Podwójna immunofluorescencja γH2AX i 53BP1 w ludzkich limfocytach obwodowych
14 lipca 2023
Ten protokół przedstawia metodę oceny powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA poprzez jednoczesne wykrywanie ognisk γH2AX i 53BP1 w jądrach interfazowych ludzkich limfocytów obwodowych traktowanych bleomycyną.
Celem pracy była ocena przydatności jednoczesnej kwantyfikacji ognisk Gamma H2AX i 53BP1 do oceny uszkodzeń genomowych indukowanych w ludzkich limfocytach obwodowych przez bleomycynę. Kilka czynników może powodować podwójne pęknięcia żył. Komórki są zatem wyposażone w kilka mechanizmów naprawczych, obejmujących zarówno Gamma H2AX, jak i białko wiążące 53 1, które mogą kolokalizować się w pobliżu pęknięcia podwójnej nici.
Po pobraniu próbek krwi pełnej dodaj 300 mikrolitrów próbki do probówki zawierającej 4,7 mililitra kompletnej pożywki. Następnie dodaj pięć mikrogramów na mililitr końcowego stężenia siarczanu bleomycyny. Dla każdej próbki należy ustanowić kontrolę ujemną.
Umieść rurkę w termostacie w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny. Odwirować próbki o sile 540 g przez pięć minut. Następnie dodaj pięć mililitrów roztworu hipotonicznego do osadu.
Następnie dodaj 400 mikrolitrów roztworu wstępnego utrwalacza, aby wywołać hemolizę. Odwirować próbki o sile 540 G przez pięć minut, a następnie ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach metanolu w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 minut w celu utrwalenia komórek. Odwirować próbki o sile 540 G przez pięć minut, a następnie ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach roztworu utrwalającego.
Powtórz ten krok jeszcze raz. Ponownie odwirować przy 540 G przez pięć minut, a następnie zasysać supernatant, pozostawiając wystarczającą ilość roztworu do ponownego zawieszenia osadu. Upuść zawieszone granulki komórek na szkiełka.
Przygotować dwa roztwory zawierające przeciwciała pierwszorzędowe anty-Gamma H2AX i przeciwciała pierwszorzędowe anty-53BP1 rozpuszczone w roztworze blokującym. Następnie umyj szkiełka dwa razy w PBS 1X. Następnie trzymaj szkiełka przez 30 minut w roztworze blokującym.
Do każdego szkiełka dodać 10 mikrolitrów każdego z dwóch roztworów zawierających przeciwciała pierwszorzędowe rozpuszczone w roztworze blokującym. Przykryj szkiełka parafilmem. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.
Po inkubacji wykonać trzy płukania w PBS 1X przez pięć minut. Przygotować dwa roztwory zawierające przeciwciała drugorzędowe DyLight 488 i Alexa Fluor 568 rozpuszczone w roztworze blokującym. Następnie dodać do każdego szkiełka 10 mikrolitrów każdego z dwóch roztworów zawierających przeciwciała drugorzędowe rozpuszczone w roztworze blokującym.
Przykryj szkiełka parafilmem i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Po tej drugiej inkubacji wykonać trzy płukania w PBS 1X przez pięć minut. Dodaj 2,5 mikrolitra roztworu zapobiegającego blaknięciu z DAPI na szkiełka nakrywkowe przed montażem, aby przeciwdziałać plamom jąder.
W celu oceny ognisk kinetycznych procedura jest taka sama, jak opisana obecnie. Ostatnią fazą jest obserwacja i kwantyfikacja ognisk. Limfocyty ludzkie bez ognisk Gamma H2AX i 53BP1 są pokazane w A, w B i C, pokazane są ludzkie limfocyty z różnymi ilościami ognisk Gamma H2AX i 53BP1.
Obserwuje się niski poziom kolokalizacji ognisk. Zgodnie z oczekiwaniami, między nieleczonymi nieleczonymi komórkami obserwuje się bardzo wyższą częstość zarówno ognisk Gamma H2AX, jak i 53BP1. Obserwuje się również dużą różnicę w liczbie ognisk obu markerów.
Przebieg czasowy ognisk Gamma H2AX i 53BP1 w czasie wykazał inne zachowanie, chociaż przyczyniają się do tej samej funkcji. Analiza ognisk Gamma, H2AX i 53BP1 ma możliwość oceny odpowiedzi komórkowej zarówno w kontekście ekspozycji, jak i patologii. Jednak podwójna immunofluorescencja Gamma H2AX i 53BP1 może prowadzić do niedoszacowania prawdziwej częstości tego zdarzenia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę oceny powstawania i naprawy pęknięć obu nici DNA poprzez jednoczesną detekcję ognisk γH2AX i 53BP1 w jądrach w fazie interfazy limfocytów obwodowych człowieka traktowanych bleomycyną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Genomika
Wstęp
- Pęknięcia obu nici DNA mogą być indukowane przez różne czynniki.
- Komórki posiadają wiele mechanizmów naprawy uszkodzeń DNA.
