Name: Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Odkryj genomowe badania przesiewowe shRNA i sekwencjonowanie pojedynczych komórek w celu identyfikacji receptorów terapeutycznych w guzach osłonki nerwów obwodowych. Metoda umożliwia analizę ponad 15 000 genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 i R01 NS109655 dla S.L.C.; R01 NS109655-03S1 do D.P.J.), National Cancer Institute (R01 CA122804 do S.L.C.) oraz Departament Obrony (X81XWH-09-1-0086 i W81XWH-12-1-0164 do S.L.C.).

Genome-Scale Screening to Identify and Compare Therapeutic Targets in Tumors

<ol><li>Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+promoting+the+pathogenesis+of+Schwann+cell+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms.</a> Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).</li>
<li>Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+the+Diagnosis+and+Pathogenesis+of+Neurofibromatosis+Type+1+%28NF1%29-associated+Peripheral+Nervous+System+Neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Anat+Pathol%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in the Diagnosis and Pathogenesis of Neurofibromatosis Type 1 (NF1)-associated Peripheral Nervous System Neoplasms.</a> Adv Anat Pathol. 25 (5), 353-368 (2018).</li>
<li>Longo, J. F., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RASopathies%3A+Biology%2C+genetics+and+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options.</a> Adv Cancer Res. 153, 305-341 (2022).</li>
<li>Birindelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb+and+TP53+pathway+alterations+in+sporadic+and+NF1-related+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Rb and TP53 pathway alterations in sporadic and NF1-related malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Lab Invest. 81 (6), 833-844 (2001).</li>
<li>Legius, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TP53+mutations+are+frequent+in+malignant+NF1+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">TP53 mutations are frequent in malignant NF1 tumors.</a> Genes Chromosomes Cancer. 10 (4), 250-255 (1994).</li>
<li>Menon, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+17p+deletions+and+p53+gene+mutations+associated+with+the+formation+of+malignant+neurofibrosarcomas+in+von+Recklinghausen+neurofibromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chromosome 17p deletions and p53 gene mutations associated with the formation of malignant neurofibrosarcomas in von Recklinghausen neurofibromatosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (14), 5435-5439 (1990).</li>
<li>Upadhyaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+and+somatic+NF1+gene+mutation+spectrum+in+NF1-associated+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+%28MPNSTs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Germline and somatic NF1 gene mutation spectrum in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs).</a> Hum Mutat. 29 (1), 74-82 (2008).</li>
<li>Kourea, H. P., Orlow, I., Scheithauer, B. W., Cordon-Cardo, C., Woodruff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletions+of+the+INK4A+gene+occur+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+but+not+in+neurofibromas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Deletions of the INK4A gene occur in malignant peripheral nerve sheath tumors but not in neurofibromas.</a> Am J Pathol. 155 (6), 1855-1860 (1999).</li>
<li>Nielsen, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+transformation+of+neurofibromas+in+neurofibromatosis+1+is+associated+with+CDKN2A%2Fp16+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Malignant transformation of neurofibromas in neurofibromatosis 1 is associated with CDKN2A/p16 inactivation.</a> Am J Pathol. 155 (6), 1879-1884 (1999).</li>
<li>Gregorian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+dosage+is+essential+for+neurofibroma+development+and+malignant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (46), 19479-19484 (2009).</li>
<li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC2+is+recurrently+inactivated+through+EED+or+SUZ12+loss+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Nat Genet. 46 (11), 1227-1232 (2014).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+of+SUZ12+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Nat Genet. 46 (11), 1170-1172 (2014).</li>
<li>Varela, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+structural+rearrangements+in+genetically+engineered+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Somatic structural rearrangements in genetically engineered mouse mammary tumors.</a> Genome Biol. 11 (10), 100(2010).</li>
