Mapowanie dystrybucji komórkowej białka optogenetycznego za pomocą siatki stymulacji świetlnej

Nasze laboratorium bada przestrzenną i czasową regulację cyklicznego AMP, aby zrozumieć, jakie warunki wywołują określone zdarzenia w dół. Aby skutecznie naśladować subkomórkową aktywację i hamowanie cyklicznej sygnalizacji AMP, charakteryzujemy dystrybucję narzędzia optogenetycznego zwanego bPAC-nanolucyferazą. Aby przetestować trafność obecnych cyklicznych modeli sygnalizacji AMP, opracowaliśmy narzędzia do oceny, naśladowania i blokowania cyklicznej sygnalizacji AMP z przedziałów subkomórkowych w żywych komórkach.

Protokół ten może być stosowany do stymulowania i oceny dystrybucji i funkcji narzędzi optogenetycznych w sposób systematyczny. Cóż, naszym celem było sprawdzenie, czy proces skupienia światła może precyzyjnie aktywować białka optogenetyczne w określonych strefach komórkowych, unikając w ten sposób wpływu na otaczające białka. Metoda ta będzie niezbędna do badania białek o rozproszonym rozkładzie lub jeśli zamierzonym efektem jest generowanie miejscowego wzrostu cyklicznego AMP lub innych cząsteczek sygnałowych.

W eksperymentach optogenetycznych typowe podejście polega na stymulacji albo całego pola komórek, albo czasem mniejszych wyznaczonych obszarów. Jednak wybór tego obszaru i intensywności jest często arbitralny. Nasze systematyczne podejście umożliwia badaczom przeprowadzanie dokładniejszych eksperymentów, pomagając naśladować wzorce szlaków sygnałowych.

Do tego badania wykorzystano komórki transfekowane za pomocą cyklicznego czujnika AMP ukierunkowanego na jądro i optogenetycznego białka ukierunkowanego na jądro, NLS-bPAC-nanolucyferazy. Hoduj i manipuluj komórkami wyrażającymi jądrowy bPAC w ciemnym środowisku. Użyj czerwonej lampy bezpiecznej, aby uniknąć ekspozycji na fale o długości mniejszej niż 500 nanometrów.

Wykonuj eksperymenty obrazowania w zmotoryzowanym mikroskopie dwupokładowym wyposażonym w silnik świetlny z wieloma diodami LED, koło filtrów emisyjnych, zmotoryzowany stolik XY, kamerę ORCA-Fusion Digital CMOS i obiektyw olejowy o powiększeniu 100x i aperturze numerycznej 1,4. Aby uchwycić obrazy, użyj oprogramowania do mikroskopii cyfrowej. Ta konfiguracja jest w stanie stymulować komórki i jednocześnie wykonywać pomiary FRET przy użyciu niezależnej ścieżki światła wyposażonej w filtr dichroiczny ZT458rdc.

Po włączeniu UGA-42 Geosystem i laserów LDI-7 należy włączyć mikroskop, aby odpowiednio ustawić go do pozyskiwania danych za pomocą czujnika H208 FRET. Następnie kolejno otwórz oprogramowanie do obrazowania i oprogramowanie SysCon, które steruje mikroskopem. Aby skalibrować system przed każdym użyciem, przejdź do okna Kamera i wybierz kartę Kalibracja.

Ustaw długość fali lasera zgodną z białkiem optogenetycznym. Wybierz 445 nanometrów, aby stymulować nanolucyferazę bPAC. Wybierz kartę Camera (Aparat) i kliknij przycisk Start Acquisition (Rozpocznij akwizycję), aby rozpocząć pobieranie z poziomu oprogramowania do obrazowania.

Ponownie wybierz kartę Kalibracja. Kliknij przycisk Rozpocznij kalibrację. Z wyświetlonej listy rozwijanej wybierz odpowiedni tryb kalibracji.

Postępuj zgodnie z krokami kalibracji wskazanymi przez producenta. W razie potrzeby zmień ustawienia oprogramowania do obrazowania, aby przeprowadzić prawidłową kalibrację. Upewnij się, że kalibracja została wykonana na obszarze próbki wolnym od komórek.

Następnie, za pomocą oprogramowania do obrazowania, uzyskaj jeden obraz fluorescencyjny. Komórki fluorescencyjne pojawią się w oknie przeglądarki obrazów. Umieść komórkę, która będzie stymulowana za pomocą mikroskopu sterującego XY, w obszarze oddziaływania, najlepiej w jego środku.

