Name: Dostosowany test mikropłytkowy oparty na gęstości optycznej do charakteryzowania zakażenia promieniowcem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:45:00.000+00:00
Duration: 3 min 33 s
Description: Poznaj metodę mikropłytkową opartą na gęstości optycznej do charakteryzowania zakażenia bakteriofagami w wolno rosnących promieniowcach. Protokół umożliwia współhodowlę i analizę dynamiki infekcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem NSF DBI Biology Integration Institute (BII) (nagroda nr 2119968; PI-Ceballos) oraz w ramach programu Arkansas INBRE, z grantem z National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), P20 GM103429 z National Institutes of Health. Autorzy doceniają również wsparcie programu badawczego Patterson Summer Undergraduate Research Program na Uniwersytecie Baptystycznym Ouachita.

Chociaż ten protokół został napisany dla Gordonia terrae, został również z powodzeniem wykorzystany dla Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta i Gordonia westfalica.
1. Przygotowanie bakterii
<ol>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj dobrej praktyki mikrobiologicznej17, aby zaszczepić pojedynczą kolonię Gordonia terrae CAG3 w sterylnej kolbie z przegrodą o pojemności 1 l z 200 ml bulionu wapniowego z drożdży peptonowych18(PYCa) zawierającego 0,01 mg/ml cykloheksymidu (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Inkubować kolbę w temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min, aż do nasycenia kultury lub przez 3 dni7.</li>
	<li>Nasyconą kulturę G. terrae rozcieńczyć seryjnie w bulionie PYCa i rozprowadzić na płytce po 100 μl z rozcieńczeń 10−4, 10−5 i 10−6 na płytkach PYCa19,20. Nierozcieńczoną nasyconą kulturę przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Inkubować odwrócone płytki rozsiewające przez 3 dni w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Po inkubacji zidentyfikuj "policzalną płytkę", płytkę z 20-200 koloniami. Policz liczbę kolonii na tej płytce i oblicz jednostki tworzące kolonie na mililitr (jtk/ml)19,20.</li>
	<li>Rozcieńczyć nasyconą kulturę bulionem PYCa do 4,0 x 106 jtk/ml bakterii.</li>
</ol>
2. Przygotowanie faga
UWAGA: Przedstawione reprezentatywne wyniki uzyskano za pomocą faga Gordonia DelRio21, umiarkowanego bakteriofaga wyizolowanego na G. terrae. Metody te są również z powodzeniem stosowane w przypadku innych fagów Gordonia.
<ol>
	<li>Zaczynając od wyizolowanego bakteriofaga, seryjnie rozcieńczyć próbkę faga w buforze fagowym7 do rozcieńczenia 1 x 10−8. Przeprowadzić dwuwarstwowy test miana fagów agarowych7, zakażając 0,3 ml nasyconej kultury G. terrae 10 μl każdego rozcieńczenia faga. Po 5-10 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej połącz mieszaninę bakterii i fagów z 3 ml górnego agaru PYCa i wylej na płytki agarowe PYCa.</li>
	<li>Inkubować płytki odwrócone do góry dnem w temperaturze 30 °C przez 3 dni lub do momentu, gdy utworzą się blaszki miażdżycowe7.</li>
	<li>Po inkubacji zidentyfikuj "policzalną płytkę", płytkę z 20-200 blaszkami. Policz liczbę tabliczek na tej płytce i oblicz jednostki tworzące płytkę na mililitr (pfu/ml)7.</li>
</ol>
3. Przygotowanie mikropłytek
UWAGA: Do tej metody powinny być używane płaskie 96-dołkowe mikropłytki (patrz Tabela Materiałów). Całe przygotowanie i załadunek płytki musi zostać zakończone w komorze bezpieczeństwa biologicznego i należy stosować dobrą praktykę mikrobiologiczną17.
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór do powlekania pokrywy przeciwmgielnej, łącząc 100 μl Triton-X 100, 40 ml 100% izopropanolu i 160 ml wody dejonizowanej22. Wymieszaj do wymieszania i przechowuj w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj 6 ml roztworu do powlekania pokrywki na wewnętrzną powierzchnię sterylnej 96-dołkowej pokrywki mikropłytki, trzymając pokrywkę za krawędzie i obracając ją, aby upewnić się, że jest pokryta roztworem. Pozostaw roztwór na pokrywce na 20 s, a następnie odlej roztwór i odwróć pokrywkę na autoklawowanym ręczniku papierowym pod kątem, aż pokrywka całkowicie wyschnie, co zwykle zajmuje 35-45 minut. Uważaj, aby trzymać pokrywę za krawędzie.</li>
	<li>Przygotuj 20 ml 0,1% agarozy w wodzie na każdą 96-dołkową mikropłytkę, podgrzewając w kuchence mikrofalowej, aby stopić agarozę.</li>
	<li>Gdy agaroza ostygnie do 50-60 °C, odpipetuj 100 μl 0,1% agarozy do wszystkich przestrzeni między dołkami płytki i 200 μl agarozy do studzienek w rzędzie A i rzędzie H oraz w kolumnie 1, kolumnie 2, kolumnie 11 i kolumnie 1223 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
