Name: Mapowanie dystrybucji komórkowej białka optogenetycznego za pomocą siatki stymulacji świetlnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj metodę mapowania dystrybucji białka bPAC-nanoluciferazy w komórkach żywych przy użyciu siatki stymulacji świetlnej. Technika ta umożliwia precyzyzną kontrolę sygnałowania cAMP w określonych strefach komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez National Institutes of Health (NIH) przyznaje R01 GM099775 i GM130612 dla D.L.A.

1. Hodowla komórek HC-1 i przygotowanie do obrazowania
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki HC-1 w DMEM uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), penicyliną (100 IU / L), streptomycyną (100 mg / L) i L-glutaminą w 10 cm szalkach i inkubowane w temperaturze 37 °C, 5% CO2, w 95% nawilżonym powietrzu.</li>
	<li>Przenikaj komórki co 2-4 dni, gdy komórki są w ~ 90% zlewane, używając rozcieńczeń 1:5 lub 1:10.</li>
	<li>Komórki nasienne do transfekcji na szklanych szkiełkach nakrywkowych 2 dni przed eksperymentem.
	<ol>
		<li>Pracując w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli tkankowej z wstępnie podgrzaną pożywką i PBS, odessać pożywkę z prawie zlewającego się naczynia z komórkami i delikatnie przemyć 5 ml PBS.</li>
		<li>Odessać PBS i dodać 1 ml trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut, aż komórki się oderwą.</li>
		<li>Zawiesić komórki w pożywce o objętości 4 ml i przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Użyj hemocytometru, aby policzyć liczbę komórek i obliczyć gęstość komórek.</li>
		<li>Rozcieńczyć komórki do gęstości 1,5 x 104 komórek/ml.</li>
		<li>Odpipetować 2 ml zawiesiny komórek na szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm z powłoką poli-D-lizynową w naczyniu 6-dołkowym.</li>
		<li>Inkubować komórki przez około 24 godziny w inkubatorze aż do 70% zbieżności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcję komórek należy przeprowadzić za pomocą zestawu do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta, stosując stosunek 0,25 μg DNA NLS-bPAC-nLuc/0,75 μg DNA NLS-H208 na 3 μl odczynnika do transfekcji i 2 μl odczynnika P3000 rozcieńczonego w pożywce Opti-MEM pozbawionej czerwieni fenolowej.</li>
	<li>Umieść komórki w inkubatorze na ~48 godzin, aby umożliwić wystarczającą ekspresję bPAC-nLuc, niezbędną do wytworzenia wykrywalnych poziomów cAMP. 
	UWAGA: Minimalny wymagany poziom ekspresji bPAC-nLuc będzie się różnił w zależności od siły działania systemu stymulacji i parametrów stymulacji.</li>
	<li>Przygotuj komórki na szkiełkach nakrywkowych do obrazowania.
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę z jednej studzienki i przemyć dwukrotnie 2 ml PBS.</li>
		<li>Ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy i umieść je w komorze obrazowania.</li>
		<li>Dodać 1 ml Opti-MEM bez czerwieni fenolowej do komory obrazowania. Komórki można również obrazować w HBSS lub innym fizjologicznym roztworze zgodnym z fluorescencją.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Symulacja światła i obrazowanie żywych komórek
<ol>
	<li>Wykonaj hodowlę komórkową i manipulację komórkami wykazującymi ekspresję NLS-bPAC-nLuc w ciemnym środowisku. Aby uniknąć ekspozycji na długości fal <500 nm, należy użyć czerwonej lampy safelight (tabela materiałów) z bursztynową kompaktową żarówką fluorescencyjną o mocy 13 W (tabela materiałów).</li>
	<li>Wykonuj eksperymenty w zmotoryzowanym mikroskopie dwupokładowym (Tabela materiałów) wyposażonym w 6-liniowy silnik świetlny z wieloma diodami LED (Tabela materiałów), koło filtrów emisyjnych (Tabela materiałów), stolik XY (Tabela materiałów), kamerę ORCA-Fusion Digital CMOS (Tabela materiałów) i obiektyw olejowy 100x/1,4 NA (∞/0,17/FN26,5). Rejestruj obrazy za pomocą oprogramowania do mikroskopii cyfrowej (tabela materiałów). Ta konfiguracja jest w stanie stymulować komórki i jednocześnie wykonywać pomiary FRET przy użyciu niezależnej ścieżki światła wyposażonej w filtr dichroiczny ZT458rdc (tabela materiałów). 
	UWAGA: Można użyć dowolnej konfiguracji akwizycji, jeśli umożliwia jednoczesną stymulację optogenetyczną i obrazowanie FRET/intensiometryczne za pomocą kompatybilnego czujnika.</li>
	<li>Włącz geosystem UGA - 42. Włącz mikroskop i ustaw go z odpowiednimi parametrami do pomiaru za pomocą czujnika H208 FRET. Konfiguracja akwizycji będzie zależeć od poziomów ekspresji czujnika FRET. Typowe parametry to czas symulacji 40 ms dla YFP/mScarletI, 15% mocy diody LED i 0,5 Hz.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie SysCon i oprogramowanie do obrazowania, które steruje mikroskopem.</li>
	<li>W oknie Kamera wybierz zakładkę Kalibracja i wybierz długość fali lasera zgodną z białkiem optogenetycznym. Do stymulacji bPAC-nLuc należy użyć długości fali 445 nm.</li>
