Name: Podwójna immunofluorescencja γH2AX i 53BP1 w ludzkich limfocytach obwodowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Poznaj metodę podwójnej immunofluorescencji γH2AX i 53BP1 w ludzkich limfocytach obwodowych do oceny uszkodzeń DNA indukowanych bleomycyną. Ta technika pozwala ilościowo analizować odpowiedź komórkową na uszkodzenia genomu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni dawcom krwi pełnej oraz całemu personelowi medycznemu, który pobrał próbki krwi.

Badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu w, a od każdego dawcy uzyskano świadomą i podpisaną zgodę.
1. Powstawanie ognisk γH2AX i 53BP1
<ol>
	<li>Przygotowanie próbek i postępowanie mutagenne
	<ol>
		<li>Pobrać próbki krwi pełnej przez nakłucie żyły od zdrowych dorosłych osób w probówkach do pobierania krwi (np. Vacutainer) zawierających heparynę litową jako antykoagulant.</li>
		<li>W celu zapewnienia właściwego zachowania próbki krwi należy rozpocząć procedurę w ciągu 24 godzin od pobrania</li> próbki.
		<li>Dodać 300 μl próbki do probówki zawierającej 4,7 ml kompletnej pożywki (0,5% penicylina-streptomycyna, 0,75% fitohemaglutynina, 10% FBS wcześniej inaktywowane, 88,75% RPMI 1640).</li>
		<li>Następnie dodać siarczan bleomycyny do końcowego stężenia 5 μg/ml. 
		UWAGA: Siarczan bleomycyny jest mutagenem. Unikać kontaktu ze skórą i wdychania. Przygotować roztwór i dodać próbkę pod maską.</li>
		<li>Dla każdej próbki należy ustanowić kontrolę ujemną (brak mutagenu).</li>
		<li>Umieść rurkę w termostacie w temperaturze 37 °C na 2 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalenie
	<ol>
		<li>Odwirować próbki o masie 540 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą wiru.</li>
		<li>Dodać 5 ml roztworu hipotonicznego (2,87 g KCl rozpuszczonego w 500 ml wody dejonizowanej) i 400 μl roztworu wstępnego utrwalającego (kwas octowy 5:3: metanol), aby spowodować hemolizę czerwonych krwinek.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 540 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml metanolu w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut w celu utrwalenia komórek.</li>
		<li>Alternatywnie, przechowuj ogniwa w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie preparatów
	<ol>
		<li>Odwirować próbki o masie 540 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml roztworu metanolu i kwasu octowego w proporcji 3:1. Powtórz te kroki jeszcze raz.</li>
		<li>Na koniec ponownie odwirować roztwór o stężeniu 540 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ponownie odessać supernatant, pozostawiając wystarczającą ilość roztworu (0,5 ml) do ponownego zawieszenia osadu, energicznie pipetować, upuścić zawieszone osady komórkowe na szkiełka i wysuszyć na powietrzu. Przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunofluorescencja 
	UWAGA: Immunofluorescencja to immunologiczna metoda identyfikacji określonych celów komórkowych za pomocą przeciwciała pierwszorzędowego wiążącego sam cel i przeciwciała fluorescencyjnego drugorzędowego wiążącego podstawowe, które umożliwia lokalizację celu11. W tym przypadku mysie monoklonalne anty-53BP1 (1:50) i królicze poliklonalne anty-γH2AX (1:50) są stosowane jako przeciwciała pierwszorzędowe, podczas gdy AlexaFluor568 anty-mysie (1:400) i DyLight488 anty-królik (1:200) są stosowane odpowiednio jako przeciwciała drugorzędowe.
	<ol>
		<li>Umyj szkiełka dwa razy w 50 ml 1x PBS przez 5 minut w słoiku couplin (16 szkiełek tyłem do siebie).</li>
		<li>Następnie trzymaj je przez 30 minut w roztworze blokującym (10 ml FBS, 10 ml 10x PBS, 80 ml wody dejonizowanej, 300 μl Triton-X).</li>
		<li>Do każdego szkiełka dodać 10 μl każdego z dwóch roztworów zawierających przeciwciała pierwszorzędowe rozpuszczone w roztworze blokującym. Przykryć szkiełka taśmą parafinową i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Po inkubacji wykonać trzy płukania w 1x PBS przez 5 min.</li>
		<li>Do każdego szkiełka dodać 10 μl każdego z dwóch roztworów zawierających przeciwciała drugorzędowe rozpuszczone w roztworze blokującym. Przykryj szkiełka taśmą parafinową i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
		<li>Wykonaj trzy prania w 1x PBS przez 5 min.</li>
		<li>Dodać 2,5 μl roztworu zapobiegającego blaknięciu z DAPI na szkiełka nakrywkowe przed montażem, aby przeciwdziałać barwieniu jąder. 
		UWAGA: W celu oceny kinetyki ognisk, procedura jest taka sama, jak opisana od 1,1 do 1,4, zauważając, że pobieranie komórek i podwójna immunofluorescencja są wykonywane po 0 godzinach, po 2 godzinach po leczeniu bleomycyną, a następnie, po usunięciu mutagenu, po 4 godzinach, 6 godzinach i 24 godzinach po zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego
UWAGA: "Mikroskop fluorescencyjny" odnosi się do dowolnego mikroskopu, który wykorzystuje fluorescencję do generowania obrazu. Próbka jest oświetlana światłem o określonej długości fali (lub długościach fal), które jest pochłaniane przez fluorofory, powodując emitowanie światła o dłuższych długościach fal12. AlexaFluor568 i DyLight 488 pochłaniają światło o długości fali około 568 i 488 nm oraz emitują światło o długości fali odpowiednio 603 i 520 nm. W związku z tym są one widoczne jako czerwona lub zielona fluorescencja przy użyciu odpowiednio filtra TRITC lub FITC.
<ol>
	<li>Oceń obecność ognisk na każdym slajdzie pod 100-krotnym obiektywem zanurzenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Oceń 200 jąder na szkiełko i policz liczbę ognisk γH2AX/53BP1 w każdym jądrze.</li>
	<li>Wyraż wyniki pod względem średniej liczby ognisk na łączną liczbę uzyskanych jąder. Należą do nich zarówno jądra γH2AX/53BP1 dodatnie (wykazujące co najmniej jeden sygnał fluorescencyjny), jak i ujemne (niewykazujące żadnego sygnału fluorescencji).</li>
</ol>

