Name: Generowanie linii komórkowych nokautujących związanych z centromerem Protein-E CENP-E-/- przy użyciu systemu CRISPR/Cas9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Poznaj generowanie linii komórkowych nokautujących CENP-E w komórkach HeLa przy użyciu CRISPR/Cas9. Zoptymalizowane strategie przesiewania pozwalają badać specyficzność i toksyczność inhibitorów CENP-E w badaniach nad rakiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom Laboratorium Cytoszkieletu na Uniwersytecie Medycznym Fujian za pomocne dyskusje. Dziękujemy Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin i Min-Xia Wu z Publicznego Centrum Obsługi Technologii Uniwersytetu Medycznego Fujian za ich pomoc techniczną. Dziękujemy Si-Yi Zheng, Ying Lin i Qi Ke z Eksperymentalnego Centrum Nauczania Podstawowych Nauk Medycznych na Uniwersytecie Medycznym Fujian za ich wsparcie. Badanie to było wspierane przez następujące granty: Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych Chin (numer grantu 82001608 i 82101678), Fundacja Nauk Przyrodniczych prowincji Fujian w Chinach (numer grantu 2019J05071), Wspólne Fundusze na rzecz Innowacji w Nauce i Technologii w prowincji Fujian w Chinach (numer grantu 2021Y9160) oraz projekt finansowania start-upów w zakresie talentów naukowych Uniwersytetu Medycznego Fujian (numer grantu XRCZX2017025).

