Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

Staramy się zrozumieć patogenezę sporadycznych i związanych z NF1 złośliwych nowotworów osłonki nerwów obwodowych. Naszym celem jest logiczne opracowanie nowych metod leczenia tych wysoce agresywnych nowotworów. Technologie, które obecnie wdrażamy, aby posunąć naprzód nasze badania, obejmują bezstronne metody, takie jak badania przesiewowe shRNA w skali genomu, a także sekwencjonowanie pojedynczych komórek, sondy in situ BaseScope i bioinformatyka.

Korzystając z różnych obecnych podejść, zidentyfikowaliśmy wiele receptorów, które są niezbędne do proliferacji i przeżycia złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych, a także są terapeutycznie ukierunkowane. Receptory te obejmują receptor neureguliny erbB3 i receptor kwasu lizofosfatydowego 3. Zaletą stosowania tego podejścia jest jego zdolność do badania proliferacyjnego znaczenia ponad 15 000 genów w liniach komórek nowotworowych MPNST.

Jest to bezstronne podejście, które identyfikuje niezbadane cele w leczeniu MPNST. Idąc dalej, nasze laboratorium skupi się na walidacji celów zidentyfikowanych na naszym ekranie. Obejmuje to stosowanie inhibitorów na liniach komórkowych i hodowlach, a ostatecznie przełożenie tego na pracę ze zwierzętami.

W dniu zero umieść 10 milionów komórek 293T w 30 mililitrach wolnego od antybiotyków DMEM zawierającego 10% FBS w 15-centymetrowym naczyniu. Przygotuj w sumie 10 takich potraw. Następnego dnia, czyli pierwszego dnia, upewnij się, że komórki są w 80% zlewające się i gotowe do transfekcji.

Następnie w stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów sekwencyjnie dodaj 600 mikrolitrów 0,5 mikrograma na mikrolitr opakowania, mieszankę plazmidów i bibliotekę kodów kreskowych plazmidu o pojemności 60 mikrolitrów. W osobnej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów wymieszaj 900 mikrolitrów odczynnika do transfekcji i 12 mililitrów DMEM przez wirowanie. Dodaj 12,9 mililitra tej mieszaniny do mieszanki DNA i po prostu przesuń, aby połączyć.

Nie mieszając dalej, inkubować mieszankę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie kroplami dodaj 2,5 mililitra inkubowanej mieszaniny do każdej 15-centymetrowej płytki zawierającej komórki 293T i inkubuj komórki przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych. Trzeciego dnia zbierz wirusa, przepuszczając pożywkę przez jednostkę filtracyjną o wielkości 0,2 mikrona.

Podwielokrotność cząstek wirusa zawierających filtrat do 15-mililitrowych stożkowych probówek. Dodatkowo przygotuj pięć jednomililitrowych porcji przefiltrowanego wirusa w kriowialach do mianowania wirusa. Aby określić miano, pule lentiwirusowe dodaj 65 mikrolitrów polimeru kationowego do sterylnej szklanej kolby zawierającej 65 mililitrów pożywki do wzrostu komórek nowotworowych.

Odpipetować jeden mililitr pożywki zawierającej polimer na studzienkę do 11 6-dołkowych płytek do hodowli tkankowych. Następnie trypsynizuj komórki nowotworowe wczesnego pasażu. Po zliczeniu komórek preferowaną metodą przenieś komórki do płytek 6-dołkowych.

Rozmrozić jednomililitrowe porcje 48-godzinnego lentiwirusa z zamrażarki w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Postępuj zgodnie z tabelą, aby przygotować infekcję dla każdego modułu wirusowego. W przypadku infekcji lentiwirusowej należy poszczepić trypsynizowane komórki docelowe MPNST po ich policzeniu, utrzymując 2,5 miliona komórek na 15-centymetrową miskę.

Transdukować komórki z rozmrożonym wirusem przy 0,5 wielokrotności infekcji w obecności pięciu mikrogramów na mililitr polimeru kationowego. Trypsynizuj komórki trzy dni po dodaniu puromycyny. Odwirować połowę populacji komórek przy 200 g przez pięć minut w wirówce stołowej.

Po ponownym pokryciu drugiej połowy populacji komórek, hoduj je przez około siedem podwojeń populacji przed zbiorem i odwirowaniem, jak pokazano wcześniej. Podziel zawieszone osady komórkowe odpowiadające żądanemu czasowi na dwie 15-mililitrowe probówki z polimetylopentenu. Dodaj 500 mikrolitrów 10% SDS na probówkę, wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Umieść probówki w urządzeniu do ścinania DNA, aby poddać je sonikacji. Po dodaniu fenolu i chloroformu dobrze wymieszaj, energicznie wirując z maksymalną możliwą prędkością przez 45 do 60 sekund. Przenieś trzy mililitry powstałej klarownej górnej fazy z każdej probówki do innej świeżej 15-mililitrowej probówki.

Dodaj 0,5 mililitra trzech molowych octanu sodu i cztery mililitry izopropanolu i dobrze wymieszaj. Po odwirowaniu probówek przez 30 minut w temperaturze 7, 200 g i 20 stopni Celsjusza i odrzuceniu supernatantu, dodaj 0,5 mililitra 70% etanolu do osadu i usuń go, pipetując w górę iw dół. Połącz zawieszone granulki z obu probówek w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej.

Wykonaj reakcje PCR, korzystając z warunków pokazanych na ekranie. Po drugiej reakcji PCR połącz cztery próbki w jedną probówkę mikrowirówkową i dodaj do niej 80 mikrolitrów barwnika o 6-krotnym obciążeniu. Wizualizuj żel i potwierdź pasmo na około 250 parach zasad.

Ludzkie komórki MPNST transdukowane za pomocą kontroli niecelowanej i lentiwirusa wyrażającego cztery różne RNA BCL6 z krótkimi spinkami do włosów ujawniły, że kilka krótkich RNA spinki BCL6 znacznie zmniejszyło liczbę komórek. Immunoblot wykazał, że stopień spadku liczby komórek korelował ze stopniem knockdownu BCL6. Na początek umieść 80% zlewającą się złośliwą osłonkę nerwu obwodowego lub komórki MPNST o gęstości 1 200 komórek na studzienkę w 96-dołkowych płytkach o czarnych ściankach.

Po przygotowaniu rozcieńczeń leku, który ma być badany, dodać każde rozcieńczenie lub nośnik do co najmniej trzech kontrprób komórek. Aby ocenić bezpośrednią liczbę komórek, dodaj Hoechst 33342 do końcowego stężenia od jednego do pięciu mikrogramów na mililitr do płytek i inkubuj płytki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umieść płytki na wysokoprzepustowym cytometrze obrazowym i zeskanuj płytki za pomocą opcji bezpośredniego zliczania komórek dla całkowitej liczby komórek z czasem naświetlania od 100 000 do 600 000 milisekund.

Analizuj odczyty za pomocą oprogramowania, eksportuj je do arkusza kalkulacyjnego i korzystaj z odpowiedniego oprogramowania do analiz statystycznych.