<ol><li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+damage%2C+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).</li>
<li>Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+response+to+double-strand+DNA+breaks+and+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair.</a> Cells. 9 (8), 1853(2020).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Dickey, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Her, J., Bunting, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cells+ensure+correct+repair+of+DNA+double-strand+break%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%2C+Thematic+Minireview%22%5BJournal%5D)">How cells ensure correct repair of DNA double-strand break.</a> Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).</li>
<li>Kuo, L. K., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).</li>
<li>Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+the+53BP1+protein+in+genome+protection%3A+structural+and+functional+characteristics+of+53BP1-dependent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair.</a> Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).</li>
<li>Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+microscopy+of+%CE%B3H2AX+and+53BP1+for+analyzing+the+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), 56617(2017).</li>
<li>Jezkova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particles+with+similar+LET+values+generate+DNA+breaks+of+different+complexity+and+reparability%3A+a+high-resolution+microscopy+analysis+of+%CE%B3H2AX%2F53BP1+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci.</a> Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).</li>
<li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+nuclear+phosphorylation+%28%CE%B3-H2AX%29+in+human+lymphocytes+treated+in+vitro+with+UVB%2C+bleomycin+and+mitomycin+C%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C.</a> Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).</li>
<li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li>
<li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanderson%2C+MJ+%22Fluorescence+microscopy%22">Fluorescence microscopy</a>. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of the cell membrane.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Hecht, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleomycin%3A+New+perspectives+on+the+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action.</a> Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).</li>
<li>Fei, P., El-Deiry, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P53+and+radiation+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">P53 and radiation responses.</a> Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).</li>
<li>Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+ionizing+radiation-induced+DNA+double-strand+breaks+by+non-homologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining.</a> Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).</li>
<li>Palla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX%3A+Can+it+be+established+as+a+classical+cancer+prognostic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor.</a> Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931(2017).</li>
<li>Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwaves+from+GSM+mobile+telephones+affect+53BP1+and+gamma-H2AX+foci+in+human+lymphocytes+from+hypersensitive+and+healthy+persons%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons.</a> Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).</li>
<li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+damage+in+peripheral+lymphocytes+of+obese+and+overweight+Italian+children+as+evaluated+by+the+%CE%B3-H2AX+focus+assay+and+micronucleus+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test.</a> The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).</li>
<li>Shanbhag, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+neuronal+accumulation+of+DNA+double-strand+breaks+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communication%22%5BJournal%5D)">Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77(2019).</li>
<li>Lassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+of+gamma-H2AX+and+53BP1+DNA+repair+foci+in+blood+cells+after+radioiodine+therapy+of+differentiated+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).</li>
<li>Derlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+%CE%B3-H2AX+and+53BP1+foci+in+peripheral+blood+lymphocytes+to+predict+subclinical+hematotoxicity+and+response+in+somatostatin+receptor-targeted+radionuclide+therapy+for+advanced+gastroenteropancreatic+neuroendocrine+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors.</a> Cancers (Basel). 13 (7), 1516(2021).</li>
<li>Djuzenova, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitivity+in+breast+cancer+assessed+by+the+histone+%CE%B3-H2AX+and+53BP1+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci.</a> Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).</li>
<li>Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+DNA+double-strand+breaks+-+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Analiza immunofluorescencyjna ognisk γH2AX i 53BP1 jest odpowiednią metodą oceny uszkodzeń genomu w jądrach międzyfazowych układu komórkowego. Procedura ta ma kilka krytycznych punktów, które mogą mieć wpływ na wynik eksperymentów, głównie środki stosowane w utrwalaniu i przepuszczalności, rodzaj przeciwciał i ich czynniki rozcieńczające oraz stężenie mutagenu.
Utrzymanie integralności białka ma fundamentalne znaczenie, ponieważ metoda immunofluorescencyjna zakłada identyfikację antygenów, któ...

