Name: Oczyszczanie chromatyny locus genu z pojedynczą kopią u Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Poznaj metodę izolacji chromatyny locus-specyficznej u Saccharomyces cerevisiae w natywnym stanie. Technika umożliwia badanie interakcji białko-DNA bez artefaktów sieciowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratorium S.H. była wspierana przez DFG za pośrednictwem SFB1064 (ID projektu 213249687), Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) oraz Helmholtz Gesellschaft.

Locus-Specific Chromatin Isolation from Yeast Cells

<ol><li>Kornberg, R. D., Lorch, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-five+years+of+the+nucleosome%2C+fundamental+particle+of+the+eukaryote+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome.</a> Cell. 98 (3), 285-294 (1999).</li>
<li>Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+enrichment+of+specific+chromatin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and enrichment of specific chromatin loci.</a> Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).</li>
<li>Korthout, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+chromatin+proteome+of+a+single+genomic+locus+by+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing.</a> PLoS Biology. 16 (7), e2005542(2018).</li>
<li>Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+landscape+at+Drosophila+melanogaster+telomere-associated+sequence+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats.</a> Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).</li>
<li>Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins+associated+with+specific+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins associated with specific genomic loci.</a> Cell. 136 (1), 175-186 (2009).</li>
<li>Ide, S., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-targeting+proteomics+of+isolated+chromatin+segments+of+a+mammalian+ribosomal+RNA+gene+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter.</a> Nature Communications. 6, 6674(2015).</li>
<li>Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+histone+acetylation+regulate+origins+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26amp%3B+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (4), 430(2010).</li>
<li>Buxton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+protein-DNA+interactions+in+human+alphoid+chromatin+via+hybridization+capture+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).</li>
<li>Kennedy-Darling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+chromatin-associated+proteins+via+sequence-specific+capture+and+mass+spectrometric+protein+identification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).</li>
<li>Liu, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi-based+genome-scale+identification+of+functional+long+noncoding+RNA+loci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells.</a> Science. 355, 7111(2017).</li>
<li>Hamperl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+chromatin+domains+from+single-copy+gene+loci+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Analysis+of+DNA+and+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae.</a> Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).</li>
<li>Hamperl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+and+structural+analysis+of+selected+chromosomal+domains+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 2(2014).</li>
<li>Weiβ, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+locus+proteomics+of+early-+and+late-firing+DNA+replication+origins+identifies+a+role+of+Ask1%2FDASH+complex+in+replication+timing+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control.</a> Cell Reports. 42 (2), 112045(2023).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol">https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol</a> (2023).</li>
<li>Vermeulen, M., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-specific+chromatin+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Locus-specific chromatin isolation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Identyfikacja czynników i krajobrazu chromatyny w określonym docelowym regionie genomowym nadal stanowi poważne wyzwanie w badaniach nad chromatyną18. Protokół ten opisuje skuteczny system do specyficznego wycinania i oczyszczania odrębnych domen chromatyny z chromosomów drożdży. Zgodnie z naszą wiedzą, czystość i wydajność tego jednoetapowego oczyszczania przezwyciężają wiele ograniczeń metod oczyszczania chromatyny specyficznych dla locus, umożliwiając w ten sposób osiągnięcie bardzo wysokiego w...