1. Konstrukcja wektorów do wyciszania genów CRISPR/Cas9
<ol>
	<li>Wybierz docelową sekwencję genomowego DNA w ludzkim genie CENP-E (numer dostępu GenBank NM_001286734.2) i zaprojektuj sgRNA za pomocą internetowego narzędzia do projektowania CRISPR (http://crispor.tefor.net/).</li>
	<li>Wprowadź pojedynczą sekwencję genomową, wybierz genom „Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNPs): dbSNP148” oraz motyw sąsiedztwa protospacera „20 bp-NGG-spCas9”. Wybierz dwie sekwencje przewodnie, w tym sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' oraz sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3', na podstawie wyników specyficzności50, przewidywanej wydajności10 oraz minimalnej liczby efektów off-target.</li>
	<li>Zamów i zsyntetyzuj jednoniciowe oligonukleotydy DNA (ssODN). Rozcieńcz ssODN w ddH2O do końcowego stężenia 100 µM. Aby sfosforylować i zhybrydyzować oligos sgRNA, dodaj do probówki do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) 1 µL oligosu bezpośredniego (forward), 1 µL oligosu odwrotnego (reverse), 0,5 µL kinazy polinukleotydowej T4, 1 µL buforu do kinazy polinukleotydowej T4 oraz 6,5 µL wody wolnej od RNaz; inkubuj probówkę w 37 °C przez 30 min, w 95 °C przez 5 min, a następnie stopniowo obniżaj temperaturę do 25 °C w tempie 5 °C min-1.</li>
	<li>Przetraw plazmid pX458 przy użyciu enzymu restrykcyjnego Bbs<img alt="Diagram równowagi statycznej, ΣFx=0, pokazuje równowagę przy użyciu systemu dźwigni i wektorów siły." src="/files/ftp_upload/65476/65476eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">. Do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL dodaj 1 µg plazmidu pX458, 2 µL buforu G (10x), 1 µL Bbs<img alt="Diagram równowagi statycznej, ΣFx=0, pokazuje równowagę przy użyciu systemu dźwigni i wektorów siły." src="/files/ftp_upload/65476/65476eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> i uzupełnij ddH2O wolnym od RNaz do objętości 20 µL. Inkubuj probówkę w 37 °C przez 2 h. Następnie oczyść liniowy plazmid za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA z żelu kolumnowego zgodnie z protokołami producenta.</li>
	<li>Liguj oligos sgRNA w plazmid pX458 (plazmid pSpCas9(BB)-2A-green fluorescent protein (GFP), Addgene ID 48138). Do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL dodaj 1 µL zhybrydyzowanych oligonukleotydów, 25 ng liniowego plazmidu, 1 µL buforu do ligacji DNA T4 (10x) oraz 0,5 µL ligazy DNA T4 (350 U/µL) i uzupełnij ddH2O do objętości 10 µL. Inkubuj roztwór ligacyjny w 16 °C przez 2 h.</li>
	<li>Inkubuj 10 µL skonstruowanego plazmidu z kompetentnymi komórkami DH5α na lodzie przez 30 min, poddaj szokowi termicznemu w 42 °C przez 45 s, a następnie natychmiast umieść na lodzie na 5 min. Dodaj 500 µL pożywki Luria-Bertani (LB) i wysiej komórki na płytkę LB zawierającą ampicylinę (100 µg/mL). Inkubuj w 37 °C przez 16 h i wyselekcjonuj klony oporne.</li>
	<li>Wybierz od 5 do 10 pojedynczych kolonii za pomocą wysterylizowanego końcówki pipety i przenieś je do 1 mL hodowli w pożywce LB z ampicyliną (100 µg/mL). Inkubuj hodowlę w 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 180 rpm przez 12-16 h.</li>
	<li>Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidów zgodnie z protokołami producenta. Zweryfikuj plazmidowe DNA każdej kolonii poprzez sekwencjonowanie metodą Sangera z miejsca promotora U6 przy użyciu primera U6-Fwd 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3'.</li>
	<li>Wyekstrahuj i oczyść plazmidy za pomocą zestawu do izolacji plazmidowego DNA wolnego od endonukleaz (endo-free) zgodnie z protokołami producenta.</li>
</ol>
2. Transfekcja, izolacja i przesiewanie komórek HeLa z nokautem genu CENP-E
<ol>
	<li>Hodować komórki HeLa w podłożu DMEM (Dulbecco Modified Eagle's Medium) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny/streptomycyny w inkubatorze z nawilżaczem w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.</li>
	<li>Inkubować komórki HeLa z zastosowaniem 0,25% trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w temperaturze 37 °C przez 2-3 min, rozdzielić komórki poprzez delikatne pipetowanie, a następnie wysiać komórki na nowe płytki w stosunku rozcieńczenia 1:4 w celu pasażowania komórek.</li>
	<li>Wysiać komórki na płytkę 12-dołkową i hodować do osiągnięcia 60-70% konfluencji przed transfekcją. Transfekować plazmidy pX458-sgRNA do komórek HeLa przy użyciu wymienionych odczynników zgodnie z protokołami producenta (patrz: Tabela Materiałów).
	<ol>
		<li>Delikatnie zmieszać 1 µg zwalidowanego plazmidu pX458-sgRNA i 50 µL podłoża z obniżoną zawartością surowicy w probówce A. Następnie delikatnie zmieszać 2 µL odczynnika do transfekcji i 50 µL podłoża z obniżoną zawartością surowicy w probówce B. Inkubować probówki A i B oddzielnie w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
		<li>Delikatnie zmieszać zawartość probówki A i probówki B i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Dodać mieszaninę do płytki 12-dołkowej, inkubować komórki przez 6 h, a następnie wymienić podłoże na świeże podłoże DMEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocenić wydajność transfekcji komórek HeLa po 24 h lub 48 h za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Po 48 h od transfekcji całkowicie rozdzielić transfektowane komórki HeLa przy użyciu 0,25% trypsyny/EDTA w temperaturze 37 °C przez 3-5 min, policzyć liczbę komórek za pomocą komory Neubauera lub automatycznego licznika komórek i wysiać komórki na trzy oddzielne płytki 96-dołkowe dla każdej transfektowanej populacji zgodnie z metodami rozcieńczeń seryjnych10.</li>
	<li>Przenieść komórki do inkubatora z nawilżaczem, a następnie hodować przez kolejne 1-2 tygodnie. Wymieniać podłoże hodowlane raz na 3 dni. W celu przesiewania opartego na fenotypie i walidacji nokautu CENP-E, rozdzielić i namnożyć komórki na płytkach 24-dołkowych lub 12-dołkowych przez 5-7 dni.</li>
	<li>Przesiewać komórki mutanty o mniejszych średnicach kolonii komórkowych za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektywy 10x i 20x. 
	UWAGA: Mutacje w genie CENP-E zazwyczaj prowadzą do znacznego wzrostu liczby dzielących się komórek w koloniach, co może być jednym z kluczowych wskaźników podczas przesiewania komórek mutantów CENP-E.</li>
	<li>Zebrać komórki do ekstrakcji DNA przy użyciu kolumnowego zestawu do ekstrakcji genomowego DNA zwierzęcego zgodnie z protokołami producenta. Przygotować reakcje PCR w następujący sposób: 0,25 µL polimerazy Taq, 5 µL buforu 10x (Mg2+ plus), 4 µL mieszaniny dNTP, 500 ng matrycy DNA, 1 µL oligonukleotydu forward, 1 µL oligonukleotydu reverse i uzupełnić ddH2O do objętości 50 µL. Do amplifikacji genu zastosować następujące ustawienia programu PCR: 98 °C, 10 s; 98 °C, 10 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 60 s przez 33 cykle; 72 °C, 10 min, a następnie utrzymać w 4 °C. 
	UWAGA: Specyficzne primery do klonowania locus docelowego są następujące: CENP-E target F1, 5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'; CENP-E target R1, 5'-AGATCTCCGATCCTCCCCTGTC-3'; CENP-E target F2, 5'-TGGTAACTGCATTTTGGTGTTCTAC-3'; CENP-E target R2, 5'-CCTGTTGCAACGTGAGGGAAG-3'.</li>
