Wykrywanie przeciwciał IgG i IgM przeciwko wściekliźnie za pomocą pośredniego testu fluorescencyjnego na przeciwciała przeciwko wściekliźnie

Test IFA ocenia odpowiedź przeciwciał podczas zakażenia wścieklizną lub ocenia odpowiedź immunologiczną po szczepionkach. Można go użyć do ustalenia obecności przeciwciał w próbce i rozróżnienia, które izotypy przeciwciał są obecne. Testy przeciwciał neutralizujących są złotym standardem w wykrywaniu przeciwciał przeciwko wściekliźnie w celu oceny miana przeciwciał u osoby, która otrzymała profilaktykę przed- lub poekspozycyjną.

Chociaż test IFA może dawać inne wyniki niż test przeciwciał neutralizujących, nadal może dostarczyć cennych informacji, gdy jest stosowany jako alternatywa. Zazwyczaj testy, które mierzą przeciwciała neutralizujące wściekliznę, oceniają odpowiedź immunologiczną. Jednak testy te trwają wiele dni i wymagają hodowli wirusa i żywych komórek.

Test IFA pozwala na zaawansowane przygotowanie preparatów antygenowych do badań z wynikami w ciągu kilku godzin w porównaniu do dni. Zastosowanie testu IFA w przypadkach wścieklizny u ludzi może prowadzić do uzyskania większej liczby odpowiedzi na temat tego, jak układ odpornościowy danej osoby reaguje na zakażenie wścieklizną. Istnieje duże zróżnicowanie między przypadkami, a ten test może dostarczyć wyniki w czasie rzeczywistym podczas choroby.

Na początek noś środki ochrony osobistej, w tym ochronę oczu, maskę chirurgiczną i rękawice nielateksowe. Przygotuj 20 mililitrów mysich komórek nerwiaka zarodkowego lub BHK-21 o stężeniu 3,0 razy 10 do piątych komórek na mililitr w EGM. Utrzymuj przygotowane komórki w chłodzie, aż będą gotowe do użycia.

Następnie przygotuj wirusa CVS-11, rozcieńczając go w NWZ. Upewnij się, że przygotowany wirus jest przechowywany w niskiej temperaturze do momentu użycia. Wyczyść komorę szkiełka wilgotnościowego i szkiełka mikroskopowe pokryte politetrafluoroetylenem 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Po oczyszczeniu dodaj wodę destylowaną do pasków papieru chłonnego w komorze szkiełkowej, aby zapewnić stałą wilgotność przez cały zabieg. Za pomocą ołówka oznacz każdy slajd wymaganymi informacjami identyfikacyjnymi, takimi jak numer partii, data i typ komórki. Umieść oznaczone szkiełka w komorze szkiełka w celu przechowywania.

Następnie nanieść 50 mikrolitrów rozcieńczenia wirusa do studzienek na szkiełkach mikroskopowych za pomocą powtarzalnej pipety. Nałożyć 50 mikrolitrów rozcieńczenia komórek do każdej studzienki, uważając, aby nie zanieczyścić końcówki pipety wirusem znajdującym się już w studzience. Następnie zamknij komorę szkiełka wilgotnościowego i umieść ją w wilgotnym inkubatorze w temperaturze od 34 do 36 stopni Celsjusza.

Następnie wyjmij szkiełko z komory wilgotnościowej i skrupulatnie odessaj supernatant. Myj szkiełko przez dwie minuty w słoiku Coplin wypełnionym PBS, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Umieść szkiełko w zimnym słoiku Coplin wypełnionym acetonem, aby utrwalić próbkę.

Umieść słoik w zamrażarce o temperaturze 20 stopni Celsjusza dopuszczonej do materiałów łatwopalnych na co najmniej godzinę. Gdy aceton odparuje i szkiełko wyschnie, nałóż bezpośrednie przeciwciało fluorescencyjne przeciwko wściekliźnie do dołków szkiełka i inkubuj szkiełko przez 30 minut w wilgotnym inkubatorze o temperaturze od 34 do 36 stopni Celsjusza. Następnie umyj szkiełko dwukrotnie w słoiku Coplin PBS przez dwie minuty każdy.