Dynamiczna organizacja genomów eukariotycznych w chromatynę zagęszcza DNA tak, aby mieściło się w granicach jądra, zapewniając jednocześnie wystarczającą dynamikę dla ekspresji genów i dostępność dla czynników regulacyjnych. Częściowo ta wszechstronność jest pośredniczona przez nukleosom, podstawową jednostkę chromatyny, która składa się z cząstki rdzenia ze 147 pz DNA owiniętego ~1,7 razy wokół oktameru histonu1. Nukleosom jest strukturą wysoce dynamiczną pod względem składu, z licznymi wariantami histonów i modyfikacjami potranslacyjnymi (PTM) na N- i C-końcowych ogonach histonowych. Ponadto chromatyna eukariotyczna oddziałuje z wieloma innymi istotnymi składnikami, takimi jak czynniki transkrypcyjne, maszyneria przetwarzania DNA i RNA, białka architektoniczne, enzymy biorące udział w przebudowie i modyfikacji chromatyny oraz cząsteczki RNA związane z chromatyną. Te kluczowe mechanizmy zaangażowane w transkrypcję, replikację i naprawę wymagają dostępu do chromatyny, która służy jako naturalny substrat dla tych procesów. W związku z tym zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych transakcji DNA wymaga precyzyjnego zdefiniowania zbiorowych zmian w strukturze chromatyny w określonych regionach genomu, w których zbiegają się te mechanizmy i ułatwiają reakcje biologiczne.
Pomimo identyfikacji wielu czynników chromatyny poprzez genetykę i badania interakcji białko-białko, przeprowadzanie bezpośrednich, bezstronnych i kompleksowych analiz interakcji chromatyny w poszczególnych miejscach genomowych pozostało istotną przeszkodą2,3. Początkowo można było wyizolować tylko bardzo liczne regiony genomu (tj. powtarzające się loci) lub plazmidy z wieloma kopiami w wystarczających ilościach i czystości do identyfikacji powiązanych białek metodą spektrometrii mas4,5,6,7. Szereg nowych podejść opartych na bezpośredniej hybrydyzacji sond wychwytujących z chromatyzowanym DNA, biotynylacji zbliżeniowej przy użyciu systemu CRISPR-dCas9 lub wiązaniu specyficznych dla sekwencji białek adapterowych z miejscem zainteresowania zaczęło odkrywać proteom loci pojedynczej kopii z genomów drożdży i ssaków8,9,10. Jednak wszystkie te metody wymagają sieciowania formaldehydu w celu ustabilizowania interakcji białko-DNA i sonikacji w celu rozpuszczenia chromatyny w celu późniejszego oczyszczenia. Obie manipulacje łącznie wykluczają możliwość późniejszych badań strukturalnych i funkcjonalnych oczyszczonej chromatyny.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, wcześniej opracowaliśmy metodologię, która wykorzystuje rekombinację specyficzną dla miejsca do ekstrakcji docelowych domen chromosomowych z drożdży11,12. W istocie, interesujący region genomowy jest otoczony miejscami rozpoznawania (RS) dla specyficznej dla miejsca R-rekombinazy z Zygosaccharomyces rouxi, jednocześnie włączając grupę trzech miejsc wiązania DNA dla prokariotycznego białka represora transkrypcji LexA (LexA) w tym samym regionie. Komórki drożdży zawierają kasetę ekspresyjną do jednoczesnej ekspresji R-rekombinazy i białka LexA połączonego ze znacznikiem tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP). Po indukcji R-rekombinazy enzym skutecznie wycina docelowy region z chromosomu w postaci kolistej domeny chromatyny. Domena ta może zostać oczyszczona za pomocą białka adapterowego LexA-TAP, które wiąże się z miejscami wiązania DNA LexA, a także ze wsparciem powinowactwa. Metoda ta została ostatnio wykorzystana do wyizolowania odrębnych domen chromatyny zawierających wybrane początki replikacji chromosomu III drożdży13.
Jedną z głównych zalet tego podejścia ex vivo jest to, że pozwala ono na analizę funkcjonalną wyizolowanego materiału. Na przykład domeny początkowe replikacji oczyszczone tą metodą można poddać testom replikacji in vitro w celu oceny skuteczności wypalania w probówce z natywnych matryc chromatyny złożonych in vivo. Ostatecznie charakterystyka biochemiczna i funkcjonalna wyizolowanego materiału może pozwolić na odtworzenie procesów jądrowych przy użyciu oczyszczonych białek wraz z natywną matrycą chromatyny. Podsumowując, metodologia ta otwiera ekscytującą drogę w badaniach nad chromatyną, ponieważ możliwe będzie śledzenie zbiorowych zmian składu i struktury chromatyny w określonym regionie genomu podlegającym określonej transakcji chromosomalnej.

