Name: Badania przesiewowe leków komórkowych w kierunku inhibitorów peptydazy cysteinowej 4B związanej z autofagią (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj metodę przesiewową opartą na lucyferazie do identyfikacji inhibitorów peptydazy ATG4B związanych z autofagią w badaniach nad rakiem. Ta technika umożliwia szybkie testowanie związków leczniczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez główne fundusze brytyjskiej Rady ds. Badań Medycznych dla MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (numer referencyjny grantu 2018RIF_15), oraz UCL Therapeutic Acceleration Support scheme, wspierany przez finansowanie z MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. Plazmid kodujący ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) uzyskano od dr Robina Kethelera (Wydział Medycyny Człowieka, Szkoła Medyczna w Berlinie).

High-Throughput Screening Analysis for 4B Cysteine Peptidase Autophagy Inhibitor

<ol><li>Kocaturk, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+molecular+target+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a molecular target for cancer treatment.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ATG4+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Targeting ATG4 in cancer therapy.</a> Cancers. 11 (5), 649(2019).</li>
<li>Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of autophagy.</a> EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).</li>
<li>Agrotis, A., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+ATG4B+as+drug+target+for+treatment+of+solid+tumours-the+knowns+and+the+unknowns%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns.</a> Cells. 9 (1), 53(2019).</li>
<li>Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting autophagy in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).</li>
<li>Kimmelman, A. C., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+tumor+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Autophagy and tumor metabolism.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).</li>
<li>Tran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+role+of+ATG4B+as+target+for+autophagy+inhibition+in+prostate+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).</li>
<li>Pengo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+kinases+and+phosphatases+that+regulate+ATG4B+activity+by+siRNA+and+small+molecule+screening+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148(2018).</li>
<li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delipidation+of+mammalian+Atg8-family+proteins+by+each+of+the+four+ATG4+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases.</a> Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).</li>
<li>Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8L%2FApg8L+is+the+fourth+mammalian+modifier+of+mammalian+Atg8+conjugation+mediated+by+human+Atg4B%2C+Atg7+and+Atg3%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3.</a> The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).</li>
<li>Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+of+human+ATG4+protease+isoforms+in+autophagy+and+LC3%2FGABARAP+processing+revealed+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells.</a> Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).</li>
<li>Nguyen, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+family+LC3%2FGABARAP+proteins+are+crucial+for+autophagosome-lysosome+fusion+but+not+autophagosome+formation+during+PINK1%2FParkin+mitophagy+and+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).</li>
<li>Ketteler, R., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG4%3A+More+than+a+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATG4: More than a protease.</a> Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).</li>
<li>Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+roles+of+Atg4+proteases+from+autophagy+modulation+to+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy.</a> Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).</li>
<li>Fernández, ÁF., López-Otín, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+and+pathologic+relevance+of+autophagy+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The functional and pathologic relevance of autophagy proteases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).</li>
<li>Maruyama, T., Noda, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-regulating+protease+Atg4%3A+structure%2C+function%2C+regulation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition.</a> The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).</li>
<li>Ketteler, R., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+autophagy+by+luciferase+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Quantitation of autophagy by luciferase release assay.</a> Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).</li>
<li>Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+sensor+for+genome-wide+screens+of+intracellular+proteolytic+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage.</a> Genome Biology. 9 (4), 64(2008).</li>
<li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15, 14(2014).</li>
<li>Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+transgene+expression+in+primitive+hematopoietic+progenitor+cells+and+embryonic+stem+cells+efficiently+transduced+by+optimized+retroviral+hybrid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors.</a> Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Protokół ten opisuje komórkowy test genu reporterowego do identyfikacji inhibitorów ATG4B. Identyfikacja pierwotnych trafień opiera się na aktywności lucyferazy po leczeniu komórek wyrażających pełnowymiarową otwartą ramkę odczytu LC3B między β-aktyną a dNGLUC. Niektóre zalety tego testu polegają na tym, że jest on czuły, wysoce ilościowy i nieinwazyjny, ponieważ może wykryć dNGLUC bez lizy komórek. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół generowania stabilnej linii komórkowej i pierwotnego badania przesiewowego. W...

