Name: Wykrywanie przeciwciał IgG i IgM przeciwko wściekliźnie za pomocą pośredniego testu fluorescencyjnego na przeciwciała przeciwko wściekliźnie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Poznaj pośredni test fluorescencyjny na przeciwciała przeciwko wściekliźnie do wykrywania IgG i IgM. Ta metoda pozwala szybko ocenić odpowiedź immunologiczną po szczepieniu lub zakażeniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Centrum Wadsworth Departamentu Zdrowia Stanu Nowy Jork za wsparcie tego projektu.

Następujący protokół został zatwierdzony do etycznego wykorzystania próbek ludzkich przez New York State Department of Health Wadsworth Center do rozwoju testów, numer zatwierdzenia protokołu #03-019.
1. Bezpieczeństwo
<ol>
	<li>Załóż środki ochrony osobistej (PPE), minimalną ochronę oczu (okulary lub osłona twarzy), maskę chirurgiczną i rękawice nielateksowe.</li>
	<li>Upewnij się, że personel jest zaszczepiony przeciwko wściekliźnie i że w ciągu ostatnich 6 miesięcy wykazano miano ≥0,5 j.m./ml.</li>
</ol>
2. Przygotowanie preparatu antygenowego
UWAGA: Wykonuj wszystkie manipulacje wirusami, płynem mózgowo-rdzeniowym i surowicą w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) stosując uniwersalne środki ostrożności.
<ol>
	<li>Przygotuj 20 ml mysich komórek neuroblastoma lub BHK-21 o stężeniu 3,0 x 105 komórek/ml w minimalnej pożywce Eagle uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (EGM) i trzymaj w chłodzie do momentu użycia.</li>
	<li>Przygotować wirusa CVS-11 przez rozcieńczenie w EGM do roboczego rozcieńczenia 1,0 x 106,5 50% dawki zakaźnej kultury tkankowej (TCID50) na mililitr i przechowywać w chłodzie, aż będzie gotowy do użycia. 
	UWAGA: TCID50 jest określany za pomocą metody Reeda i Muencha opublikowanej wcześniej5.</li>
	<li>Wyczyść komorę szkiełka wilgotnościowego i szkiełka mikroskopowe pokryte politetrafluoroetylenem (PTFE) 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w BSC.</li>
	<li>Dodaj wodę destylowaną (dH2O) do pasków papieru chłonnego w komorze szkiełkowej, aby zapewnić stałą wilgotność przez cały czas trwania zabiegu.</li>
	<li>Za pomocą ołówka oznacz każde szkiełko numerem partii, datą, typem komórki i wszelkimi innymi informacjami identyfikacyjnymi wymaganymi do przechowywania, a następnie umieść w komorze na szkiełka. 
	UWAGA: Większość markerów, pisaków lub etykiet nie wytrzyma przyszłego etapu utrwalania acetonu (krok 2.9).</li>
	<li>Nanieść 50 μl rozcieńczenia wirusa na każdą studzienkę na szkiełkach mikroskopowych za pomocą powtarzalnej pipety. Następnie nałóż 50 μl rozcieńczenia komórek do każdej studzienki, uważając, aby nie zanieczyścić końcówki pipety wirusem znajdującym się już na studzience.</li>
	<li>Zamknąć komorę szkiełka wilgotnościowego i umieścić ją w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 34-36 °C. Ocenić zakaźność komórek po 24 godzinach 
	UWAGA: Kroki 2.8-2.12 należy wykonać tylko na jednym slajdzie.</li>
	<li>Wyjmij szkiełko z komory wilgotnościowej i ostrożnie zassaj supernatant. Umyj szkiełko w słoiku z kopliny wypełnionym solą fizjologiczną (PBS) przez 2 minuty, a następnie pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Umieść szkiełko w słoiku Coplin i zamocuj je w zimnym acetonie na co najmniej 1 godzinę w zamrażarce o temperaturze -20 °C dopuszczonej do materiałów łatwopalnych. Wszystkie procedury nalewania acetonu i suszenia na powietrzu należy wykonywać w dygestorium.</li>
	<li>Pozwól acetonowi odparować i przesuń do wyschnięcia. Bezpośredni koniugat fluorescencyjny (DFA) przeciwko wściekliźnie (DFA) przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta należy nałożyć do dołków szkiełka i inkubować przez 30 minut w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 34-36 °C.</li>
	<li>Umyj szkiełko w słoikach Coplin PBS dwa razy po 2 minuty każdy. Wysuszyć szkiełko na powietrzu.</li>