<li>Johnson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+genomics+matches+driver+mutations+and+cell+compartments+to+model+ependymoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cross-species genomics matches driver mutations and cell compartments to model ependymoma.</a> Nature. 466 (7306), 632-636 (2010).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+oncogenomics+identifies+NEDD9+as+a+melanoma+metastasis+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene.</a> Cell. 125 (7), 1269-1281 (2006).</li>
<li>Zender, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+oncogenes+in+liver+cancer+using+an+integrative+oncogenomic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach.</a> Cell. 125 (7), 1253-1267 (2006).</li>
<li>Uren, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+mutagenesis+in+p19%28ARF%29-+and+p53-deficient+mice+identifies+cancer+genes+and+their+collaborative+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale mutagenesis in p19(ARF)- and p53-deficient mice identifies cancer genes and their collaborative networks.</a> Cell. 133 (4), 727-741 (2008).</li>
<li>Starr, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-based+genetic+screen+in+mice+identifies+genes+altered+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer.</a> Science. 323 (5922), 1747-1750 (2009).</li>
<li>Dupuy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+sleeping+beauty+transposon+system+that+can+be+used+to+model+a+wide+variety+of+human+cancers+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice.</a> Cancer Res. 69 (20), 8150-8156 (2009).</li>
<li>Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Challenge+of+Cancer+Genomics+in+Rare+Nervous+System+Neoplasms%3A+Malignant+Peripheral+Nerve+Sheath+Tumors+as+a+Paradigm+for+Cross-Species+Comparative+Oncogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The Challenge of Cancer Genomics in Rare Nervous System Neoplasms: Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors as a Paradigm for Cross-Species Comparative Oncogenomics.</a> Am J Pathol. 186 (3), 464-477 (2016).</li>
<li>Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+neuropathies+and+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+in+transgenic+mice+overexpressing+glial+growth+factor+beta3+in+myelinating+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells.</a> J Neurosci. 23 (19), 7269-7280 (2003).</li>
<li>Kazmi, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+overexpressing+neuregulin-1+model+neurofibroma-malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+progression+and+implicate+specific+chromosomal+copy+number+variations+in+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis.</a> Am J Pathol. 182 (3), 646-667 (2013).</li>
<li>Brosius, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin-1+overexpression+and+Trp53+haploinsufficiency+cooperatively+promote+de+novo+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis.</a> Acta Neuropathol. 127 (4), 573-591 (2014).</li>
<li>Hart, T., Brown, K. R., Sircoulomb, F., Rottapel, R., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+error+rates+in+genomic+perturbation+screens%3A+gold+standards+for+human+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics.</a> Mol Syst Biol. 10 (7), 733(2014).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR%2FSpCas9+Knockout+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens.</a> G3. 7 (8), Bethesda. 2719-2727 (2017).</li>
<li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+genomic+characterization+of+a+sporadic+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line.</a> Sci Rep. 11 (1), 5690(2021).</li>
<li>Maser, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomally+unstable+mouse+tumours+have+genomic+alterations+similar+to+diverse+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers.</a> Nature. 447 (7147), 966-971 (2007).</li>
<li>Rahrmann, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+screen+for+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+formation+identifies+new+genes+and+pathways+driving+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Forward genetic screen for malignant peripheral nerve sheath tumor formation identifies new genes and pathways driving tumorigenesis.</a> Nat Genet. 45 (7), 756-766 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Przedstawione tu szczegółowe metody zostały opracowane w celu badania neoplazji obwodowego układu nerwowego i patogenezy MPNST. Chociaż stwierdziliśmy, że te metody są skuteczne, należy zdać sobie sprawę, że istnieją pewne potencjalne ograniczenia metod, które tutaj opisujemy. Poniżej omawiamy niektóre z tych ograniczeń i potencjalne strategie ich pokonywania w innych systemach modelowych.
Odkryliśmy, że sekwencjonowanie całego egzomu skutecznie identyfikuje interesujące mutacje u myszy P 0-GG...