	<li>Skalibruj system przed każdym użyciem. Jest to ważne, ponieważ niewielkie różnice w konfiguracji, a nawet zmiany temperatury pokojowej (RT), mogą zmienić precyzję stymulacji.</li>
	<li>W oknie kamery wybierz kartę Kamera i kliknij <Rozpocznij akwizycję> aby rozpocząć akwizycję z poziomu oprogramowania do wyobrażania sobie.</li>
	<li>W oknie Przeglądarka obrazów wizualizuj na żywo lub wcześniejszą akwizycję fluorescencji komórek pobraną z oprogramowania do obrazowania, które pokieruje położeniem obiektów stymulujących.</li>
	<li>Użyj trybu "kliknij i odblokuj", aby szybko ocenić czas reakcji pojedynczej komórki przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
	<li>Korzystając z okna Sequence-Manager, wybierz <dodaj> aby utworzyć nową sekwencję. 
	UWAGA: Aby sprawdzić, czy kalibracja systemu jest prawidłowa, narysuj różne kształty i rozmiary w oknie przeglądarki obrazów. Powinny one dokładnie odpowiadać wzorcom stymulacji rzutowanym na komórki, zapewniając dokładne dopasowanie do zamierzonego projektu.</li>
	<li>W oknie Przeglądarka obrazów wybierz ikonę Okrągły na pasku narzędzi po lewej stronie, aby narysować okrągłe obiekty stymulacyjne.</li>
	<li>Utwórz wiele małych identycznych okręgów i rozprowadź je równomiernie, aby zapewnić jednorodne pokrycie całej cytoplazmy komórek, które mają być stymulowane.</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy każdy z nich, aby sprawdzić jednorodność okrągłych obiektów stymulacyjnych. Pojawi się okno; Użyj go, aby zbadać ich promień, położenie itp.</li>
	<li>Ustaw promień od 1 do 5, w zależności od używanego obiektywu i rozmiaru komórki.</li>
	<li>Aby uzyskać równomierne odstępy i wyrównanie okręgów, użyj przycisku <Przyciągaj do siatki> w oknie podrzędnym Widok. Dodatkowo ustaw właściwości siatki za pomocą przycisku <Ustaw siatkę></li>
	<li>Upewnij się, że siatka lub matryca równomiernie rozmieszczonych okrągłych obiektów stymulacyjnych całkowicie zakrywa komórkę, a jej rozmiar (np. 6 x 6 lub 10 x 10) zależy od wielkości komórki. Jako kontrolę dla zerowej stymulacji, która nie powinna wyzwalać żadnych zdarzeń komórkowych, dołącz kilka okręgów umieszczonych na zewnątrz komórki.</li>
	<li>Każdy obiekt utworzony w oknie przeglądarki obrazów pojawi się w oknie Oś czasu.
	<ol>
		<li>W oknie podrzędnym Czas obiektu skonfiguruj właściwości czasowe każdego obiektu stymulacji (czas rozpoczęcia, czas trwania, opóźnienie).</li>
		<li>W oknie podrzędnym Źródło światła skonfiguruj długość fali i intensywność każdego obiektu. W przypadku tego protokołu upewnij się, że każdy obiekt używa tej samej długości fali i jest identyczny pod względem czasu trwania i intensywności. Czas rozpoczęcia będzie inny dla każdego obiektu, a opóźnienie między nimi może być zróżnicowane w zależności od oczekiwanego wyniku, aby uniknąć nakładania się efektu różnych stymulacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W oknie Oś czasu zmień kolejność, w której każdy obiekt stymulacji będzie aktywowany, jeśli jest to wymagane. Konfiguruj stymulacje w regularny sposób (np. od lewej do prawej, od góry do dołu) lub w losowy wzór, w zależności od konkretnego eksperymentu.</li>
	<li>Prześlij sekwencję do systemu i skonfiguruj liczbę cykli sekwencji (przebiegów), które system wykona.</li>
	<li>Umieść obszary zainteresowania (ROI) w oprogramowaniu do obrazowania w żądanych pozycjach.</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję obrazów fluorescencyjnych za pomocą mikroskopu i naciśnij <Play> w oknie UGA-42.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Chociaż oprogramowanie dostarczone przez system stymulacji pozwala na zapisywanie sekwencji do dalszego wykorzystania, nie rejestruje ono rzeczywistych informacji z eksperymentu. Dlatego skrupulatnie dokumentuj wszystkie szczegóły związane z miejscami i sekwencjami stymulacji zastosowanymi podczas eksperymentu, w tym parametry takie jak pozycja, intensywność, czas trwania, liczba przebiegów itp. Należy udokumentować wszelkie inne istotne warunki doświadczalne, takie jak środki farmakologiczne lub określone roztwory.</li>
	<li>Podczas eksperymentu umieść wyznaczone ROI w oprogramowaniu do obrazowania, aby uchwycić zmiany intensywności fluorescencji z całej komórki lub określonych miejsc w komórkach.</li>
	<li>Zwróć szczególną uwagę na umiejscowienie ROI względem miejsc stymulacji. Zmierz zmiany intensywności fluorescencji w obrębie lub daleko od stymulowanych obszarów. Dostosuj pozycje ROI po eksperymencie, dostarczając oprogramowanie do obrazowania, które umożliwia zapisywanie obrazów uzyskanych podczas eksperymentu, a nie tylko wartości intensywności ROI.</li>
</ol>

