Oczyszczanie chromatyny locus genu z pojedynczą kopią u Saccharomyces cerevisiae

Jądro eukariotyczne jest bardzo zatłoczone, a wiele procesów biologicznych zachodzi jednocześnie. Zakres naszych badań polega na zrozumieniu, w jaki sposób wszystkie te procesy są koordynowane w naszych genomach bez poważnych wypadków, które w przeciwnym razie prowadziłyby do niestabilności genomu i chorób u ludzi. Protokół ten pozwala nam oczyścić określone locus genomu w jego natywnym stanie, umożliwiając zarówno kompozycyjną, jak i funkcjonalną charakterystykę wyizolowanego materiału, taką jak pomiary interakcji białko-DNA.

Protokół ten umożliwia ogromny poziom wzbogacenia docelowego locus, który pokonuje wiele obecnych ograniczeń związanych z izolacją chromatyny specyficznej dla locus. Materiał nie został usieciowany. Pozwala to również na wiele dalszych analiz funkcjonalnych, takich jak transkrypcja in vitro lub replikacja in vitro.

Protokół ten umożliwił nam wycięcie i oczyszczenie odrębnych początków replikacji chromosomów drożdży, co pozwoliło nam przeprowadzić analizę proteomiczną i zidentyfikować nowe czynniki chromatyny oddziałujące na pochodzenie, a tym samym posunąć naprzód dziedzinę badań nad replikacją DNA. Protokół ten umożliwia badania replikacji in vitro z wykorzystaniem oczyszczonego materiału wyjściowego w celu zbadania stanów chromatyny, modyfikacji histonów i przeprowadzenia analizy strukturalnej na natywnych matrycach nukleosomalnych z endogennych chromosomów, posuwając naprzód badania nad chromatyną. Zacznij od zaszczepienia kompetentnych szczepów drożdży kontrolnych i rekombinacyjnych z płytek YPD do pięciu mililitrów pożywki YPR i hoduj kulturę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obr./min.

Następnie zwiększ skalę kultury, zaszczepiając dwa mililitry w 100 mililitrach świeżej pożywki YPR i uprawiając ją przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obr./min. Dla każdego szczepu dozować 1 800 mililitrów autoklawowanego podłoża peptonowego drożdży i 200 mililitrów autoklawowanego 20% roztworu rafinozy do dwóch pięciolitrowych kolb Erlenmeyera. Zaszczepić każdy szczep drożdży o gęstości optycznej 0,2 przy 600 nanometrach w odpowiednim pożywce i inkubować przez około sześć godzin przy 200 obr./min lub do momentu, gdy komórki osiągną pożądaną gęstość optyczną 1,0.

Dodaj jednocześnie 200 mililitrów 2% galaktozy i 110 mikrolitrów czynnika kojarzenia drożdży alfa lub YMFA, aby zatrzymać komórki w fazie G1 i inkubować je przez dwie godziny. Przenieś zawiesinę komórkową do jednolitrowych wiader wirówek i odwiruj wiadro w temperaturze 6 000 G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś granulki komórek w 10 do 15 mililitrach wody destylowanej.

Następnie zamknij 25-mililitrową strzykawkę z zatyczką do przynęty i umieść ją w 50-mililitrowej stożkowej tubie wypełnionej wodą. Przenieść zawiesinę komórek do zespołu strzykawki. Umyj wiadra wirówkowe pięcioma mililitrami wody destylowanej, aby zebrać pozostałe komórki.

Następnie odwirować zestaw o stężeniu 2,397 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant. Następnie wyjmij zatyczkę przynęty ze strzykawki i wytłacz komórki do ciekłego azotu, aby uformować spaghetti komórkowe. Na koniec przenieś spaghetti z zamrożonych komórek do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia.

Rozpocznij chłodzenie komercyjnego młynka do kawy, mieląc około 30 do 50 gramów suchego lodu dwa razy przez 30 sekund za każdym razem. Wyrzuć suchy lód w proszku i wymieszaj trzy gramy zamrożonego spaghetti z komórkami drożdży z około 30 do 50 gramami suchego lodu we wstępnie schłodzonym młynku do kawy. Uszczelnij połączenie między nasadką a młynkiem za pomocą Parafilm.

Wymieszaj komórkę drożdży, suchy lód mieszaj 10 razy po 30 sekund każde, pozostawiając 30-sekundowe odstępy między każdą rundą. Przenieś powstałą komórkę drożdży, suchy lód w proszku do plastikowej zlewki za pomocą czystej i suchej szpatułki. Po odparowaniu suchego lodu dodaj 2,25 mililitra kulki magnetycznej lub buforu MB z inhibitorami proteazy i fosfatazy do proszku komórek drożdży.

Po energicznym odpipetowaniu mieszaniny komórkowych przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie przechowuj 0,1% próbek z surowych ekstraktów komórkowych do DNA i 0,05% próbek do analizy białek w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Przenieś pozostałą zawiesinę komórkową do dwumililitrowych probówek reakcyjnych o niskim poziomie wiązania i oddziel resztki komórek, odwirowując probówki.