	<li>Zamontuj szkiełko nakrywkowe z 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl (pH 9,0) i 20% mocowaniem glicerolu i odczytaj szkiełko za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy 200-krotnym powiększeniu, aby ocenić zakaźność. Jeśli komórki nie są zainfekowane w około 50%, powtórz kroki 2.7-2.12 następnego dnia, aż do osiągnięcia pożądanej zakaźności. 
	UWAGA: Zakaźność komórek jest przybliżona na podstawie wizualnej oceny stosunku komórek ujemnych do komórek dodatnich przeciwko wściekliźnie na szkiełku. Komórki ujemne mają kolor czerwony, podczas gdy komórki dodatnie mają zielone barwienie fluorescencyjne.</li>
	<li>Wyjmij pozostałe szkiełka z inkubatora i komory wilgotnościowej. Ostrożnie odessać supernatant z każdej studzienki, a następnie umieścić szkiełka w słoiku (słoikach) z Coplin z PBS na 1-2 minuty. Suszyć szkiełka na powietrzu przez około 30 minut. Przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będą gotowe do użycia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Przygotować rozcieńczenia surowicy pacjenta lub próbki płynu mózgowo-rdzeniowego do badania. Przygotować koniugat niezbędny do uzyskania właściwego stężenia roboczego rozcieńczony w PBS 0,05% błękitem Evansa. 
	UWAGA: Trzymaj koniugat w ciemności, aby zachować integralność fluoroforu przed aplikacją</li>
</ol>
4. Procedura IFA
<ol>
	<li>Wyjąć niezbędną liczbę przygotowanych szkiełek antygenowych potrzebnych do każdego testu i pozostawić szkiełka do całkowitego rozmrożenia i wyschnięcia.</li>
	<li>Umieść szkiełka w słoiku (słoikach) Coplin i zamocuj je w zimnym acetonie na okres od 2 godzin do nocy w zamrażarce o temperaturze -20 °C dopuszczonej do materiałów łatwopalnych. Wyjmij szkiełka z acetonu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Umieść szkiełka w komorze wilgotnościowej wewnątrz BSC z paskami chłonnymi nasączonymi dH2O, aby utrzymać wilgotność. Nanieść 50 μl każdej próbki rozcieńczonej lub próbki kontrolnej lub PBS do wcześniej ustalonego dołka. 
	UWAGA: Każdy szkiełko musi zawierać odpowiednią liczbę studzienek na próbki pacjenta, kontrolę pozytywną, kontrolę ujemną i studzienkę kontrolną komórek PBS.</li>
	<li>Umieścić zamkniętą komorę szkiełkową wilgotności w inkubatorze o temperaturze 37 °C, wilgotności 5% CO2 . Inkubować szkiełka przez 30 minut, a następnie wyjąć komorę szkiełka wilgotnościowego z inkubatora i umieścić ją w BSC.</li>
	<li>Użyj końcówki aspiratora, aby ostrożnie zassać supernatant z każdej studzienki, upewniając się, że nie naruszysz monowarstwy komórek. Użyj sterylnej pipety z zakraplaczem, aby nanieść jedną kroplę PBS na każdą studzienkę.</li>
	<li>Powtórz staranne aspirację, a następnie umieść każde szkiełko w słoiku z koplinu wypełnionym PBS i umyj dwukrotnie, łącznie przez 15 minut.</li>
	<li>Umieścić szkiełka z powrotem w komorze wilgotnościowej i nałożyć 50 μl odpowiedniego koniugatu przeciwciał antyludzkich do każdej studzienki. Powtórz kroki od 4.4 do 4.6.</li>
	<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu, zamontuj szkiełko nakrywkowe z nośnikiem montażowym i odczytaj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
5. Analiza slajdów
<ol>
	<li>Klasyfikacja próbek na podstawie wzoru barwienia i intensywności fluorescencji w porównaniu z dodatnimi próbkami kontrolnymi z potwierdzonym wysokim mianem przeciwciał przeciwko wściekliźnie.</li>
	<li>Oceń próbki w skali negatywnej, 1+, 2+, 3+ i 4+, przy czym wynik ujemny nie wykazuje barwienia fluorescencyjnego, a 4+ oznacza fluorescencję koloru jasnozielonego jabłka ze wzorem barwienia podobnym do pozytywnych próbek kontrolnych1. 
	UWAGA: Kolor zielonego jabłka dotyczy tylko przeciwciał znakowanych FITC; Kolor różni się w zależności od wyboru fluoroforu.</li>
	<li>Przypisz próbkom wartość punktu końcowego reprezentowaną przez współczynnik rozcieńczenia, przy którym próbka wykazuje stopień 1-2+. Badać próbki przy wyższym współczynniku rozcieńczenia, jeżeli punkt końcowy nie został osiągnięty w próbie początkowej.</li>
</ol>