A Light-Stimulation Grid Approach to Study Cellular Optogenetic Protein

<ol><li>Naim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescence-activated+nucleotide+cyclase+regulates+spatial+and+temporal+cAMP+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).</li>
<li>Naim, N., Reece, J. M., Zhang, X., Altschuler, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+activation+of+cAMP+production+through+photostimulation+or+chemical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Dual activation of cAMP production through photostimulation or chemical stimulation.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2173, 201-216 (2020).</li>
<li>Stierl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+modulation+of+cellular+cAMP+by+a+small+bacterial+photoactivated+adenylyl+cyclase%2C+bPAC%2C+of+the+soil+bacterium+Beggiatoa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1181-1188 (2011).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Liccardo, F., Luini, A., Di Martino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endomembrane-based+signaling+by+GPCRs+and+G-proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Endomembrane-based signaling by GPCRs and G-proteins.</a> Cells. 11 (3), 528(2022).</li>
<li>Groschner, K., Graier, W. F., Romanin, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGroschner%2C+K+%22Store-operated+ca%282%29%2B+entry+%28SOCE%29+pathways%22">Store-operated ca(2)+ entry (SOCE) pathways</a>. , Springer, Vienna. (2017).</li>
<li>Ross, E. M., Howlett, A. C., Ferguson, K. M., Gilman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+hormone-sensitive+adenylate+cyclase+activity+with+resolved+components+of+the+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of hormone-sensitive adenylate cyclase activity with resolved components of the enzyme.</a> The Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6401-6412 (1978).</li>
<li>Insel, P. A., Maguire, M. E., Gilman, A. G., Bourne, H. R., Coffino, P., Melmon, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+adrenergic+receptors+and+adenylate+cyclase%3A+products+of+separate+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Beta adrenergic receptors and adenylate cyclase: products of separate genes.</a> Molecular Pharmacology. 12, 1062-1069 (1976).</li>
<li>Pizzoni, A., Zhang, X., Naim, N., Altschuler, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+cyclase-mediated+nuclear+cAMP+synthesis+is+sufficient+for+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Soluble cyclase-mediated nuclear cAMP synthesis is sufficient for cell proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (4), e2208749120(2023).</li>
<li>Keravis, T., Lugnier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+nucleotide+phosphodiesterase+%28PDE%29+isozymes+as+targets+of+the+intracellular+signalling+network%3A+benefits+of+PDE+inhibitors+in+various+diseases+and+perspectives+for+future+therapeutic+developments%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) isozymes as targets of the intracellular signalling network: benefits of PDE inhibitors in various diseases and perspectives for future therapeutic developments.</a> British Journal of Pharmacology. 165 (5), 1288-1305 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Celem tego badania było precyzyjne monitorowanie wewnątrzkomórkowej dystrybucji białka optogenetycznego i ocena jego działania w określonym przedziale cytoplazmatycznym. Pokazaliśmy również precyzyjne możliwości stymulacyjne systemu skanowania punktowego na komórkach wykazujących ekspresję białka optogenetycznego. Aby to osiągnąć, zastosowaliśmy ukierunkowany na energię jądrową bPAC-nLuc o wysokich poziomach ekspresji, ale bardzo ograniczonej dystrybucji ograniczonej do jądra. Wyniki wykazały, że miejsca stymulacji oddalone tylko o ~1 μm mogą albo wywołać produkcję cAMP, albo nie, w zależności od dystrybucji komórkowej białka optogenetycznego; tylko stymulacje skierowane do jądra były w stanie podnieść poziom cAMP. W tym protokole celem nie było wygenerowanie zlokalizowanego wzrostu cAMP, ale raczej pokazanie, że krótkie stymulacje światłem mogą być wystarczająco dokładne, aby aktywować białka optogenetyczne w bardzo ograniczonych obszarach komórki bez stymulacji otaczających białek. Jednak takie podejście stanowi niezbędną kontrolę dla badania innych białek optogenetycznych o rozproszonym rozmieszczeniu i/lub generowaniu zlokalizowanych wzrostów cAMP. Można to osiągnąć poprzez zmianę poziomów ekspresji białka optogenetycznego, intensywności i częstotliwości stymulacji itp. Aby dokładnie zmierzyć te zlokalizowane sygnały, kluczowe znaczenie ma dokładne rozważenie parametrów akwizycji i charakterystyki czujnika. Obejmuje to wybór odpowiednich pozycji i rozmiarów ROI, określenie częstotliwości akwizycji oraz wybór czujników FRET/intensiometrycznych o optymalnym powinowactwie, intensywności, zakresie dynamiki i stałej dysocjacji.
W niedawno opublikowanym artykule zastosowaliśmy podobną strategię, aby funkcjonalnie zademonstrować dystrybucję ukierunkowanego na jądro bPAC-nLuc i zdolność zmodyfikowanej fosfodiesterazy (PDE; ΔRI-PDE8) do zniesienia podwyższenia cAMP w linii komórkowej9 pochodzącej z tarczycy. W tym artykule przeprowadziliśmy stymulację komórek wzdłuż linii prostej, a nie siatki, a punkty świetlne zostały umieszczone względem punktów orientacyjnych komórek (np. centrum jądra, krawędzi jądrowej itp.), a nie w systematycznym wzorze. Co ciekawe, nawet stymulacje skierowane na krawędź jądra były niewystarczające, aby wywołać wykrywalną odpowiedź cAMP. Doszliśmy do wniosku, że było to prawdopodobnie spowodowane stymulacją niewystarczającej masy NLS-bPAC-nLuc9. Jednak w obecnym protokole niektóre stymulacje skierowane w okolice krawędzi jądrowej wywołały wykrywalny wzrost cAMP. Ta rozbieżność może być przypisana różnym czynnikom, w tym poziomom ekspresji bPAC-nLuc, charakterystyce stymulacji, morfologii jądra, obecności endogennych PDE, białek buforowych itp.
Podczas gdy inne celowane lub nieukierunkowane białka optogenetyczne mogą wykazywać bardziej rozproszone rozmieszczenie, to systematyczne podejście wspiera wyciąganie znaczących wniosków poprzez staranne przygotowanie eksperymentów i analizę danych. Co więcej, podejście to umożliwia celowanie w wyspecjalizowane struktury komórkowe (np. lamellipodia, dendryty, rzęski pierwotne itp.), ułatwiając porównanie odpowiedzi w dystalnych i proksymalnych regionach tych struktur i/lub ciała komórki. 
Strategia ta może być również wykorzystana do oceny aktywacji dalszych elementów w szlaku cAMP, takich jak kinaza białkowa A (PKA) lub białko wymienne bezpośrednio aktywowane przez cAMP (EPAC1). Ponadto, ponieważ na bPAC-nLuc nie mają wpływu te same modulatory, co endogenne AC, na które mogą wpływać lokalne interakcje z białkami lub innymi czynnikami, można założyć, że konsekwentnie generuje tę samą ilość cAMP przy tym samym poziomie ekspresji. Badając zmniejszenie uniesienia cAMP lub spadek poziomu cAMP po chwilowym wzroście, podejście to pozwala na ocenę degradacji, dyfuzji lub funkcjonalności i dystrybucji endogennych lub transfekowanych PDE. Strategia ta okazuje się szczególnie przydatna do oceny zachowania dowolnego białka optogenetycznego w różnych lokalizacjach komórkowych, pomagając uniknąć stronniczości wynikającej z arbitralnego umieszczania miejsc stymulacji w cytoplazmie.
Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że wielkość miejsca stymulacji i jego energia będą ostatecznie zależeć od szczególnych cech zastosowanej konfiguracji (ścieżki światła, obiektywy, system skanowania itp.). Aby zapewnić dokładne wyniki, względna ekspresja białka optogenetycznego, wrażliwość komórek na użytą długość fali oraz wszelkie inne parametry powinny być brane pod uwagę podczas przeprowadzania każdego eksperymentu w każdym poszczególnym systemie. Należy również zauważyć, że nie zbadaliśmy pełnego zakresu, w jakim system może być sterowany w wdrażaniu mniejszych punktów stymulacji i/lub gęstszych siatek (tj. mniej rozmieszczonych miejsc stymulacji) w celu systematycznej oceny mniejszych struktur komórkowych z większą precyzją. Dodatkowo przetestowaliśmy tę strategię przy użyciu wyłącznie systemu skanowania punktów UGA-42 Geo. Takie podejście może być możliwe przy użyciu różnych systemów, pod warunkiem, że mogą one w powtarzalny sposób generować równomiernie rozmieszczone zlokalizowane miejsca. Każdy system powinien być zoptymalizowany, aby dawać podobne wyniki.
Na koniec należy dokładnie ocenić potencjalną stymulację czujników FRET przez system stymulacji. Na przykład cyjanowe białko fluorescencyjne (CFP) z pewnością będzie stymulowane, a nawet wybielane przez laser o długości fali 445 nm stosowany w tym protokole. Zastosowanie wyższych mocy lasera (lub filtrów o neutralnej gęstości (ND) o wyższej przepuszczalności) zwiększy szanse na pobudzenie czujników fluorescencyjnych i wprowadzenie fałszywych informacji do eksperymentu i/lub wygenerowanie problemów z analizą danych. Należy również dokładnie ocenić normalne fotowybielanie czujników FRET/intensiometrycznych. Wreszcie, ponieważ bPAC może być wrażliwy na światło otoczenia i generować cAMP nawet w ciemnych warunkach (ciemna aktywność bPAC została zmierzona jako 33 ± 5 pmol/min/mg białka3), po transfekcji bPAC-nLUC należy ostrożnie manipulować komórkami, aby uniknąć zanieczyszczenia światłem (np. w inkubatorze, przed i/lub w trakcie eksperymentów itp.). Opcjonalnie komórki mogą być inkubowane z inhibitorem PDE (np. 3-izobutylo-1-metyloksantyna; IBMX10) w celu określenia podstawowej aktywności bPAC-nLuc i potwierdzenia, że stosowane warunki oświetleniowe są odpowiednio ciemne.