	<li>Zligować docelowe DNA do wektora pMD18-T zgodnie z protokołami producenta. Transfekować zligowany plazmid do kompetentnych komórek DH5α i hodować w celu selekcji klonów.</li>
	<li>Przeprowadzić sekwencjonowanie metodą Sangera, aby określić typy nokautu CENP-E. Izolować plazmidowe DNA przy użyciu zestawu do ekstrakcji plazmidów zgodnie z protokołami producenta. Wykonać sekwencjonowanie Sangera DNA plazmidowego każdej kolonii przy użyciu primerów M13 forward i reverse. Primer M13F, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'; primer M13R, 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'.</li>
	<li>Wysiać odpowiednio komórki HeLa typu dzikiego oraz mutanty CENP-E na szklane okrycie o średnicy 12 mm w płytce 24-dołkowej. Usunąć pełne podłoże DMEM i utrwalić komórki w 4% roztworze fiksacyjnym paraformaldehydu w soli fosforanowej (PBS) w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
	<li>Barwić jądra roztworem 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) w temperaturze pokojowej przez 5 min. Przesiewać i walidować komórki mutanty CENP-E na podstawie fenotypu ustawienia chromosomów za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw Plan Fluor 40x/ Apertura Numeryczna (NA) 0,75.</li>
	<li>Przesiewać i walidować komórki z nokautem CENP-E za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i analizy (patrz sekcja 3) białek CENP-E.</li>
</ol>
3. Barwienie immunofluorescencyjne i konfokalna mikroskopia wysokiej rozdzielczości
<ol>
	<li>Utrwalone komórki w 4% roztworze paraformaldehydu w PBS w temperaturze pokojowej przez 10 min, a następnie zanurzono je w 1x PBS (2 x 5 min). 
	UWAGA: Należy upewnić się, że komórki są w dobrym stanie; proces zbierania i utrwalania komórek musi przebiegać delikatnie, aby zapobiec odrywaniu się komórek w stadium metafazy.</li>
	<li>Przepuszczalność błon komórkowych zwiększono, stosując 0,25% Triton X-100 w PBS w temperaturze pokojowej przez 10 min, po czym komórki zanurzono w 1x PBS (2 x 5 min).</li>
	<li>Komórki zablokowano, stosując 1% BSA w PBST (0,1% Tween 20 w PBS) w temperaturze pokojowej przez 1 h. Przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczono w 1% BSA w PBST, a następnie inkubowano próbki w temperaturze 4 °C przez 12 h.</li>
	<li>Roztwory przeciwciał pierwszorzędowych usunięto, komórki przemyto 3 x 5 min w 1x PBS, a następnie inkubowano je z rozcieńczonymi przeciwciałami wtórnymi w temperaturze pokojowej przez 2 h.</li>
	<li>Przeciwciała wtórne usunięto i przemyto komórki w 1x PBS (3 x 5 min).</li>
	<li>Jądra komórkowe barwiono DAPI w temperaturze pokojowej przez 5 min. Preparaty zamknięto za pomocą medium montażowego i zabezpieczono lakierem do paznokci.</li>
	<li>Obserwację i rejestrację obrazów fluorescencyjnych przeprowadzono przy użyciu skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw 63x/NA 1,40.</li>
</ol>
4. Przygotowanie chromosomów i analiza kariotypu
<ol>
	<li>Kulturować komórki HeLa typu dzikiego oraz CENP-E-/- w pełnej pożywce DMEM uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny przez 24 h, a następnie inkubować komórki HeLa typu dzikiego i CENP-E-/- z 300 nM kolchicyną przez 5 h.</li>
	<li>Inkubować komórki z 0,25% trypsyną/EDTA w temperaturze 37 °C przez 3 min i zebrać komórki do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 mL.</li>
	<li>Wirować komórki przy 1 000 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej, odlać nadsączniki, dodać 1,2 mL roztworu KCl o stężeniu 0,075 mol/L i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 min.</li>
	<li>Wirować komórki przy 1 000 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej, odlać nadsączniki, dodać 0,2 mL roztworu utrwalającego (metanol: octowy kwas lodowaty = 3:1) do przedutrwalenia i delikatnie mieszać przez 1 min.</li>
	<li>Wirować komórki przy 1 000 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej, zebrać osady, dodać 1,5 mL roztworu utrwalającego w temperaturze pokojowej na 10 min, a następnie wirować przy 1 000 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odlać nadsączniki, dodać 0,6 mL roztworów utrwalających i przygotować zawiesinę komórkową. Nanieść 3-5 kropli zawiesiny komórkowej z wysokości 35-40 cm na szkiełka lodowe. 
	UWAGA: Należy zachować wysokość 35-40 cm podczas nanoszenia zawiesin komórkowych na szkiełka; w przeciwnym razie chromosomy mogą być zbyt rozproszone lub nie odseparowane od siebie.</li>
	<li>Niezwłocznie wysuszyć szkiełka lampą alkoholową, zabarwić próbki 10% roztworem barwiącym Giemsy przez 7 min, płukać szkiełka pod bieżącą wodą przez 2 min i obserwować próbki za pomocą mikroskopu świetlnego wyposażonego w obiektyw Plan Fluor 40x/NA 0,75.</li>
</ol>
5. Test tworzenia kolonii komórkowych
<ol>
	<li>Przygotować zawiesiny komórkowe w płytkach 6-dołkowych przy gęstości 1 000-2 000 komórek/dołek. Delikatnie wstrząsnąć płytkami, aby równomiernie rozprzestrzenić komórki.</li>
	<li>Umieścić płytki 6-dołkowe w inkubatorze CO2 i inkubować przez 2-3 tygodnie w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Wymieniać pożywkę hodowlaną raz na 5 dni. Rejestrować obrazy za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektywy 10x i 20x. Zebrać komórki, gdy pojawią się widoczne kolonie (setki komórek w obrębie jednego klonu).</li>
	<li>Aby zbadać działanie GSK923295, hodować komórki w płytkach 6-dołkowych przez 24 h, a następnie dodać 2 mL GSK923295 w końcowych stężeniach 10, 25, 50, 100 i 200 nM. 
	UWAGA: Nie przesuwać naczynia hodowlanego na wczesnym etapie tworzenia się klonów, aby uniknąć odrywania się komórek, co może prowadzić do powstawania nowych klonów i wpływać na przesiewanie komórek transfekowanych.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną i utrwalić komórki 1% PFA w temperaturze pokojowej przez 10 min. Barwić kolonie 0,1% roztworem fioletu krystalicznego w temperaturze pokojowej przez 15 min. Płukać próbki 1x PBS trzykrotnie. Rejestrować obrazy kolonii komórkowych i wyznaczyć średnice każdej kolonii za pomocą oprogramowania ImageJ. Wybrać narzędzie zaznaczania Straight line , kliknąć Analyze, wybrać Measure i zapisać długość.</li>
	<li>Płukać kolonie 1 mL 10% roztworem kwasu octowego przez 5 min. Przenieść 200 µL roztworów nadsączu do płytki 96-dołkowej i zmierzyć wartości absorbancji za pomocą spektrofotometru do mikropłytek przy A600 nm.</li>
</ol>
6. Test żywotności komórek
<ol>
	<li>Wysiać komórki na płytki 24-dołkowe i hodować przez 48 h do uzyskania gęstości 80-90%.</li>
	<li>Inkubować komórki z 100 µL 0,25% trypsyny/EDTA w temperaturze 37 °C przez 3 min.</li>
	<li>Wymieszać 400 µL PBS z komórkami za pomocą pipety automatycznej. Przenieść 100 µL zawiesiny komórkowej na płytkę 96-dołkową.</li>
	<li>Do każdego dołka dodać 20 µL roztworu MTS w końcowym stężeniu 317 µg/mL i delikatnie wymieszać zgodnie z protokołami producenta. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 1-3 h w inkubatorze CO2.</li>
	<li>Pomiar absorbancji każdego dołka przeprowadzić przy piku A490 nm za pomocą spektrofotometru do mikropłytek. Użyć długości fali referencyjnej A630 nm w celu odjęcia tła pochodzącego z fragmentów komórek i niespecyficznej absorbancji (Żywotność komórek = A490nm- A630 nm).</li>
</ol>