Złośliwe guzy osłonki nerwów obwodowych (MPNST) są wysoce agresywnymi nowotworami wrzecionowatokomórkowymi, które powstają w związku z zespołem podatności na nowotwory nerwiakowłókniakowatość typu 1 (NF1), sporadycznie w populacji ogólnej i w miejscach wcześniejszej radioterapii1,2,3. Pacjenci z NF1 rodzą się z dziką kopią genu supresorowego NF1 i drugim allelem NF1 z mutacją powodującą utratę funkcji. Ten stan haploinsuficjencji sprawia, że pacjenci z NF1 są podatni na drugą mutację powodującą utratę funkcji w genie NF1 typu dzikiego, która wywołuje nowotworzenie Kiedy ta mutacja NF1 "drugiego trafienia" występuje w komórce z linii komórek Schwanna, powstały guz jest albo nerwiakowłókniakiem skóry powstającym w skórze, albo nerwiakowłókniakiem splotowym, który rozwija się w dużych nerwach lub splotach nerwowych. Chociaż patologia nerwiakowłókniaków skórnych i splotowatych jest identyczna, ich zachowanie biologiczne jest zupełnie inne - chociaż zarówno nerwiakowłókniaki skórne, jak i splotowate są łagodne, tylko nerwiakowłókniaki splotowate mogą ulegać transformacji i powodować powstawanie MPNST. Oprócz utraty neurofibrominy, białka aktywującego GTPazę Ras kodowanego przez gen NF1, MPNST przenoszą mutacje wielu innych genów supresorowych nowotworów, w tym TP534,5,6,7, CDKN2A8,9 oraz PTEN10, mutacje genów kodujących składniki kompleksu represyjnego Polycomb 211,12 (PRC2; geny SUZ12 i EED) oraz nieprawidłowa ekspresja receptorowych kinaz tyrozynowych 1,2. Mutacje NF1 i innych genów wymienionych powyżej są również obecne w sporadycznych i wywołanych promieniowaniem MPNSTs11,12.
Chociaż te postępy w naszym zrozumieniu nieprawidłowości genomowych w MPNST były nieocenione dla zrozumienia ich patogenezy, nie doprowadziły jeszcze do opracowania nowych, skutecznych terapii dla MPNST. Główną barierą utrudniającą opracowywanie nowych metod leczenia jest fakt, że MPNST są rzadkimi nowotworami. Z tego powodu trudno jest uzyskać dużą liczbę próbek pacjentów, która jest wymagana do globalnych analiz definiujących kluczowe mutacje powodujące, takich jak te przeprowadzone przez The Cancer Genome Atlas (TCGA). Z naszego doświadczenia wynika, że zgromadzenie nawet niewielkiej liczby ludzkich próbek MPNST może zająć lata. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, wielu badaczy badających inne rzadkie typy nowotworów zwróciło się ku wykorzystaniu onkogenomiki porównawczej między gatunkami w celu zidentyfikowania istotnych mutacji genów napędowych, zdefiniowania podstawowych cytoplazmatycznych szlaków sygnałowych w guzie będącym przedmiotem zainteresowania i zidentyfikowania nowych celów terapeutycznych. Ponieważ szlaki sygnałowe, które są niezbędne do nowotworzenia, są wysoce konserwatywne między ludźmi a innymi gatunkami kręgowców, zastosowanie podejść genomiki funkcjonalnej, takich jak badania przesiewowe shRNA w skali genomu, może być skutecznym sposobem identyfikacji tych nowych mutacji napędzających, szlaków sygnałowych i celów terapeutycznych13,14,15,16,17,18,19, szczególnie podczas badania rzadkich typów nowotworów u ludzi, które są dostępne w ograniczonej liczbie20.
W prezentowanych tutaj metodologiach opisujemy to podejście do przeprowadzania profilowania genomowego w ludzkich liniach komórkowych MPNST i wczesnych pasażach hodowli MPNST pochodzących od myszy P 0-GGFβ3, genetycznie modyfikowany model myszy (GEM), w którym specyficzna dla komórek Schwanna nadekspresja czynnika wzrostu neureguliny-1 (NRG1) promuje patogenezę nerwiakowłókniaków splotowatych i ich późniejszą progresję do MPNSTs21,22,23. Pierwszym krokiem w tym podejściu jest identyfikacja potencjalnych genów sterujących w P 0-GGFβ3 MPNST, ludzkich liniach komórkowych MPNST i chirurgicznie wyciętych ludzkich MPNST. Aby funkcjonalnie zweryfikować szlaki sygnałowe, na które wpływają te mutacje, używamy badań przesiewowych shRNA w skali genomu w celu identyfikacji genów wymaganych do proliferacji i przeżycia w ludzkich i mysich liniach komórkowych MPNST. Po zidentyfikowaniu genów wymaganych do proliferacji i przeżycia, identyfikujemy produkty genów podatnych na działanie leków w kolekcji "trafień" za pomocą Bazy Danych Interakcji Genów Leków. Porównujemy również "trafienia" w ludzkich i mysich komórkach MPNST, aby określić, czy model GEM i ludzkie MPNST wykazują podobną zależność od tych samych genów i szlaków sygnałowych. Identyfikacja nakładających się genów wymaganych do proliferacji i przeżycia oraz dotkniętych szlaków sygnałowych służy jako sposób walidacji mysiego modelu P 0-GGFβ3 na poziomie molekularnym. Podejście to podkreśla również skuteczność łączenia badań przesiewowych na ludziach i myszach w celu identyfikacji nowych celów terapeutycznych, w przypadku których model mysi może służyć jako uzupełnienie badań przesiewowych u ludzi. Wartość tego międzygatunkowego podejścia jest szczególnie widoczna, gdy poszukuje się celów terapeutycznych w rzadkich nowotworach, w których ludzkie nowotwory i linie komórkowe są trudne do uzyskania.