Uszkodzenia DNA są stale indukowane przez czynniki, które mogą być endogenne, takie jak ROS generowane przez komórkowy metabolizm oksydacyjny, lub egzogenne, zarówno chemiczne, jak i fizyczne1. Do najbardziej szkodliwych zmian chorobowych należą pęknięcia dwuniciowe (DSB), które odgrywają zasadniczą rolę w przyczynianiu się do niestabilności genomu, ponieważ powodują aberracje chromosomowe, które z kolei mogą zainicjować proces karcynogenezy. W ten sposób komórki są wyposażone w złożone i wydajne mechanizmy naprawy DSBs2.
Gdy dochodzi do DSB, komórka uruchamia odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR), gdzie wraz z kompleksem MRE11/RAD50/NBS1 rekrutowane są kinazy ATM lub ATR do aktywacji innych białek, które spowalniają lub zatrzymują cykl komórkowy3. Istotnym celem tych kinaz jest histon H2AX, który jest fosforylowany na Ser-139 w ciągu kilku megazasad od DSB (a mianowicie γH2AX), umożliwiając w ten sposób rekrutację kilku czynników naprawczych, takich jak m.in. białko wiążące BRCA1 i p53 1 (53BP1)3. Później uruchamiana jest jedna ścieżka między rekombinacją homologiczną (HR), niehomologicznym łączeniem końców (NHEJ) lub wyżarzaniem jednoniciowym (SSA) w celu naprawy DSBs4,5. W związku z tym 53BP1 jest zaangażowany w dyktowanie wyboru między HR a NHEJ, głównie promując aktywację NHEJ, a nie HR6. Co więcej, zarówno ufosforylowana forma histonu H2AX, jak i 53BP1 mogą tworzyć ogniska w miejscach DSB. Ponieważ ogniska te utrzymują się do momentu przywrócenia integralności podwójnej nici, ocena pojawienia się/zaniku ognisk γH2AX lub 53BP1 w pewnym przedziale czasu jest uważana za użyteczną metodę oceny występowania i naprawy DSB w systemie komórkowym6,7. Jednakże, zgodnie z opisanymi powyżej procesami molekularnymi, ponieważ oczekuje się, że ogniska γH2AX i 53BP1 będą kolokalizować się w pobliżu DSB podczas DDR8,9, przydatne może być jednoczesne wykrycie obecności tych markerów w podwójnej immunofluorescencji.
Tak więc, celem tego manuskryptu było oszacowanie przydatności jednoczesnej kwantyfikacji ognisk γH2AX i 53BP1 do oceny uszkodzeń genomowych indukowanych w ludzkich limfocytach obwodowych przez radiomimetyczny czynnik bleomycynę. Korzystając z tej samej metodologii, podjęliśmy również próbę nakreślenia kinetyki naprawy DSB indukowanych bleomycyną zgodnie z wcześniej ustaloną procedurą eksperymentalną10.