Optogenetyka, która zrewolucjonizowała neuronauki, jest teraz rozwijającą się dziedziną badań i rozwijającą się technologią rutynowo używaną przez wiele laboratoriów na całym świecie i w różnych obszarach badawczych w biologii. Opracowaliśmy bPAC-nLuc, wszechstronne białko optogenetyczne, łącząc światłoczułą cyklazę adenylową (AC) z Beggiatoa sp. (bakteryjna fotoaktywowana cyklaza adenylowa; bPAC) z nanolucyferazy (nLuc)1,2,3. Po stymulacji niebieskim światłem bPAC wytwarza drugi przekaźnik 3',5'-cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP). nLuc to niedawno opracowana mała lucyferazy, która w obecności jednego ze swoich substratów może generować bioluminescencję i aktywować produkcję cAMP4. W ten sposób to białko optogenetyczne może być aktywowane przejściowo za pomocą krótkich impulsów świetlnych lub stale z furimazyną lub innymi substratami lucyferazy, co pozwala nam naśladować różne wzorce sygnalizacji cAMP i oceniać odpowiedzi komórkowe (aktywacja czynników transkrypcyjnych, ekspresja genów, proliferacja komórek, migracja itp.). Ostatnie postępy w sygnalizacji2-go przekaźnika podkreśliły znaczenie zdarzeń zachodzących w bardzo ograniczonych regionach cytozolowych (np. endosomalna produkcja cAMP dla fosforylacji białka wiążącego element odpowiedzi cAMP (CREB) lub mikrodomeny Ca2+ dla czynnika jądrowego translokacji aktywowanych limfocytów T (NFAT) do jądra)5,6. Dlatego ważne jest opracowanie spójnych i systematycznych strategii oceny, naśladowania i blokowania sygnalizacji z tych przedziałów w żywych komórkach. Aby pokazać zdolność bPAC-nLuc do specyficznej aktywacji w różnych przedziałach komórkowych, przeprowadziliśmy kotransfekcję linii komórkowej pochodzącej z wątrobiaka (HC-1) z ukierunkowanym na jądro bPAC-nLuc i H208, czujnikiem cAMP rezonansowego transferu energii Förstera (FRET) (NLS-bPAC-nLuc; NLS-H208). Komórki HC-1 wywodzące się z linii HTC są pozbawione możliwej do osądzenia aktywności AC, co skutkuje bardzo niskimi podstawowymi poziomami cAMP, co czyni je idealnymi do pomiaru przypuszczalnej produkcji cAMP przy jednoczesnym wykorzystaniu pełnego zakresu dynamiki czujników FRET7,8. Za pomocą lasera na ciele stałym (445 nm, LDI-7, 89 North) podłączonego do systemu skanowania punktowego (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic), opisujemy protokół systematycznej stymulacji bardzo małych okrągłych obszarów lub plamek (~1μm2) w obrębie pojedynczych komórek. System skanowania punktowego został podłączony do jednego z backportów dwupoziomowego mikroskopu, co pozwoliło nam na stymulację komórek i jednoczesne wykonywanie pomiarów FRET za pośrednictwem niezależnej ścieżki światła. Przedstawiamy metodę w tym protokole, w której oprogramowanie SysCon Geo, dostarczone wraz z systemem stymulacji przez Rapp OptoElectronic, jest wykorzystywane do wykonania kompleksowego skanowania cytoplazmy komórek. Podejście to polega na wygenerowaniu mapy odpowiedzi cAMP poprzez ustawienie sekwencji iluminacji, które stymulują komórki we wzorze siatki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>Kompaktowa żarówka fluorescencyjna 13 W Bursztynowa - Low Blue Lights</td><td>Photonic Developments&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I7018</td><td></td></tr><tr><td>6-liniowa multi-LED Lumencor Spectra X</td><td>Lumencor&nbsp;</td><td></td><td>6-liniowy silnik oświetleniowy multi-LED&nbsp;</td></tr><tr><td>Corning - DMEM&nbsp;</td><td>Thermo Fischer</td><td>MT10013CMEA</td><td></td></tr><tr><td>Corning - Regularna płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fischer</td><td>MT35011CV</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe: kółka</td><td>Thermo Fischer</td><td>12545102P</td><td></td></tr><tr><td>GBX-2 ciemnoczerwony filtr safelight 5,5"&nbsp;</td><td>Kodak</td><td>1416827</td><td>Czerwona lampa ostrzegawcza&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) 10x</td><td>Thermo Fischer</td><td>14185052</td><td>Rozcieńczony do 1x, dostosowane pH</td></tr><tr><td>LDI-7</td><td>89 North</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fischer</td><td>BW17605E</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000&nbsp;</td><td>Zestaw do transfekcji</td> <td>Thermo Fischer</td><td>L3000001</td>&nbsp;</tr><tr><td>Olympus IX83 z napędem silnikowym&nbsp; dwupokładowy&nbsp; mikroskop&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Zmotoryzowany mikroskop dwupokładowy&nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fischer</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-fusion cyfrowa kamera CMOS&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>C14440-20UP</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Fischer</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowany fosforanem (1x)</td><td>Lonza</td><td>17516F</td><td></td></tr> Koło filtrów <tr><td>i zestawy filtrów przed emisją</td><td>Prior Scientific, Inc.</td><td></td><td>Koło filtra emisji&nbsp;</td></tr><tr><td>Wcześniej&nbsp; Proscan XY stage</td><td>Prior Scientific, Inc.</td><td></td><td>Stolik XY&nbsp;</td></tr><tr><td>Slidebook 6</td><td>Innowacje w zakresie inteligentnego obrazowania Oprogramowanie</td><td></td> do <td>mikroskopii cyfrowej</td></tr><tr><td>Oprogramowanie SysCon</td><td>Oprogramowanie</td><td></td> SysCon <td>dostarczane przez system stymulacji&nbsp;</td></tr><tr><td>UGA-42&nbsp; Położenie geograficzne&nbsp;</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPlanSApo 100x</td><td>Olympus</td><td></td><td>100x/1.4 NA obiektyw olejowy (&infin;/0.17/FN26.5)</td></tr><tr><td>ZT458rdc dichroik&nbsp;</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>BS, Długość fali (CWL):&nbsp; 498 nm</td></tr></tbody></table>