</ol>
4. Ładowanie płytki bakteriami i fagami
UWAGA: Wszystkie czynności związane z przygotowaniem i załadunkiem płytki muszą być zakończone w komorze bezpieczeństwa biologicznego, a dobra praktyka mikrobiologiczna17 powinna być stosowana.
<ol>
	<li>Płytka 96-dołkowa będzie zawierała 75 μl bakterii 2,0 x 106 jtk/ml w każdym dołku9. Rozcieńczyć kulturę bakteryjną 4,0 x 106 jtk/ml w stosunku 1:1 bulionem 2x PYCa do 2,0 x 106 jtk/ml. Przygotować 5 ml na płytkę 96-dołkową.</li>
	<li>Rozcieńczyć lizat fagowy za pomocą buforu fagowego7, aby uzyskać po 1 ml o stężeniach 2,0 x 106 pfu/ml, 2,0 x 105 pfu/ml i 2,0 x 104 pfu/ml. Pozwoli to na wielokrotność infekcji (MOI) 1, 0,1 i 0,01 w obrębie klasy microplate<sup="xref">9.</li>
	<li>Aby załadować mikropłytkę, weź płytkę, która została przygotowana z roztworem przeciwmgielnym i agarozą, a następnie odpipetuj 75 μl bakterii 2,0 x 106 jtk/ml do kolumn 3-10, postępując zgodnie z <silna klasa="xfig">Rysunek 1.</li>
	<li>Do kolumny 3 i kolumny 4 dodaj 75 μl sterylnego buforu fagowego do każdej studzienki, aby służyła jako kontrola pozytywna bez fagów, postępując zgodnie z <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1, a po każdym dodaniu pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Dodać 75 μl faga 2,0 x 106 pfu/ml do kolumny 5 i kolumny 6, 75 μl faga 2,0 x10 5 pfu/ml do kolumny 7 i kolumny 8 oraz 75 μl faga 2,0 x 104 pfu/ml do kolumny 9 i kolumny 10, pipetowanie w górę i w dół, aby wymieszać po każdym dodaniu.</li>
	<li>Zaklej oba krótsze boki tabliczki taśmą etykietującą o grubości 0,5 cala, aby częściowo uszczelnić płytkę, umożliwiając jednocześnie wymianę gazową.</li>
</ol>
5. Inkubacja i pomiar absorbancji
<ol>
	<li>Po załadowaniu płytek bakteriami i fagami umieść je na wytrząsarce do mikropłytek z prędkością 250 obr./min i inkubuj w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Inkubować płytki przez 96 godzin, wykonując pomiar gęstości optycznej przy długości fali 600 nm na czytniku mikropłytek co 8 godzin, począwszy od godziny 16. Włóż płytki do wytrząsarki między pomiarami. 
	UWAGA: Oceniono okresy pomiarowe wynoszące 4, h, 6 h, 8 h i 12 h, rozpoczynające się o godzinie 0, i ustalono, że 8-godzinny okres pobierania próbek rozpoczynający się o 16 h po zakażeniu najlepiej uchwycił interakcje Gordonia-.</li>
	<li>Monitoruj pokrywę pod kątem kondensacji przez cały czas trwania eksperymentu. Jeśli zaobserwuje się kondensację, załóż pokrywę na inną pokrytą zgodnie z krokiem 3.2.</li>
	<li>Wygeneruj krzywe wzrostu kontrolnego i zakażonego zgodnie z sekcją 6 protokołu.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Użyj programu arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć średnią i odchylenie standardowe dla każdego rozcieńczenia faga, postępując zgodnie z układem arkusza kalkulacyjnego w repozytorium GitHub Stacy-Ceballos-Index (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).</li>
	<li>Utwórz krzywe kontroli i zainfekowanego wzrostu oraz oblicz metryki infekcji za pomocą R (patrz Tabela materiałów) z pakietami DescTools24, dplyr25, ggplot226 i readxl27 i postępuj zgodnie ze skryptem R w repozytorium GitHub Stacy-Ceballos-Index (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
	<ol>
		<li>AUCcon to obszar pod krzywą kontrolnej niezainfekowanej, podczas gdy AUCinf to obszar pod krzywą zakażenia16. Oblicz AUC, a następnie oblicz procentowe zahamowanie wzrostu na podstawie wartości obszaru pod krzywą, PIAUC16, używając następującego równania: 
		(1 - [AUCinf/AUC con]) × 100</li>
		<li>Przerywane poziome linie na każdej krzywej pokazują szczytowy wzrost, przy czym niezainfekowany szczyt wzrostu oznaczony jest jako Nasymptote(con), a zainfekowany szczyt wzrostu jest oznaczony jako Nasymptote(inf). Zidentyfikuj wartościasymptoty N, a następnie oblicz procentowe zahamowanie wzrostu na podstawie tych szczytowych wartości wzrostu, PImax16, używając następującego równania: 
		(1 - [Nasymptote(inf)/ Nasymptote(con)]) × 100</li>
		<li>Oblicz indeks Stacy'ego-Ceballosa, ISC16, na podstawie wartościPI AUC iPI max, w następujący sposób: 
		(PIAUC × PImaks.)0,5 
		Oblicz względną zjadliwość, całkując indeks Stacy'ego-Ceballosa w czasie16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Characterizing Actinobacteriophage Infection Using an Adapted Optical Density Assay