Przed rozpoczęciem właściwego eksperymentu użyj trybu Click-and-Fire, aby szybko ocenić responsywność pojedynczej komórki. W oknie Oś czasu dostosuj parametry stymulacji komórek, w tym źródło światła, czas trwania i intensywność bodźca. W oknie Przeglądarka obrazów kliknij mniej więcej środek komórki i oceń odpowiedź.

W oknie Przeglądarka obrazów wybierz okrągłą ikonę na pasku narzędzi po lewej stronie, a następnie w menu rozwijanym kliknij Wypełnione, aby narysować wypełnione okrągłe obiekty stymulacyjne. Powtórz ten krok, aby utworzyć wiele identycznych okręgów i rozprowadzić je równomiernie, zapewniając jednorodne pokrycie całej cytoplazmy komórki, która ma być stymulowana. W oknie Przeglądarka obrazów kliknij ikonę wskaźnika myszy po lewej stronie, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy jeden z obiektów stymulacji, aby sprawdzić i edytować jego właściwości.

Możesz też zaznaczyć wszystkie narysowane obiekty stymulacji, a następnie kliknąć prawym przyciskiem myszy, aby edytować właściwości wszystkich wybranych obiektów stymulacji razem. W oknie podrzędnym Widok kliknij przycisk Przyciągaj do siatki. Ta siatka może pomóc w utrzymaniu równych odstępów i wyrównania okręgów, aby utworzyć odpowiednią macierz lub tablicę.

Dodatkowo dostosuj właściwości siatki za pomocą przycisku Ustaw siatkę. Rozłóż obiekty stymulujące równomiernie za pomocą siatki. W razie potrzeby dodaj więcej obiektów stymulujących, aby pokryć całą komórkę.

Upewnij się, że wszystkie mają te same właściwości. Każdy obiekt stymulacji utworzony wcześniej w oknie przeglądarki obrazów będzie obecny w oknie osi czasu, w którym można edytować inny zestaw właściwości, w tym czas rozpoczęcia, czas trwania, opóźnienie, intensywność i inne. Aby prawidłowo zwizualizować obiekty stymulacyjne, najpierw rozwiń okno Oś czasu.

Teraz można zobaczyć czasowe właściwości obiektów stymulujących w oknie Oś czasu. Zaznacz wszystkie obiekty stymulujące i edytuj ich opóźnienie i czas trwania w oknie podrzędnym Czas synchronizacji obiektu. W oknie podrzędnym Źródło światła skonfiguruj długości fal i intensywności obiektu.

Zapewnij identyczną długość fali i intensywność dla wszystkich. Aby zapobiec nadmiernemu nałożeniu efektu dwóch lub więcej stymulacji, ustaw różne czasy rozpoczęcia dla każdego obiektu lub zmieniaj opóźnienie między nimi w zależności od oczekiwanego wyniku. Następnie w oknie Oś czasu zmień kolejność, w jakiej każdy obiekt stymulacji zostanie aktywowany, jeśli jest to wymagane.

Skonfiguruj sekwencję stymulacji w regularny lub losowy wzór w zależności od eksperymentu. Po wgraniu sekwencji do systemu należy skonfigurować liczbę cykli sekwencji lub uruchomień, które system wykona w podoknie Sekwencja. Aby zmierzyć zmiany fluorescencji stymulowanej komórki, umieść interesujące Cię obszary w oprogramowaniu do obrazowania w żądanych pozycjach.

Zacznij rejestrować obrazy fluorescencyjne. Na koniec naciśnij Play w oknie UGA-42, aby rozpocząć stymulację komórek. Obserwuj rzeczywiste wiązki stymulacyjne, które mogą być również rejestrowane przez kamerę, i ich korelację z obiektami stymulującymi.

Zwróć uwagę na zmianę intensywności tylko zielonego śladu, który pokazuje wzrost cyklicznego stężenia AMP mierzonego przez czujnik. Dzieje się tak w szczególności, gdy wiązka dociera do części komórki z minimalną ilością nanolucyferazy bPAC. Do określenia położenia jądra wykorzystano fluorescencję YFP H208.

Obszar zainteresowania obejmujący całe jądro wykorzystano do pomiaru zmian współczynnika FRET czujnika H208 spowodowanych stymulacją we wskazanych niebieskich punktach. Okazało się, że przejściowy wzrost cyklicznego AMP występował tylko wtedy, gdy niebieskie światło było skierowane na obszary zawierające nanolucyferazę bPAC. Potwierdziło to, że ukierunkowana na jądro nanolucyferazy bPAC ulegała ekspresji wyłącznie w kompartmencie jądrowym komórek HC-1.