mapowanie dystrybucji komórkowej białka optogenetycznego za pomocą siatki stymulacji świetlnej

Mapping the Cellular Distribution of an Optogenetic Protein Using a Light-Stimulation Grid

Naszym celem było dokładne śledzenie dystrybucji komórkowej białka optogenetycznego i ocena jego funkcjonalności w określonym miejscu cytoplazmatycznym. Aby to osiągnąć, przeprowadziliśmy jednoczesną transfekcję komórek za pomocą czujników cAMP ukierunkowanych na jądro i naszego opracowanego laboratoryjnie białka optogenetycznego, bakteryjnej fotoaktywowanej cyklazy adenylowej-nanolucyferazy (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc, po stymulacji światłem o długości 445 nm lub substratami lucyferazy, wytwarza adenozyno-3',5'-cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP). Zastosowaliśmy półprzewodnikowy oświetlacz laserowy podłączony do systemu skanowania punktowego, który pozwolił nam stworzyć wzór siatki/matrycy małych oświetlonych plamek (~1 μm2) w całej cytoplazmie komórek HC-1. W ten sposób byliśmy w stanie skutecznie śledzić rozmieszczenie bPAC-nLuc ukierunkowanych na cele jądrowe i wygenerować kompleksową mapę odpowiedzi cAMP. Mapa ta dokładnie przedstawiała rozmieszczenie komórkowe bPAC-nLuc, a jego reakcja na stymulację światłem zmieniała się w zależności od ilości białka w oświetlonym miejscu. To innowacyjne podejście przyczynia się do poszerzania zestawu dostępnych technik do badania komórkowych białek optogenetycznych. Możliwość mapowania jego rozmieszczenia i reakcji z dużą precyzją ma daleko idący potencjał i może przyczynić się do rozwoju różnych dziedzin badań.