Centromere-Associated Protein-E Gene Editing Using the CRISPR/Cas9 System

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Kinesin-7 CENP-E jest kluczowym regulatorem w wyrównaniu chromosomów i punkcie kontrolnym składania wrzeciona podczas podziału komórki 17,19,20. Genetyczna delecja CENP-E zwykle powoduje aktywację punktu kontrolnego montażu wrzeciona, zatrzymanie cyklu komórkowego i śmierć komórki 27,29,51,52. Tak więc...

Inżynieria edycji genomu pośredniczy w ukierunkowanych modyfikacjach genów w różnych komórkach i organizmach. U eukariontów mutageneza specyficzna dla miejsca może być wprowadzona przez zastosowanie nukleaz specyficznych dla sekwencji, które stymulują homologiczną rekombinację docelowego DNA1. W ostatnich latach pojawiło się kilka technologii edycji genomu, w tym nukleazy palców cynkowych (ZFN)2,3, aktywatory transkrypcji podobne do efektorów nukleazy (TALENs)4,5, oraz homing meganukleazy6,7, zostały zaprojektowane tak, aby rozszczepiać genomy w określonych miejscach, ale podejścia te wymagają złożonej inżynierii białek i zbędnych procedur eksperymentalnych. Badania wykazały, że system prokariotyczny typu II zgrupowany regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/Cas jest wydajną technologią edycji genów, która w szczególności pośredniczy w kierowanym przez RNA, specyficznym dla miejsca rozszczepieniu DNA w wielu różnych komórkach i gatunkach8,9,10,11. Technologia nokautu genów CRISPR/Cas9 zrewolucjonizowała dziedziny podstawowej biologii, biotechnologii i medycyny12.
Bakterie i większość archeonów wykształciły adaptacyjny system odpornościowy oparty na RNA, który wykorzystuje białka CRISPR i Cas do identyfikacji i niszczenia wirusów i plazmidów13. Streptococcus pyogenes (paciorkowiec pospolity) Endonukleaza Cas9 (SpCas9) zawiera podobną do RuvC resollawazę połączeniową Hollidaya (RuvC) i domenę His-Asn-His (HNH), które mogą skutecznie pośredniczyć w specyficznych dla sekwencji, dwuniciowych pęknięciach (DSB), dostarczając syntetyczny jednoprowadnicowy RNA (sgRNA) zawierający RNA CRISPR (crRNA) i transaktywujący crRNA (tracrRNA)14,15,16. DSB mogą być naprawiane przez niehomologiczny szlak łączenia końców tworzący indel (NHEJ) lub naprawę kierowaną homologią (HDR), który wprowadza wiele mutacji, w tym insercje, delecje lub substytucje pojedynczych nukleotydów bez blizn, w komórkach ssaków1,8. Zarówno podatny na błędy NHEJ, jak i szlak HDR o wysokiej wierności mogą być używane do pośredniczenia w nokautowaniu genów poprzez insercje lub delecje, co może powodować mutacje z przesunięciem ramki i przedwczesne kodony stop10.
Kinesin-7 CENP-E jest wymagany do przyłączania kinetochoru-mikrotubul i wyrównywania chromosomów podczas podziału komórki17,18,19. Mikroiniekcja przeciwciał20,21, zubożenie siRNA22,23, inhibicja chemiczna24,25,26 i delecja genetyczna27,28,29 CENP-E prowadzi do niewspółosiowości chromosomów, aktywacji punktu kontrolnego składania wrzeciona i defektów mitotycznych, co skutkuje aneuploidią i niestabilnością chromosomów19,30. U myszy delecja CENP-E powoduje nieprawidłowy rozwój i śmiertelność zarodka na bardzo wczesnych etapach rozwoju27,29,31. Genetyczna delecja CENP-E zwykle prowadzi do niewspółosiowości chromosomów i śmierci komórki26,27,29, co stanowi przeszkodę w badaniu funkcji i mechanizmów białek CENP-E.
Niedawne badanie ustaliło warunkową linię komórkową nokautującą CENP-E przy użyciu indukowanej auksyną metody edycji genów CRISPR/Cas932, która umożliwia szybką degradację białek CENP-E w stosunkowo krótkim czasie33. Jednak do tej pory nie ustalono stabilnych linii komórkowych z nokautem CENP-E, co jest nierozwiązanym wyzwaniem technicznym w biologii CENP-E. Biorąc pod uwagę odporność genetyczną34, odpowiedzi kompensacji genetycznej35,36,37, oraz złożone środowiska wewnątrzkomórkowe, ponieważ bezpośrednie konsekwencje całkowitego usunięcia CENP-E mogą być złożone i nieprzewidywalne, ważne jest ustalenie CENP-E Linie komórkowe nokautu do badania mechanizmów wyrównania chromosomów, punktu kontrolnego składania wrzeciona i dalszych szlaków sygnałowych.
Odkrycie i zastosowanie inhibitorów CENP-E są ważne w leczeniu raka. Do tej pory odkryto i zsyntetyzowano siedem typów inhibitorów CENP-E, w tym GSK923295 i jego pochodne24,25, PF-277138,39, imidazo[1,2-a]pochodne rusztowania pirydynowego40,41, compound-A42,43, syntelin44,45, UA6278446 i pochodne benzo[d]pyrrolo[2,1-b]tiazolu47. Wśród tych inhibitorów GSK923295 jest allosterycznym i skutecznym inhibitorem CENP-E, który wiąże się z domeną motoryczną CENP-E i hamuje aktywność ATPazy stymulowanej mikrotubulami CENP-E o Ki wynoszącym 3,2 ± 0,2 nM24,25. Jednak w porównaniu z hamującym działaniem GSK923295 na hodowane komórki nowotworowe, efekty terapeutyczne GSK923295 u pacjentów klinicznych z rakiem nie są idealne48,49, co również wzbudziło obawy co do specyficzności GSK923295 dla CENP-E. Co więcej, specyficzność i skutki uboczne innych inhibitorów CENP-E dla białek CENP-E są kluczowymi kwestiami w badaniach nad rakiem.