Po zakończeniu zbierz wszystkie supernatanty w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Ponownie przechowuj 0,1% supernatantu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza dla DNA i 0,05% supernatantu do analizy białka. Następnie przemyć 500 mikrolitrów zawiesiny kulek magnetycznych sprzężonej z immunoglobuliną G z 500 mikrolitrami zimnego buforu MB zawierającego inhibitory proteazy i fosfatazy dwa razy przez pięć minut każdy w czterech stopniach Celsjusza przy rotacji z prędkością 20 obr./min.

Inkubować kulki magnetyczne w 500 mikrolitrach zimnego buforu MB przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy rotacji z prędkością 20 obr./min, a następnie usunąć supernatant z kulek za pomocą stojaka magnetycznego. Wymieszaj zrównoważoną zawiesinę kulek magnetycznych z uzyskanym wcześniej lizatem komórkowym i połącz w 15-mililitrową stożkową rurkę. Po inkubacji przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 20 obr./min przenieś pełną zawiesinę lizatu komórek kulek magnetycznych do probówek reakcyjnych o niskim poziomie wiązania.

Oddziel kulki magnetyczne przenoszące interesujące nas pierścienie chromatyny od lizatu komórkowego za pomocą stojaka magnetycznego. Przenieś pozostały przepływ z każdej probówki do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów przed przechowywaniem niektórych próbek w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do analizy DNA i białka. Następnie zawieś kulkę magnetyczną z każdej 15-mililitrowej stożkowej rurki w 300 mikrolitrach zimnego buforu MB i połącz kulki w jedną rurkę reakcyjną.

Wykonaj pięć płukań po 10 minut każde, używając 750 mikrolitrów zimnego buforu MB zawierającego inhibitory proteazy i fosfatazy w temperaturze czterech stopni Celsjusza, obracając się z prędkością 20 obr./min. Następnie przeprowadzić końcowe płukanie 750 mikrolitrami zimnego buforu MB bez inhibitorów proteazy i fosfatazy. Przygotowane kulki zawiesić w 40 mikrolitrach zimnego buforu MB bez inhibitorów proteazy i fosfatazy.

Uwolnij kompleksy pierścieni chromatyny LexA CBP z kulek magnetycznych używanych do oczyszczania locus pojedynczej kopii genu chromatyny poprzez inkubację kulek z dwoma mikrolitrami 6-krotnie znakowanego hist-tagowanego rekombinowanego wirusa wytrawiania tytoniu lub proteazy TEV. Po oddzieleniu kulek od końcowego eluatu za pomocą stojaka magnetycznego, przenieś eluat zawierający rozszczepione pierścienie chromatyny do nowej 1,5 mililitrowej probówki reakcyjnej. Ponownie umieść probówki na stojaku magnetycznym, aby oddzielić resztki kulek od końcowego eluatu.

Ponownie zawiesić kulki w 750 mikrolitrach zimnego buforu węglanu amonu przed przechowywaniem niektórych próbek w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do analizy DNA i białka. Z końcowego eluatu wyjmij próbki i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do analizy DNA i białek. Ponadto pobierz próbki z pozostałych kulek.

Rozpocznij eluację denaturacyjną od dwukrotnego przemycia kulek magnetycznych w 750 mikrolitrach zimnego buforu węglanu amonu przez 20 minut każdy, obracając się w czterech stopniach Celsjusza z prędkością 20 obrotów na minutę. Następnie dodaj 500 mikrolitrów 0,5 molowego wodorotlenku amonu do kulek, aby wyekstrahować związane kompleksy chromatyny LexA i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Oddzielić kulki od zawiesiny za pomocą stojaka magnetycznego i przenieść eluat do probówki reakcyjnej o niskim poziomie wiązania.

Inkubować probówkę reakcyjną o niskim poziomie wiązania w temperaturze pokojowej przez 30 minut i oddzielić kulki od zawiesiny za pomocą stojaka magnetycznego. Po zakończeniu przenieś eluat do probówki reakcyjnej o niskim poziomie wiązania. Ponownie zawiesić kulki w 750 mikrolitrach wody dejonizowanej i pobrać próbki do analizy DNA i białek.

Na koniec należy pobrać próbki analizy DNA i białek z końcowego eluatu. W badaniu określono ilościowo skuteczność oczyszczania locus ARS316 w szczepie rekombinacyjnym i porównano go z locus kontrolnym PDC1. Locus ARS316 wykazał niższy odzysk w przepływie w porównaniu z PDC1.

Chociaż część pierścieni chromatyny pozostała związana z kulkami TEV z powodu niepełnego rozszczepienia proteazy TEV, elucja denaturacji spowodowała odzyskanie locus ARS316 od 80 do 90%. Odpowiada to wysokiemu wzbogaceniu cząsteczek ARS316 w kulki TEV i frakcje elucji denaturacji po uwzględnieniu wielkości genomu drożdży w porównaniu ze szczepem kontrolnym, który nie wykazał wzbogacenia locus ARS316 w żadnej z frakcji oznaczonych ilościowo. Po elucji TEV kulki wykazały wyższy procent odzysku locus ARS316, ponieważ wydajność rozszczepienia TEV nie wynosiła 100%, co spowodowało, że frakcja pierścieni chromatyny pozostała związana z kulkami.

Jednak elucja denaturująca wykazała 80 do 90% odzyskanie locus ARS316 w szczepie rekombinacyjnym, co odpowiada wysokiemu wzbogaceniu cząsteczek ARS316 przy uwzględnieniu wielkości genomu drożdży.