Wyniki przedstawione na Rysunku 1 wykazują, że tylko stymulacje skierowane do jądra komórkowego były w stanie wywołać mierzalne wzrosty poziomu cAMP. Potwierdza to, że NLS-bPAC-nLuc jest ekspresowany wyłącznie w kompartmencie jądrowym komórek HC-1. Wykorzystując ten wzór siatki/macierzy, możliwe jest precyzyjne stymulowanie białka optogenetycznego w celu zmapowania jego rozmieszczenia wewnątrzkomórkowego. Ponadto wyższe wzrosty cAMP w obszarze centrum jądra odzwierciedlają większą masę bPAC-nLuc stymulowaną przez plamki centralne w porównaniu do tych umieszczonych na obwodzie jądra (Rysunek 1).
<img alt="Wynik mikroskopii YFP H208, stymulacja światłem o długości 445 nm, wykresy sygnałów przejściowych, spektroskopia optyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65471/65471fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Protokół stymulacji w układzie siatki oraz mapa odpowiedzi cAMP. Sekwencyjne stymulacje niebieskim światłem (445 nm; 30 s odstępu między impulsami; pociąg impulsów: 50 ms, całkowity czas trwania 500 ms, 10 Hz, 7% mocy lasera) komórek HC-1 przetransfekowanych NLS-H208 (sensor cAMP) oraz NLS-bPAC-nLuc. Lewy panel przedstawia fluorescencję żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) z H208, na którą nałożono faktyczne impulsy światła zarejestrowane przez kamerę sCMOS, przedstawione na jednym obrazie. Krzywe po prawej stronie pokazują przejściowe wzrosty cAMP wywołane stymulacją NLS-bPAC-nLuc w każdym punkcie stymulacji. Fluorescencję NLS-H208 po odjęciu tła mierzono przy użyciu pojedynczego ROI obejmującego całe jądro i obliczano znormalizowane stosunki (R/R0). Odpowiedzi w obszarach zewnętrznych (wiersze 1 i 7, kolumny A i G) były ujemne i nie zostały przedstawione. Pasek skali = 3 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65471/65471fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół obejmuje transfekcję czujników cAMP i bPAC-nLuc, białka optogenetycznego, w celu dokładnego śledzenia jego dystrybucji komórkowej i odpowiedzi na stymulację światłem. Innowacyjne podejście polegające na stworzeniu mapy odpowiedzi cAMP przy użyciu systemu skanowania punktowego ma potencjał do przyspieszenia badań nad białkami optogenetycznymi w różnych dziedzinach.

Mapowanie dystrybucji komórkowej białka optogenetycznego za pomocą siatki stymulacji świetlnej

Our goal was to accurately track the cellular distribution of an optogenetic protein and evaluate its functionality within a specific cytoplasmic ...