<table><tbody><tr><td>AlexaFluor 568 kozia anty-mysia IgG (&gamma; 1)</td> Przeciwciało drugorzędowe <td>Invitrogen</td><td>A21124</td><td>53BP1</td></tr><tr><td>Bleoprim</td><td>Sanofi</td><td></td><td>Siarczan bleomycyny (mutagen)</td></tr> <tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny 100X</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td>antybiotyki do pożywki</td></tr><tr><td>hodowlanej PBS 10X</td><td>Termofisher</td><td>14200075</td><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td></tr><tr><td></td><td>FBS Euroclone</td><td>EC20180L</td><td>Płodowa surowica bydlęca do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated</td><td>Termofisher</td><td>#35552</td><td>&gamma; Przeciwciało drugorzędowe H2AX</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-53BP1</td><td>Merck</td><td>MAB 3802</td><td>53BP1 przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Labophot 2</td> Mikroskop <td>fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Histon H2AX (Ser139) przeciwciało królika</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td> <td># 2577</td> <td>i gamma; Przeciwciało pierwszorzędowe H2AX</td></tr><tr><td>Fitohemoaglutynina</td><td>Termofisher</td><td>R30852801</td><td>składnik pożywki</td></tr><tr><td>hodowlanej Przedłuż złoty odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>#8961</td><td>Roztwór zapobiegający blaknięciu z DAPI do barwienia przeciwdziałającego</td></tr><tr><td>barwieniu RPMI 1640</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td>Pożywka</td></tr><tr><td>hodowlana Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Niejonowy detergent do przepuszczalność</td></tr></tbody></table>

podwójna immunofluorescencja γh2ax i 53bp1 w ludzkich limfocytach obwodowych

Dual Immunofluorescence of &#947;H2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes

Pęknięcia podwójnej nici (DSB) są jednym z najpoważniejszych uszkodzeń, jakie mogą wystąpić w jądrach komórkowych, a jeśli nie zostaną naprawione, mogą prowadzić do poważnych skutków, w tym raka. Komórka jest zatem wyposażona w złożone mechanizmy naprawy DSB, a szlaki te obejmują histon H2AX w swojej fosforylowanej formie w Ser-139 (a mianowicie γH2AX) i białko wiążące p53 1 (53BP1). Ponieważ oba białka mogą tworzyć ogniska w miejscach DSB, identyfikacja tych markerów jest uważana za odpowiednią metodę badania zarówno DSB, jak i ich kinetyki naprawy. Zgodnie z procesami molekularnymi, które prowadzą do powstawania ognisk γH2AX i 53BP1, bardziej przydatne może być zbadanie ich kolokalizacji w pobliżu DSB w celu opracowania alternatywnego podejścia, które umożliwia ilościowe określenie DSB poprzez jednoczesne wykrycie dwóch markerów uszkodzenia DNA. W związku z tym protokół ten ma na celu ocenę uszkodzeń genomowych indukowanych w ludzkich limfocytach przez czynnik radiomimetyczny bleomycynę poprzez obecność ognisk γH2AX i 53BP1 w podwójnej immunofluorescencji. Korzystając z tej metodologii, określiliśmy również zmienność liczby ognisk γH2AX i 53BP1 w czasie, jako wstępną próbę zbadania kinetyki naprawy DSB indukowanych bleomycyną.

Dane uzyskane z analizy mikroskopowej fluorescencyjnej limfocytów obwodowych pozwalają na ocenę trzech głównych aspektów: skuteczności leczenia bleomycyną w zwiększaniu liczby ognisk γH2AX i 53BP1 (a tym samym liczby DSB) ze względu na jej efekt mutagenny, stopnia ko-lokalizacji obu rodzajów ognisk w miejscach DSB oraz przebiegu czasowego pojawiania się ognisk γH2AX i 53BP1 w celu określenia kinetyki naprawy pęknięć DSB indukowanych przez bleomycynę. Zgodnie z oczekiwaniami, zaobserwowano znacznie wyższą częstotliwość wy...

Ten protokół przedstawia metodę oceny powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA poprzez jednoczesne wykrywanie ognisk γH2AX i 53BP1 w jądrach interfazowych ludzkich limfocytów obwodowych traktowanych bleomycyną.