Autofagia to konserwatywny proces metaboliczny, który pozwala komórkom utrzymać homeostazę wewnątrzkomórkową i reagować na stres poprzez degradację starej, wadliwej lub niepotrzebnej zawartości komórkowej za pomocą lizosomów1,2,3. W pewnych warunkach patofizjologicznych proces ten działa jako kluczowa odpowiedź komórkowa na niedobór składników odżywczych i tlenu, co skutkuje recyklingiem składników odżywczych i lipidów, umożliwiając komórkom dostosowanie się do ich potrzeb metabolicznych2,3,4. Autofagia została również zidentyfikowana jako komórkowa reakcja na stres związana z kilkoma chorobami, takimi jak zaburzenia neurodegeneracyjne, infekcje patogenami i różne rodzaje raka. Funkcja autofagii w raku jest złożona i zależy od rodzaju, stadium i statusu guza. Może hamować nowotworzenie poprzez autofagiczną degradację uszkodzonych komórek, ale może również promować przeżycie zaawansowanych nowotworów poprzez poprawę przeżywalności komórek w stresujących warunkach, takich jak niedotlenienie, niedobór składników odżywczych i uszkodzenia cytotoksyczne2,4,5,6.
Kilka badań wykazało, że hamowanie autofagii przynosi korzyści jako strategia przeciwnowotworowa. Tak więc hamowanie krytycznych etapów, takich jak tworzenie autofagosomu lub jego fuzja z lizosomem, może być skuteczną metodą kontroli raka2,4,5,6. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że ATG4B bierze udział w pewnych stanach patologicznych i zyskał uwagę jako potencjalny cel przeciwnowotworowy2,3,4. Na przykład zaobserwowano, że komórki raka jelita grubego i komórki ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu receptora 2 (HER2) z dodatnim receptorem 2 piersi miały znacznie wyższe poziomy ekspresji ATG4B niż sąsiednie normalne komórki2,4. W komórkach raka prostaty hamowanie ATG4B skutkowało specyficzną dla linii komórkowej podatnością na chemioterapię i radioterapię7. Ostatnio pojawiły się mocne dowody na to, że gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) jest szczególnie podatny na hamowanie ATG4B. Na przykład w genetycznie zmodyfikowanym modelu mysim wykazano, że okresowa utrata funkcji ATG4B zmniejsza wzrost guza PDAC i zwiększa przeżywalność3,4. Ogólnie rzecz biorąc, ATG4B ulega silnej nadekspresji w niektórych typach raka, jest związany z progresją guza i jest związany z opornością na terapię przeciwnowotworową2,4,8.
Proteazy cysteinowe ATG4 u ssaków mają czterech członków rodziny, ATG4A-ATG4D. Białka te wykazują pewną selektywność docelową w stosunku do rodziny białek LC3/GABARAP (ATG8)9,10,11 i mogą mieć dodatkowe funkcje niezwiązane z ich aktywnością proteazy12,13. Co więcej, ATG4 funkcjonuje w regulacji nowego rodzaju modyfikacji potranslacyjnej, ylacji białek ATG811,12. Podczas gdy ATG4B i jego główny substrat LC3B są najszerzej badane, wyłania się obraz, który sugeruje złożoną rolę każdego członka podrodziny w regulacji procesów autofagicznych i nieautofagicznych. Jest to dodatkowo potwierdzone przez złożoną sieć modyfikacji potranslacyjnych, które regulują aktywność ATG4B poprzez fosforylację, acetylację, glikozylację i nitrozylację9,10,11,12,13.
Opublikowano kilka znanych inhibitorów ATG4B2,4,14,15. Chociaż są one odpowiednie jako narzędzia badawcze, ich profil farmakodynamiczny, selektywność lub siła działania uniemożliwiły jeszcze ich opracowanie jako kandydatów przedklinicznych4,16. Ogólnie rzecz biorąc, istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania silniejszych i bardziej selektywnych związków. Często związki te są dobrymi biochemicznymi inhibitorami funkcji białek, jednak ich skuteczność w testach komórkowych jest słaba. Istnieje wiele testów do monitorowania aktywności ATG4B, w tym metody biochemiczne i testy komórkowe4. Wcześniej opracowaliśmy prosty, oparty na luminescencji, wysokoprzepustowy test do monitorowania aktywności ATG4B w komórkach8,17. Ten test wykorzystuje białko lucyferazy z Gaussia princeps (GLUC), które jest stabilne i aktywne w środowisku zewnątrzkomórkowym i może być indukcyjnie uwalniane z komórek w odpowiedzi na aktywność proteolityczną ATG4B18,19.
W tym konstrukcie reporterowym, dNGLUC jest połączony z cytoszkieletem aktynowym komórek. Łącznik specyficzny dla proteazy może zostać wprowadzony między kotwicę β-aktyny a dNGLUC, zmieniając wydzielanie w zależności od rozszczepienia łącznika. Użyliśmy pełnowymiarowej otwartej ramki odczytu LC3B między β-aktyną a dNGLUC, aby móc monitorować rozszczepienie LC3B17,18,19. Chociaż mechanizm wydzielania dNGLUC jest słabo poznany, jest on specyficzny dla monitorowania aktywności ATG4B, nie zależy od ogólnej autofagii, ponieważ występuje w komórkach nokautujących ATG5 i jest pośredniczony przez niekonwencjonalne mechanizmy, które nie wymagają klasycznego peptydu sygnałowego4,18,19. Z powodzeniem wykorzystaliśmy ten reporter do badań przesiewowych małych cząsteczek i bibliotek siRNA oraz zidentyfikowaliśmy nowe regulatory aktywności ATG4B, takie jak kinazy białkowe Akt8. W tym artykule opisano szczegółowy protokół użycia tego reportera lucyferazy w półautomatycznym, wysokoprzepustowym formacie przesiewowym.

