Magnetyczna analiza przepływu podwójnego reportera oparta na kulkach magnetycznych blokady przeciwciał wywołanych szczepionką peptydu PDL1-Vaxx w interakcji PD-1/PD-L1

Nasz projekt kierowany przez profesora Pravina Kaumaya koncentruje się na opracowaniu szczepionek heptapeptydowych z komórek B, które mogą być stosowane w celu wzmocnienia układu odpornościowego w celu lepszej walki z rakiem. Uważamy, że szczepionki peptydowe ukierunkowane na immunologiczne punkty kontrolne mogą być nawet łączone z innymi terapiami w celu poprawy wyników leczenia pacjentów. Chcieliśmy przetestować zdolność blokowania naszych przeciwciał anty PD-L1 w tradycyjnym teście mikrokulek, w którym ludzkie rekombinowane białko PD-L1 było związane z kulkami MagPlex.

Odkryliśmy, że po związaniu PD-L1 z kulkami, miały one niską zdolność wiązania liganda PD-1. Uniemożliwiło nam to skorzystanie z tej drogi blokowania testów. Gdy wiązanie białka z kulkami hamuje wiązanie z ligandem lub przeciwciałami, możliwe jest wstępne traktowanie testowymi przeciwciałami w roztworze, a następnie dodanie kulek pokrytych ligandem do docelowej mieszaniny blokerów.

Ich wzajemne oddziaływanie może być badane. Może to być inna ścieżka do badania tej samej interakcji wiązania cel-ligand. Opracowaliśmy szczepionki przeciwnowotworowe B-Vaxx, PD1-Vaxx, PDL1-Vaxx i CTLA4-Vaxx.

Szczepionki te są ukierunkowane na HER2, a kilka markerów immunologicznych punktów kontrolnych jest zaangażowanych w różne formy raka. B-Vaxx i PD1-Vaxx są w trakcie trwających badań klinicznych w Australii i USA. Mamy nadzieję, że nasze szczepionki przeciwko punktom kontrolnym układu odpornościowego przyniosą korzyści większej liczbie pacjentów. W poprzednich eksperymentach mikrosferycznych odkryliśmy, że PD-1 dobrze oddziaływał ze swoim ligandem PD-L1.

Dlatego przeprojektowaliśmy protokół, wstępnie wiążąc przeciwciała peptydowe anty PD-L1 z biotynylowanym białkiem PD-L1 przed dodaniem kulek MagPlex oznaczonych PD-1. Pozwoliło nam to przetestować nasze przeciwciała pod kątem ich zdolności do blokowania interakcji PD-1-PD-L1. Będziemy nadal koncentrować się na immunoterapiach skojarzonych.

Pokonajmy oporność na leczenie. Chcemy również zbadać skuteczniejsze terapie skojarzone, które lepiej hamują wzrost guza, zapobiegają przerzutom i przedłużają przeżywalność pacjentów. Zacznij od przygotowania roztworów podstawowych wszystkich przeciwciał w dawce 2 000 mikrogramów na mililitr.

Następnie, dla każdego przeciwciała, oznaczyć probówki z rozcieńczalnikiem ich odpowiednimi stężeniami, w tym nazwą przeciwciała. Należy również dołączyć ślepą probówkę dla każdego przeciwciała jako kontrolę tylko dla nośnika PBS-TBN. Następnie dodaj 75 mikrolitrów PBS-TBN do wszystkich probówek do rozcieńczania przeciwciał oznaczonych jako 500 mikrogramów na mililitr i mniej, w tym do probówek kontrolnych tylko dla nośnika.

Dla każdego przeciwciała należy odpipetować 150 mikrolitrów roztworu podstawowego do probówki oznaczonej jako 1 000 mikrogramów na mililitr. Aby utworzyć pełną serię rozcieńczeń dla każdego przeciwciała, należy przenieść 75 mikrolitrów z probówki o objętości 1 000 mikrogramów na mililitr do kolejnego niższego rozcieńczenia w serii. Następnie zamknąć nowo ukończoną probówkę rozcieńczającą i na krótko ją przemieszać.

Następnie dodaj 25 mikrolitrów rozcieńczonych przeciwciał do wyznaczonych dołków 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej, a następnie dodaj 25 mikrolitrów biotynylowanego rekombinowanego ludzkiego PD-L1 do każdej studzienki reakcyjnej. Przykryć płytkę do mikromiareczkowania folią lub plastikową uszczelką samoprzylepną i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, wytrząsając na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 600 obr./min. Następnie rozcieńczyć rekombinowane ludzkie kulki sprzężone PD-1 do stężenia 50 000 kulek na mililitr za pomocą PBS-TBN.