<table><tbody><tr><td><silny>Szczepy drożdży< / silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>kontrolny szczep: < / silny> MATa; ura3 i Delta; 0; leu2&Delta; 0; jego3&Delta; 1; met15 i Delta; 0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR</td><td></td><td></td><td>Sekcja 1, patrz referencje 13 i 14</td></tr><tr><td>Recombination Szczep: MATa; ura3&Delta; 0; leu2&Delta; 0; jego3&Delta; 1; met15 i Delta; 0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR</td><td></td><td></td><td>Sekcja 1, patrz odniesienie 13 i 14</td></tr><tr><td>Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K238 plazmid</td><td></td><td></td><td>sekcja 1, patrz numer referencyjny 13 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>K071 Kolce plazmidowego DNA</td><td></td><td></td><td>Sekcja 7.1, patrz odniesienie 13 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Carl Roth</td><td>5025.1</td><td>Sekcja 2 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Octan amonu (NH4Ac)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7262</td><td>Sekcja 6 i 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Roztwór amonu (NH4OH) 25%</td> <td>Merck Millipore</td><td>533003</td><td>Sekcja 6 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-29085</td><td>Sekcja 2 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Agar baktonowy</td><td>BD (VWR)</td><td>90000-760</td><td>Sekcja 3 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Pepton baktonowy</td><td>BD (VWR)</td><td>211820</td><td>Sekcja 3 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>07604</td><td>Sekcja 7.2 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Zestaw podłoża chemiluminescencyjnego</td><td>ThermoFisher</td><td>34580</td><td>Sekcja 7.2 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Wodorofosforan di-sodowy dwunastowodny</td><td>Merck</td><td>1.06579.1000</td><td>Sekcja 2 i 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher</td><td>15508013</td><td>Section 4 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 & C</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Sekcja 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ED</td><td>Sekcja 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Galaktoza (zapas 20% (w/v))</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0625-1KG&nbsp; /&nbsp; 5KG</td><td>Sekcja 3 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Żel Barwnik ładujący (6x)</td><td>BioLabs</td><td>B7024A</td><td>Sekcja 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Glusose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Sekcja Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl</td> <td>Roth.0079.4</td><td>Section 2 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Glikogen (5 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td>Sekcja 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>182109.1211</td><td>Sekcja 2, 4 i 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Octan magnezu (MgAc)</td><td>Bernd Kraft</td><td>15274.2600/C035</td><td>Sekcja 4 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>Sekcja 6 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Bufor do próbek Nu PAGE LDS (4x)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>2399549 Sekcja 7.2 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (25:24:1 v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>Sekcja 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Sekcja 4 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Znakowane radioaktywnie &alfa;-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL)</td><td>Hartmann Analytic</td><td>SRP-203</td><td>Sekcja 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 &deg; C</td></tr><tr><td>System etykietowania RadPrime</td><td>ThermoFisher</td><td>18428-011</td><td>Sekcja 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Rafinoza (20% (w/v) zapasów)SERVA</td><td></td> <td>34140.03</td><td>Sekcja 3 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Merck</td><td>K53710504142</td><td>sekcja 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu (Na3C6H5O7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71402</td><td>Sekcja 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Sekcja 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>N-dodecylosiarczan sodu (SDS) (5% zapasu (w/v) ) Alfa</td> <td>Aesar</td><td>A11183</td><td>Sekcja 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71496</td><td>Sekcja 2 i 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Sód&nbsp; azide</td><td>Santa Cruz&nbsp; Biotechnologia</td><td>sc-208393</td><td>Sekcja 2 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>&nbsp; Triethylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90340</td><td>Section 2 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Chem