<ol><li>Mushegian, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+there+1031+virus+particles+on+Earth%2C+or+more%2C+or+fewer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Are there 1031 virus particles on Earth, or more, or fewer.</a> Journal of Bacteriology. 202 (9), e00052-e00020 (2020).</li>
<li>Chevallereau, A., Pons, B. J., van Houte, S., Westra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+bacterial+and+phage+communities+in+natural+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interactions between bacterial and phage communities in natural environments.</a> Nature Reviews Microbiology. 20 (1), 49-62 (2022).</li>
<li>Olszak, T., Latka, A., Roszniowski, B., Valvano, M. A., Drulis-Kawa, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+life+cycles+behind+bacterial+biodiversity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phage life cycles behind bacterial biodiversity.</a> Current Medicinal Chemistry. 24 (36), 3987-4001 (2017).</li>
<li>Weitz, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-bacteria+infection+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phage-bacteria infection networks.</a> Trends in Microbiology. 21 (2), 82-91 (2013).</li>
<li>Turner, P. E., Draghi, J. A., Wilpiszeski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+growth+differences+among+phage+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of growth differences among phage strains.</a> Journal of Microbiological Methods. 88 (1), 117-121 (2012).</li>
<li>Storms, Z. J., Teel, M. R., Mercurio, K., Sauvageau, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+virulence+index%3A+A+metric+for+quantitative+analysis+of+phage+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PHAGE%22%5BJournal%5D)">The virulence index: A metric for quantitative analysis of phage virulence.</a> PHAGE. 1 (1), 27-36 (2020).</li>
<li>Poxleitner, M., Pope, W., Jacobs-Sera, D., Sivanathan, V., Hatfull, G. Phage Discovery Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://seaphagesphagediscoveryguide.helpdocsonline.com/home">https://seaphagesphagediscoveryguide.helpdocsonline.com/home</a> (2012).</li>
<li>Martinez-Soto, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHIDA%3A+A+high+throughput+turbidimetric+data+analytic+tool+to+compare+host+range+profiles+of+bacteriophages+isolated+using+different+enrichment+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">PHIDA: A high throughput turbidimetric data analytic tool to compare host range profiles of bacteriophages isolated using different enrichment methods.</a> Viruses. 13 (11), 2120-2137 (2021).</li>
<li>Rajnovic, D., Muñoz-Berbel, X., Mas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+phage+detection+and+quantification%3A+An+optical+density-based+approach%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fast phage detection and quantification: An optical density-based approach.</a> PLoS One. 14 (5), e0216292(2019).</li>
<li>Xie, Y., Wahab, L., Gill, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+microtiter+plate-based+assay+for+determination+of+bacteriophage+host+range+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a microtiter plate-based assay for determination of bacteriophage host range and virulence.</a> Viruses. 10 (4), 189-204 (2018).</li>
<li>Sørensen, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+in+vitro+phage-host+population+growth+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Classification of in vitro phage-host population growth dynamics.</a> Microorganisms. 9 (12), 2470-2486 (2021).</li>
<li>Konopacki, M., Grygorcewicz, B., Dołęgowska, B., Kordas, M., Rakoczy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhageScore%3A+A+simple+method+for+comparative+evaluation+of+bacteriophages+lytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">PhageScore: A simple method for comparative evaluation of bacteriophages lytic activity.</a> Biochemical Engineering Journal. 161, 107652(2020).</li>
<li>Holt, J. G., Krieg, N. R., Sneath, P. H. A., Staley, J. T., Williams, S. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolt%2C+JG+%22Bergey%27s+Manual+of+Determinative+Bacteriology.%2C+9th+edition%22">Bergey's Manual of Determinative Bacteriology., 9th edition</a>. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (1994).</li>
<li>Fusconi, R., Godinho, M. J. L., Bossolan, N. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+exopolysaccharide+production+from+sugarcane+molasses+by+Gordonia+polyisoprenivorans+CCT+7137%2C+isolated+from+contaminated+groundwater+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Culture and exopolysaccharide production from sugarcane molasses by Gordonia polyisoprenivorans CCT 7137, isolated from contaminated groundwater in Brazil.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (7), 937-943 (2007).</li>
<li>Bujold, A. R., Lani, N. R., Sanz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-to-strain+variation+of+Rhodococcus+equi+growth+and+biofilm+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Strain-to-strain variation of Rhodococcus equi growth and biofilm formation in vitro.</a> BMC Research Notes. 12 (1), 519(2019).</li>
<li>Ceballos, R. M., Stacy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+relative+virulence%3A+When+%C2%B5max+fails+and+AUC+alone+just+is+not+enough%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Quantifying relative virulence: When µmax fails and AUC alone just is not enough.</a> Journal of General Virology. 102 (1), 001515(2021).</li>
<li>Siddiquee, S. The basic concept of microbiology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSiddiquee%2C+S+%22Practical+Handbook+of+the+Biology+and+Molecular+Diversity+of+Trichoderma+Species+from+Tropical+Regions%22">Practical Handbook of the Biology and Molecular Diversity of Trichoderma Species from Tropical Regions</a>. , Springer. Cham, Switzerland. 1-15 (2017).</li>
<li>Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+and+characterization+of+the+Tsukamurella+bacteriophage+TPA2%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genome sequence and characterization of the Tsukamurella bacteriophage TPA2.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1389-1398 (2011).</li>
<li>Van Alst, A. J., LeVeque, R. M., Martin, N., DiRita, V. J. Growth curves: Generating growth curves using colony forming units and optical density measurements. JoVE Science Education Database. Microbiology. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/v/10511/growth-curvesgenerating-growth-curves-using-colony-forming-units">https://www.jove.com/v/10511/growth-curvesgenerating-growth-curves-using-colony-forming-units</a> (2023).</li>
<li>Wise, K. Preparing spread plates protocols. American Society for Microbiology. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://asm.org/ASM/media/Protocol-Images/Preparing-Spread-Plates-Protocols.pdf">https://asm.org/ASM/media/Protocol-Images/Preparing-Spread-Plates-Protocols.pdf</a> (2006).</li>