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

<ol><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Techniques+in+Rabies.+Volume+1%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1.</a> World Health Organization. , Geneva. 232-245 (2018).</li>
<li>Moore, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+rabies+serology%3A+defining+context+of+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Challenges of rabies serology: defining context of interpretation.</a> Viruses. 13 (8), 1516(2021).</li>
<li>Zajac, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+rabies+enzyme-linked+immunosorbent+assay+%28ELISA%29+targeting+IgM+and+IgG+in+human+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera.</a> Viruses. , 40-49 (2019).</li>
<li>Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+antibodies+and+boostability+after+rabies+intradermal+pre-exposure+prophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Travel+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis.</a> Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).</li>
<li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+50%25+endpoint+titer+using+a+simple+formula%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li>
<li>Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+cross-reactions+with+other+viral+encephalitides+in+the+indirect+fluorescent-antibody+test+for+diagnosis+of+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).</li>
<li>Fooks, A. R., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFooks%2C+AR+%22Rabies%3A+scientific+basis+of+the+disease+and+its+management%22">Rabies: scientific basis of the disease and its management</a>. , Academic Press. (2020).</li>
<li>Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Chlamydia+pneumoniae-specific+immunoglobulin+A+%28IgA%29+antibodies+by+the+microimmunofluorescence+%28MIF%29+method%3A+comparison+of+seven+fluorescein-labeled+anti-human+IgA+conjugates+in+an+in-house+MIF+test+using+one+commercial+MIF+and+one+enzyme+immunoassay+kit%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).</li>
<li>Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+anti-rabies+glycoprotein+antibodies%3A+current+state+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).</li>
<li>Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+aspects+of+rabies%3A+a+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Immunological aspects of rabies: a literature review.</a> Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).</li>
<li>Moore, S. M., Hanlon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies-specific+antibodies%3A+measuring+surrogates+of+protection+against+a+fatal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595(2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test IFA wykorzystuje kompleks antygen-przeciwciało, co pozwala na wizualizację przeciwciał specyficznych dla wścieklizny w miejscu znakowania. Komórki nerwiaka zarodkowego lub BHK są wysiewane na wielodołkowych szkiełkach mikroskopowych pokrytych PTFE i zaszczepiane szczepem laboratoryjnym CVS-11 wirusa wścieklizny. Gdy monowarstwa zlewa się, a komórki osiągną pożądaną zakaźność około 50%, szkiełka są przechowywane do momentu przygotowania do użycia6.
Surowicę pacjenta lub płyn mózgowo-rdzeniowy nakłada się na monowarstwę zakażonej komórki i inkubuje, aby umożliwić przyłączenie się przeciwciał specyficznych dla wścieklizny do antygenuwirusa 7. Po procedurze mycia nakłada się znakowane fluorescencyjnie przeciwciało anty-ludzkie IgG lub IgM, które wiąże się z dowolnym przeciwciałem związanym z wirusem z aplikacji próbki. Znakowane przeciwciała można następnie uwidocznić pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Przygotowując się do wykonania tego testu, ważne jest, aby określić najlepsze przygotowanie próbek pacjenta, kontroli i koniugatów. Początkowe próbki pacjentów poddano badaniom przesiewowym przy niskim współczynniku rozcieńczenia lub nierozcieńczonym w celu zbadania obecności przeciwciał. Sparowane próbki lub wcześniej przebadane próbki, które wykazały wysoki poziom przeciwciał, zostały następnie rozcieńczone do punktu końcowego. Wstępne rozcieńczenia próbek pacjenta do badania IgG przygotowano w dostępnym na rynku rozcieńczalniku IFA. Próbki do badań IgM wstępnie przygotowano w dostępnym na rynku odczynniku blokującym IgG. Kolejne seryjne rozcieńczenia dla obu testów przygotowano następnie w PBS.
Kontrole użyte do testów uzyskano od znanych biorców PrEP przeciwko wściekliźnie lub od osób, które nie były szczepione przeciwko wściekliźnie w przeszłości. Wszystkie próbki kontrolne zostały przebadane pod kątem obecności przeciwciał przed użyciem. Kontrolę IgG uzyskano od osoby zaszczepionej przeciwko wściekliźnie z ustalonym mianem przeciwciał neutralizujących wściekliznę, potwierdzonym przez FAVN. Próbkę kontrolną IgM-dodatnią pobrano od osoby zaszczepionej przeciwko wściekliźnie około 2 tygodnie po zakończeniu szczepienia.
Zastosowanie odpowiedniego koniugatu to kolejny istotny aspekt wykonywania testu IFA. Koniugat używany do każdego testu zależy od docelowego izotypu przeciwciała dla tego testu. W tym przypadku wykorzystano dostępne na rynku przeciwciała anty-ludzkie IgG i anty-ludzkie IgM znakowane FITC. Rozcieńczenia koniugatu przeciwciał roboczych oznaczono przed badaniem na podstawie zalecenia producenta.
Istnieje kilka kluczowych etapów procedury, które zapewnią pomyślne przeprowadzenie testu IFA, a być może najważniejszym z nich jest przygotowanie preparatu antygenowego. Osiągnięcie około 50% zakaźności zapewnia obfite miejsca wiązania dla dostępnych przeciwciał, a jednocześnie zapewnia przejrzystość podczas odczytywania i klasyfikowania próbek. Komórki ujemne przeciwko wściekliźnie tworzą kontrastowe tło, aby lepiej uwidocznić znakowane przeciwciała. Barwienie niespecyficzne może również stanowić problem podczas barwienia fluorescencyjnego przy użyciu złożonych matryc próbek, takich jak surowica. Stosowanie odczynników inaktywujących IgG (np. Gullsorb) pomaga ograniczyć niespecyficzne barwienie spowodowane interferującymi przeciwciałami IgG podczas oceny obecności IgM8. Odpowiednie przygotowanie materiałów i włączenie specjalnych odczynników do zabiegu pomaga zmniejszyć problematyczne barwienie przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej jakości wyników.
Opracowano wiele metod testowania, które koncentrują się na wykrywaniu, kwantyfikacji i identyfikacji przeciwciał przeciwko wściekliźnie. Każdy z tych testów oferuje wyniki, które można wykorzystać na różne sposoby w zależności od poszukiwanych informacji. Testy IFA na wściekliznę są potężnym narzędziem do identyfikacji izotypów przeciwciał specyficznych dla wirusa, a wyniki mogą być gotowe w stosunkowo krótkim czasie w porównaniu z innymi metodami testowania, takimi jak testy RFFIT i FAVN.
Chociaż test IFA może wykryć przeciwciała przeciwko wściekliźnie w próbce, nie zapewnia znormalizowanej kwantyfikacji przeciwciał. Test IFA zapewnia współczynnik rozcieńczenia surowicy, przy którym kończy się wykrywanie przeciwciał. Dla porównania, testy RFFIT i FAVN określają ilościowo zdolności neutralizacyjne przeciwciał w próbce, w wyniku czego uzyskuje się miano jednostek międzynarodowych (IU), zapewniając bardziej szczegółowy i znormalizowany wynik. Wyniki testu FAVN lub RFFIT wykazują obecność przeciwciał neutralizujących, które zostały określone jako przeciwciała IgG9. Uważa się, że rola IgM w aktywności neutralizującej jest ograniczona ze względu na jej strukturę10. Dlatego testy te nie wykrywają jednoznacznie obecności IgM.
Rodzaj testu i jego wynik mogą być nieco problematyczne w przypadku zastosowania ich do konkretnego problemu. Koncepcja ochronnego poziomu ochrony przeciwciał przed zakażeniem wirusem wścieklizny nie jest już stosowana do oceny odpowiedzi immunologicznej na szczepienie przeciwko wściekliźnie. Wcześniej odpowiedź ochronna była definiowana jako ≥0,5 j.m. Jednak obecne publikacje zazwyczaj odnoszą się do odpowiedzi przeciwciał po szczepieniu jako akceptowalnej (≥0,5 j.m.) lub nieakceptowalnej (<0,5 j.m.). Jak stwierdzono, test IFA nie zapewnia miana przeciwciał w j.m. i nie powinien być stosowany do określenia poziomu ochrony przed wścieklizną. Stosowanie testu IFA podczas oceny pacjenta, u którego rozwinęła się wścieklizna, nie zawsze może skutkować dodatnią obecnością przeciwciał ze względu na różnice w odpowiedzi immunologicznej w trakcie choroby. Ze względu na prawie 100% śmiertelność zakażenia wścieklizną, ważne jest, aby wziąć pod uwagę test i to, ile informacji można bezpiecznie uzyskać z tych wyników11. Z tych powodów zawsze najlepiej jest ocenić wszystkie metody testowania przeciwciał przeciwko wściekliźnie i określić, która działa najlepiej w danym scenariuszu.