Wysuszyć szkiełko na powietrzu i zamontować szkiełko nakrywkowe za pomocą 0,05 molowego Tris, 0,15 molowego chlorku sodu i 20% glicerolu. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego o 200-krotnym powiększeniu, aby ocenić zakaźność komórek. Następnie wyjmij pozostałe szkiełka z inkubatora i komory wilgotnościowej.

Ostrożnie odessać supernatant z każdej studzienki, a następnie umieścić szkiełka w słoiku Coplin z PBS na jedną do dwóch minut. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez około 30 minut, a następnie przechowuj je w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu użycia. Na początek należy przygotować rozcieńczenie do próbek surowicy pacjenta lub płynu mózgowo-rdzeniowego do badania.

Przygotować wymagany koniugat w odpowiednim stężeniu roboczym, rozcieńczając go w PBS 0,05% błękitem Evansa. W przypadku pośrednich testów fluorescencyjnych na obecność przeciwciał należy pobrać odpowiednią liczbę przygotowanych preparatów antygenowych wymaganych do przeprowadzenia testu. Poczekaj, aż szkiełka całkowicie się rozmrozą i wyschną.

Następnie umieść szkiełka w słoiku Coplin wypełnionym acetonem i przenieś je do zamrażarki o temperaturze 20 stopni Celsjusza dopuszczonej do materiałów łatwopalnych na dwie godziny do nocy. Następnie wyjmij szkiełka z acetonu i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu. Teraz umieść szkiełka w komorze wilgotnościowej wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego.

Aby utrzymać wilgotność, dodaj do komory destylowane paski chłonne nasączone wodą. Nałożyć 50 mikrolitrów z każdej próbki kontrolnej, rozcieńczenia próbki lub PBS do wcześniej ustalonego dołka. Umieść zamkniętą komorę szkiełka wilgotnościowego w inkubatorze wilgotności 5% dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut.

Po zakończeniu wyjmij komorę szkiełka wilgotnościowego z inkubatora i przenieś ją do komory bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą końcówki aspiratora ostrożnie zassaj supernatant z każdej studzienki, nie naruszając monowarstwy komórek. Następnie nałóż jedną kroplę PBS na każdą studzienkę za pomocą sterylnej pipety z zakraplaczem.

Ostrożnie zassać PBS i przenieść każde szkiełko do słoika Coplin wypełnionego PBS. Następnie umieść szkiełka z powrotem w komorze wilgotnościowej. Do każdej studzienki nanieść 50 mikrolitrów odpowiedniego koniugatu przeciwciał anty-ludzkich i inkubować przez 30 minut w wilgotnym inkubatorze.

Pod koniec inkubacji przenieść komorę wilgotnościową do komory bezpieczeństwa biologicznego. Odessać supernatant za pomocą końcówki aspiratora. Następnie nałóż jedną kroplę PBS na każdą studzienkę za pomocą sterylnej pipety z zakraplaczem.

Po wyjęciu PBS umyć szkiełko dwukrotnie w słoiku Coplin z PBS przez łącznie 15 minut. Po umyciu pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu, a następnie zamontuj szkiełko nakrywkowe z nośnikami montażowymi. Weź szkiełka i przeczytaj je pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Próbki należy klasyfikować od ujemnych do 4+, przy czym próbki ujemne nie wykazują fluorescencji, a próbki 4+ wykazują jasnozieloną fluorescencję. Przypisz próbki i wartość końcową reprezentowaną przez współczynnik rozcieńczenia, przy którym próbka wykazuje ocenę od 1 do 2+. Po pierwszym szczepieniu w próbkach pobranych od pacjentów zaobserwowano wysoki poziom zarówno immunoglobuliny M, jak i G.

Około sześć miesięcy po szczepieniu w próbkach pobranych od pacjentów stwierdzono znacznie niższe poziomy obu przeciwciał, ale poziomy immunoglobuliny M spadły prawie całkowicie. 18 miesięcy po szczepieniu w próbkach pobranych od pacjentów nie wykryto przeciwciał immunoglobuliny M. Poziomy immunoglobuliny G utrzymywały się i pozostawały na poziomie wykrytym w sześciomiesięcznym punkcie czasowym po początkowym spadku z dwutygodniowego punktu czasowego.