W tym badaniu całkowicie wyeliminowaliśmy gen CENP-E w komórkach HeLa za pomocą systemu CRISPR/Cas9. Ustanowiono trzy zoptymalizowane strategie badań przesiewowych opartych na fenotypie, w tym badania przesiewowe kolonii komórkowych, fenotypy dopasowania chromosomów i intensywność fluorescencji białek CENP-E, w celu poprawy skuteczności badań przesiewowych i wskaźnika powodzenia edycji genu CENP-E. Co więcej, linie komórkowe z nokautem CENP-E mogą być wykorzystywane do badania specyficzności związków kandydujących do CENP-E.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówka wirówkowa</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>4S Gelred, 10 000x w wodzie</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj)</td><td>A616697</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>6 cm szalka Petriego</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430166</tr><tr><td>95% etanol</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10009164</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10000218</td><td>Rozpuść w H2O, aby przygotować 10% roztwór roboczy.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj A620014</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Alexa Fluor 488 znakowana kozią anty-mysią IgG (H + L)</td> <td>Beyotime</td><td>A0428</td><td>Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:500.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 znakowany kozią anty-króliczą IgG (H + L)</td> <td>Beyotime</td><td>A0423</td><td>Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:500.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 znakowany Donkey Anti-Mouse IgG (H + L)</td> <td>Beyotime</td><td>A0460</td><td>Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:500.</td></tr><tr><td>Bezwodny etanol</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny</td><td>100092690</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne królika anty-BubR1</td><td>Abcam</td><td>ab254326</td><td>Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:100 </td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-CENP-B</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-376392</td><td>Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:50.</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne królika anty-CENP-E</td><td>Abcam</td><td>ab133583</td><td>Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:100.</td></tr><tr><td>Medium do montażu zapobiegającego blaknięciu</td><td>Beyotime</td><td>P0131</td><td>Spowolnienie wygaszania sygnałów fluorescencyjnych.</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-&amp;alfa;-tubuliny</td><td>Abcam</td><td>ab7291</td><td>Do immunofluorescencji. Rozpuścić w 1% BSA/PBST. Rozcieńczenie 1:100.</td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikropłytkowy Biotek Epoch</td><td>Biotek Instruments Biotek</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>69003435</td><td></td></tr><tr><td>BpiI (BbsI)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER1011</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 wodny test proliferacji komórek w jednym roztworze</td> Wirówka <td>Promega</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5424BK745380</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik chemiczny Colchicine</td><td>Sinopharm</td><td>61001563</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop skaningowy</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP8</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>CITOTEST</td><td>80344-1220</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime</td><td>C1006</td><td></td></tr><tr><td>DH5α kompetentne komórki</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj)</td><td>B528413</td><td></td></tr><tr><td>Marker DNA DL2000</td><td>TaKaRa</td><td>3427A</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>Endo-free plasmid mini kit <img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/65476/65476eq02.jpg" style="margin: auto; "></td><td>Omega</td><td>D6950</td><td></td></tr><tr><td>Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit</td><td>Sangon Biotech (Shanghai)</td><td>B518251</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Zhejiang Tianhang Biotechnology</td><td>11011-8611</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>fiolet goryczkowy</td><td>71019944</td><td>Rozpuść w PBS, aby przygotować 0,1% fioletu goryczkowego/PBS.</td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia Giemsa</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>71020260</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie GraphPad Prism w wersji 8.0</td><td>GraphPad</td><td>www.graphpad.com</td><td>Analiza statystyczna.</td></tr><tr><td>GSK923295</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10299</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Nawilżany inkubator</td><td>Heal Force</td><td>HF90 / HF240</td><td></td></tr><tr><td>Image J oprogramowanie</td><td>National Institutes of Health</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td> <td>Przetwarzanie i analiza obrazu.</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nanjing Jiangnan Novel Optics</td><td>XD-202</td><td></td></tr><tr><td>LB proszek agarowy</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj)</td><td>A507003</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipo6000</td><td>Beyotime</td><td>C0526</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon Ti-S2</td><td>Nikon</td><td>Ti-S2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM  Obniżony  serum  medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny</td><td>80096618</td><td>Rozpuść w PBS, aby uzyskać 4% paraformaldehydu / PBS.</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do ekstrakcji żelu DNA kolumny SanPrep</td><td>Sangon Biotech (Szanghaj)</td><td>B518131</td><td></td></tr><tr><td>SanPrep  Kolumna  plazmid  mini-przygotowania  </td><td>zestaw Sangon Biotech (Szanghaj)</td><td>B518191</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>TaKaRa</td><td>2011A</td> Kinaza polinukleotydowa <td></td></tr><tr><td>T4</td><td>TaKaRa</td><td>2021A</td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny</td><td>30188928</td><td>Rozpuść w PBS, aby otrzymać 0,25% Triton X-100/PBS.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>30189328</td><td>Rozpuść w PBS, aby przygotować 0,1% Tween 20/PBS.</td></tr></tbody></table>