<table><tbody><tr><td>System Sonikacji Bioruptor</td><td>Diagenode&nbsp;</td><td>UCD-600</td><td></td></tr><tr><td>CASAVA 1.8.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cbot</td><td>Illumina, San Diego, Kalifornia</td><td></td><td></td></tr> Nie dotyczy <tr><td>cytometru obrazowego Celigo</td><td>Nexcelom</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cellecta Analizator kodów kreskowych i oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td>dekonwolucyjne</tr><tr><td>Citrisolve Hybrid</td><td>Decon Laboratories</td><td>5989-27-5</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-dołkowa mikropłytka</td> Rurki stożkowe <td>Millipore Sigma</td><td>CLS3603</td><td></td></tr><tr><td>Diagenode Bioruptor 15ml</td><td>Diagenode&nbsp;</td><td></td><td></td>C30010009</tr><tr><td>mieszanka dNTP</td><td>Clontech</td><td>639210</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Thermo Scientific</td><td>7111</td><td></td></tr><tr><td>Bufor elucyjny</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (200 dowodów)</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Excel&nbsp;</td><td>Microsoft&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FWDGEX 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FWDHTS 5'-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GexSeqS (5' AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3'</td><td></td><td></td><td>Oczyszczony HPLC</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>Fisherbrand</td><td>245-677</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiScanSQ</td><td>Illumina, San Diego, CA</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehydu (4%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>PLUS Odczynnik do transfekcji</td><td>Thermo Scientific</td><td>11514015</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji polibrenu</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR1003G</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Zestaw do szybkiego oczyszczania PCR</td><td>Invitrogen</td><td>K310001</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Buffer P1</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>19051</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu Qiagen</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>RevGEX 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RevHTS1 5'-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza tytanowa Taq</td><td>Clontech</td><td>639210</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td> Trimmomatic <td>www.usadellab.org</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Złośliwe guzy osłonki nerwów obwodowych (MPNST) pochodzą z komórek Schwanna lub ich prekursorów. U pacjentów z zespołem podatności na nowotwory nerwiakowłókniakowatość typu 1 (NF1) MPNST są najczęstszą złośliwością i główną przyczyną zgonów. Te rzadkie i agresywne mięsaki tkanek miękkich oferują surową przyszłość, z 5-letnimi wskaźnikami przeżycia wolnego od choroby wynoszącymi 34-60%. Możliwości leczenia osób z MPNST są rozczarowująco ograniczone, a główną opcją leczenia jest operacja szpecąca. Wiele niegdyś obiecujących terapii, takich jak tyfifarnib, inhibitor sygnalizacji Ras, poniosło kliniczne porażkę. Podobnie, badania kliniczne II fazy z erlotynibem, który jest ukierunkowany na naskórkowy czynnik wzrostu (EFGR) i sorafenibem, który jest ukierunkowany na receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), receptorem płytkowego czynnika wzrostu (PDGF) i Raf, w połączeniu ze standardową chemioterapią, również nie przyniosły odpowiedzi u pacjentów. 
W ostatnich latach funkcjonalne metody badań przesiewowych genomu w połączeniu z profilowaniem genetycznym linii komórek nowotworowych okazały się przydatne do identyfikacji istotnych szlaków sygnalizacji cytoplazmatycznej i rozwoju terapii specyficznych dla celu. W przypadku rzadkich typów nowotworów odmiana tego podejścia, znana jako onkogenomika porównawcza między gatunkami, jest coraz częściej stosowana do identyfikacji nowych celów terapeutycznych. W onkogenomice porównawczej międzygatunkowej profilowanie genetyczne i genomika funkcjonalna są przeprowadzane w genetycznie modyfikowanych modelach myszy (GEM), a wyniki są następnie weryfikowane na rzadkich próbkach ludzkich i liniach komórkowych, które są dostępne. 
Ten artykuł opisuje, jak zidentyfikować potencjalne mutacje genów sterujących w ludzkich i mysich komórkach MPNST za pomocą sekwencjonowania całego egzomu (WES). Następnie opisujemy, jak wykonywać badania przesiewowe shRNA w skali genomu w celu identyfikacji i porównania krytycznych szlaków sygnałowych w mysich i ludzkich komórkach MPNST oraz identyfikacji celów lekowych w tych szlakach. Metodologie te zapewniają skuteczne podejście do identyfikacji nowych celów terapeutycznych w różnych typach nowotworów u ludzi.

