pomiarów i proporcji. Aby uzyskać korekcję tła lub szumu, wybierz opcję Wybierz obszar obrazu, postępuj zgodnie z instrukcjami, aby narysować obszar tła za pomocą narzędzia ROI prostokąta, a następnie kliknij przycisk W porządku. Analizując poszczególne komórki lub regiony subkomórkowe, narysuj obszary zainteresowania na podstawie obrazu jasnego pola.

Zwrot z inwestycji nie musi dokładnie odpowiadać konturowi komórki, ponieważ mierzone będą tylko mitochondria progowe w obrębie ROI. Po utworzeniu każdego ROI naciśnij T, aby dodać wybrany ROI do Menedżera ROI. Zaznacz opcję Pokaż wszystko w menedżerze ROI, aby udokumentować zaznaczone komórki.

Każdy dodany region pojawi się jako numerowany element na liście menedżera ROI. Jeśli analizujesz więcej niż jeden zwrot z inwestycji na komórkę, zaznacz zwrot z inwestycji w tej samej kolejności dla każdej analizowanej komórki. Po dodaniu wszystkich żądanych ROI do menedżera ROI kliknij przycisk OK w oknie dialogowym Zaznacz komórki.

Następnie wybierz format tabeli pomiarów. W oknie dialogowym z wieloma miarami zaznacz opcje Zmierz wszystkie wycinki i Jeden wiersz na wycinek, aby utworzyć tabelę o żądanym formacie. Skorzystaj z ProcessMultiROITables.

Skrypt języka R do przetwarzania tabel utworzonych za pomocą opcji Jeden wiersz na wycinek. Nie zaznaczaj opcji Dołącz wyniki. Zapisz pliki wyjściowe w wybranym folderze za pomocą skryptu.

Teraz otwórz obraz proporcji Z-Stack na Fidżi, aby wygenerować obraz o pokolorowanych proporcjach. Następnie otwórz colorize_ratio_image. ijm script i kliknij Uruchom w oknie Script Editor (Edytor skryptów).

Pojawi się okno dialogowe z prośbą o wprowadzenie wymaganych informacji. W opcji Niemodulowane wszystkie piksele mitochondrialne pojawiają się przy tej samej jasności. Niektóre obrazy mogą wydawać się zaszumione, ponieważ przyciemnione i jasne piksele przyczyniają się do proporcji obrazu.

Użyj opcji Intensywność modulowana, aby zredukować szum. W metodzie minimalnych i maksymalnych wyświetlanych wartości wybierz wartości zbliżone do średnich wartości minimalnych i maksymalnych zaobserwowanych w eksperymencie. Aby zapewnić spójność, wszystkie obrazy należy uzyskać w tych samych warunkach obrazowania i wyświetlić wszystkie obrazy przy użyciu tych samych wartości minimalnych i maksymalnych.

Następnie wybierz tryb projekcji, aby wyświetlić stos Z i pokazać całą populację mitochondriów przed kolorowaniem. Aby uzyskać projekcję maksymalnej intensywności, wybierz opcję Maksimum. Aby utworzyć projekcję średniej intensywności, wybierz opcję Średnia.

Na koniec wybierz folder, w którym chcesz zapisać pokolorowane obrazy. Jeśli zaznaczona jest opcja Bez modulacji, wybierz schemat kolorów w wyświetlonym oknie dialogowym. Wykorzystaj tabele przeglądowe Fire lub Rainbow RGB wbudowane w Fidżi lub dowolną żądaną tabelę przeglądową w formacie LUT ImageJ.

Użyj skryptu, aby zapisać pliki wyjściowe w wybranym folderze. Utleniony, zredukowany stosunek znakowanego mitochondriami HyPer 7 wykazywał zależną od dawki reakcję na stężenie nadtlenku wodoru, które osiągnęło plateau przy jednym do dwóch milimolowych zewnętrznie dodanych nadtlenkach wodoru. W komórkach drożdży zaobserwowano różnice w mitochondrialnym nadtlenku wodoru.

Statystycznie istotny spadek odczytu biosensora nadtlenku wodoru wykryto w mitochondriach w zarodku w porównaniu z komórką macierzystą.