generowanie linii komórkowych nokautujących związanych z centromerem protein-e cenp-e-/- przy użyciu systemu crispr/cas9

Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System

System CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 okazał się potężnym narzędziem do precyzyjnej i efektywnej edycji genów w różnych organizmach. Białko E ZWIĄZANE Z CENTROMEREM (CENP-E) jest kinezyną skierowaną na koniec dodatni, wymaganą do wychwytywania mikrotubul kinetochorowych, wyrównania chromosomów i punktu kontrolnego montażu wrzeciona. Chociaż funkcje komórkowe białek CENP-E zostały dobrze zbadane, trudno było badać bezpośrednie funkcje białek CENP-E przy użyciu tradycyjnych protokołów, ponieważ ablacja CENP-E zwykle prowadzi do aktywacji punktu kontrolnego składania wrzeciona, zatrzymania cyklu komórkowego i śmierci komórki. W tym badaniu całkowicie wyeliminowaliśmy gen CENP-E w ludzkich komórkach HeLa i z powodzeniem wygenerowaliśmy komórki CENP-E-/- HeLa za pomocą systemu CRISPR/Cas9.
Ustalono trzy zoptymalizowane strategie przesiewowe oparte na fenotypie, w tym badania przesiewowe kolonii komórkowych, fenotypy dopasowania chromosomów oraz intensywności fluorescencji białek CENP-E, które skutecznie poprawiają skuteczność badań przesiewowych i wskaźnik sukcesu eksperymentalnego komórek nokautujących CENP-E. Co ważne, delecja CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów, nieprawidłową lokalizację białek mitotycznego punktu kontrolnego BUB1 kinazy serynowo-treoninowej B (BubR1) oraz defekty mitotyczne. Ponadto wykorzystaliśmy model komórki HeLa z nokautem CENP-E do opracowania metody identyfikacji inhibitorów specyficznych dla CENP-E.
W tym badaniu ustalono użyteczne podejście do walidacji specyficzności i toksyczności inhibitorów CENP-E. Ponadto w pracy przedstawiono protokoły edycji genów CENP-E z wykorzystaniem systemu CRISPR/Cas9, który może być potężnym narzędziem do badania mechanizmów CENP-E w podziale komórek. Co więcej, linia komórkowa z nokautem CENP-E przyczyni się do odkrycia i walidacji inhibitorów CENP-E, co ma ważne implikacje dla opracowywania leków przeciwnowotworowych, badań nad mechanizmami podziału komórek w biologii komórki oraz zastosowań klinicznych.

Komórki HeLa CENP-E-/- zostały pomyślnie wygenerowane przy użyciu systemu CRISPR/Cas9 (Rysunek 1). Harmonogram i krytyczne kroki eksperymentalne tej metody przedstawiono na Rysunku 1. Najpierw zaprojektowano i zsyntetyzowano specyficzne dla CENP-E sgRNA, poddano je hybrydyzacji i ligowano w plazmid pX458, a następnie przeprowadzono transfekcję plazmidu do komórek HeLa i inkubowano je przez 48 h. Transfekowane komórki rozdzielono i wy...

Ten artykuł opisuje budowę komórek nokautujących białko-E związanych z centromerem (CENP-E) przy użyciu systemu CRISPR/Cas9 i trzech strategii przesiewowych opartych na fenotypie. Wykorzystaliśmy linię komórkową z nokautem CENP-E do opracowania nowatorskiego podejścia do walidacji swoistości i toksyczności inhibitorów CENP-E, co jest przydatne przy opracowywaniu leków i badaniach biologicznych.

Generowanie linii komórkowych nokautujących związanych z centromerem Protein-E CENP-E-/- przy użyciu systemu CRISPR/Cas9

The CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 system has emerged as a powerful tool for precise and efficient gene editing ...