Test na pośrednie przeciwciała fluorescencyjne przeciwko wściekliźnie (IFA) służy do wykrywania różnych izotypów przeciwciał specyficznych dla wścieklizny w surowicach lub płynie mózgowo-rdzeniowym. Jest to jeden z arsenału dostępnych testów do monitorowania pacjenta z wścieklizną antemortem. Jest to szczególnie przydatne do wczesnego wykrywania przeciwciał w celu oceny odpowiedzi immunologicznej pacjenta na zakażenie wścieklizną. W połączeniu z innymi testami, historią przypadku i statusem szczepienia pacjenta, test IFA może pomóc w określeniu narażenia na wirusa wścieklizny lub szczepionkę1. Ponieważ test IFA mierzy IgM i/lub IgG, wartości swoistego przeciwciała mogą wskazywać przybliżone ramy czasowe od ekspozycji na antygen1. Ten test może być przydatny w wymienionych aplikacjach lub innych, które nie zostały jeszcze zbadane.
Dostępnych jest kilka testów serologicznych na wściekliznę. Szybki test hamowania ogniska fluorescencyjnego (RFFIT), test neutralizacji wirusa przeciwciał fluorescencyjnych (FAVN) lub ich modyfikacje są podstawowymi metodami pomiaru przeciwciał neutralizujących wirusa wścieklizny (RVNA)<klasa sup='xref'>1. Jednak testy te nie różnicują przeciwciał IgM i IgG. Gdy różnicowanie izotypu przeciwciał jest ważne w monitorowaniu odpowiedzi immunologicznej wścieklizny, stosuje się testy IFA przeciwko wściekliźnie i test immunoenzymatyczny (ELISA) przeciwko wściekliźnie, ale nie mierzą one RVNA. Chociaż testy IFA i ELISA mogą być stosowane do określania obecności przeciwciał specyficznych dla wścieklizny w próbce, istnieją pewne różnice w sposobie ich wykonywania. Test IFA wykorzystuje żywego wirusa z hodowli komórkowej jako substrat antygenu, podczas gdy typowy test ELISA do wykrywania wścieklizny wykorzystuje jedno lub więcej białek wirusowych. W warunkach laboratoryjnych, w których można hodować wirusa wścieklizny, test IFA może być łatwiejszy do wykonania zamiast kupowania lub hodowli pojedynczych białek wirusowych do testu ELISA. Cel badania i informacje uzyskane na podstawie wyników wszelkich testów serologicznych na wściekliznę powinny być brane pod uwagę przy określaniu, który z nich wybrać2.
IgM jest pierwszym, który odpowiada, zwiększając się aż do momentu zaobserwowania zmiany klasy około 28 dnia, kiedy to IgG staje się dominującym krążącym przeciwciałem3. W związku z tym IgM można się spodziewać tylko przez ograniczony czas po ekspozycji na wirusa wścieklizny lub szczepieniu. Badanie zarówno surowicy, jak i płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) może wskazać, czy narażenie nastąpiło poprzez szczepienie, w którym przeciwciała byłyby widoczne tylko w surowicach, czy też z infekcji wirusowej, która potencjalnie wykazałaby przeciwciała w klasie CSF<sup='xref'>1.
Ustalono, że przeciwciała przeciwko wściekliźnie utrzymują się przez kilka lat po profilaktyce przedekspozycyjnej (PrEP)4. Test IFA może być użytecznym narzędziem do wykazania tego w różnych punktach czasowych po szczepieniu lub ekspozycji.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane 25x55mm</td><td>Dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aceton</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgG Znakowana anty-ludzka IgG Sprzęgany</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9512</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Human IgM znakowany Koniugat</td><td>SeraCare</td><td>5230-0286</td><td></td></tr><tr><td>Zasysająca końcówka do pipety</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>komórka BHK-21</td><td>ATCC</td><td>CCL-10</td><td></td></tr><tr><td>BION IFA Rozcieńczalnik</td><td>MBL BION</td><td>DIL-9993</td><td></td></tr><tr><td>Woda do hodowli komórkowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Słoiki z kopliną</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny z filtrem FITC</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do inaktywacji IgM Gullsorb</td><td>Mountant Fisher Scientific</td><td>23-043-158</td><td>Odczynnik do inaktywacji IgG</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7513</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Minimum Essential Media Eagle &ndash; w/Earle' s sole, L-glutamina i aminokwasy endogenne, bez wodorowęglanu sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Mysie komórki nerwiaka zarodkowego</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>Wielodołkowe szkiełka szklane z powłoką PTFE</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Dowolne</td><td></td><td>pH 7,6&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicylina</td><td>Sigma</td><td>P-3032</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Wścieklizna Bezpośredni koniugat przeciwciał fluorescencyjnych</td><td>Millipore Sigma</td><td>5100, 5500, 6500, RU5100 lub RU5500</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5761</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Kryształy chlorku sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>Mountant</td></tr><tr><td>Sterylny zakraplacz</td><td>Dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól siarczanu streptomycyny</td><td>Sigma</td><td>S9137</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Wstępnie ustawione kryształy Trizma pH 9,0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9693</td><td>Mocowanie</td></tr><tr><td>Bulion z fosforanu tryptozy</td><td>BD</td><td>260300</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Mieszanka witamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td>EGM</td></tr></tbody></table>

