Generowanie linii komórkowych nokautujących związanych z centromerem Protein-E CENP-E^-/- przy użyciu systemu CRISPR/Cas9

Genetyczna delecja Kinesin-7 i CENP zwykle powoduje zatrzymanie cyklu komórkowego i śmierć komórki. Budowa stabilnych linii komórkowych z nokautem CENP jest ważnym, nierozwiązanym zagadnieniem w biologii CENP. W tym badaniu wygenerowaliśmy komórki HeLa z nokautem CENP przy użyciu systemu CRISPR/Cas9 i ustaliliśmy trzy zoptymalizowane strategie badań przesiewowych.

Ostatnio kilka technologii edycji genomu, w tym nukleazy palców cynkowych, nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji i sposób, w jaki wytwarzamy nasze nukleazy, zostało zmodyfikowanych tak, aby rozszczepiać genomy o określonym rozmiarze. Technologia nokautu genów CRISPR/Cas9 zrewolucjonizowała podstawy biologii, biotechnologii i medycyny. CENP jest niezbędny do przyłączania kinetochorów do mikrotubul i wyrównywania chromosomów.

Zakłócenie CENP, czy to poprzez mikroiniekcję przeciwciał, delecję sgRNA, hamowanie chemiczne czy delecję genetyczną, powoduje niewspółosiowość chromosomów, defekty mitotyczne i często śmierć komórki, komplikując badanie mechanizmów białka CENP. W tym badaniu ustalono trzy zoptymalizowane strategie przesiewowe oparte na fenotypie, w tym badania przesiewowe kolonii komórkowych, wyrównanie chromosomów fenotypów oraz intensywność fluorescencji białek CENP, co poprawiło skuteczność badań przesiewowych i wskaźnik sukcesu eksperymentu. Co ważne, delecja CENP powoduje niewspółosiowość chromosomów, nieprawidłową lokalizację białek BubR1 i defekty mitotyczne.

Tryby interakcji i mechanizmy molekularne CENP i jego inhibitorów są ważnymi dziedzinami badawczymi w biologii komórki i badaniach nad rakiem. W tym badaniu linia komórkowa HeLa z nokautem CENP została uznana za cenne narzędzie do walidacji swoistości i toksyczności inhibitorów CENP. Na początek dodaj 0,25% roztwór trypsyny EDTA do komórek HeLa i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do trzech minut.

Delikatnie rozdzielić komórki przez pipetowanie i umieścić je w nowych płytkach w stosunku 1:4 do przejścia komórkowego. Aby transfekować plazmid do komórek HeLa, wymieszaj jeden mikrogram zwalidowanego plazmidu PX 4 58 sgRNA z 50 mikrolitrami zredukowanej pożywki surowicy w probówce A.In probówce B, delikatnie wymieszaj dwa mikrolitry odczynnika do transfekcji i 50 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie połącz zawartość z probówek A i B i inkubuj w temperaturze pokojowej przez kolejne pięć minut.

Dodaj mieszaninę do 12-dołkowej płytki i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin. Pod koniec inkubacji zastąp pożywkę świeżą pożywką DMEM. Po 24 lub 48 godzinach oceń skuteczność transfekcji, badając komórki HeLa pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Całkowicie zdysocjuj transfekowane komórki HeLa za pomocą 0,25% trypsyny EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut. Następnie policz komórki za pomocą komory Neubauera lub automatycznego licznika komórek. Umieścić komórki na trzech oddzielnych 96-dołkowych płytkach dla każdej transfekowanej populacji, stosując metody seryjnego rozcieńczania.

Umieść komórki z powrotem w nawilżonym inkubatorze na jeden do dwóch tygodni. W celu przeprowadzenia badań przesiewowych opartych na fenotypie i walidacji nokautu CENP-E, należy zdysocjować i roznręczyć komórki na płytkach 24-dołkowych lub 12-dołkowych przez pięć do siedmiu dni. Przesiewaj zmutowane komórki o mniejszych średnicach kolonii za pomocą odwróconego mikroskopu z soczewkami obiektywowymi o 10-krotnym i 20-krotnym powiększeniu.

Następnie zbierz komórki do ekstrakcji DNA, używając zestawu do ekstrakcji genomowego DNA zwierząt kolumnowych zgodnie z instrukcjami producenta i ustaw reakcje łańcuchowe polimerazy. Zligować docelowe DNA do wektora pMD18-T zgodnie z zaleceniami protokołów producenta. Transfekować ligowany plazmid do właściwych komórek DH5-alfa i kontynuować hodowlę w celu selekcji klonów.