<li>Mathes, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequences+of+Chop%2C+DelRio%2C+and+GrandSlam%2C+three+Gordonia+phages+isolated+from+soil+in+Central+Arkansas%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Resource+Announcements%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequences of Chop, DelRio, and GrandSlam, three Gordonia phages isolated from soil in Central Arkansas.</a> Microbiology Resource Announcements. 12 (5), e0002323(2023).</li>
<li>Krishnamurthi, V. R., Niyonshuti, I. I., Chen, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+analysis+method+for+evaluating+bacterial+growth+with+microplate+readers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new analysis method for evaluating bacterial growth with microplate readers.</a> PLoS One. 16 (1), 0245205(2021).</li>
<li>Evoluted New Media. Beating the edge effect. Laboratory News. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.labnews.co.uk/article/2028052/beating_the_edge_effect">http://www.labnews.co.uk/article/2028052/beating_the_edge_effect</a> (2011).</li>
<li>Signorell, A. DescTools: Tools for descriptive statistics, R package version 0.99.49. DescTools. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=DescTools">https://CRAN.R-project.org/package=DescTools</a> (2023).</li>
<li>Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K., Vaughan, D. dplyr: A grammar of data manipulation, R package version 1.1.2. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=dplyr">https://CRAN.R-project.org/package=dplyr</a> (2023).</li>
<li>Wickham, H., et al. ggplot2: Create elegant data visualisations using the grammar of graphics, R package version 3.4.2. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=ggplot2">https://CRAN.R-project.org/package=ggplot2</a> (2023).</li>
<li>Wickham, H., Bryan, J. readxl: Read excel files, R package version 1.4.2. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=readxl">https://CRAN.R-project.org/package=readxl</a> (2023).</li>
<li>Yao, T., Coleman, S., Nguyen, T. V. P., Golding, I., Igoshin, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+self-counting+in+the+presence+of+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage self-counting in the presence of viral replication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (51), 2104163118(2021).</li>
<li>Fang, Q., Feng, Y., McNally, A., Zong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+phage+resistance+and+phages+capable+of+intestinal+decolonization+of+carbapenem-resistant+Klebsiella+pneumoniae+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of phage resistance and phages capable of intestinal decolonization of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in mice.</a> Communications Biology. 5, 48(2022).</li>
<li>Burrowes, B. H., Molineux, I. J., Fralick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+in+vitro+evolution+of+therapeutic+bacteriophages%3A+The+Appelmans+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Directed in vitro evolution of therapeutic bacteriophages: The Appelmans protocol.</a> Viruses. 11 (3), 241(2019).</li>
<li>Shapiro, J. W., Williams, E. S. C. P., Turner, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+parasitism+and+mutualism+between+filamentous+phage+M13+and+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Evolution of parasitism and mutualism between filamentous phage M13 and Escherichia coli.</a> PeerJ. 4, e2060(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ta metoda mikropłytek oparta na gęstości optycznej pozwala na badanie zakresu gospodarzy bakteriofagów i dynamiki infekcji11 oraz pokazuje użyteczność wskaźnika Stacy-Ceballosa16 jako miary zjadliwości bakteriofagów. Chociaż metoda ta może być stosowana z dowolnym systemem bakteriofag-gospodarz, została zaprojektowana specjalnie w celu dostosowania testów szybkiego wzrostu mikropłytek 9,10,11 do stosowania z wolniej rosnącymi bakteriami, takimi jak promieniowce. Szybkie testy mikropłytek nie mogą być stosowane w przypadku wolno rosnących bakterii bez modyfikacji w celu rozwiązania problemu parowania i kondensacji pokrywy. Metoda ta opisuje te niezbędne modyfikacje i po raz pierwszy demonstruje zastosowanie wskaźnika Stacy'ego-Ceballosa i powiązanych wskaźników16 do opisu zakażenia bakteriofagami.
Parowanie może być poważnym wyzwaniem w wielodniowych testach 96-dołkowej krzywej wzrostu płytki; Ta metoda rozwiązuje ten problem poprzez dodanie agarozy do studzienek granicznych i przestrzeni między studzienkami. Margines agarozowy w połączeniu z powłoką przeciwmgielną22 zapewnia niezbędną wilgotność wewnątrz mikropłytki i pozwala na wiarygodne pomiary gęstości optycznej. Bez dodatkowej wilgotności dochodzi do znacznego parowania z efektem krawędziowym23 podczas wymaganego długiego okresu inkubacji, co prowadzi do sztucznie zawyżonych odczytów gęstości optycznej. Powłoka przeciwmgielna pokrywy jest konieczną modyfikacją, ponieważ kondensacja pokrywy może również sztucznie podnieść wartości gęstości optycznej. Zalecaną modyfikacją jest potrząsanie płytkami w okresie inkubacji, ponieważ bakterie promieniowcowe mogą zbrylać się podczas wzrostu, dając sztucznie zawyżone wartości gęstości optycznej i skutecznie zmniejszając mnogość infekcji.
Stosunek bakterii do fagów w eksperymentach charakteryzujących dynamikę infekcji ma kluczowe znaczenie, ponieważ musi być wystarczająco dużo fagów, aby wykazać efekt infekcji, ale nie tak wiele, aby populacja bakterii gospodarza natychmiast się załamała9 lub częstotliwość lizogenii dramatycznie wzrosła28. W tej metodzie stosunkiem, który okazał się najbardziej skuteczny w uzyskiwaniu spójnych wyników, był MOI równy 1, ale użyteczne wyniki uzyskano również przy MOI 0,1 i 0,01. Przy wdrażaniu tej metody zaleca się wybór jednego stężenia bakterii i badanie wielu stężeń fagów w zakresie MOI 0,01-1 9,10,11.
Ta opisana tutaj technika pozwala na ocenę interakcji bakteriofag-gospodarz pod kątem wolno rosnących bakterii w wysokoprzepustowych testach mikropłytek, a nie przy pobieraniu podpróbek z większej kolby hodowlanej w każdym interwale pomiarowym29. Ponadto, demonstrując, w jaki sposób można dostosować testy wzrostu mikropłytek 9,10,11, technika ta zwiększa użyteczność innych testów bakteriofagowych opartych na mikropłytkach dla wolniej rosnących bakterii, w tym charakterystyki fagów 5,6,12 i badań ewolucji30,31. Wreszcie, metoda ta demonstruje użycie wskaźnika Stacy-Ceballosa16 do opisania infekcji bakteriofagowej. Metryka ta została początkowo opracowana na podstawie danych z archeonowego systemu modeli wirusów i jest obliczana na podstawie wartości gęstości optycznej, co zapewnia jej szerokie zastosowanie w różnych systemach wirusowych.