Genetyczna delecja Kinesin-7 i CENP zwykle powoduje zatrzymanie cyklu komórkowego i śmierć komórki. Budowa stabilnych linii komórkowych z nokautem CENP jest ważnym, nierozwiązanym zagadnieniem w biologii CENP. W tym badaniu wygenerowaliśmy komórki HeLa z nokautem CENP przy użyciu systemu CRISPR/Cas9 i ustaliliśmy trzy zoptymalizowane strategie badań przesiewowych.Ostatnio kilka technologii edycji genomu, w tym nukleazy palców cynkowych, nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji i sposób, w jaki wytwarzamy nasze nukleazy, zostało zmodyfikowanych tak, aby rozszczepiać genomy o określonym rozmiarze. Technologia nokautu genów CRISPR/Cas9 zrewolucjonizowała podstawy biologii, biotechnologii i medycyny. CENP jest niezbędny do przyłączania kinetochorów do mikrotubul i wyrównywania chromosomów.Zakłócenie CENP, czy to poprzez mikroiniekcję przeciwciał, delecję sgRNA, hamowanie chemiczne czy delecję genetyczną, powoduje niewspółosiowość chromosomów, defekty mitotyczne i często śmierć komórki, komplikując badanie mechanizmów białka CENP. W tym badaniu ustalono trzy zoptymalizowane strategie przesiewowe oparte na fenotypie, w tym badania przesiewowe kolonii komórkowych, wyrównanie chromosomów fenotypów oraz intensywność fluorescencji białek CENP, co poprawiło skuteczność badań przesiewowych i wskaźnik sukcesu eksperymentu. Co ważne, delecja CENP powoduje niewspółosiowość chromosomów, nieprawidłową lokalizację białek BubR1 i defekty mitotyczne.Tryby interakcji i mechanizmy molekularne CENP i jego inhibitorów są ważnymi dziedzinami badawczymi w biologii komórki i badaniach nad rakiem. W tym badaniu linia komórkowa HeLa z nokautem CENP została uznana za cenne narzędzie do walidacji swoistości i toksyczności inhibitorów CENP. Na początek dodaj 0,25% roztwór trypsyny EDTA do komórek HeLa i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do trzech minut.Delikatnie rozdzielić komórki przez pipetowanie i umieścić je w nowych płytkach w stosunku 1:4 do przejścia komórkowego. Aby transfekować plazmid do komórek HeLa, wymieszaj jeden mikrogram zwalidowanego plazmidu PX 4 58 sgRNA z 50 mikrolitrami zredukowanej pożywki surowicy w probówce A.In probówce B, delikatnie wymieszaj dwa mikrolitry odczynnika do transfekcji i 50 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie połącz zawartość z probówek A i B i inkubuj w temperaturze pokojowej przez kolejne pięć minut.Dodaj mieszaninę do 12-dołkowej płytki i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin. Pod koniec inkubacji zastąp pożywkę świeżą pożywką DMEM. Po 24 lub 48 godzinach oceń skuteczność transfekcji, badając komórki HeLa pod mikroskopem fluorescencyjnym.Całkowicie zdysocjuj transfekowane komórki HeLa za pomocą 0,25% trypsyny EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut. Następnie policz komórki za pomocą komory Neubauera lub automatycznego licznika komórek. Umieścić komórki na trzech oddzielnych 96-dołkowych płytkach dla każdej transfekowanej populacji, stosując metody seryjnego rozcieńczania.Umieść komórki z powrotem w nawilżonym inkubatorze na jeden do dwóch tygodni. W celu przeprowadzenia badań przesiewowych opartych na fenotypie i walidacji nokautu CENP-E, należy zdysocjować i roznręczyć komórki na płytkach 24-dołkowych lub 12-dołkowych przez pięć do siedmiu dni. Przesiewaj zmutowane komórki o mniejszych średnicach kolonii za pomocą odwróconego mikroskopu z soczewkami obiektywowymi o 10-krotnym i 20-krotnym powiększeniu.Następnie zbierz komórki do ekstrakcji DNA, używając zestawu do ekstrakcji genomowego DNA zwierząt kolumnowych zgodnie z instrukcjami producenta i ustaw reakcje łańcuchowe polimerazy. Zligować docelowe DNA do wektora pMD18-T zgodnie z zaleceniami protokołów producenta. Transfekować ligowany plazmid do właściwych komórek DH5-alfa i kontynuować hodowlę w celu selekcji klonów.Aby zidentyfikować rodzaje nokautów CENP-E, należy wyizolować DNA plazmidu za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidu zgodnie z wytycznymi producenta. Następnie przeprowadź sekwencjonowanie Sangera dla plazmidowego DNA każdej kolonii przy użyciu starterów M13 do przodu i do tyłu. Zasiaj komórki HeLa typu dzikiego i zmutowane CENP-E na 12-milimetrowych szklanych szkiełkach nakrywkowych na 24-dołkowej płytce.Usuń całe podłoże DMEM i utrwal komórki za pomocą 4% roztworu paraformaldehydu i PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie wybarwić jądra DAPI w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Obserwuj i weryfikuj zmutowane komórki CENP-E w oparciu o fenotyp dopasowania chromosomów za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.Fenotypowe badania przesiewowe kolonii wykazały, że komórki nokautujące CENP-E wykazywały zwiększoną niewspółosiowość chromosomów w porównaniu z grupą kontrolną. Na początek weź płytkę z komórkami HeLa typu dzikiego i zmutowanymi CENP-E rosnącymi na szkiełku nakrywkowym. Utrwal komórki za pomocą 4% roztworu paraformaldehydu i utrwalacza PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Następnie zanurz się w PBS na dwie rundy po pięć minut każda. Następnie przepuszczaj komórki za pomocą 0,25% Triton X-100 i PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Zanurz je w PBS na dwie rundy po pięć minut każda.Kontynuuj blokowanie komórek za pomocą 1%BSA PBS z 0,1%Tween 20 w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała w 1% BSA i PBST i inkubować próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 godzin. Odrzuć roztwory przeciwciał pierwotnych, a następnie przepłucz komórki trzy razy przez pięć minut każda PBS.Dodaj rozcieńczone przeciwciała drugorzędowe do komórki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie wyrzuć przeciwciała drugorzędowe, a następnie przepłucz komórki PBS trzy razy przez pięć minut każda. Wybarwić jądra za pomocą DAPI w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Zamontuj prowadnice za pomocą medium montażowego i uszczelnij je lakierem do paznokci. Obserwuj obrazy fluorescencyjne za pomocą skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw z aperturą numeryczną o powiększeniu 63x i 1,40 i zapisuj je do dalszej analizy. Barwienie immunofluorescencyjne grup kontrolnych i grup z mutacją CENP-E wykazało, że intensywność fluorescencji białek CENP-E została całkowicie znokautowana w komórkach klonu 1 z mutacją CENP-E i znacznie zmniejszona w komórkach klonu 3 z mutacją CENP-E.Proporcje komórek metafazowych z niewspółosiowością chromosomów zwiększają się w klonach 1 i 3 w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Tymczasem proporcje komórek metafazy znacznie wzrosły w komórkach klonu 1 i komórkach klonu 3. Ponadto stosunek komórek interfazowych nieznacznie wzrósł w grupach klonów 1 i 3 po delecji CENP-E w porównaniu z grupą kontrolną.Wskaźniki komórek profazy, anafazy i telofazy były nieznacznie zmniejszone po delecji CENP-E, podczas gdy wskaźniki komórek metafazy wzrosły po delecji CENP-E. Na początek weź hodowle komórek HeLa typu dzikiego i zmutowanego CENP-E i dodaj 300 nanomolowych kolchicyny przed inkubacją przez pięć godzin. Następnie inkubuj komórki z 0,25% trypsyną EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty i zbierz komórki do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych.Następnie odwirować komórki w temperaturze 1000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatanty i dodać 1,2 mililitra 0,075 molowego roztworu chlorku potasu. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.Pod koniec inkubacji odwirować komórki, odrzucić supernatant i dodać 0,2 mililitra roztworu utrwalającego w celu wstępnego utrwalenia. Mieszaj delikatnie przez jedną minutę, a następnie zbierz granulki komórek, jak pokazano wcześniej, i dodaj 1,5 mililitra roztworu utrwalającego w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po odwirowaniu komórek i odrzuceniu supernatantu dodać 0,6 mililitra roztworów utrwalających, aby utworzyć zawiesinę komórek.Ostrożnie upuść trzy do pięciu kropel zawiesin komórkowych o głębokości od 35 do 40 centymetrów na zjeżdżalnie lodowe. Natychmiast wysuszyć szkiełka za pomocą lampy alkoholowej i zabarwić je 10% roztworem podtrzymującym Giemsa przez siedem minut. Płucz szkiełka bieżącą wodą przez dwie minuty, a następnie badaj próbki za pomocą mikroskopu świetlnego wyposażonego w obiektyw Plan Fluor o powiększeniu 40x, aperturze numerycznej 0,75.Analiza kariotypu wykazała zmniejszoną liczbę chromosomów w komórkach HeLa z mutacją CENP-E w porównaniu z komórkami typu dzikiego.