wykrywanie przeciwciał igg i igm przeciwko wściekliźnie za pomocą pośredniego testu fluorescencyjnego na przeciwciała przeciwko wściekliźnie

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Test na pośrednie przeciwciała fluorescencyjne przeciwko wściekliźnie (IFA) został opracowany do wykrywania różnych izotypów przeciwciał specyficznych dla wścieklizny w surowicy lub płynie mózgowo-rdzeniowym. Ten test zapewnia szybkie wyniki i może być stosowany do wykrywania przeciwciał przeciwko wściekliźnie w kilku różnych scenariuszach. Test IFA na wściekliznę jest szczególnie przydatny do szybkiego i wczesnego wykrywania przeciwciał w celu oceny odpowiedzi immunologicznej u pacjenta, u którego rozwinęła się wścieklizna. Chociaż inne metody diagnozowania wścieklizny antemortem mają pierwszeństwo, test ten może być wykorzystany do wykazania niedawnej ekspozycji na wirusa wścieklizny poprzez wykrywanie przeciwciał. Test IFA nie zapewnia miana przeciwciał neutralizujących wirusa (VNA), ale odpowiedź profilaktyki przedekspozycyjnej (PrEP) można ocenić na podstawie dodatniej lub ujemnej obecności przeciwciał. Ten test może być wykorzystywany w różnych sytuacjach i może dostarczyć wyników dla wielu różnych celów. W tym badaniu wykorzystaliśmy kilka sparowanych próbek surowicy od osób, które otrzymały PrEP i wykazały obecność przeciwciał przeciwko wściekliźnie w czasie za pomocą testu IFA.

Wszystkie próbki surowicy pobrano od pacjentów w podobnych odstępach czasu po zastosowaniu PrEP. Próbki od pięciu różnych pacjentów badano w następujących punktach czasowych: 2 tygodnie po ostatniej inokulacji szczepionką przeciwko wściekliźnie, 6 miesięcy po serii szczepień przeciwko wściekliźnie oraz 18 miesięcy po serii szczepień przeciwko wściekliźnie. Każdą próbkę surowicy rozcieńczano seryjnie i oceniano pod kątem obecności przeciwciał IgM oraz IgG, zgodnie z opisem w krokach protokołu 5.2 i 5.3. Przypisana wartość przeciwciał reprezentuje czynnik rozcieńczenia, przy którym próbka osiągnęła końcowy stopień oceny 1-2+.
Wyniki testów przeprowadzonych dla każdego punktu czasowego po zastosowaniu PrEP wykazują zdolność testu do wykrywania różnych poziomów obecności przeciwciał. Krótko po wstępnym szczepieniu w próbkach pacjentów stwierdzono wysokie poziomy zarówno IgM, jak i IgG, co przedstawiono na Rysunku 1. Obszary jasnozielonego fluorescencyjnego barwienia komórek wskazują na obecność przeciwciał; komórki czerwone to komórki ujemne pod kątem wirusa wścieklizny, do których nie przyłączyły się przeciwciała. Około 6 miesięcy po szczepieniu w próbkach pacjentów stwierdzono znacznie niższe poziomy zarówno IgM, jak i IgG, przy czym poziom IgM spadł niemal całkowicie. W ostatnim punkcie czasowym, 18 miesięcy po szczepieniu, w żadnej z próbek pacjentów nie wykryto przeciwciał IgM, co zaprezentowano na Rysunku 2, gdzie nie obserwuje się zielonego fluorescencyjnego barwienia komórek. Jednak poziomy IgG utrzymywały się i pozostały zbliżone do poziomów wykrytych w 6. miesiącu, po początkowym spadku odnotowanym w 2. tygodniu. Wyniki wykrywania IgG i IgM w próbkach pobranych 2 tygodnie po szczepieniu, 6 miesięcy po szczepieniu oraz 18 miesięcy po szczepieniu wymieniono odpowiednio w Tabeli 1, Tabeli 2 i Tabeli 3. Rysunek 3 przedstawia schemat blokowy etapów wykonania.
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej zabarwionych komórek wskazujący na żywotność komórek, pasek skali 100 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65459/65459fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Pozytywne barwienie IFA dla IgM przeciwko wściekliznie. Serum pacjenta w rozcieńczeniu 1:8 wykazało pozytywny wzorzec barwienia krótko po zakończeniu serii szczepień PrEP. Pasek skali na obrazie odpowiada 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65459/65459fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy hodowli komórkowej; mikroskopia fluorescencyjna do analizy struktury komórkowej, skala 100µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65459/65459fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Negatywne barwienie IFA dla wścieklizny IgM. Surowica pacjenta w rozcieńczeniu 1:2 nie wykazała pozytywnego barwienia około 18 miesięcy po zakończeniu serii szczepień PrEP. Pasek skali na obrazie reprezentuje 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65459/65459fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat testu przesiewowego antygenu wirusa na szkiełku; inkubacja, koniugat przeciwciał, płukanie; analiza mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65459/65459fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schemat procedury IFA w kierunku wścieklizny. Schemat przedstawiający etapy realizacji głównych kroków w procedurze IFA, ułatwiający wizualizację procesu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65459/65459fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Próbka pacjenta</td>
			<td>IgM</td>
			<td>IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS1-1</td>
			<td>1:32</td>
			<td>1:512</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS2-1</td>
			<td>1:8</td>
			<td>1:128</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS3-1</td>
			<td>1:16</td>
			<td>1:256</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS4-1</td>
			<td>1:64</td>
			<td>1:512</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS5-1</td>
			<td>1:16</td>
			<td>1:128</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wyniki 2 tygodnie po szczepieniu. Wyniki próbek pacjentów z surowicy pobranej około 2 tygodnie po zakończeniu serii szczepień PrEP.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Próbka pacjenta</td>
			<td>IgM</td>
			<td>IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS1-2</td>
			<td>1:2</td>
			<td>1:128</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS2-2</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:128</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS3-2</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS4-2</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:256</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS5-2</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:32</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Wyniki 6 miesięcy po szczepieniu. Wyniki próbek pacjentów z próbek surowicy pobranych w przybliżeniu 6 miesięcy po zakończeniu serii szczepień PrEP.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Próbka pacjenta</td>
			<td>IgM</td>
			<td>IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS1-3</td>
			<td>Nie wykryto</td>
			<td>1:128</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS2-3</td>
			<td>Nie wykryto</td>
			<td>1:128</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS3-3</td>
			<td>Nie wykryto</td>
			<td>1:64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS4-3</td>
			<td>Nie wykryto</td>
			<td>1:64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS5-3</td>
			<td>Nie wykryto</td>
			<td>1:32</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Wyniki 18 miesięcy po szczepieniu.Wyniki próbek pacjentów z surowicy pobranej około 18 miesięcy po zakończeniu serii szczepień PrEP.