<table><tbody><tr><td>50 &mikro; L Jednorazowe końcówki - niefiltrowane, czyste, zagnieżdżone 8 stosów (stos pasywny)</td><td>Tecan</td><td>30038609</td><td>Jednorazowy stojak na 96 końcówek</td></tr><tr><td>Dozownik zbiorczy</td><td>BioTek MultiFlo</td><td>BioTek</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-205904</td><td>podłoże</td></tr><tr><td>Columbus Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Perkin Elmer</td><td>Wersja 2.9.1</td><td>oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Echo Qualified 384-dołkowa mikropłytka polipropylenowa, przezroczysta, niesterylna</td><td>Beckman Coulter</td><td>001-14555</td><td>Płytka 384PP</td></tr><tr><td>EnVision II</td><td>Perkin Elmer</td><td></td> czytnik <td>płytek luminescencyjnych</td></tr><tr><td>Biblioteka ekspresowego wyboru (96-dołkowa)-L3600-Z369949-100&micro; L</td><td>Selleckchem</td><td>L3600</td><td>Selleckchem</td></tr><tr><td>FMK9A</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-100522</td><td></td></tr><tr><td>Greiner FLUOTRAC 200 384-dołkowe płytki</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781076</td><td>384-dołkowe płytki w kolorze czarnym</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania Harmony</td> Oprogramowanie do <td>obrazowania</td><td>Perkin Elmer</td><td>Wersja 5.1</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trichlorowodorek, Trójwodzian - 10 mg/ml Roztwór w wodzie</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>Seria Labcyte Echo 550 z oprogramowaniem Echo Cherry Pick</td><td>Nanoskalowy akustyczny dozownik cieczy</td><td>Labcyte/Beckman Coulter</td><td></td> Woda</tr><tr>dejonizowana<td>Milli-Q</td><td></td><td></td><td>Woda dejonizowana</td></tr><tr><td>Opera Phenix High-Content System badań przesiewowych</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Automatyczny mikroskop</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 4% w PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnologia</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate 384-well,, optycznie przezroczysty płaskie dno, poddany hodowli tkankowej, pokrywki</td><td>Perkin Elmer</td><td>6057300</td><td>CellCarrier-384 Ultra PN</td></tr><tr><td>pMOWS-ActinLC3dNGLUC</td><td></td><td></td><td>Uzyskany od dr Robina Kethelera (Wydział Medycyny Człowieka, Szkoła Medyczna w Berlinie)</td></tr><tr><td>Odczynnik do infekcji / transfekcji polibrenem</td><td>Merck</td><td>TR-1003-G</td><td>polybrene</td></tr><tr><td>Dichlorowodorek puromycyny, 98%, Thermo Scientific Chemicals</td><td>ThermoFisher</td><td>J61278.ME</td><td>Puromycin</td></tr><tr><td>Tecan Freedom EVO 200 robot</td><td>Tecan</td><td></td><td>platforma robotyczna do obsługi cieczy</td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA Odczynnik do transfekcji</td> Roche <td>Merck</td><td>6366244001</td><td>DNA</td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe leków komórkowych w kierunku inhibitorów peptydazy cysteinowej 4b związanej z autofagią

Cell-Based Drug Screening for Inhibitors of Autophagy Related 4B Cysteine Peptidase