Cruz</td><td>SC-3715B</td><td>Section 2 and 4 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Section 2 i 4 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bernd Kraft</td><td>18014332</td><td>Sekcja 4 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>BD (VWR)</td><td>212720</td><td>Sekcja 3 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Czynnik kojarzenia drożdży alfa (1 &mikro; g/ml zapasu )</td><td>&nbsp; Biomol</td><td>Y2016.5</td><td>Sekcja 3 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Drożdżowe syntetyczne pożywki drop-out Suplementy bez LEUCINE</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1376</td><td>Sekcja 1, patrz odniesienie 14</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny HpaI (5,000 U/ml)</td><td>NEB</td><td>R0105S</td><td>Sekcja 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78446</td><td>Sekcja 4 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Proteinaza K (10 mg / ml)</td> <td>SERVA</td><td>33756</td><td>Sekcja 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>RNaza A (10 mg/ml)</td><td>&nbsp; ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td>Sekcja 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni; Proteaza C</td></tr><tr><td>TEV (10000 U/&mikro; L)</td> <td>NEB</td><td>P8112S</td><td>Sekcja 5 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BcMag Aktywowane epoksydem kulki magnetyczne</td><td>Bioclone Inc.</td><td>FC-102</td><td>Sekcja 2 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Suchy lód</td><td></td><td></td><td>Sekcja 4</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe o niskim poziomie wiązania 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td>Sekcja 4</td></tr><tr><td>Microspin&nbsp; Kolumny G-25</td><td>Cytiva</td><td>27-5325-01</td><td>Sekcja 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Merck</td><td>P7793</td><td>Sekcja 4</td></tr><tr><td>Dodatnia membrana nylonowa</td><td>Biozol</td><td>11MEMP0001</td><td>Sekcja 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Membrana transferowa PVDF</td><td>Immobilon-Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Sekcja 7.2 Przechowywanie: Przechowywać w pokoju temperatura</td></tr><tr><td>SDS-PAGE żel 4-12% bis-tris (15 dołków, 1,5 mm)</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; NP0336BOX</td><td>Sekcja 7.2 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 stopni; </td></tr><tr><td>Strzykawka C (25 ml) z mocowaniem typu luer</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4200-000V0</td><td>Sekcja 3</td></tr><tr><td>Papier Whatman (arkusz bibuły Western Blotting Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting)</td><td>Cytiva</td><td>3030-917</td><td>Sekcja 7.1 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-LexA, poliklonalne IgG królika, przeciwciało regionu wiążącego DNA</td><td>Merck Millipore</td><td>06-719</td><td>Sekcja 7.2 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Kozia IgG Anty-Królicza IgG (H + L), koniugat peroksydazy chrzanowej</td><td>Invitrogen</td><td>G21234</td><td>Sekcja 7.2 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 &; Przeciwciało</td></tr><tr><td>antyperoksydazy C (PAP) wytwarzane u królika w celu wykrywania białek znakowanych TAP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1291-500UL</td><td>Sekcja 7.2 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 &; C</td></tr><tr><td>Przeciwciała IgG królika</td><td>Sigma</td><td>I5006-100MG</td><td>Sekcja 2 Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 &; </td></tr><tr><td>CPrimery (10 &mikro; M)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT</td><td></td><td></td><td>Sekcja 7.1</td></tr><tr><td>K071 Kolce w plazmidowym DNA: fwd: 5'-TTTTCCTGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT</td><td></td><td></td><td>Sekcja 7.1</td></tr><tr><td>PCR fragment genomowego DNA drożdży jako matryca &nbsp; dla wzmocnienia ARS316 (dla southern blot): fwd 5'- AAATTCTGCCCTTGATTCGT&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; rev 5'- TTTGTTTATCTCATCACTAAT</td><td></td><td></td><td>Sekcja 7.1</td></tr><tr><td>PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT</td><td></td><td></td><td>Sekcja 7.1</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Młynek do kawy</td><td>Gastroback</td><td>42601</td><td>Sekcja 4</td></tr><tr><td>Kolba Dewara</td><td>NAL GENE</td><td>4150-2000</td><td>Sekcja 3</td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny DynaMag TM-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Sekcja 4, 5 i 6</td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji</td><td>Hybaid Mini10</td><td>Ri418</td><td>Sekcja 2</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>Sekcja 4 i 7.1</td></tr><tr><td>Sieciownik UV</td><td>Analytikjena</td><td>95-0174-02</td><td>Sekcja 7.1</td></tr></tbody></table>