Nasze laboratorium bada przestrzenną i czasową regulację cyklicznego AMP, aby zrozumieć, jakie warunki wywołują określone zdarzenia w dół. Aby skutecznie naśladować subkomórkową aktywację i hamowanie cyklicznej sygnalizacji AMP, charakteryzujemy dystrybucję narzędzia optogenetycznego zwanego bPAC-nanolucyferazą. Aby przetestować trafność obecnych cyklicznych modeli sygnalizacji AMP, opracowaliśmy narzędzia do oceny, naśladowania i blokowania cyklicznej sygnalizacji AMP z przedziałów subkomórkowych w żywych komórkach.Protokół ten może być stosowany do stymulowania i oceny dystrybucji i funkcji narzędzi optogenetycznych w sposób systematyczny. Cóż, naszym celem było sprawdzenie, czy proces skupienia światła może precyzyjnie aktywować białka optogenetyczne w określonych strefach komórkowych, unikając w ten sposób wpływu na otaczające białka. Metoda ta będzie niezbędna do badania białek o rozproszonym rozkładzie lub jeśli zamierzonym efektem jest generowanie miejscowego wzrostu cyklicznego AMP lub innych cząsteczek sygnałowych.W eksperymentach optogenetycznych typowe podejście polega na stymulacji albo całego pola komórek, albo czasem mniejszych wyznaczonych obszarów. Jednak wybór tego obszaru i intensywności jest często arbitralny. Nasze systematyczne podejście umożliwia badaczom przeprowadzanie dokładniejszych eksperymentów, pomagając naśladować wzorce szlaków sygnałowych.Do tego badania wykorzystano komórki transfekowane za pomocą cyklicznego czujnika AMP ukierunkowanego na jądro i optogenetycznego białka ukierunkowanego na jądro, NLS-bPAC-nanolucyferazy. Hoduj i manipuluj komórkami wyrażającymi jądrowy bPAC w ciemnym środowisku. Użyj czerwonej lampy bezpiecznej, aby uniknąć ekspozycji na fale o długości mniejszej niż 500 nanometrów.Wykonuj eksperymenty obrazowania w zmotoryzowanym mikroskopie dwupokładowym wyposażonym w silnik świetlny z wieloma diodami LED, koło filtrów emisyjnych, zmotoryzowany stolik XY, kamerę ORCA-Fusion Digital CMOS i obiektyw olejowy o powiększeniu 100x i aperturze numerycznej 1,4. Aby uchwycić obrazy, użyj oprogramowania do mikroskopii cyfrowej. Ta konfiguracja jest w stanie stymulować komórki i jednocześnie wykonywać pomiary FRET przy użyciu niezależnej ścieżki światła wyposażonej w filtr dichroiczny ZT458rdc.Po włączeniu UGA-42 Geosystem i laserów LDI-7 należy włączyć mikroskop, aby odpowiednio ustawić go do pozyskiwania danych za pomocą czujnika H208 FRET. Następnie kolejno otwórz oprogramowanie do obrazowania i oprogramowanie SysCon, które steruje mikroskopem. Aby skalibrować system przed każdym użyciem, przejdź do okna Kamera i wybierz kartę Kalibracja.Ustaw długość fali lasera zgodną z białkiem optogenetycznym. Wybierz 445 nanometrów, aby stymulować nanolucyferazę bPAC. Wybierz kartę Camera (Aparat) i kliknij przycisk Start Acquisition (Rozpocznij akwizycję), aby rozpocząć pobieranie z poziomu oprogramowania do obrazowania.Ponownie wybierz kartę Kalibracja. Kliknij przycisk Rozpocznij kalibrację. Z wyświetlonej listy rozwijanej wybierz odpowiedni tryb kalibracji.Postępuj zgodnie z krokami kalibracji wskazanymi przez producenta. W razie potrzeby zmień ustawienia oprogramowania do obrazowania, aby przeprowadzić prawidłową kalibrację. Upewnij się, że kalibracja została wykonana na obszarze próbki wolnym od komórek.Następnie, za pomocą oprogramowania do obrazowania, uzyskaj jeden obraz fluorescencyjny. Komórki fluorescencyjne pojawią się w oknie przeglądarki obrazów. Umieść komórkę, która będzie stymulowana za pomocą mikroskopu sterującego XY, w obszarze oddziaływania, najlepiej w jego środku.Przed rozpoczęciem właściwego eksperymentu użyj trybu Click-and-Fire, aby szybko ocenić responsywność pojedynczej komórki. W oknie Oś czasu dostosuj parametry stymulacji komórek, w tym źródło światła, czas trwania i intensywność bodźca. W oknie Przeglądarka obrazów kliknij mniej więcej środek komórki i oceń odpowiedź.W oknie Przeglądarka obrazów wybierz okrągłą ikonę na pasku narzędzi po lewej stronie, a następnie w menu rozwijanym kliknij Wypełnione, aby narysować wypełnione okrągłe obiekty stymulacyjne. Powtórz ten krok, aby utworzyć wiele identycznych okręgów i rozprowadzić je równomiernie, zapewniając jednorodne pokrycie całej cytoplazmy komórki, która ma być stymulowana. W oknie Przeglądarka obrazów kliknij ikonę wskaźnika myszy po lewej stronie, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy jeden z obiektów stymulacji, aby sprawdzić i edytować jego właściwości.Możesz też zaznaczyć wszystkie narysowane obiekty stymulacji, a następnie kliknąć prawym przyciskiem myszy, aby edytować właściwości wszystkich wybranych obiektów stymulacji razem. W oknie podrzędnym Widok kliknij przycisk Przyciągaj do siatki. Ta siatka może pomóc w utrzymaniu równych odstępów i wyrównania okręgów, aby utworzyć odpowiednią macierz lub tablicę.Dodatkowo dostosuj właściwości siatki za pomocą przycisku Ustaw siatkę. Rozłóż obiekty stymulujące równomiernie za pomocą siatki. W razie potrzeby dodaj więcej obiektów stymulujących, aby pokryć całą komórkę.Upewnij się, że wszystkie mają te same właściwości. Każdy obiekt stymulacji utworzony wcześniej w oknie przeglądarki obrazów będzie obecny w oknie osi czasu, w którym można edytować inny zestaw właściwości, w tym czas rozpoczęcia, czas trwania, opóźnienie, intensywność i inne. Aby prawidłowo zwizualizować obiekty stymulacyjne, najpierw rozwiń okno Oś czasu.Teraz można zobaczyć czasowe właściwości obiektów stymulujących w oknie Oś czasu. Zaznacz wszystkie obiekty stymulujące i edytuj ich opóźnienie i czas trwania w oknie podrzędnym Czas synchronizacji obiektu. W oknie podrzędnym Źródło światła skonfiguruj długości fal i intensywności obiektu.Zapewnij identyczną długość fali i intensywność dla wszystkich. Aby zapobiec nadmiernemu nałożeniu efektu dwóch lub więcej stymulacji, ustaw różne czasy rozpoczęcia dla każdego obiektu lub zmieniaj opóźnienie między nimi w zależności od oczekiwanego wyniku. Następnie w oknie Oś czasu zmień kolejność, w jakiej każdy obiekt stymulacji zostanie aktywowany, jeśli jest to wymagane.Skonfiguruj sekwencję stymulacji w regularny lub losowy wzór w zależności od eksperymentu. Po wgraniu sekwencji do systemu należy skonfigurować liczbę cykli sekwencji lub uruchomień, które system wykona w podoknie Sekwencja. Aby zmierzyć zmiany fluorescencji stymulowanej komórki, umieść interesujące Cię obszary w oprogramowaniu do obrazowania w żądanych pozycjach.Zacznij rejestrować obrazy fluorescencyjne. Na koniec naciśnij Play w oknie UGA-42, aby rozpocząć stymulację komórek. Obserwuj rzeczywiste wiązki stymulacyjne, które mogą być również rejestrowane przez kamerę, i ich korelację z obiektami stymulującymi.Zwróć uwagę na zmianę intensywności tylko zielonego śladu, który pokazuje wzrost cyklicznego stężenia AMP mierzonego przez czujnik. Dzieje się tak w szczególności, gdy wiązka dociera do części komórki z minimalną ilością nanolucyferazy bPAC. Do określenia położenia jądra wykorzystano fluorescencję YFP H208.Obszar zainteresowania obejmujący całe jądro wykorzystano do pomiaru zmian współczynnika FRET czujnika H208 spowodowanych stymulacją we wskazanych niebieskich punktach. Okazało się, że przejściowy wzrost cyklicznego AMP występował tylko wtedy, gdy niebieskie światło było skierowane na obszary zawierające nanolucyferazę bPAC. Potwierdziło to, że ukierunkowana na jądro nanolucyferazy bPAC ulegała ekspresji wyłącznie w kompartmencie jądrowym komórek HC-1.