Rycina 5 wykresy przedstawiają wyniki utraty (depletion scores) podstawowych genów niezbędnych (CEGs), oznaczonych jako TRUE, w porównaniu do genów niebędących CEG (oznaczonych jako FALSE) w każdej z przebadanych linii komórkowych człowieka. Punkty reprezentują log2-krotność wyników utraty dla poszczególnych genów, naniesioną na wykres pudełkowy obrazujący ogólny rozkład wyników. Test t Studenta t-test zastosowano w celu sprawdzenia, czy istnieje istotna różnica w średnich wartościa...

Opracowaliśmy międzygatunkowe porównawcze podejście onkogenomiczne, wykorzystując analizy genomiczne i funkcjonalne badania genomowe do identyfikacji i porównania celów terapeutycznych w nowotworach powstających w genetycznie modyfikowanych modelach mysich i odpowiadającym im typie nowotworu ludzkiego.

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...

Staramy się zrozumieć patogenezę sporadycznych i związanych z NF1 złośliwych nowotworów osłonki nerwów obwodowych. Naszym celem jest logiczne opracowanie nowych metod leczenia tych wysoce agresywnych nowotworów. Technologie, które obecnie wdrażamy, aby posunąć naprzód nasze badania, obejmują bezstronne metody, takie jak badania przesiewowe shRNA w skali genomu, a także sekwencjonowanie pojedynczych komórek, sondy in situ BaseScope i bioinformatyka.Korzystając z różnych obecnych podejść, zidentyfikowaliśmy wiele receptorów, które są niezbędne do proliferacji i przeżycia złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych, a także są terapeutycznie ukierunkowane. Receptory te obejmują receptor neureguliny erbB3 i receptor kwasu lizofosfatydowego 3. Zaletą stosowania tego podejścia jest jego zdolność do badania proliferacyjnego znaczenia ponad 15 000 genów w liniach komórek nowotworowych MPNST.Jest to bezstronne podejście, które identyfikuje niezbadane cele w leczeniu MPNST. Idąc dalej, nasze laboratorium skupi się na walidacji celów zidentyfikowanych na naszym ekranie. Obejmuje to stosowanie inhibitorów na liniach komórkowych i hodowlach, a ostatecznie przełożenie tego na pracę ze zwierzętami.W dniu zero umieść 10 milionów komórek 293T w 30 mililitrach wolnego od antybiotyków DMEM zawierającego 10% FBS w 15-centymetrowym naczyniu. Przygotuj w sumie 10 takich potraw. Następnego dnia, czyli pierwszego dnia, upewnij się, że komórki są w 80% zlewające się i gotowe do transfekcji.Następnie w stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów sekwencyjnie dodaj 600 mikrolitrów 0,5 mikrograma na mikrolitr opakowania, mieszankę plazmidów i bibliotekę kodów kreskowych plazmidu o pojemności 60 mikrolitrów. W osobnej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów wymieszaj 900 mikrolitrów odczynnika do transfekcji i 12 mililitrów DMEM przez wirowanie. Dodaj 12,9 mililitra tej mieszaniny do mieszanki DNA i po prostu przesuń, aby połączyć.Nie mieszając dalej, inkubować mieszankę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie kroplami dodaj 2,5 mililitra inkubowanej mieszaniny do każdej 15-centymetrowej płytki zawierającej komórki 293T i inkubuj komórki przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych. Trzeciego dnia zbierz wirusa, przepuszczając pożywkę przez jednostkę filtracyjną o wielkości 0,2 mikrona.Podwielokrotność cząstek wirusa zawierających filtrat do 15-mililitrowych stożkowych probówek. Dodatkowo przygotuj pięć jednomililitrowych porcji przefiltrowanego wirusa w kriowialach do mianowania wirusa. Aby określić miano, pule lentiwirusowe dodaj 65 mikrolitrów polimeru kationowego do sterylnej szklanej kolby zawierającej 65 mililitrów pożywki do wzrostu komórek nowotworowych.Odpipetować jeden mililitr pożywki zawierającej polimer na studzienkę do 11 6-dołkowych płytek do hodowli tkankowych. Następnie trypsynizuj komórki nowotworowe wczesnego pasażu. Po zliczeniu komórek preferowaną metodą przenieś komórki do płytek 6-dołkowych.Rozmrozić jednomililitrowe porcje 48-godzinnego lentiwirusa z zamrażarki w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Postępuj zgodnie z tabelą, aby przygotować infekcję dla każdego modułu wirusowego. W przypadku infekcji lentiwirusowej należy poszczepić trypsynizowane komórki docelowe MPNST po ich policzeniu, utrzymując 2,5 miliona komórek na 15-centymetrową miskę.Transdukować komórki z rozmrożonym wirusem przy 0,5 wielokrotności infekcji w obecności pięciu mikrogramów na mililitr polimeru kationowego. Trypsynizuj komórki trzy dni po dodaniu puromycyny. Odwirować połowę populacji komórek przy 200 g przez pięć minut w wirówce stołowej.Po ponownym pokryciu drugiej połowy populacji komórek, hoduj je przez około siedem podwojeń populacji przed zbiorem i odwirowaniem, jak pokazano wcześniej. Podziel zawieszone osady komórkowe odpowiadające żądanemu czasowi na dwie 15-mililitrowe probówki z polimetylopentenu. Dodaj 500 mikrolitrów 10% SDS na probówkę, wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Umieść probówki w urządzeniu do ścinania DNA, aby poddać je sonikacji. Po dodaniu fenolu i chloroformu dobrze wymieszaj, energicznie wirując z maksymalną możliwą prędkością przez 45 do 60 sekund. Przenieś trzy mililitry powstałej klarownej górnej fazy z każdej probówki do innej świeżej 15-mililitrowej probówki.Dodaj 0,5 mililitra trzech molowych octanu sodu i cztery mililitry izopropanolu i dobrze wymieszaj. Po odwirowaniu probówek przez 30 minut w temperaturze 7, 200 g i 20 stopni Celsjusza i odrzuceniu supernatantu, dodaj 0,5 mililitra 70% etanolu do osadu i usuń go, pipetując w górę iw dół. Połącz zawieszone granulki z obu probówek w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej.Wykonaj reakcje PCR, korzystając z warunków pokazanych na ekranie. Po drugiej reakcji PCR połącz cztery próbki w jedną probówkę mikrowirówkową i dodaj do niej 80 mikrolitrów barwnika o 6-krotnym obciążeniu. Wizualizuj żel i potwierdź pasmo na około 250 parach zasad.Ludzkie komórki MPNST transdukowane za pomocą kontroli niecelowanej i lentiwirusa wyrażającego cztery różne RNA BCL6 z krótkimi spinkami do włosów ujawniły, że kilka krótkich RNA spinki BCL6 znacznie zmniejszyło liczbę komórek. Immunoblot wykazał, że stopień spadku liczby komórek korelował ze stopniem knockdownu BCL6. Na początek umieść 80% zlewającą się złośliwą osłonkę nerwu obwodowego lub komórki MPNST o gęstości 1 200 komórek na studzienkę w 96-dołkowych płytkach o czarnych ściankach.Po przygotowaniu rozcieńczeń leku, który ma być badany, dodać każde rozcieńczenie lub nośnik do co najmniej trzech kontrprób komórek. Aby ocenić bezpośrednią liczbę komórek, dodaj Hoechst 33342 do końcowego stężenia od jednego do pięciu mikrogramów na mililitr do płytek i inkubuj płytki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umieść płytki na wysokoprzepustowym cytometrze obrazowym i zeskanuj płytki za pomocą opcji bezpośredniego zliczania komórek dla całkowitej liczby komórek z czasem naświetlania od 100 000 do 600 000 milisekund.Analizuj odczyty za pomocą oprogramowania, eksportuj je do arkusza kalkulacyjnego i korzystaj z odpowiedniego oprogramowania do analiz statystycznych.