oczyszczanie chromatyny locus genu z pojedynczą kopią u saccharomyces cerevisiae

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

Podstawową jednostką organizacyjną eukariotycznej chromatyny jest cząstka rdzenia nukleosomu (NCP), która składa się z DNA owiniętego ~1,7 razy wokół oktameru histonu. Chromatyna jest definiowana jako jednostka NCP i wielu innych kompleksów białkowych, w tym czynników transkrypcyjnych, enzymów przebudowujących chromatynę i modyfikujących ją. Nadal nie jest jasne, w jaki sposób te interakcje białko-DNA są organizowane na poziomie określonych loci genomowych na różnych etapach cyklu komórkowego. Wynika to przede wszystkim z obecnych ograniczeń technicznych, które utrudniają uzyskanie precyzyjnych pomiarów takich oddziaływań dynamicznych. W tym miejscu opisujemy ulepszoną metodę łączącą rekombinację specyficzną dla miejsca z wydajnym jednoetapowym protokołem oczyszczania powinowactwa w celu wyizolowania interesującego pojedynczej kopii genu w jego natywnym stanie chromatyny. Metoda ta pozwala na solidne wzbogacenie locus docelowego w stosunku do chromatyny genomowej, dzięki czemu technika ta jest skuteczną strategią identyfikacji i ilościowego określania interakcji białek w sposób bezstronny i systematyczny, na przykład za pomocą spektrometrii mas. W nawiązaniu do takich analiz składowych, natywna chromatyna oczyszczona tą metodą prawdopodobnie odzwierciedla sytuację in vivo dotyczącą pozycjonowania nukleosomów i modyfikacji histonów, a zatem jest podatna na dalsze analizy strukturalne i biochemiczne chromatyny pochodzącej z praktycznie dowolnego locus genomowego drożdży.

Oczyszczanie domeny chromatyny ARS316 o wielkości ~1,4 kb odbywało się za pośrednictwem konstytutywnie ekspresowanego białka adapterowego LexA-TAP. W celu uzyskania kontroli negatywnej przeprowadzono oczyszczanie z użyciem szczepu izogennego, który wykazuje ekspresję LexA-TAP, ale nie posiada zintegrowanych sekwencji RS oraz miejsc wiązania LexA. Rysunek 3 przedstawia wynik analizy DNA z typowego eksperymentu oczyszczania przeprowadzonego zarówno na szczepie kontrolnym, jak i na szczepie zdo...

Ten protokół przedstawia metodę izolacji chromatyny specyficzną dla locus, opartą na rekombinacji specyficznej dla miejsca, w celu oczyszczenia interesującego miejsca pojedynczej kopii genu w jego natywnym kontekście chromatyny z pączkujących drożdży, Saccharomyces cerevisiae.

Oczyszczanie chromatyny locus genu z pojedynczą kopią u Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