Coraz więcej dowodów pokazuje, że wysoki strumień autofagiczny jest związany z progresją nowotworu i opornością na terapię przeciwnowotworową. Oznaczanie poszczególnych białek autofagii jest warunkiem wstępnym dla strategii terapeutycznych ukierunkowanych na ten szlak. Wykazano, że hamowanie autofagii proteazy ATG4B zwiększa całkowite przeżycie, co sugeruje, że ATG4B może być potencjalnym celem leczenia raka. Nasze laboratorium opracowało selektywny test na bazie lucyferazy do monitorowania aktywności ATG4B w komórkach. W tym teście substrat ATG4B, LC3B, jest oznaczany na C-końcu za pomocą wydzielalnej lucyferazy z morskiego widłonoga Gaussia princeps (GLUC). Ten reporter jest połączony z cytoszkieletem aktyny, utrzymując go w ten sposób w cytoplazmie komórek po nierozszczepieniu. Rozszczepienie, w którym pośredniczy ATG4B, powoduje uwalnianie GLUC przez niekonwencjonalne wydzielanie, które następnie można monitorować poprzez zbieranie supernatantów z hodowli komórkowej jako korelatu komórkowej aktywności ATG4B. W artykule przedstawiono adaptację tego testu opartego na lucyferazie do zautomatyzowanych wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Opisujemy przebieg pracy i optymalizację dla przykładowej wysokoprzepustowej analizy aktywności komórkowej ATG4B.

W poprzedniej publikacji8 z powodzeniem wykorzystaliśmy ten test do przesiewania bibliotek małych cząsteczek i siRNA, identyfikując nowe regulatory ATG4B. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół oraz reprezentatywne wyniki wykorzystania tego reportera lucyferazowego w półautomatycznym formacie wysokoprzepustowego przesiewania. Rysunek 8 przedstawia przykład analizy surowych danych dla jąder komórkowych oraz luminescencji. Typowy wynik pomiaru luminescencji ukazano...

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół użycia testu reporterowego opartego na lucyferazie w półautomatycznym, wysokoprzepustowym formacie przesiewowym.

Badania przesiewowe leków komórkowych w kierunku inhibitorów peptydazy cysteinowej 4B związanej z autofagią

Growing evidence has shown that high autophagic flux is related to tumor progression and cancer therapy resistance. Assaying individual autophagy proteins ...

Głównym celem badań w moim laboratorium jest zrozumienie regulacji autofagii, a w szczególności proteanu cysteiny ATG4 i wykorzystanie tej wiedzy do opracowania inhibitorów małocząsteczkowych, które celują w ten szlak, w szczególności w przypadku chorób takich jak rak trzustki. Używamy technologii badań przesiewowych o wysokiej zawartości i wysokiej przepustowości do identyfikacji celów leków, a także kandydatów na leki, i skupiamy się na rodzinie proteaz cysteinowych ATG4, ponieważ uważamy, że jest to bardzo dobry cel dla różnych form raka. Badamy członków rodziny ATG4 już od dłuższego czasu.Dokonaliśmy znaczących odkryć dotyczących dysfunkcji tej rodziny białek i komórek. Zidentyfikowaliśmy również nowe potranslacyjne mechanizmy regulacji członków rodziny ATG4, a obecnie opracowujemy inhibitory małocząsteczkowe, a także aktywatory z rodziny ATG4 w chorobach takich jak rak i neurodegeneracja. Nie ma wielu testów do monitorowania aktywności proteazy ATG4 w komórkach.Byliśmy więc jednymi z pierwszych, którzy opracowali test oparty na lucyferazy do monitorowania tej aktywności. Nasz test jest dość nietypowy, ponieważ wykorzystuje wydzielane, powiedzmy określenie, dlatego nie musimy licencjonować komórek i możemy łatwo dostosować ten protokół do wysokowydajnych metod badań przesiewowych i automatyzacji laboratorium. Już od dłuższego czasu skupiamy się na proteazie białkowej ATG4 B.Wygenerowaliśmy linie komórkowe nokautujące członków rodziny ATG4. Zidentyfikowaliśmy nowe mechanizmy regulacji potranslacyjnej ATG4, a ostatecznie zidentyfikowaliśmy również kilka nowych związków małocząsteczkowych, które mogą hamować, a nawet aktywować proteazę ATG4 B. W przyszłości chcielibyśmy kontynuować prace nad członkami rodziny ATG4.Uważamy, że jest to całkiem sporo, co jest obecnie nieznane i wciąż pozostaje do odkrycia. Na przykład, w jaki sposób białka te regulują autofagię w neuronach, jest obecnie całkowicie niezrozumiałe. Chcielibyśmy również skoncentrować naszą pracę na walidacji tych zidentyfikowanych przez nas związków małocząsteczkowych i potencjalnie na wykorzystaniu aktywatorów w chorobach neurodegeneracyjnych.