Podwójna immunofluorescencja γH2AX i 53BP1 w ludzkich limfocytach obwodowych

Double strand breaks (DSBs) are one of the most severe lesions that can occur in cell nuclei, and, if not repaired, they can lead to severe outcomes, ...

Celem pracy była ocena przydatności jednoczesnej kwantyfikacji ognisk Gamma H2AX i 53BP1 do oceny uszkodzeń genomowych indukowanych w ludzkich limfocytach obwodowych przez bleomycynę. Kilka czynników może powodować podwójne pęknięcia żył. Komórki są zatem wyposażone w kilka mechanizmów naprawczych, obejmujących zarówno Gamma H2AX, jak i białko wiążące 53 1, które mogą kolokalizować się w pobliżu pęknięcia podwójnej nici.Po pobraniu próbek krwi pełnej dodaj 300 mikrolitrów próbki do probówki zawierającej 4,7 mililitra kompletnej pożywki. Następnie dodaj pięć mikrogramów na mililitr końcowego stężenia siarczanu bleomycyny. Dla każdej próbki należy ustanowić kontrolę ujemną.Umieść rurkę w termostacie w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny. Odwirować próbki o sile 540 g przez pięć minut. Następnie dodaj pięć mililitrów roztworu hipotonicznego do osadu.Następnie dodaj 400 mikrolitrów roztworu wstępnego utrwalacza, aby wywołać hemolizę. Odwirować próbki o sile 540 G przez pięć minut, a następnie ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach metanolu w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut w celu utrwalenia komórek. Odwirować próbki o sile 540 G przez pięć minut, a następnie ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach roztworu utrwalającego.Powtórz ten krok jeszcze raz. Ponownie odwirować przy 540 G przez pięć minut, a następnie zasysać supernatant, pozostawiając wystarczającą ilość roztworu do ponownego zawieszenia osadu. Upuść zawieszone granulki komórek na szkiełka.Przygotować dwa roztwory zawierające przeciwciała pierwszorzędowe anty-Gamma H2AX i przeciwciała pierwszorzędowe anty-53BP1 rozpuszczone w roztworze blokującym. Następnie umyj szkiełka dwa razy w PBS 1X. Następnie trzymaj szkiełka przez 30 minut w roztworze blokującym.Do każdego szkiełka dodać 10 mikrolitrów każdego z dwóch roztworów zawierających przeciwciała pierwszorzędowe rozpuszczone w roztworze blokującym. Przykryj szkiełka parafilmem. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Po inkubacji wykonać trzy płukania w PBS 1X przez pięć minut. Przygotować dwa roztwory zawierające przeciwciała drugorzędowe DyLight 488 i Alexa Fluor 568 rozpuszczone w roztworze blokującym. Następnie dodać do każdego szkiełka 10 mikrolitrów każdego z dwóch roztworów zawierających przeciwciała drugorzędowe rozpuszczone w roztworze blokującym.Przykryj szkiełka parafilmem i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Po tej drugiej inkubacji wykonać trzy płukania w PBS 1X przez pięć minut. Dodaj 2,5 mikrolitra roztworu zapobiegającego blaknięciu z DAPI na szkiełka nakrywkowe przed montażem, aby przeciwdziałać plamom jąder.W celu oceny ognisk kinetycznych procedura jest taka sama, jak opisana obecnie. Ostatnią fazą jest obserwacja i kwantyfikacja ognisk. Limfocyty ludzkie bez ognisk Gamma H2AX i 53BP1 są pokazane w A, w B i C, pokazane są ludzkie limfocyty z różnymi ilościami ognisk Gamma H2AX i 53BP1.Obserwuje się niski poziom kolokalizacji ognisk. Zgodnie z oczekiwaniami, między nieleczonymi nieleczonymi komórkami obserwuje się bardzo wyższą częstość zarówno ognisk Gamma H2AX, jak i 53BP1. Obserwuje się również dużą różnicę w liczbie ognisk obu markerów.Przebieg czasowy ognisk Gamma H2AX i 53BP1 w czasie wykazał inne zachowanie, chociaż przyczyniają się do tej samej funkcji. Analiza ognisk Gamma, H2AX i 53BP1 ma możliwość oceny odpowiedzi komórkowej zarówno w kontekście ekspozycji, jak i patologii. Jednak podwójna immunofluorescencja Gamma H2AX i 53BP1 może prowadzić do niedoszacowania prawdziwej częstości tego zdarzenia.

dual-immunofluorescence-h2ax-53bp1-human-peripheral

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ilościowe oznaczanie pęknięć obu nici DNA z wykorzystaniem formowania γH2AX jako markera molekularnego stało się nieocenionym narzędziem w radiobiologii. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie testu immunofluorescencyjnego do ilościowego oznaczania ognisk γH2AX po narażeniu komórek na promieniowanie.