Aby zidentyfikować rodzaje nokautów CENP-E, należy wyizolować DNA plazmidu za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidu zgodnie z wytycznymi producenta. Następnie przeprowadź sekwencjonowanie Sangera dla plazmidowego DNA każdej kolonii przy użyciu starterów M13 do przodu i do tyłu. Zasiaj komórki HeLa typu dzikiego i zmutowane CENP-E na 12-milimetrowych szklanych szkiełkach nakrywkowych na 24-dołkowej płytce.

Usuń całe podłoże DMEM i utrwal komórki za pomocą 4% roztworu paraformaldehydu i PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie wybarwić jądra DAPI w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Obserwuj i weryfikuj zmutowane komórki CENP-E w oparciu o fenotyp dopasowania chromosomów za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Fenotypowe badania przesiewowe kolonii wykazały, że komórki nokautujące CENP-E wykazywały zwiększoną niewspółosiowość chromosomów w porównaniu z grupą kontrolną. Na początek weź płytkę z komórkami HeLa typu dzikiego i zmutowanymi CENP-E rosnącymi na szkiełku nakrywkowym. Utrwal komórki za pomocą 4% roztworu paraformaldehydu i utrwalacza PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Następnie zanurz się w PBS na dwie rundy po pięć minut każda. Następnie przepuszczaj komórki za pomocą 0,25% Triton X-100 i PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Zanurz je w PBS na dwie rundy po pięć minut każda.

Kontynuuj blokowanie komórek za pomocą 1%BSA PBS z 0,1%Tween 20 w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała w 1% BSA i PBST i inkubować próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 godzin. Odrzuć roztwory przeciwciał pierwotnych, a następnie przepłucz komórki trzy razy przez pięć minut każda PBS.

Dodaj rozcieńczone przeciwciała drugorzędowe do komórki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie wyrzuć przeciwciała drugorzędowe, a następnie przepłucz komórki PBS trzy razy przez pięć minut każda. Wybarwić jądra za pomocą DAPI w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Zamontuj prowadnice za pomocą medium montażowego i uszczelnij je lakierem do paznokci. Obserwuj obrazy fluorescencyjne za pomocą skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw z aperturą numeryczną o powiększeniu 63x i 1,40 i zapisuj je do dalszej analizy. Barwienie immunofluorescencyjne grup kontrolnych i grup z mutacją CENP-E wykazało, że intensywność fluorescencji białek CENP-E została całkowicie znokautowana w komórkach klonu 1 z mutacją CENP-E i znacznie zmniejszona w komórkach klonu 3 z mutacją CENP-E.

Proporcje komórek metafazowych z niewspółosiowością chromosomów zwiększają się w klonach 1 i 3 w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Tymczasem proporcje komórek metafazy znacznie wzrosły w komórkach klonu 1 i komórkach klonu 3. Ponadto stosunek komórek interfazowych nieznacznie wzrósł w grupach klonów 1 i 3 po delecji CENP-E w porównaniu z grupą kontrolną.

Wskaźniki komórek profazy, anafazy i telofazy były nieznacznie zmniejszone po delecji CENP-E, podczas gdy wskaźniki komórek metafazy wzrosły po delecji CENP-E. Na początek weź hodowle komórek HeLa typu dzikiego i zmutowanego CENP-E i dodaj 300 nanomolowych kolchicyny przed inkubacją przez pięć godzin. Następnie inkubuj komórki z 0,25% trypsyną EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty i zbierz komórki do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych.

Następnie odwirować komórki w temperaturze 1000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatanty i dodać 1,2 mililitra 0,075 molowego roztworu chlorku potasu. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Pod koniec inkubacji odwirować komórki, odrzucić supernatant i dodać 0,2 mililitra roztworu utrwalającego w celu wstępnego utrwalenia. Mieszaj delikatnie przez jedną minutę, a następnie zbierz granulki komórek, jak pokazano wcześniej, i dodaj 1,5 mililitra roztworu utrwalającego w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po odwirowaniu komórek i odrzuceniu supernatantu dodać 0,6 mililitra roztworów utrwalających, aby utworzyć zawiesinę komórek.

Ostrożnie upuść trzy do pięciu kropel zawiesin komórkowych o głębokości od 35 do 40 centymetrów na zjeżdżalnie lodowe. Natychmiast wysuszyć szkiełka za pomocą lampy alkoholowej i zabarwić je 10% roztworem podtrzymującym Giemsa przez siedem minut. Płucz szkiełka bieżącą wodą przez dwie minuty, a następnie badaj próbki za pomocą mikroskopu świetlnego wyposażonego w obiektyw Plan Fluor o powiększeniu 40x, aperturze numerycznej 0,75.

Analiza kariotypu wykazała zmniejszoną liczbę chromosomów w komórkach HeLa z mutacją CENP-E w porównaniu z komórkami typu dzikiego.