cell-based-drug-screening-for-inhibitors-autophagy-related-4b

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Autofagia to wszechobecny proces, który umożliwia komórkom degradację i recykling białek i organelli. Stosujemy zaawansowaną mikroskopię fluorescencyjną do wizualizacji i ilościowego określenia niewielkich, ale istotnych zmian fizycznych związanych z indukcją autofagii, w tym powstawania i dystrybucji autofagosomów i lizosomów oraz ich fuzji w autolizosomy.

Ilościowa analiza autofagii przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Aby przeciwdziałać rozprzestrzenianiu się patogenów, komórki gospodarza reorganizują swój cytoszkielet, aby podzielić bakterie na grupy i wywołać autofagię. Za pomocą zakażenia Shigella komórek hodowli tkankowej identyfikowane i charakteryzowane są determinanty gospodarza i patogenu leżące u podstaw tego procesu. Korzystając z modeli zakażenia Shigella danio pręgowanego, bada się rolę odkrytych cząsteczek i mechanizmów in vivo.

Zastosowanie Shigella flexneri do badania interakcji autofagia-cytoszkielet

Tutaj, wielospektralna cytometria przepływowa z funkcją analityczną, która porównuje jasne obrazy szczegółów 3 markerów autofagii i określa ilościowo ich kolokalizację, wraz z liczeniem plamek LC3, została użyta do pomiaru autofagii w obiektywny, ilościowy i statystycznie solidny sposób.

Ocena strumienia autofagicznego poprzez pomiar kolokalizacji LC3, p62 i LAMP1 za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Przedstawione tutaj są dwie techniki badań interakcji białko-białko oparte na przeciwciałach: immunofluorescencja i immunoprecypitacja. Techniki te nadają się do badania fizycznych interakcji między białkami w celu odkrycia nowych składników komórkowych szlaków sygnałowych i zrozumienia dynamiki białek.<br...

Badanie interakcji białko-białko w badaniach nad autofagią

Mitofagia, proces oczyszczania uszkodzonych mitochondriów, jest niezbędny do homeostazy mitochondriów i utrzymania zdrowia. W tym artykule przedstawiono niektóre z najnowszych metod wykrywania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans i myszach.

Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

Tutaj opisany jest prosty i dobrze sprawdzony protokół pomiaru masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków. Metoda opiera się na ilościowym określeniu proporcji dehydrogenazy mleczanowej (LDH) we frakcjach komórek sedymentacyjnych w porównaniu z całkowitymi poziomami LDH w komórkach.

Test sekwestracji dehydrogenazy mleczanowej — prosta i wiarygodna metoda określania masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków

Ten artykuł wykorzystuje test oparty na cytometrii przepływowej do badania bibliotek chemicznych inhibitorów w celu identyfikacji inhibitorów i ich celów, które wpływają na sygnalizację receptora limfocytów T. Opisane tutaj metody można również rozszerzyć o badania przesiewowe o wysokiej przepustowości.

Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badania przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych

Przedstawiono szczegółowy protokół generowania samodzielnie składających się mikromacierzy białek ludzkich do badań przesiewowych inhibitorów kinaz.

Badania przesiewowe inhibitorów kinaz w samoorganizujących się mikromacierzach białek ludzkich

W tym badaniu prezentujemy strategie oparte na inhibitorach i siRNA, które mają na celu zakłócenie przepływu autofagicznego w komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów zakażonych wirusem opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1).

Elektroporacja siRNA w celu modulacji autofagii w komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów zakażonych wirusem opryszczki pospolitej typu 1

Celem tego protokołu jest określenie poziomów autofagicznych w raku trzustki i komórkach groniastych trzustki poprzez immunofluorescencję LC3 i kwantyfikację kropek LC3.

Ocena poziomów autofagii w dwóch różnych modelach komórek trzustki przy użyciu immunofluorescencji LC3

Poznaj metodę przesiewową opartą na lucyferazie do identyfikacji inhibitorów peptydazy ATG4B związanych z autofagią w badaniach nad rakiem. Ta technika umożliwia szybkie testowanie związków leczniczych.

Badania przesiewowe leków komórkowych w kierunku inhibitorów peptydazy cysteinowej 4B związanej z autofagią

Przeglądaj więcej filmów