Celem tego manuskryptu jest zbadanie zastosowania testu na pośrednie przeciwciała fluorescencyjne przeciwko wściekliźnie do wykrywania przeciwciał IgG i IgM specyficznych dla wścieklizny.

Wykrywanie przeciwciał IgG i IgM przeciwko wściekliźnie za pomocą pośredniego testu fluorescencyjnego na przeciwciała przeciwko wściekliźnie

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...

Test IFA ocenia odpowiedź przeciwciał podczas zakażenia wścieklizną lub ocenia odpowiedź immunologiczną po szczepionkach. Można go użyć do ustalenia obecności przeciwciał w próbce i rozróżnienia, które izotypy przeciwciał są obecne. Testy przeciwciał neutralizujących są złotym standardem w wykrywaniu przeciwciał przeciwko wściekliźnie w celu oceny miana przeciwciał u osoby, która otrzymała profilaktykę przed- lub poekspozycyjną.Chociaż test IFA może dawać inne wyniki niż test przeciwciał neutralizujących, nadal może dostarczyć cennych informacji, gdy jest stosowany jako alternatywa. Zazwyczaj testy, które mierzą przeciwciała neutralizujące wściekliznę, oceniają odpowiedź immunologiczną. Jednak testy te trwają wiele dni i wymagają hodowli wirusa i żywych komórek.Test IFA pozwala na zaawansowane przygotowanie preparatów antygenowych do badań z wynikami w ciągu kilku godzin w porównaniu do dni. Zastosowanie testu IFA w przypadkach wścieklizny u ludzi może prowadzić do uzyskania większej liczby odpowiedzi na temat tego, jak układ odpornościowy danej osoby reaguje na zakażenie wścieklizną. Istnieje duże zróżnicowanie między przypadkami, a ten test może dostarczyć wyniki w czasie rzeczywistym podczas choroby.Na początek noś środki ochrony osobistej, w tym ochronę oczu, maskę chirurgiczną i rękawice nielateksowe. Przygotuj 20 mililitrów mysich komórek nerwiaka zarodkowego lub BHK-21 o stężeniu 3,0 razy 10 do piątych komórek na mililitr w EGM. Utrzymuj przygotowane komórki w chłodzie, aż będą gotowe do użycia.Następnie przygotuj wirusa CVS-11, rozcieńczając go w NWZ. Upewnij się, że przygotowany wirus jest przechowywany w niskiej temperaturze do momentu użycia. Wyczyść komorę szkiełka wilgotnościowego i szkiełka mikroskopowe pokryte politetrafluoroetylenem 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego.Po oczyszczeniu dodaj wodę destylowaną do pasków papieru chłonnego w komorze szkiełkowej, aby zapewnić stałą wilgotność przez cały zabieg. Za pomocą ołówka oznacz każdy slajd wymaganymi informacjami identyfikacyjnymi, takimi jak numer partii, data i typ komórki. Umieść oznaczone szkiełka w komorze szkiełka w celu przechowywania.Następnie nanieść 50 mikrolitrów rozcieńczenia wirusa do studzienek na szkiełkach mikroskopowych za pomocą powtarzalnej pipety. Nałożyć 50 mikrolitrów rozcieńczenia komórek do każdej studzienki, uważając, aby nie zanieczyścić końcówki pipety wirusem znajdującym się już w studzience. Następnie zamknij komorę szkiełka wilgotnościowego i umieść ją w wilgotnym inkubatorze w temperaturze od 34 do 36 stopni Celsjusza.Następnie wyjmij szkiełko z komory wilgotnościowej i skrupulatnie odessaj supernatant. Myj szkiełko przez dwie minuty w słoiku Coplin wypełnionym PBS, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Umieść szkiełko w zimnym słoiku Coplin wypełnionym acetonem, aby utrwalić próbkę.Umieść słoik w zamrażarce o temperaturze 20 stopni Celsjusza dopuszczonej do materiałów łatwopalnych na co najmniej godzinę. Gdy aceton odparuje i szkiełko wyschnie, nałóż bezpośrednie przeciwciało fluorescencyjne przeciwko wściekliźnie do dołków szkiełka i inkubuj szkiełko przez 30 minut w wilgotnym inkubatorze o temperaturze od 34 do 36 stopni Celsjusza. Następnie umyj szkiełko dwukrotnie w słoiku Coplin PBS przez dwie minuty każdy.Wysuszyć szkiełko na powietrzu i zamontować szkiełko nakrywkowe za pomocą 0,05 molowego Tris, 0,15 molowego chlorku sodu i 20% glicerolu. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego o 200-krotnym powiększeniu, aby ocenić zakaźność komórek. Następnie wyjmij pozostałe szkiełka z inkubatora i komory wilgotnościowej.Ostrożnie odessać supernatant z każdej studzienki, a następnie umieścić szkiełka w słoiku Coplin z PBS na jedną do dwóch minut. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez około 30 minut, a następnie przechowuj je w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu użycia. Na początek należy przygotować rozcieńczenie do próbek surowicy pacjenta lub płynu mózgowo-rdzeniowego do badania.Przygotować wymagany koniugat w odpowiednim stężeniu roboczym, rozcieńczając go w PBS 0,05% błękitem Evansa. W przypadku pośrednich testów fluorescencyjnych na obecność przeciwciał należy pobrać odpowiednią liczbę przygotowanych preparatów antygenowych wymaganych do przeprowadzenia testu. Poczekaj, aż szkiełka całkowicie się rozmrozą i wyschną.Następnie umieść szkiełka w słoiku Coplin wypełnionym acetonem i przenieś je do zamrażarki o temperaturze 20 stopni Celsjusza dopuszczonej do materiałów łatwopalnych na dwie godziny do nocy. Następnie wyjmij szkiełka z acetonu i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu. Teraz umieść szkiełka w komorze wilgotnościowej wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego.Aby utrzymać wilgotność, dodaj do komory destylowane paski chłonne nasączone wodą. Nałożyć 50 mikrolitrów z każdej próbki kontrolnej, rozcieńczenia próbki lub PBS do wcześniej ustalonego dołka. Umieść zamkniętą komorę szkiełka wilgotnościowego w inkubatorze wilgotności 5% dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut.Po zakończeniu wyjmij komorę szkiełka wilgotnościowego z inkubatora i przenieś ją do komory bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą końcówki aspiratora ostrożnie zassaj supernatant z każdej studzienki, nie naruszając monowarstwy komórek. Następnie nałóż jedną kroplę PBS na każdą studzienkę za pomocą sterylnej pipety z zakraplaczem.Ostrożnie zassać PBS i przenieść każde szkiełko do słoika Coplin wypełnionego PBS. Następnie umieść szkiełka z powrotem w komorze wilgotnościowej. Do każdej studzienki nanieść 50 mikrolitrów odpowiedniego koniugatu przeciwciał anty-ludzkich i inkubować przez 30 minut w wilgotnym inkubatorze.Pod koniec inkubacji przenieść komorę wilgotnościową do komory bezpieczeństwa biologicznego. Odessać supernatant za pomocą końcówki aspiratora. Następnie nałóż jedną kroplę PBS na każdą studzienkę za pomocą sterylnej pipety z zakraplaczem.Po wyjęciu PBS umyć szkiełko dwukrotnie w słoiku Coplin z PBS przez łącznie 15 minut. Po umyciu pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu, a następnie zamontuj szkiełko nakrywkowe z nośnikami montażowymi. Weź szkiełka i przeczytaj je pod mikroskopem fluorescencyjnym.Próbki należy klasyfikować od ujemnych do 4+, przy czym próbki ujemne nie wykazują fluorescencji, a próbki 4+ wykazują jasnozieloną fluorescencję. Przypisz próbki i wartość końcową reprezentowaną przez współczynnik rozcieńczenia, przy którym próbka wykazuje ocenę od 1 do 2+. Po pierwszym szczepieniu w próbkach pobranych od pacjentów zaobserwowano wysoki poziom zarówno immunoglobuliny M, jak i G.Około sześć miesięcy po szczepieniu w próbkach pobranych od pacjentów stwierdzono znacznie niższe poziomy obu przeciwciał, ale poziomy immunoglobuliny M spadły prawie całkowicie. 18 miesięcy po szczepieniu w próbkach pobranych od pacjentów nie wykryto przeciwciał immunoglobuliny M. Poziomy immunoglobuliny G utrzymywały się i pozostawały na poziomie wykrytym w sześciomiesięcznym punkcie czasowym po początkowym spadku z dwutygodniowego punktu czasowego.

detection-rabies-igg-igm-antibodies-using-rabies-indirect-fluorescent

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje barwienie immunohistochemiczne do wykrywania antygenu wirusa wścieklizny w zakażonej tkance mózgowej myszy. Proces ten obejmuje deparatynizację i leczenie alkoholem, a następnie leczenie proteolityczne w celu zwiększenia dostępności antygenu. Barwienie immunohistochemiczne ujawnia czerwone osady, potwierdzające obecność antygenów wścieklizny w skrawku tkankowym.