Ilościowe oznaczanie ognisk &gamma;H2AX w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące

Ilościowe oznaczanie pęknięć dwuniciowych DNA na podstawie ognisk γH2AX stało się nieocenionym narzędziem, szczególnie w radiobiologii, służącym do oceny radiowrażliwości tkanek oraz efektów związków modyfikujących działanie promieniowania. W niniejszym materiale demonstrujemy zastosowanie testu immunofluorescencyjnego do ilościowego oznaczania ognisk γH2AX w próbkach tkanek.

Ilościowe oznaczenie ognisk $\gamma$H2AX w próbkach tkanek

Analiza mikroskopowa ognisk γH2AX, które tworzą się po fosforylacji H2AX w Ser-139 w odpowiedzi na pęknięcia dwuniciowe DNA, stała się nieocenionym narzędziem w radiobiologii. W niniejszej pracy wykorzystaliśmy przeciwciało przeciwko monometylowanej histonie H3 w lizynie 4 jako marker epigenetyczny aktywnie transkrybowanej euchromatyny, aby ocenić przestrzenną dystrybucję powstawania indukowanych promieniowaniem ognisk γH2AX w jądrze komórkowym.

Ocena rozkładu przestrzennego $\gamma$H2AX po napromieniowaniu jonizującym

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii immunofluorescencyjnej do wykrywania specyficznych białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA zlokalizowanych w miejscach pęknięć dwuniciowych DNA w ludzkich komórkach jednojądrzastych. Białka są rozpoznawane przez specyficzne przeciwciała pierwszorzędowe, które z kolei wiążą się z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluoroforem, które fluoryzują podczas wizualizacji mikroskopowej, umożliwiając wizualizację białek jako odrębnych ognisk...

Mikroskopia immunofluorescencyjna do analizy pęknięć dwuniciowych DNA

Ten manuskrypt zawiera protokół do analizy pęknięć dwuniciowych DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej γH2AX i 53BP1.

Mikroskopia immunofluorescencyjna γH2AX i 53BP1 do analizy powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Reakcja na uszkodzenia DNA wywołana promieniowaniem, aktywowana przez wiązkę neutronów używaną w terapii wychwytywania neutronów borowych (BNCT), nie została w pełni ustalona. Protokół ten zapewnia procedurę krok po kroku do wykrywania ognisk indukowanych promieniowaniem (RIF) białek naprawczych poprzez barwienie immunofluorescencyjne w liniach komórkowych ludzkiego raka jelita grubego po napromieniowaniu wiązką zmieszaną z neutronami.

Obrazowanie immunofluorescencyjne uszkodzeń DNA i ognisk naprawczych w ludzkich komórkach raka jelita grubego

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Ten protokół przedstawia przygotowanie preparatu i automatyczną ocenę testu ognisk γ-H2AX na limfocytach krwi obwodowej. Aby zilustrować metodę i czułość testu, izolowane limfocyty napromieniano in vitro. Ta zautomatyzowana metoda wykrywania DNA DSB jest przydatna w szybkich i wysokowydajnych zastosowaniach dozymetrii biologicznej.

Zautomatyzowana mikroskopowa metoda oceny ognisk γ-H2AX w ludzkich limfocytach krwi obwodowej

Tutaj prezentujemy prosty i szybki protokół wykrywania oddziaływań białek w miejscach uszkodzenia DNA.

Test ligandów zbliżeniowych do lokalizacji białek w miejscach uszkodzenia DNA

Poznaj metodę podwójnej immunofluorescencji γH2AX i 53BP1 w ludzkich limfocytach obwodowych do oceny uszkodzeń DNA indukowanych bleomycyną. Ta technika pozwala ilościowo analizować odpowiedź komórkową na uszkodzenia genomu.

Podwójna immunofluorescencja γH2AX i 53BP1 w ludzkich limfocytach obwodowych

Przeglądaj więcej filmów