Bakteriofagi lub fagi to wirusy, które infekują bakterie. Są to najliczniejsze jednostki biologiczne na świecie1, i ogólnie przyjmuje się, że bakteriofagi wpływają na ewolucję bakterii i procesy ekosystemowe2,3,4. Istnieje kilka metod opisujących, mierzących i analizujących zakres gospodarzy bakteriofagów8 i dynamika infekcji5,6, w tym metody oparte na agarze, takie jak metoda agaru dwuwarstwowego7 oraz metody mikropłytek oparte na gęstości optycznej8,9,10,11,12. Każda metoda ma swoje wady i zalety. Ze względu na swoją skuteczność, testy galwaniczne przy użyciu metody agaru dwuwarstwowego są "złotym standardem" dla testów zakresu żywicieli, ale ta metoda jest czasochłonna i pracochłonna9. Szybkie metody mikropłytkowe, które zwracają wyniki w ciągu 24 godzin lub krócej, dają doskonałe wyniki dla szybko rosnących gospodarzy bakteryjnych, takich jak Escherichia coli9,10,11,12 ale są zbyt krótkie, aby pokazać postęp infekcji bakteriofagowej u wolniej rosnących gospodarzy bakteryjnych, takich jak promieniowce7,13,14,15.
Test mikropłytek oparty na gęstości optycznej, przeznaczony dla szybko rosnących bakterii, nie może być prowadzony przez wiele dni wymaganych do scharakteryzowania dynamiki infekcji w wolno rosnącej bakterii gospodarza bez wystąpienia parowania i sztucznie wysokiego zagęszczenia bakterii. W związku z tym uzyskanie porównywalnych danych o wysokiej przepustowości dotyczących dynamiki infekcji bakteriofagami dla wolno rosnących gatunków bakterii wymaga specjalistycznych technik dostosowanych do tych bakterii.
Przedstawiona tutaj metoda mikropłytek zmniejsza parowanie, umożliwiając w ten sposób współhodowlę wolno rosnących bakterii z fagiem przez dłuższy okres 96 godzin i umożliwiając badania dynamiki infekcji fagów i zakresu gospodarzy. Ta metoda prezentuje również indeks Stacy'ego-Ceballosa 16, metrykę opartą na gęstości optycznej, która umożliwia porównanie wirulencji między różnymi systemami gospodarz-wirus.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Omni-Pur</td><td>2090</td><td>do napełniania studzienek granicznych mikropłytek&nbsp;</td></tr><tr><td>Costar 96 Well Lid Low Eparation Corner Notch</td><td>Corning</td><td>3931</td><td>wymienna pokrywka mikropłytki</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A461-4</td><td>do powlekania pokrywki</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Tecan Spark 20M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do mikropłytek z 4-miejscową platformą</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88-861-023</td><td>do potrząsania płytkami podczas inkubacji</td></tr><tr><td>Non-Tissue Płytka poddana kulturze 96-dołkowa</td><td>Falcon (marka Corning)</td><td>351172</td><td>mikropłytka do oznaczania krzywej wzrostu</td></tr><tr><td>Agar z drożdży peptonowych wapniowych (PYCa)</td><td>domowej roboty</td><td></td><td>1 g peptonu 15 g ekstraktu drożdżowego 15 g agaru 990 ml dd H2O 4,5 ml 1 M CaCl2 2,5 ml 40% dekstrozy 1 ml 10 mg/ml cykloheksymidu</td></tr><tr><td>Peptonowy bulion drożdżowy wapniowy (PYCa)</td><td>domowej roboty, z numeru referencyjnego 16</td><td></td><td>1 g peptonu 15 g ekstraktu drożdżowego 990 ml dd H2O 4,5 ml 1 M CaCl2 2,5 ml 40% dekstrozy 1 ml 10 mg/ml cykloheksymidu</td></tr><tr><td>Pepton drożdży wapń ( PYCa) agar górny</td><td>Domowe</td><td></td><td>1 g peptonu 15 g ekstraktu drożdżowego 4 g agaru 990 ml dd H2O 4,5 ml 1M CaCl2 2,5 ml 40% dekstrozy</td></tr><tr><td>Płytki Petriego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>do oznaczania stężenia bakterii i oznaczania miana fagów</td></tr><tr><td>Bufor fagowy</td><td>domowej roboty, z Odniesienie 7</td><td></td><td>10 ml 1 M Tris, pH 7,5 10 ml 1 M MgSO4 4 g NaCl 980 ml dd Oprogramowanie H2O</td></tr><tr><td>R</td><td>https://www.r-project.org/</td> <td>wersja 4.3.0</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna jednorazowa kolba PETG z przegrodowym dnem z wentylowanym zamknięciem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4116-1000</td><td>do hodowli bakteryjnych</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9036-19-5</td><td>do powlekania pokrywy</td></tr></tbody></table>

dostosowany test mikropłytkowy oparty na gęstości optycznej do charakteryzowania zakażenia promieniowcem

An Adapted Optical Density-Based Microplate Assay for Characterizing Actinobacteriophage Infection

Bakteriofagi są kluczowym elementem naturalnego środowiska i mają potężną zdolność do kształtowania populacji bakterii. Aby zrozumieć, w jaki sposób poszczególne fagi oddziałują z wolno rosnącymi gospodarzami bakteryjnymi, takimi jak promieniowce, potrzebna jest łatwa i niezawodna metoda ilościowego określania długoterminowego wzrostu bakterii w obecności fagów. Czytniki mikropłytek spektrofotometrycznych pozwalają na powtarzalne pomiary o wysokiej przepustowości, ale inkubacja małej objętości przez dłuższy czas może stanowić wyzwanie techniczne. Procedura ta dostosowuje standardową 96-dołkową mikropłytkę, aby umożliwić kohodowlę fagów i bakterii bez pobierania podpróbek przez 96 godzin, przy czym wzrost bakterii rejestruje się co 8 godzin przy użyciu spektrofotometrycznych wartości absorbancji. Te wartości gęstości optycznej są analizowane przy użyciu R w celu uzyskania wskaźników infekcji, w tym procentowego zahamowania wzrostu, względnej zjadliwości i wskaźnika Stacy'ego-Ceballosa. Przedstawione tutaj metody zapewniają skuteczny sposób przeprowadzania i analizowania eksperymentów z krzywą wzrostu mikropłytek o wydłużonym czasie trwania i obejmują modyfikacje w celu zmniejszenia parowania i kondensacji pokrywy. Protokoły te ułatwiają przeprowadzanie testów interakcji między wolno rosnącymi gospodarzami bakteryjnymi a ich bakteriofagami.

Eksperyment uznaje się za udany, jeśli wynikowa krzywa wzrostu wykazuje wzrost populacji bakterii w kontroli pozytywnej w czasie, bez nagłych wahań absorbancji. Przykłady udanego eksperymentu przy MOI wynoszącym 1 z produktywną infekcją fagową oraz bez niej przedstawiono odpowiednio na Rysunku 2 i Rysunku 3. Produktywną infekcję przy MOI 0,01 przedstawiono na Rysunku 4. Wzorzec wzrostu kontroli pozytywnej (zielona krzywa) widoczny na wszystkich trzech rysunkach wskazuje, że bakterie rosną, nie tworzą agregatów podczas wzrostu i nie występują zanieczyszczenia. Agregację i zanieczyszczenie sygnalizuje nietypowo wysoka absorbancja w pojedynczym punkcie czasowym. Odchylenia standardowe zazwyczaj rosną w czasie trwania eksperymentu; jednak gwałtowny wzrost lub nakładanie się odchyleń standardowych między krzywą kontrolną a zainfekowaną może wskazywać na zanieczyszczenie lub agregację w jednym lub więcej dołkach.
Krzywa wzrostu obrazująca produktywną infekcję fagową, przedstawiona na Rysunku 2, wykazuje spadek absorbancji bakterii w czasie w dołkach, do których dodano faga. Tego spadku gęstości bakterii nie zaobserwuje się, jeśli bakteria znajduje się poza zakresem gospodarzy faga, co pokazano na Rysunku 3.
Wskaźniki infekcji przedstawiono dla wszystkich reprezentatywnych eksperymentów, z relatywnie dużym ISC dla infekcji produktywnych na Rysunku 2 i Rysunku 4 oraz bardzo małym ISC na Rysunku 3 dla faga, który nie infekował efektywnie bakterii gospodarza.
<img alt="Schemat płytki ELISA z wzorami kropek; wyniki detekcji białek; analiza; test immunoenzymatyczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65482/65482fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Układ mikropłytki. Obszary szare są wypełnione 0,1% agarozą. Puste dołki w kolumnie 3 i kolumnie 4 stanowią dodatnie kontrole bez faga, zawierające jedynie bufor do fagów oraz bakterie w stężeniu 2,0 x 106 cfu/mL. Dołki z kropkami zawierają fagi i bakterie w stężeniu 2,0 x 106 cfu/mL; duże kropki w kolumnie 5 i kolumnie 6 oznaczają MOI równy 1 przy stężeniu fagów 2,0 x 106 pfu/mL; średnie kropki w kolumnie 7 i kolumnie 8 oznaczają MOI równy 0,1 przy stężeniu fagów 2,0 x 105 pfu/mL; a małe kropki w kolumnie 9 i kolumnie 10 oznaczają MOI równy 0,01 przy stężeniu fagów 2,0 x 104 pfu/mL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65482/65482fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Krzywa wzrostu bakterii; absorbancja w funkcji godzin po infekcji; wykres przedstawiający dane eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65482/65482fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Pomyślny eksperyment z krzywą wzrostu z użyciem faga przy MOI równym 1, który produktywnie infekuje bakterię gospodarza. Przedstawiono średnie wartości absorbancji (± odchylenie standardowe) dla bakterii nieinfekowanych (kolor zielony) oraz bakterii z dodanym fagiem (kolor niebieski). Skróty: AUC = pole pod krzywą; PIAUC = procentowe zahamowanie wzrostu obliczone na podstawie pola pod krzywą; Nasymptote = szczytowa wartość wzrostu; PImax = procentowe zahamowanie wzrostu obliczone na podstawie szczytowych wartości wzrostu; ISC = indeks Stacy-Ceballos. Wykres ten przedstawia temperowany fag Gordonia DelRio infekujący G. terrae, bakterię, z której został wyizolowany. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65482/65482fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres krzywej wzrostu absorbancji; OD 600nm w funkcji godzin po infekcji; analiza danych modelu infekcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65482/65482fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Pomyślny eksperyment z krzywą wzrostu dla faga przy MOI równym 1, który nie infekuje wydajnie bakterii gospodarza. Średnie wartości absorbancji (± odchylenie standardowe) przedstawiono dla bakterii nieinfekowanych (kolor zielony) oraz bakterii z dodanym fagiem (kolor niebieski). Skróty: AUC = pole pod krzywą; PIAUC = procentowe zahamowanie wzrostu obliczone na podstawie pola pod krzywą; Nasymptote = szczytowa wartość wzrostu; PImax = procentowe zahamowanie wzrostu obliczone na podstawie szczytowych wartości wzrostu; ISC = indeks Stacy-Ceballos. Wykres przedstawia infekcję G. rubripertincta przez DelRio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65482/65482fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza krzywej wzrostu bakterii, OD 600nm w funkcji czasu, wykres z danymi absorbancji po infekcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65482/65482fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Pomyślny eksperyment z krzywą wzrostu z użyciem faga przy MOI wynoszącym 0,01. Przedstawiono średnie wartości absorbancji (± odchylenie standardowe) dla bakterii nieinfekowanych (zielony) oraz bakterii z dodanym fagiem (niebieski). Skróty: AUC = pole pod krzywą; PIAUC = procentowe zahamowanie wzrostu obliczone na podstawie pola pod krzywą; Nasymptote = maksymalna wartość wzrostu; PImax = procentowe zahamowanie wzrostu obliczone na podstawie maksymalnych wartości wzrostu; ISC = indeks Stacy-Ceballos. Wykres ten przedstawia infekcję G. terrae fagiem DelRio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65482/65482fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Opisano metodę mikropłytek opartą na gęstości optycznej, która pozwala określić ilościowo długoterminowy wzrost bakterii w obecności bakteriofagów, odpowiednich dla promieniowców i innych wolno rosnących bakterii. Metoda ta obejmuje modyfikacje mające na celu zmniejszenie parowania i kondensacji pokrywy oraz kod R do obliczania wskaźników infekcji wirusowej, w tym obszaru pod krzywą, maksimum wzrostu i względnej zjadliwości.

Dostosowany test mikropłytkowy oparty na gęstości optycznej do charakteryzowania zakażenia promieniowcem

Bacteriophages are a key part of natural environments, and they have a powerful ability to shape bacterial populations. To understand how individual ...

Docelowo interesują nas interakcje bakteriofagów z gospodarzami. Protokół ten umożliwia pomiar infekcji fagowej u wolno rosnących bakterii, generując opisowe wskaźniki infekcji. Metodologia ta ma zasadnicze znaczenie w badaniu koewolucji gospodarza bakteriofagów u wolno rosnących bakterii promieniowców.Szybkie metody mikropłytek dają doskonałe wyniki w przypadku szybko rosnących gospodarzy bakteryjnych, ale są zbyt krótkie, aby pokazać postęp infekcji bakteriofagowej u wolniej rosnących gospodarzy bakteryjnych, takich jak promieniowce. Nasza metoda jest dostosowana do wolno rosnących bakterii, co pozwala na jednoczesną hodowlę bakterii i fagów przez wiele dni wymaganych do scharakteryzowania dynamiki infekcji bakteriofagowej. Nasz protokół umożliwia ocenę interakcji bakteriofagów z gospodarzem pod kątem wolno rosnących bakterii na mikropłytkach, zamiast wymagać pobierania podpróbek z większej kolby hodowlanej.Protokół ten wykorzystuje łatwo dostępne materiały w celu dostosowania się do wydłużonego czasu hodowli i umożliwia sianie wielu powtórzeń na jednej mikropłytce. Na początek dodaj sześć mililitrów roztworu do powlekania pokrywki na wewnętrzną powierzchnię sterylnej 96-dołkowej pokrywki mikropłytki, trzymając ją za krawędzie. Obróć pokrywkę, aby zapewnić całkowite pokrycie roztworu.Pozostaw roztwór na 20 sekund przed wylaniem. Odwróć pokrywkę na autoklawowany ręcznik papierowy pod kątem i pozostaw do wyschnięcia na 35 do 45 minut. Schłodzić stopioną agarozę do temperatury od 50 do 60 stopni Celsjusza.Następnie odpipetować 100 mikrolitrów 0,1% roztworu agarozy do przestrzeni między dołkami płytki. Następnie odpipetować 200 mikrolitrów agarozy do studzienek znajdujących się w rzędzie A, rzędzie H, kolumnie pierwszej, kolumnie drugiej, kolumnie 11 i kolumnie 12. Weź wcześniej przygotowaną mikropłytkę z roztworem przeciwmgielnym i agarozą.Odpipetować 75 mikrolitrów bakterii do kolumn od trzech do 10. Następnie dodaj 75 mikrolitrów sterylnego buforu fagowego do studzienek w kolumnach trzeciej i czwartej jako kontrolę pozytywną bez faga. Wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół po każdym dodaniu, następnie dodać 75 mikrolitrów faga o różnych stężeniach do kolumn i wymieszać każdy roztwór, pipetując ponownie w górę i w dół po każdym dodaniu.Przyklej oba krótsze boki tabliczki za pomocą taśmy opisowej 0,5 cala, która częściowo uszczelni płytkę, umożliwiając jednocześnie wymianę gazową. Inkubować płytkę na wytrząsarce do mikropłytek i mierzyć gęstość optyczną za pomocą czytnika mikropłytek. Następnie, za pomocą pomiarów gęstości optycznej, wygeneruj krzywe wzrostu kontrolne i zainfekowane.Krzywa wzrostu przedstawia produktywną infekcję fagową objawiającą się zmniejszoną absorbancją bakterii w czasie w studzienkach z dodatkiem faga, to zmniejszenie gęstości bakterii nie będzie widoczne, jeśli bakteria znajduje się poza zakresem gospodarza faga.

an-adapted-optical-density-based-microplate-assay-for-characterizing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Prostą metodą identyfikacji priorytetowych patogenów bakteryjnych jest zastosowanie genetycznie zmodyfikowanych fagów reporterowych. Fagi reporterowe te, specyficzne dla konkretnych gatunków gospodarzy, są zdolne do szybkiej transdukcji sygnału bioluminescencyjnego w komórkach gospodarza. W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie fagów reporterowych do detekcji Yersinia pestis.

„Bioluminescencyjny” fagi raportujący do detekcji bakteryjnych patogenów kategorii A

Tutaj prezentujemy protokół ilościowego oznaczania fagocytozy cząstek fluorescencyjnych za pomocą przylegającej linii komórkowej makrofagów przy użyciu metody fluorometrycznej. Metoda ta ułatwia wysokoprzepustową kwantyfikację internalizacji cząstek, a także wynikającą z niej polimeryzację aktyny.

Wysokoprzepustowa technika fluorometryczna do oceny fagocytozy makrofagów i polimeryzacji aktyny

Tutaj prezentujemy fenomiczne podejścia do funkcjonalnej charakterystyki domniemanych genów fagowych. Techniki obejmują opracowany test zdolny do monitorowania metabolizmu anabolicznego gospodarza, płytki do oznaczania wielu fenotypów (MAP), oprócz uznanej metody metabolomiki, zdolnej do pomiaru wpływu na metabolizm kataboliczny.

Fenomika fagów: fizjologiczne podejścia do charakterystyki nowych białek wirusowych

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru zjadliwości bakterii planktonowych lub przyczepionych powierzchniowo przy użyciu D. discoideum (ameba) jako gospodarza. Wirulencję mierzy się przez okres 1 godziny, a zabijanie gospodarza określa się ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i analizy obrazu. Demonstrujemy ten protokół za pomocą bakterii P. aeruginosa.

Szybki test zjadliwości bakterii oparty na obrazie przy użyciu ameby

Powtarzalna, dokładna i efektywna czasowo metoda ilościowego PCR (qPCR) do oznaczania bakteriofagów T7 jest opisana tutaj. Protokół jasno opisuje przygotowanie genomowego DNA fagowego, przygotowanie reakcji PCR, warunki cykliczne qPCR i analizę danych qPCR.

Ilościowy PCR bakteriofaga T7 z biopanowania

Ten protokół opisuje solidną metodę korzystania z ustawień o wysokiej przepustowości do badania skuteczności przeciwbakteryjnej koktajli bakteriofagowych.

Skuteczność bakteriofagów w biokontroli patogenów przenoszonych przez żywność oceniana za pomocą ustawień o wysokiej przepustowości

Tutaj przedstawiamy zasadę, strukturę i instrukcję inteligentnego, wysokoprzepustowego systemu testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe/przesiewowego fagów. Jego zastosowanie ilustruje przykład Salmonelli wyizolowanej z drobiu w Shandong w Chinach. Obliczany jest indeks Lar, a jego znaczenie w ocenie oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe jest szczegółowo omawiane.

Zastosowanie inteligentnego, wysokowydajnego systemu badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe/przesiewowego fagów oraz wskaźnika Lar oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Bakteriofagi (fagi), wirusy infekujące bakterie, są integralnym składnikiem mikrobiomu jelitowego. Chociaż ci symbiotyczni mieszkańcy napędzają sprawność bakterii i dynamikę populacji, niewiele wiadomo o tym, jak wpływają na homeostazę i choroby jelit. W tym protokole bada się izolowane fagi T4 w modelu mysim, które można dostosować do innych par-bakteria.

Interakcja bakteriofaga T4 i E. coli w jelicie myszy: prototypowy model do badania dynamiki gospodarz-bakteriofag in vivo

W tym miejscu opisano metody pobierania próbek ze stref eufotowych ekosystemów morskich i słodkowodnych w celu wyizolowania cyjanofagów (i ich gospodarzy) oraz procesy po pobraniu próbek, które wzbogacają pojedyncze genotypy i charakteryzują dynamikę interakcji wirus-gospodarz.

Pobieranie próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetycznych i ich wirusów: od terenu do laboratorium

Utrzymanie czystości optyki mikroskopu jest kluczowe dla uzyskania obrazowania wysokiej jakości. Kurz, odciski palców, nadmiar olejku imersyjnego lub medium montażowego na powierzchni lub wewnątrz mikroskopu powodują spadek kontrastu i rozdzielczości. Metoda DIC jest szczególnie wrażliwa na zanieczyszczenia i zarysowania powierzchni soczewek. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje procedurę czyszczenia mikroskopu.

Właściwa pielęgnacja i czyszczenie mikroskopu

Poznaj metodę mikropłytkową opartą na gęstości optycznej do charakteryzowania zakażenia bakteriofagami w wolno rosnących promieniowcach. Protokół umożliwia współhodowlę i analizę dynamiki infekcji.

Dostosowany test mikropłytkowy oparty na gęstości optycznej do charakteryzowania zakażenia promieniowcem

Przeglądaj więcej filmów