Barwienie immunohistochemiczne do wykrywania antygenów wirusa wścieklizny

Bezpośredni szybki test immunohistochemiczny (DRIT) stanowi uznaną przez Światową Organizację Zdrowia Zwierząt i Światową Organizację Zdrowia (OIE/WHO) alternatywę dla testu na przeciwciała fluorescencyjne (DFA) do diagnozowania wścieklizny. Test ten pozwala na zastosowania w terenie, które można wykonać w ciągu około 1 godziny po pobraniu wycisków mózgu za pomocą mikroskopii świetlnej.

Wzmocniony nadzór nad wścieklizną za pomocą bezpośredniego szybkiego testu immunohistochemicznego

Tutaj opisujemy pośrednie wychwytywanie immunologiczne metodą ELISA w celu określenia zawartości immunogennej glikoproteiny w szczepionkach przeciwko wściekliźnie. Ten test wykorzystuje neutralizujące przeciwciało monoklonalne (mAb-D1) rozpoznające trimery glikoproteiny. Jest to alternatywa dla testu NIH in vivo w celu śledzenia spójności siły działania szczepionki podczas produkcji.

Test ELISA in vitro do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie

Przedstawiamy kompletny protokół do pośmiertnej diagnozy wścieklizny zwierząt w warunkach polowych przy użyciu szybkiego immunochromatograficznego testu diagnostycznego (RIDT), od pobrania próbki z biopsji mózgu do ostatecznej interpretacji. Opisujemy również dalsze zastosowania urządzenia do analizy molekularnej i genotypowania wirusów.

Terenowy pośmiertny szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny wścieklizny do zastosowań o ograniczonych zasobach z dalszymi zastosowaniami molekularnymi

Tutaj prezentujemy protokół testu immunohistochemicznego do wykrywania antygenu wirusa wścieklizny jako alternatywny test diagnostyczny dla tkanek utrwalonych w formalinie.

Test immunohistochemiczny do wykrywania antygenu wirusa Lyssa z tkanek utrwalonych formaliną

Ten protokół przedstawia oparte na qRT-PCR podejście do określania liczby kopii genu nukleoproteiny (N) wirusa wścieklizny w różnych strukturach anatomicznych mózgu bydlęcego za pomocą transkrypcji in vitro.

Kwantyfikacja wirusa wścieklizny w różnych strukturach mózgu bydła

Synteza ludzkich przeciwciał monoklonalnych jest pierwszym krokiem w badaniach mających na celu rozwikłanie patofizjologicznych mechanizmów odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem autoprzeciwciał. Opracowaliśmy protokół wytwarzania rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych ludzkiej immunoglobuliny G (IgG) z komórek B posortowanych krwią, w tym izolację komórek B, klonowanie przeciwciał i syntezę in vitro.

Wytwarzanie rekombinowanych ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgG z unieśmiertelnionych sortowanych komórek B

Przedstawiamy protokół do identyfikacji grup białkowych zawierających antygeny dla ludzkich i mysich przeciwciał IgM ze specyficznymi łańcuchami lekkimi kappa (Vκ). Protokół ten nie ogranicza się do przeciwciał klasy IgM, ale ma zastosowanie do wszystkich izotypów immunoglobulin, które celują w swój antygen z wystarczająco wysokim powinowactwem podczas immunoprecypitacji.

Swoistość wiązania przeciwciał dla ludzkich przeciwciał Kappa (Vκ) zawierających łańcuch lekki (IgM): kwas polisjalowy (PSA) dołączony do NCAM jako studium przypadku

Opisujemy tutaj metodę generowania konfigurowalnych mikromacierzy antygenowych, które mogą być używane do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM w surowicy od ludzi i myszy. Macierze te pozwalają na wysokoprzepustowe i ilościowe wykrywanie przeciwciał przeciwko dowolnemu antygenom lub epitopom.

Generacja dwukolorowych mikromacierzy antygenowych do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM

Metoda znakowania przeciwciał na koralikach z małymi cząsteczkami umożliwia znakowanie niewielkiej ilości przeciwciał bezpośrednio z pożywki komórkowej. Metoda ta jest kompatybilna z chemią amin i tioli i może obsługiwać wiele próbek równolegle, ręcznie lub przy użyciu zautomatyzowanych platform.

Znakowanie przeciwciał barwnikami fluorescencyjnymi przy użyciu magnetycznych kulek białka A i białka G

Poznaj pośredni test fluorescencyjny na przeciwciała przeciwko wściekliźnie do wykrywania IgG i IgM. Ta metoda pozwala szybko ocenić odpowiedź immunologiczną po szczepieniu lub zakażeniu.

Wykrywanie przeciwciał IgG i IgM przeciwko wściekliźnie za pomocą pośredniego testu fluorescencyjnego na przeciwciała przeciwko wściekliźnie (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie przeciwciał IgG i IgM przeciwko wściekliźnie za pomocą pośredniego testu fluorescencyjnego na przeciwciała przeciwko wściekliźnie

Przeglądaj więcej filmów