Jądro eukariotyczne jest bardzo zatłoczone, a wiele procesów biologicznych zachodzi jednocześnie. Zakres naszych badań polega na zrozumieniu, w jaki sposób wszystkie te procesy są koordynowane w naszych genomach bez poważnych wypadków, które w przeciwnym razie prowadziłyby do niestabilności genomu i chorób u ludzi. Protokół ten pozwala nam oczyścić określone locus genomu w jego natywnym stanie, umożliwiając zarówno kompozycyjną, jak i funkcjonalną charakterystykę wyizolowanego materiału, taką jak pomiary interakcji białko-DNA.Protokół ten umożliwia ogromny poziom wzbogacenia docelowego locus, który pokonuje wiele obecnych ograniczeń związanych z izolacją chromatyny specyficznej dla locus. Materiał nie został usieciowany. Pozwala to również na wiele dalszych analiz funkcjonalnych, takich jak transkrypcja in vitro lub replikacja in vitro.Protokół ten umożliwił nam wycięcie i oczyszczenie odrębnych początków replikacji chromosomów drożdży, co pozwoliło nam przeprowadzić analizę proteomiczną i zidentyfikować nowe czynniki chromatyny oddziałujące na pochodzenie, a tym samym posunąć naprzód dziedzinę badań nad replikacją DNA. Protokół ten umożliwia badania replikacji in vitro z wykorzystaniem oczyszczonego materiału wyjściowego w celu zbadania stanów chromatyny, modyfikacji histonów i przeprowadzenia analizy strukturalnej na natywnych matrycach nukleosomalnych z endogennych chromosomów, posuwając naprzód badania nad chromatyną. Zacznij od zaszczepienia kompetentnych szczepów drożdży kontrolnych i rekombinacyjnych z płytek YPD do pięciu mililitrów pożywki YPR i hoduj kulturę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obr./min.Następnie zwiększ skalę kultury, zaszczepiając dwa mililitry w 100 mililitrach świeżej pożywki YPR i uprawiając ją przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obr./min. Dla każdego szczepu dozować 1 800 mililitrów autoklawowanego podłoża peptonowego drożdży i 200 mililitrów autoklawowanego 20% roztworu rafinozy do dwóch pięciolitrowych kolb Erlenmeyera. Zaszczepić każdy szczep drożdży o gęstości optycznej 0,2 przy 600 nanometrach w odpowiednim pożywce i inkubować przez około sześć godzin przy 200 obr./min lub do momentu, gdy komórki osiągną pożądaną gęstość optyczną 1,0.Dodaj jednocześnie 200 mililitrów 2% galaktozy i 110 mikrolitrów czynnika kojarzenia drożdży alfa lub YMFA, aby zatrzymać komórki w fazie G1 i inkubować je przez dwie godziny. Przenieś zawiesinę komórkową do jednolitrowych wiader wirówek i odwiruj wiadro w temperaturze 6 000 G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś granulki komórek w 10 do 15 mililitrach wody destylowanej.Następnie zamknij 25-mililitrową strzykawkę z zatyczką do przynęty i umieść ją w 50-mililitrowej stożkowej tubie wypełnionej wodą. Przenieść zawiesinę komórek do zespołu strzykawki. Umyj wiadra wirówkowe pięcioma mililitrami wody destylowanej, aby zebrać pozostałe komórki.Następnie odwirować zestaw o stężeniu 2,397 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant. Następnie wyjmij zatyczkę przynęty ze strzykawki i wytłacz komórki do ciekłego azotu, aby uformować spaghetti komórkowe. Na koniec przenieś spaghetti z zamrożonych komórek do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia.Rozpocznij chłodzenie komercyjnego młynka do kawy, mieląc około 30 do 50 gramów suchego lodu dwa razy przez 30 sekund za każdym razem. Wyrzuć suchy lód w proszku i wymieszaj trzy gramy zamrożonego spaghetti z komórkami drożdży z około 30 do 50 gramami suchego lodu we wstępnie schłodzonym młynku do kawy. Uszczelnij połączenie między nasadką a młynkiem za pomocą Parafilm.Wymieszaj komórkę drożdży, suchy lód mieszaj 10 razy po 30 sekund każde, pozostawiając 30-sekundowe odstępy między każdą rundą. Przenieś powstałą komórkę drożdży, suchy lód w proszku do plastikowej zlewki za pomocą czystej i suchej szpatułki. Po odparowaniu suchego lodu dodaj 2,25 mililitra kulki magnetycznej lub buforu MB z inhibitorami proteazy i fosfatazy do proszku komórek drożdży.Po energicznym odpipetowaniu mieszaniny komórkowych przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie przechowuj 0,1% próbek z surowych ekstraktów komórkowych do DNA i 0,05% próbek do analizy białek w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Przenieś pozostałą zawiesinę komórkową do dwumililitrowych probówek reakcyjnych o niskim poziomie wiązania i oddziel resztki komórek, odwirowując probówki.Po zakończeniu zbierz wszystkie supernatanty w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Ponownie przechowuj 0,1% supernatantu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza dla DNA i 0,05% supernatantu do analizy białka. Następnie