Wyjąć 96-dołkową płytkę reakcyjną mikromiareczkowania z wytrząsarki i zdjąć uszczelkę płytki samoprzylepnej. Dodaj 50 mikrolitrów rekombinowanej ludzkiej mieszaniny sprzężonych kulek PD-1 do każdej studzienki. Szczelnie zamknąć płytkę i inkubować przez godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 600 obr./min.

Po inkubacji ostrożnie usunąć uszczelkę z płytki samoprzylepnej. Następnie umieść płytkę na magnetycznym separatorze płytkowym na dwie minuty, aby unieruchomić koraliki. Upewnij się, że magnes i płytka do mikromiareczkowania są dobrze połączone.

Odwrócić płytkę i ostrożnie wyrzucić supernatant. Aby zmyć nadmiar odczynników reakcyjnych z kulek, wyjmij płytkę mikromiareczkowania z magnetycznego separatora płytkowego i dodaj 150 mikrolitrów PBS-TBN do każdej studzienki. Po usunięciu uszczelniacza i unieruchomieniu kulek, jak pokazano, upewnić się, że magnes i płytka mikromiareczkowania są zabezpieczone i wylać supernatant.

Teraz dodaj 100 mikrolitrów roztworu roboczego SAPE do każdej studzienki reakcyjnej i ponownie zawieś kulki przez pipetowanie. Uszczelnij płytkę i inkubuj ją przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie ostrożnie usuń samoprzylepny uszczelniacz do płytek. Po unieruchomieniu kulek oraz zabezpieczeniu magnesu i płytki należy delikatnie zrzucić supernatant, odwracając płytkę.

Aby zmyć nadmiar SAPE z kulek, wyjmij płytkę do mikromiareczkowania z uchwytu płytki magnetycznej i dodaj 150 mikrolitrów PBS-TBN do każdej studzienki w celu ponownego zawieszenia kulek. Następnie unieruchamiaj kulki, umieszczając płytkę mikromiareczkowania na magnetycznym separatorze płytkowym na dwie minuty. Po upewnieniu się, że magnes i płytka mikromiareczkowania są zabezpieczone, odwróć płytkę i usuń supernatant.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonej fioletu brylantowego 421 sprzężonej anty-ludzkiej lub anty-króliczej immunoglobuliny G do odpowiednich studzienek. Zamknąć płytkę i inkubować przez godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej. Następnie unieruchamić koraliki i usunąć samoprzylepny uszczelniacz do płytek.

Upewnij się, że magnes i płytka do mikromiareczkowania są zabezpieczone i zrzuć supernatant. Umyj nadmiar przeciwciał wtórnych z kulek, dodając 150 mikrolitrów PBS-TBN do każdej studzienki w celu ponownego zawieszenia kulek. Następnie umieść płytkę do mikromiareczkowania na magnetycznym separatorze płytkowym na dwie minuty, aby unieruchomić kulki.

Upewnij się, że magnes i płytka mikromiareczkowania są bezpiecznie połączone, a następnie odwróć płytkę i zrzuć supernatant. Po usunięciu czwartego i ostatniego buforu do płukania wyjmij płytkę do mikromiareczkowania z magnetycznego separatora płytkowego. Za pomocą pipety ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach PBS-TBN na studzienkę.

Na koniec, aby określić medianę intensywności fluorescencji każdej reakcji, odczytaj tabliczkę w systemie analizy przepływu z podwójnym reporterem z objętością aspiracji ustawioną na 50 mikrolitrów, minimalną liczbą kulek do 100 kulek, ustawieniem limitu czasu na 40 sekund, zakresem bramkowania na 7 000 do 17 000 i trybem pracy na podwójnym reporterze. Wszystkie cztery poliklonalne przeciwciała peptydowe anty-PD-L1 blokowały rekombinowaną ludzką interakcję PD-L1 z PD-1. Procent inhibicji różnych przeciwciał peptydowych anty PD-L1 wahał się od 48% do 74% przy maksymalnym badanym stężeniu 1000 mikrogramów na mililitr.

Przeciwciało monoklonalne kontroli pozytywnej atezolizumab osiągnęło 92% blokadę interakcji PD-1-PD-L1 przy maksymalnym badanym stężeniu czterech mikrogramów na mililitr. Analiza porównawcza wiązania indukowanych PDL1-Vaxx przeciwciał kandydujących do rekombinowanego ludzkiego PD-L1 wykazała, że wszystkie cztery poliklonalne przeciwciała peptydowe anty PD-L1 wiążą się z rekombinowanym ludzkim PD-L1 w sposób zależny od stężenia. Przeciwciało anty-PDL1 (130) wykazało najwyższy sygnał wiązania RH PD-L1 spośród czterech kandydatów na przeciwciała indukowane PDL1-Vaxx.