- γH2AX i 53BP1 to kluczowe białka uczestniczące w naprawie DNA.
- Kolokalizacja tych białek zachodzi w pobliżu pęknięć obu nici.
Cel badania
- Ocena przydatności jednoczesnego oznaczania ognisk γH2AX i 53BP1.
- Ocena uszkodzeń genomu w ludzkich limfocytach obwodowych.
- Zrozumienie wpływu bleomycyny na integralność DNA.
Zastosowane metody
- Od osób badanych pobiera się próbki krwi pełnej.
- Próbki poddaje się działaniu siarczanu bleomycyny.
- Do porównania przygotowuje się kontrole negatywne.
- W jądrach w fazie interfazy przeprowadza się detekcję ognisk γH2AX i 53BP1.
Główne wyniki
- Możliwe jest jednoczesne wykrywanie ognisk γH2AX i 53BP1.
- Traktowanie bleomycyną prowadzi do mierzalnych uszkodzeń DNA.
- Ilościowe oznaczenie ognisk koreluje z zakresem uszkodzeń genomu.
- Wyniki potwierdzają przydatność tej metody do oceny mechanizmów naprawy DNA.
Wnioski
- Protokół skutecznie ocenia powstawanie i naprawę pęknięć obu nici DNA.
- Jednoczesna detekcja γH2AX i 53BP1 dostarcza cennych informacji.
- Metoda ta może być stosowana w różnych badaniach nad uszkodzeniami i naprawą DNA.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe wykrywanie markerów pęknięć dwuniciowych (DSB) DNA, γH2AX i 53BP1 w limfocytach ludzkich, umożliwia precyzyjną ocenę uszkodzeń genomu oraz kinetyki ich naprawy. To podwójne podejście immunofluorescencyjne zwiększa wiarygodność prognostyczną wczesnego screeningu genotoksyczności oraz mechanistycznej oceny ryzyka dla związków kandydackich. Integracja tych odczytów na etapie odkrywania wspiera decyzje dotyczące portfela projektów w oparciu o analizę ryzyka oraz zapewnia ciągłość translacyjną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę szlaków odpowiedzi na uszkodzenia DNA w komórkach ludzkich.
- Wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka poprzez kwantyfikację indukcji DSB oraz kinetyki naprawy.
- Ułatwia walidację funkcjonalną celów zaangażowanych w stabilność genomu.
- Zwiększa pewność predykcyjną w zakresie potencjału genotoksycznego związków wiodących.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany system ilościowego oznaczania markerów uszkodzeń DNA w pierwotnych komórkach ludzkich.
- Umożliwia uzyskanie powtarzalnych, ilościowych wyników dla pęknięć dwuniciowych (DSB) indukowanych przez związki chemiczne.
- Wspiera standaryzację testu w celu wysokoprzepustowego przesiewu (high-content screening) modulatorów uszkodzeń DNA.
- Ułatwia wiarygodną ocenę profili bezpieczeństwa związków w badaniach przesiewowych na wczesnym etapie.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia kwantyfikację markerów uszkodzeń DNA ze strategiami biomarkerów translacyjnych.
- Wspiera ciągłość procesu od odkryć in vitro do przedklinicznej oceny bezpieczeństwa.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój kandydatów o korzystnych profilach naprawy DNA.
- Zapewnia wgląd mechanistyczny w odpowiedzi komórkowe istotne dla choroby i terapii.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda podwójnej immunofluorescencji sytuuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając opartą na hipotezach ocenę uszkodzeń i naprawy DNA w limfocytach ludzkich.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie ognisk markerów DSB w celu wyjaśnienia zaangażowania szlaków naprawy DNA i ograniczania ryzyka biologicznego.
- Przesiewy: Dostarczanie powtarzalnych, ilościowych wyników do profilowania genotoksyczności związków.
- Analityka: Zapewnianie pomiarów czasowych ognisk γH2AX i 53BP1 do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Przenoszenie wyników in vitro do przedklinicznych strategii biomarkerowych w zakresie odpowiedzi na uszkodzenia DNA.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanowienie platformy wielokrotnego użytku do oceny uszkodzeń DNA w ramach programów odkrywczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w ocenie uszkodzeń DNA.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje kwantyfikację markerów DSB w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji dla decyzji go/no-go i zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach badań genotoksyczności.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia ustalanie priorytetów kandydatów w oparciu o skorygowane ryzyko na podstawie profili naprawy DNA.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w zakresie mikroskopii immunofluorescencyjnej oraz ilościowej analizy obrazów.
- Konieczny jest dostęp do zwalidowanych przeciwciał oraz infrastruktury do obrazowania fluorescencyjnego.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów przygotowania próbek i kwantyfikacji pomiędzy zespołami.
- Możliwa może być konieczność adaptacji metody dla różnych typów komórek lub systemów modelowych.
- Istnieje ryzyko niedoszacowania rzeczywistej częstotliwości DSB ze względu na ograniczenia ko-lokalizacji markerów.