mapping-cellular-distribution-an-optogenetic-protein-using-light

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł przedstawia podejście łączące fotostymulację za pomocą skanowania laserowego z rejestracją z całej komórki u myszy transgenicznych wykazujących ekspresję GFP w ograniczonych populacjach neuronów hamujących. Technika ta umożliwia szerokie mapowanie i analizę ilościową lokalnych obwodów synaptycznych specyficznych hamujących neuronów kory mózgowej.

Mapowanie hamujących obwodów neuronalnych za pomocą fotostymulacji skanującej laserowo

Neurony powstałe w wieku dorosłym wykazujące ekspresję ChR2 mogą być manipulowane w preparatach elektrofizjologicznych w plastrach tkankowych w celu zbadania ich wkładu w funkcjonowanie węchowych obwodów neuronalnych.

Wykorzystanie przystępnych cenowo mat LED do fotostymulacji neuronów

Neurony powstałe w wieku dorosłym w opalfaktorycznej cebulce mogą być kontrolowane optogenetycznie poprzez wstrzyknięcie lentiwirusa wykazującego ekspresję Channelrhodopsin2 do przedniego strumienia migracyjnego oraz przewlekłą fotostymulację za pomocą wszczepionej miniaturowej diody LED.

Selektywna transdukcja wirusowa neuronów węchowych pochodzenia dorosłego w celu chronicznej optogenetycznej stymulacji in vivo

Niniejszy artykuł przedstawia rejestrację sygnałów z pojedynczych komórek pochodzących z fluorescencyjnie znakowanych populacji neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy. Dzięki zastosowaniu dwufotonowego wzbudzenia w podczerwieni, transgenicznie znakowane komórki zostały wytypowane do rejestracji metodą patch-clamp w celu zbadania ich reakcji na światło, właściwości pól recepcyjnych oraz morfologii.

Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Zaprojektowaliśmy aparat do ciągłej hodowli do użytku z systemami optogenetycznymi do oświetlania kultur mikrobów i regularnego obrazowania komórek w ściekach za pomocą mikroskopu odwróconego. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje na oświetlenie mogą być mierzone przez kilka dni.

Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

Tutaj prezentujemy protokół do analizy transferu informacji oscylacyjnych między komórkami za pomocą kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Podejście to stanowi unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia programów dynamicznej ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

Niezawodna kontrola komórek ssaków reagujących na światło wymaga standaryzacji metod optogenetycznych. Aby osiągnąć ten cel, badanie to nakreśla linię budowy obwodów genowych, inżynierii komórkowej, obsługi sprzętu optogenetycznego i testów weryfikacyjnych w celu standaryzacji badania ekspresji genów indukowanej światłem przy użyciu optogenetycznego obwodu genowego o ujemnym sprzężeniu zwrotnym jako studium przypadku.

Niezawodna inżynieria i kontrola stabilnych optogenetycznych obwodów genowych w komórkach ssaków

Bioluminescencja - światło emitowane przez enzym lucyferazy utleniający substrat o małych cząsteczkach, lucyferynę - może być wykorzystane do aktywacji białek fotosensorycznych, dodając w ten sposób kolejny wymiar do stymulacji świetlnej i umożliwiając manipulowanie wieloma funkcjami zależnymi od światła w komórkach w skalach czasowych i przestrzennych.

Optogenetyka bioluminescencyjna 2.0: wykorzystanie bioluminescencji do aktywacji białek fotosensorycznych in vitro i in vivo

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Ten protokół opisuje zastosowanie zaprojektowanej domeny przełącznika allosterycznego aktywowanego niebieskim światłem (LightR) do odwracalnej czasoprzestrzennej kontroli aktywności białek. Wykorzystując kinazę tyrozynową Src jako model, badanie to oferuje skomplikowany protokół do opracowania i scharakteryzowania regulowanego światłem Src (LightR-Src). Pokazuje to wszechstronność tego podejścia w różnych klasach enzymów.

Czasoprzestrzenna kontrola aktywności białek poprzez optogenetyczną regulację allosteryczną

Poznaj metodę mapowania dystrybucji białka bPAC-nanoluciferazy w komórkach żywych przy użyciu siatki stymulacji świetlnej. Technika ta umożliwia precyzyzną kontrolę sygnałowania cAMP w określonych strefach komórki.

Mapowanie dystrybucji komórkowej białka optogenetycznego za pomocą siatki stymulacji świetlnej

Przeglądaj więcej filmów