generation-centromere-associated-protein-e-cenp-e-knockout-cell-lines

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

CRISPR/Cas9 to solidny system do wywoływania zakłóceń w genach i elementach genetycznych. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznego tworzenia delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR/Cas9.

Generowanie delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków za pomocą CRISPR/Cas9

Narzędzia do edycji genomu, takie jak system CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (związany z CRISPR), znacznie poprawiły skuteczność celowania w geny w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hiPSC). Niniejszy manuskrypt opisuje protokół generowania specyficznego dla linii reportera hiPSC przy użyciu rekombinacji homologicznej wspomaganej systemem CRISPR/Cas.

Wydajne generowanie reporterów knockin specyficznych dla linii neuronowej hiPSC przy użyciu systemu podwójnej nickazy CRISPR/Cas9 i Cas9

Eksperymentalne potwierdzenie aktywności wzmacniacza najlepiej podejść poprzez analizę utraty funkcji. Przedstawiono tutaj skuteczny protokół, który wykorzystuje delecję za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do badania specyficznej dla alleli regulacji transkrypcji genów w komórkach F1 ES, które zawierają genom hybrydowy (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Ta metoda jest przeznaczona do śledzenia tworzenia domen chromatyny za pośrednictwem PRC2 w liniach komórkowych, a metoda może być dostosowana do wielu innych systemów.

Metoda badania tworzenia się de novo domen chromatyny

Ten protokół zapewnia metodę ułatwiającą generowanie zdefiniowanych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmian nukleotydowych za pomocą CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

W miarę jak protokoły związane z CRISPR stają się coraz bardziej użyteczne i dostępne, w określonych warunkach eksperymentalnych nadal mogą pojawić się komplikacje i przeszkody. Protokół ten przedstawia w zarysie tworzenie wchodzącej w interakcję z receptorem ludzkiej linii komórkowej kinazy serynowo-treoninowej 1 (RIPK1/RIP1) przy użyciu CRISPR/Cas9 i podkreśla potencjalne wyzwania napotkane podczas tego procesu.

Generowanie linii komórkowej U937 z nokautem RIP1 przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Poznaj generowanie linii komórkowych nokautujących CENP-E w komórkach HeLa przy użyciu CRISPR/Cas9. Zoptymalizowane strategie przesiewania pozwalają badać specyficzność i toksyczność inhibitorów CENP-E w badaniach nad rakiem.

Generowanie linii komórkowych nokautujących związanych z centromerem Protein-E CENP-E^-/- przy użyciu systemu CRISPR/Cas9

Przeglądaj więcej filmów