Przezźrenicowe przeszczepienie przeztwardówkowe przeszczepów podsiatkówkowych w mysim modelu zwyrodnienia siatkówki

Ogólnym celem tego badania jest opracowanie platformy do przeszczepu przeztwardówkowego z bezpośrednią kontrolą przezźrenicową, aby ułatwić podsiatkówkowe dostarczanie komórek u myszy. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z przewodnikiem National Institute of Health. Nasze oświadczenie o wykorzystywaniu zwierząt zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.

Myszy w wieku poporodowym w 3-6 dniu po urodzeniu wykorzystano jako dawców zawiesin komórek siatkówki. Myszy OPN1LW-EGFP/NRL w wieku 3 dnia po urodzeniu zostały adoptowane jako dawcy prześcieradeł siatkówki. Jako biorców wykorzystano dorosłe myszy Rd1 / NS ze zwyrodnieniem siatkówki z niedoborem odporności

Eutanazja myszy dawców za pomocą przedawkowania dwutlenku węgla. Aby odizolować gałki oczne myszy, ostrożnie otwórz powieki szczeniąt za pomocą mikronożyczek i odsłoń gałkę oczną. Owiń nerw wzrokowy i wyciągnij gałkę oczną gładkimi kleszczami.

Po odizolowaniu gałek ocznych naciąć otwór w środku rogówki za pomocą igły o rozmiarze 25. Przetnij rogówkę na pół przez otwór. I powiększ nacięcie do twardówki i RPE.

Następnie usuń twardówkę i RPE. Następnie użyj kleszczyków z mikrozębami, aby delikatnie usunąć soczewkę i ciała szklistego, aby wyizolować siatkówkę nerwową. Aby pobrać zawiesinę siatkówki dawcy, należy inkubować siatkówkę nerwową w roztworze papainy w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut, aż nie będą wykrywalne żadne grudki komórek.

Zbierz pojedyncze komórki zgodnie z instrukcjami producenta zestawu Papaina. Aby przygotować arkusz siatkówki, umieść izolowaną siatkówkę na szalce Petriego z PBS. Następnie delikatnie przetnij siatkówkę nerwową na wiele arkuszy siatkówki za pomocą mikronożyczek.

Znieczulenie myszy biorcy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia ketaminy i ksylazyny. Upewnij się, że osiągnięta płaszczyzna znieczulenia, czyli płaszczyzna chirurgiczna, w której zwierzę traci mruganie i odruchy bólowe, ale oddychanie i oddychanie pozostają regularne. Oceń głębokość znieczulenia na podstawie uszczypnięcia ogona lub odruchów wycofania pedału.

Ponownie sprawdź głębokość znieczulenia podczas zabiegu operacyjnego. Trzymaj myszy na rozgrzanym stole operacyjnym, aby uniknąć hipotermii. Rozszerz źrenice biorcy za pomocą tropikamidowych kropli do oczu na pięć minut przed zabiegiem.

Dobrze rozszerzona źrenica może ułatwić wizualizację przezźrenicową pod mikroskopem operacyjnym. Umieść kroplę chlorowodorku proparakainy na oku myszy w celu znieczulenia. Zdezynfekuj operujące oko myszy i otaczające je tkanki oka jodem.

Następnie oczyść oko sterylnym PBS. Przeniknąć przez tunel obwodowy do komory wewnętrznej, aby obniżyć ciśnienie wewnątrzgałkowe. Następnie umieść kroplę hialuronianu sodu i szklane szkiełko nakrywkowe na rogówce.

Przezźrenicowa wizualizacja dna oka myszy jest już dostępna w zakresie chirurgicznym. Odsłonić miejsce wstrzyknięcia, popychając ścianę oka w kierunku środka przezźrenicy za pomocą kleszczy zębatych. Następnie częściowo wniknąć w twardówkę za pomocą igły do mikroiniekcji, skierowanej pod kątem 90 stopni do ściany oka.

Powierzchowne naczynia siatkówki mogą służyć jako anatomiczne odniesienie do zlokalizowania igły w przestrzeni podsiatkówkowej. Następnie wstrzyknąć przeszczepy siatkówki. Wstępnie załadowane małe pęcherzyki w strzykawce mogą ułatwić walidację lokalizacji komórek dawcy w stanie podsiatkówkowym.

Jeśli rogówka stanie się mętna, trzymaj igłę w przestrzeni podsiatkówkowej, aż rogówka stanie się przezroczysta, aby znormalizować ciśnienie wewnątrzgałkowe. Chwycić za krawędź otworu iniekcyjnego i szybko wyciągnąć igłę. Kryterium pomyślnego dostarczenia zawiesiny komórkowej jest stały pęcherzyk w przestrzeni podsiatkówkowej.

O udanym dostarczeniu arkusza siatkówki przemawia widoczny biały arkusz. Trzymaj przeszczepione myszy we wstępnie ogrzanej, czystej klatce regeneracyjnej i uważnie monitoruj je pod kątem jakichkolwiek oznak niepokoju. Jeśli tak się stanie, umieść kroplę miejscowego chlorowodorku proparakainy na oku chirurgicznym dwa, trzy razy.

Usuń myszy z powrotem do klatki domowej, gdy myszy są całkowicie czujne i mobilne. Umieść niewielką liczbę granulek pokarmu w kubku na żel na podłodze klatki. Jeśli myszy mają problemy z dotarciem do pojemnika na żywność.

Dwa miesiące po przeszczepie wykonano multimodalną konfokalną skaningową oftalmoskopię laserową w celu sprawdzenia stanów przeszczepów siatkówki obserwowanych vivo. Optyczna tomografia koherentna w domenie spektralnej wykazała, że przeszczepy siatkówki przetrwały w przestrzeni podsiatkówkowej i odtwarzają zewnętrzną warstwę jądrową wszystkich myszy biorców. Obrazowanie w podczerwieni nie wykryło oczywistej zaćmy u wszystkich przeszczepionych myszy.

Inne powikłania chirurgiczne, w tym krwotok, zostały źle wykryte u przeszczepionych myszy za pomocą wielokolorowego obrazowania refleksyjnego. Barwienie histologiczne wykazało obfite fotoreceptory czopków wyrażające OPN1LW:EGFP i S-opsynę w przeszczepionych arkuszach siatkówki. Podobnie, przeszczepienie zawiesin komórek siatkówki wykazało duży odsetek odzyskiwanych dodatnich fotoreceptorów in vivo, w tym licznych dojrzałych pałeczek EGFP.

Myszy bez przeszczepu wykazywały poważną degenerację zewnętrznej warstwy jądrowej z rzadkimi szczątkowymi fotoreceptorami czopków wyrażającymi regenerację. Jednak nie wykryto sygnału EGP u myszy nieprzeszczepionych. Badanie to zapewnia przeztwardówkową platformę chirurgiczną z bezpośrednimi wskazówkami dotyczącymi widzenia przezźrenicowego do przeszczepu podsiatkówkowego u biorców myszy.

Platforma ta umożliwia precyzyjne dostarczanie znanych dawek komórek. Jest stosunkowo łatwy do nauczenia się i ułatwienia dostarczania podsiatkówkowego oprócz iniekcji dosiatkówkowych lub doszklistkowych dla różnych rodzajów środków terapeutycznych, w tym terapii genowej.