przemyć 500 mikrolitrów zawiesiny kulek magnetycznych sprzężonej z immunoglobuliną G z 500 mikrolitrami zimnego buforu MB zawierającego inhibitory proteazy i fosfatazy dwa razy przez pięć minut każdy w czterech stopniach Celsjusza przy rotacji z prędkością 20 obr./min.Inkubować kulki magnetyczne w 500 mikrolitrach zimnego buforu MB przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy rotacji z prędkością 20 obr./min, a następnie usunąć supernatant z kulek za pomocą stojaka magnetycznego. Wymieszaj zrównoważoną zawiesinę kulek magnetycznych z uzyskanym wcześniej lizatem komórkowym i połącz w 15-mililitrową stożkową rurkę. Po inkubacji przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 20 obr./min przenieś pełną zawiesinę lizatu komórek kulek magnetycznych do probówek reakcyjnych o niskim poziomie wiązania.Oddziel kulki magnetyczne przenoszące interesujące nas pierścienie chromatyny od lizatu komórkowego za pomocą stojaka magnetycznego. Przenieś pozostały przepływ z każdej probówki do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów przed przechowywaniem niektórych próbek w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do analizy DNA i białka. Następnie zawieś kulkę magnetyczną z każdej 15-mililitrowej stożkowej rurki w 300 mikrolitrach zimnego buforu MB i połącz kulki w jedną rurkę reakcyjną.Wykonaj pięć płukań po 10 minut każde, używając 750 mikrolitrów zimnego buforu MB zawierającego inhibitory proteazy i fosfatazy w temperaturze czterech stopni Celsjusza, obracając się z prędkością 20 obr./min. Następnie przeprowadzić końcowe płukanie 750 mikrolitrami zimnego buforu MB bez inhibitorów proteazy i fosfatazy. Przygotowane kulki zawiesić w 40 mikrolitrach zimnego buforu MB bez inhibitorów proteazy i fosfatazy.Uwolnij kompleksy pierścieni chromatyny LexA CBP z kulek magnetycznych używanych do oczyszczania locus pojedynczej kopii genu chromatyny poprzez inkubację kulek z dwoma mikrolitrami 6-krotnie znakowanego hist-tagowanego rekombinowanego wirusa wytrawiania tytoniu lub proteazy TEV. Po oddzieleniu kulek od końcowego eluatu za pomocą stojaka magnetycznego, przenieś eluat zawierający rozszczepione pierścienie chromatyny do nowej 1,5 mililitrowej probówki reakcyjnej. Ponownie umieść probówki na stojaku magnetycznym, aby oddzielić resztki kulek od końcowego eluatu.Ponownie zawiesić kulki w 750 mikrolitrach zimnego buforu węglanu amonu przed przechowywaniem niektórych próbek w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do analizy DNA i białka. Z końcowego eluatu wyjmij próbki i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do analizy DNA i białek. Ponadto pobierz próbki z pozostałych kulek.Rozpocznij eluację denaturacyjną od dwukrotnego przemycia kulek magnetycznych w 750 mikrolitrach zimnego buforu węglanu amonu przez 20 minut każdy, obracając się w czterech stopniach Celsjusza z prędkością 20 obrotów na minutę. Następnie dodaj 500 mikrolitrów 0,5 molowego wodorotlenku amonu do kulek, aby wyekstrahować związane kompleksy chromatyny LexA i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Oddzielić kulki od zawiesiny za pomocą stojaka magnetycznego i przenieść eluat do probówki reakcyjnej o niskim poziomie wiązania.Inkubować probówkę reakcyjną o niskim poziomie wiązania w temperaturze pokojowej przez 30 minut i oddzielić kulki od zawiesiny za pomocą stojaka magnetycznego. Po zakończeniu przenieś eluat do probówki reakcyjnej o niskim poziomie wiązania. Ponownie zawiesić kulki w 750 mikrolitrach wody dejonizowanej i pobrać próbki do analizy DNA i białek.Na koniec należy pobrać próbki analizy DNA i białek z końcowego eluatu. W badaniu określono ilościowo skuteczność oczyszczania locus ARS316 w szczepie rekombinacyjnym i porównano go z locus kontrolnym PDC1. Locus ARS316 wykazał niższy odzysk w przepływie w porównaniu z PDC1.Chociaż część pierścieni chromatyny pozostała związana z kulkami TEV z powodu niepełnego rozszczepienia proteazy TEV, elucja denaturacji spowodowała odzyskanie locus ARS316 od 80 do 90%. Odpowiada to wysokiemu wzbogaceniu cząsteczek ARS316 w kulki TEV i frakcje elucji denaturacji po uwzględnieniu wielkości genomu drożdży w porównaniu ze szczepem kontrolnym, który nie wykazał wzbogacenia locus ARS316 w żadnej z frakcji oznaczonych ilościowo. Po elucji TEV kulki wykazały wyższy procent odzysku locus ARS316, ponieważ wydajność rozszczepienia TEV nie wynosiła 100%, co spowodowało, że frakcja pierścieni chromatyny pozostała związana z kulkami.Jednak elucja denaturująca wykazała 80 do 90% odzyskanie locus ARS316 w szczepie rekombinacyjnym, co odpowiada wysokiemu wzbogaceniu cząsteczek ARS316 przy uwzględnieniu wielkości genomu drożdży.

