Test jednostkowy tworzenia mikrokolonii do oceny skuteczności szczepionek przeciwko gruźlicy
July 28th, 2023
Oznaczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) jest złotym standardem w ilościowym oznaczaniu bakterii, w tym Mycobacterium tuberculosis, które mogą potrzebować tygodni na utworzenie widocznych kolonii. W tym miejscu opisujemy mikro-CFU do oznaczania CFU ze zwiększoną wydajnością czasową, zmniejszoną przestrzenią laboratoryjną i kosztami odczynników oraz skalowalnością do eksperymentów o średniej i wysokiej przepustowości.
Oznaczenie CFU jest konieczne do zmierzenia skuteczności odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakteriom. Jest jednak bardzo dobrze przepustowy i staje się kłopotliwy i kosztowny, gdy jest stosowany do bakterii chorobotwórczych, takich jak Mycobacterium tuberculosis. Jest to istotne ograniczenie, gdy musimy testować duże panele z zabiegami.
Badania koncentrują się na gruźlicy i ocenie szczepionek przeciwko gruźlicy. Bada bezpieczeństwo, immunogenność i skuteczność szczepionek przeciwko prątkom gruźlicy. W badaniu przedstawiono zoptymalizowaną metodę, mikro CFU do zliczania kolonii bakteryjnych w celu oceny skuteczności szczepionki w badaniach przedklinicznych.
Protokół ten ma na celu optymalizację oznaczania CFU poprzez generowanie wyników z małej kropli, podobnych do tych ze zwykłej szalki Petriego. Kwantyfikacja żywotności bakterii na podstawie tak małej próbki pozwala nam przeanalizować tysiące punktów danych przy użyciu ułamka materiałów i czasu niezbędnego do zastosowania klasycznych metod. Nasze badania mają na celu przeanalizowanie mechanizmów prezentacji antygenów i zidentyfikowanie najbardziej odpowiednich antygenów w celu optymalizacji prezentacji antygenu.
Pozwoli nam to zaprojektować i opracować lepsze szczepionki w celu ulepszenia lub zastąpienia obecnej szczepionki przeciwko gruźlicy, którą jest BCG. Zacznij od zebrania kultury BCG w środkowej lub późnej fazie wzrostu kłody. Odwiruj go przy 3000 g przez 10 minut.
Następnie odrzucić supernatant. Następnie dodaj 10 mililitrów PBS, aby umyć bakterie. Po odwirowaniu odrzucić supernatant.
Zawiesić osad w pięciu mililitrach pożywki infekcyjnej. Umieść rurkę w kąpieli ultradźwiękowej na 15 minut z pełną mocą i częstotliwością 80 Hz. Teraz odwiruj przy 1000 g przez 10 minut.
Zebrać supernatant. I wyrzuć granulkę. Zmierzyć gęstość optyczną supernatantu.
Aby przeprowadzić seryjne rozcieńczanie za pomocą płytki studzienkowej, najpierw umieść zawiesiny prątków w rzędach A i E płytki 96-dołkowej. Dodaj 180 mikrolitrów wody dejonizowanej do pozostałych studzienek w celu przeprowadzenia procesu seryjnego rozcieńczania. Używając pipety 12-kanałowej, ponownie zawiesić zawiesiny w rzędzie A i przenieść 20 mikrolitrów do rzędu B. Powtórzyć przenoszenie zawiesiny dla rzędów B i C, aż do osiągnięcia ostatniego rozcieńczenia w rzędzie D. Do powlekania mikrokropelkami użyj pipety wielokanałowej o pojemności od 0,5 do 10 mikrolitrów z cienkimi końcówkami, aby przenieść pięć mikrolitrów z każdego rzędu płytki 96-dołkowej na stałą płytkę kwadratową.
Pozwól, aby kropelki lekko dotknęły agaru, zapewniając prawidłowe przenoszenie i minimalizując zatrzymywanie płynu wewnątrz końcówki. Pozostaw kropelki do wyschnięcia i zamknij płytkę agarową. Inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza, monitorując wzrost bakterii.
Opcjonalnie umieść płytki agarowe w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie, aby zapobiec wysuszeniu. Po sześciu do 10 dniach inkubacji sprawdź, czy poszczególne kolonie są widoczne gołym okiem. Umieść płytkę pod odwróconym mikroskopem, używając obiektywu o najmniejszym powiększeniu.
Alternatywnie, użyj aparatu, aby zrobić zdjęcie kropli i ręcznie zlicz kolonie na komputerze za pomocą ImageJ do automatycznego zliczania kolonii. Jednostka tworząca mikrokolonie lub test mikro CFU została wykorzystana do uzyskania dużej ilości danych z niewielkiej ilości płytek agarowych. Stosowanie liposomów do dostarczania sakwinawiru zwiększa skuteczność leczenia przeciwko szczepom prątków o różnej oporności na leki.
Aby wykonać metodę liczenia ręcznego, rozpocznij uruchamianie oprogramowania Fiji. Otwórz obraz zawierający jednostki tworzące mikrokolonie. Przejdź do Wtyczki, a następnie kliknij Analizuj, a następnie Licznik komórek.
W menu licznika komórek zainicjuj program, klikając Inicjuj i wybierz licznik. Kontynuuj, klikając każdą kolonię. Jeśli nastąpi przypadkowe kliknięcie, kliknij przycisk Usuń, aby cofnąć.
Zanotuj wartość wyświetlaną na liczniku. Naciśnij przycisk Reset, aby wznowić zliczanie i otworzyć nowy obraz, aby policzyć dodatkowe próbki. Aby uzyskać automatyczne liczenie, przekonwertuj obraz w Fidżi na 8-bitowy obraz w skali szarości, wybierając Obraz, a następnie Typ i klikając 8-bitowy.
Za pomocą narzędzia Owal na pasku narzędzi narysuj owal wokół kolonii, w razie potrzeby dostosuj owal. Następnie wybierz Edytuj, a następnie Wyczyść na zewnątrz, aby usunąć wszelkie zakłócenia spoza obszaru. Teraz wybierz Obraz, a następnie naciśnij Dostosuj i wybierz Próg, aby dostosować suwaki w menu progów, aż kolonie pojawią się na czerwono z minimalnym szumem w tle.
Kliknij Zastosuj i wyjdź z okna Próg, generując czarno-biały obraz. Teraz wybierz pozycję Analizuj. Następnie kliknij Analizuj cząstki i określ zakres obszaru kolonii i kołowości w oknie Analizuj cząstki.
Wybierz Kontury z menu podręcznego pokaż, włącz opcję Wyświetl wyniki dla szczegółowych pomiarów i zaznacz opcję Wyczyść wyniki, aby usunąć wszystkie poprzednie pomiary. Kliknij pole Podsumuj i zainicjuj analizator, wybierając opcję OK, aby wyświetlić podsumowane wyniki pomiarów. Obserwuj, jak pojawi się nowe okno przedstawiające wszystkie wykryte i zliczone kolonie z zarysowanymi liniami.
Szczegóły każdej rodziny można zobaczyć w oknie wyników, a łączna liczba rodzin zliczonych w oknie podsumowanych wyników.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia metodę mikro-CFU do określania liczby kolonii tworzących jednostki (CFU) Mycobacterium tuberculosis, poprawiającą efektywność i obniżającą koszty. Metoda radzi sobie z ograniczeniami tradycyjnego określania CFU, szczególnie w ustawieniach o wysokiej wydajności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Immunologia
- Rozwój szczepionek
Tło
- Określanie CFU jest niezbędne do mierzenia skuteczności odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakteriom.
- Tradycyjne metody CFU są uciążliwe i kosztowne, szczególnie dla patogennych bakterii.
- Mycobacterium tuberculosis stanowi znaczące wyzwanie w badaniu leków.
- Ocenianie szczepionek przeciwko gruźlicy wymaga efektywnych metod liczenia kolonii bakteryjnych.
Cel badania
- Optymalizacja określania CFU do oceny skuteczności szczepionek.
- Poprawa wydajności i zmniejszenie kosztów w badaniach przedklinicznych.
- Ułatwienie dużej skali badań leków przeciwko gruźlicy.
Zastosowane metody
- Rozwój metody mikro-CFU do liczenia bakterii.
- Zastosowanie metody w przedklinicznych badaniach skuteczności szczepionek.
- Porównanie z tradycyjnymi technikami określania CFU.
- Ocena bezpieczeństwa i immunogeniczności szczepionek przeciwko gruźlicy.
Główne wyniki
- Metoda mikro-CFU wykazała zwiększoną efektywność czasową.
- Osiągnięto mniejsze zużycie przestrzeni laboratoryjnej i kosztów reagentów.
- Metoda jest skalowalna dla średnich i dużych wydajności eksperymentów.
- Skutecznie ocena skuteczności szczepionek przeciwko Mycobacterium tuberculosis.
Wnioski
- Metoda mikro-CFU jest wykonalną alternatywą dla określania CFU.
- Radzi sobie z ograniczeniami tradycyjnych metod w badaniach nad gruźlicą.
- To podejście może poprawić ocenę kandydatów do szczepionki przeciwko gruźlicy.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient, quantitative evaluation of vaccine efficacy is critical for advancing tuberculosis (TB) vaccine candidates through preclinical pipelines. The micro-CFU assay enables rapid, high-throughput assessment of Mycobacterium tuberculosis viability, directly supporting target validation and portfolio triage. This streamlined approach reduces operational bottlenecks and accelerates data-driven decision-making in vaccine R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of immune response efficacy against M.tb in preclinical models.
- Supports functional validation of vaccine targets by quantifying bacterial viability post-challenge.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing rapid comparison of antigen presentation strategies.
- Improves predictive confidence for advancing vaccine candidates.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible biological systems for downstream vaccine efficacy screening.
- Standardizes quantitative outputs for cross-study and cross-team comparability.
- Enables scalable, high-throughput screening with reduced reagent and space requirements.
- Supports reliable evaluation of large vaccine panels and formulations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical efficacy readouts with translational biomarker strategies for TB vaccines.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing consistent, quantitative endpoints.
- Reduces risk in advancing candidates by minimizing variability and contamination risk.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on robust efficacy data.
Pipeline & Workflow Integration
The micro-CFU assay integrates into the preclinical vaccine development continuum, from early discovery through lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Provides quantitative hypothesis testing for immune-mediated bacterial clearance.
- Screening: Delivers reproducible, high-throughput assay readiness for vaccine efficacy evaluation.
- Analytics: Generates standardized, quantitative colony counts for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases with consistent efficacy metrics.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for ongoing TB vaccine candidate evaluation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vaccine efficacy studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput while minimizing resource use.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency in vaccine portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of TB vaccine candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mycobacterial culture and quantitative microbiology.
- Needs access to multichannel pipettes, imaging systems, and analytical software (e.g., Fiji/ImageJ).
- Demands cross-team standardization of assay setup and data analysis protocols.
- Adaptable to various tissue sources and vaccine formulations in preclinical models.
- Dependent on rigorous contamination control and consistent sample preparation.