genetic-profiling-genome-scale-dropout-screening-to-identify

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opracowaliśmy metodologię oceny, czy nowotwory układu nerwowego u genetycznie modyfikowanych myszy dokładnie odwzorowują patologię ich ludzkich odpowiedników. Tutaj stosujemy te techniki histologiczne, zdefiniowane kryteria patologiczne i metodologie hodowli do nerwiakowłókniaków i złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych powstających w mysim modelu P 0-GGFβ3.

Identyfikacja, diagnozowanie i ocena złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych w genetycznie modyfikowanych modelach myszy

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Identyfikacja nowych celów leków, które przechodzą od testów przedklinicznych do badań na ludziach, jest priorytetem naukowym. W tym celu opisujemy tutaj podejście genomiki funkcjonalnej do badania wpływu wyczerpania genów na sferoidy linii komórek nowotworowych, które bardziej odpowiednio modelują nowotwory u ludzi in vivo.

Wykorzystanie badań przesiewowych genomiki funkcjonalnej do identyfikacji potencjalnie nowych celów leków w hodowlach sferoidalnych komórek nowotworowych

Tutaj opisujemy protokół do wykorzystania wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi w celu odkrycia celów gospodarza, które mogą być manipulowane w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi, w szczególności terapii wirusem rabodu i krowianki, ale można go łatwo dostosować do innych platform wirusów onkolitycznych lub do odkrywania genów gospodarza, które ogólnie modulują replikację wirusa.

Badania przesiewowe RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza, które modulują terapię wirusem onkolitycznym

Opisujemy protokół przedklinicznego śledzenia in vivo przerzutów nowotworowych. Opiera się on na reporterze radionuklidowo-fluorescencyjnym łączącym symporter jodku sodu, wykrywany przez nieinwazyjny [18F]tetrafluoroboran-PET, oraz białko fluorescencyjne w celu usprawnionego potwierdzenia ex vivo. Metoda ma zastosowanie do przedklinicznego śledzenia komórek in vivo poza biologią guza.

Obrazowanie genu reporterowego radionuklidowo-fluorescencyjnego w celu śledzenia progresji guza w modelach guzów gryzoni

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest użytecznym narzędziem do bardzo czułego wykrywania wariantów pojedynczych nukleotydów i wariantów liczby kopii DNA. W tym miejscu przedstawiamy kluczowe zagadnienia dotyczące pomiaru rzadkich wariantów w ludzkim genomie za pomocą cyfrowego PCR w formacie chip-in-a-tube.

Cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy pod kątem zmienności genetycznej u pacjenta ze sporadyczną rodzinną polipowatością gruczolakowatą przy użyciu formatu chip-in-a-tube

Guzy neuroendokrynne (NET) wywodzą się z komórek neuroendokrynnych grzebienia nerwowego. Rosną wolno i stanowią wyzwanie dla kultury. Przedstawiamy alternatywną strategię hodowli NET z jelita cienkiego poprzez hodowlę ich jako sferoid. Te sferoidy mają markery siatki jelita cienkiego i mogą być używane do testowania narkotyków.

Ustalenie i charakterystyka sferoid guza neuroendokrynnego jelita cienkiego

Tutaj prezentujemy protokół przeprowadzania nokautów genów, które są embrionalne śmiertelne in vivo w genetycznie modyfikowanych mysich modelach nowotworów, a następnie oceniamy wpływ nokautu na wzrost, proliferację, przeżycie, migrację, inwazję i transkryptom in vitro i in vivo.

Definiowanie funkcji genów w nowotworzeniu poprzez ablację ex vivo floksowanych alleli w złośliwych komórkach nowotworowych osłonki nerwów obwodowych

Ostatnie prace odkrywają wpływ neuronów na komórki glejaka dziecięcego (pHGG) wysokiego stopnia i ich wzajemne interakcje. Niniejsza praca pokazuje rozwój modelu in vitro kokulturującego komórki pHGG i neurony glutaminergiczne oraz rejestrującego ich interakcje elektrofizjologiczne w celu naśladowania tych interakcji.

Wspólna hodowla neuronów glutaminergicznego i pediatrycznych komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości w urządzeniach mikroprzepływowych w celu oceny interakcji elektrycznych

Celem tego artykułu metodycznego jest zademonstrowanie solidnej i powtarzalnej metodologii wzbogacania, generowania i rozszerzania pierwotnych linii komórek nowotworowych z chirurgicznie wyciętego międzybłoniaka opłucnej.

Generowanie i rozszerzanie pierwotnych, złośliwych linii guza międzybłoniaka opłucnej

Odkryj genomowe badania przesiewowe shRNA i sekwencjonowanie pojedynczych komórek w celu identyfikacji receptorów terapeutycznych w guzach osłonki nerwów obwodowych. Metoda umożliwia analizę ponad 15 000 genów.

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych (Wideo) | JoVE Journal

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

Przeglądaj więcej filmów