single-copy-gene-locus-chromatin-purification-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten artykuł przedstawia czułą metodę o nazwie Circle-Seq do oczyszczania pozachromosomalnego kolistego DNA (eccDNA). Metoda obejmuje oczyszczanie kolumny, usuwanie pozostałego liniowego chromosomalnego DNA, amplifikację w okręgu toczonym i sekwencjonowanie wysokoprzepustowe. Circle-Seq ma zastosowanie do badań przesiewowych eukariotycznego eccDNA w skali genomu oraz badania niestabilności genomu i zmienności liczby kopii.

Oczyszczanie całego genomu pozachromosomalnego kolistego DNA z komórek eukariotycznych

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny zmodyfikowanych histonów z pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecypitowane DNA jest następnie wykorzystywane do ilościowego PCR w celu zbadania obfitości i lokalizacji modyfikacji potranslacyjnych histonów w całym genomie.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) modyfikacji histonów z Saccharomyces cerevisiae

System CRISPR/Cas12a w połączeniu z pojedynczą matrycą crRNA umożliwia efektywną multipleksową edycję genomu S. cerevisiae w wielu loci jednocześnie. Wykazano to, konstruując szczepy drożdży wytwarzające karotenoidy, które są następnie wykorzystywane do tworzenia drożdżowej grafiki pikselowej.

CRISPR/Cas12a: Multipleksowa edycja genomu Saccharomyces cerevisiae i tworzenie drożdżowego pixel artu

Oto protokół do identyfikacji interakcji genetycznych za pomocą zwiększonej liczby kopii u Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta pozwala naukowcom identyfikować, klonować i testować supresory w krótko żyjących mutantach drożdży. Testujemy wpływ wzrostu liczby kopii SIR2 na długość życia w autofagii mutanta zerowego.

Ekran supresorowy do charakterystyki powiązań genetycznych regulujących chronologiczną długość życia u Saccharomyces cerevisiae

Ta praca opisuje protokół dla wielokopijnego badania genetycznego supresorowego u Schizosaccharomyces pombe. To badanie przesiewowe wykorzystuje bibliotekę plazmidów obejmującą cały genom do identyfikacji klonów supresorowych fenotypu utraty funkcji związanego ze zmutowanym szczepem zapytania. Za pomocą tego badania przesiewowego zidentyfikowano nowe supresory genetyczne mutanta zerowego ell1.

Genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem mutacji termostabilizujących, oczyścić ludzki transporter serotoniny, wygenerować przeciwciała o wysokim powinowactwie i skrystalizować kompleks transporter-przeciwciało serotoniny związany z lekiem przeciwdepresyjnym S-citalopram. Protokół ten można dostosować do badania innych trudnych transporterów błonowych, receptorów i kanałów.

Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem

Tutaj prezentujemy metodę wyrażania i oczyszczania S100A12 (kalgranulina C). Opisujemy protokół pomiaru jego aktywności przeciwdrobnoustrojowej wobec ludzkiego patogenu H. pylori.

Ekspresja, oczyszczanie i aktywność przeciwdrobnoustrojowa S100A12

Przedstawiono nowy protokół przygotowania chromatyny z mięśni szkieletowych dorosłej myszy, przystosowany do badania regulacji genów we włóknach mięśniowych przez immunoprecypitację chromatyny.

Ulepszony protokół immunoprecypitacji chromatyny z mięśni szkieletowych myszy

Tutaj prezentujemy nowatorską metodę określania powinowactwa wiązania w równowadze i w roztworze z wysoką czułością na dużą skalę. Poprawia to analizę ilościową wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA. Metoda opiera się na zautomatyzowanych pomiarach anizotropii fluorescencji w kontrolowanym systemie dostarczania.

Pomiar wysokiej czułości powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA za pomocą miareczkowania kompetencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj metodę izolacji chromatyny locus-specyficznej u Saccharomyces cerevisiae w natywnym stanie. Technika umożliwia badanie interakcji białko-DNA bez artefaktów sieciowania.

Oczyszczanie chromatyny locus genu z pojedynczą kopią u Saccharomyces cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów