Dostosowany test mikropłytkowy oparty na gęstości optycznej do charakteryzowania zakażenia promieniowcem
30 czerwca 2023
Opisano metodę mikropłytek opartą na gęstości optycznej, która pozwala określić ilościowo długoterminowy wzrost bakterii w obecności bakteriofagów, odpowiednich dla promieniowców i innych wolno rosnących bakterii. Metoda ta obejmuje modyfikacje mające na celu zmniejszenie parowania i kondensacji pokrywy oraz kod R do obliczania wskaźników infekcji wirusowej, w tym obszaru pod krzywą, maksimum wzrostu i względnej zjadliwości.
Docelowo interesują nas interakcje bakteriofagów z gospodarzami. Protokół ten umożliwia pomiar infekcji fagowej u wolno rosnących bakterii, generując opisowe wskaźniki infekcji. Metodologia ta ma zasadnicze znaczenie w badaniu koewolucji gospodarza bakteriofagów u wolno rosnących bakterii promieniowców.
Szybkie metody mikropłytek dają doskonałe wyniki w przypadku szybko rosnących gospodarzy bakteryjnych, ale są zbyt krótkie, aby pokazać postęp infekcji bakteriofagowej u wolniej rosnących gospodarzy bakteryjnych, takich jak promieniowce. Nasza metoda jest dostosowana do wolno rosnących bakterii, co pozwala na jednoczesną hodowlę bakterii i fagów przez wiele dni wymaganych do scharakteryzowania dynamiki infekcji bakteriofagowej. Nasz protokół umożliwia ocenę interakcji bakteriofagów z gospodarzem pod kątem wolno rosnących bakterii na mikropłytkach, zamiast wymagać pobierania podpróbek z większej kolby hodowlanej.
Protokół ten wykorzystuje łatwo dostępne materiały w celu dostosowania się do wydłużonego czasu hodowli i umożliwia sianie wielu powtórzeń na jednej mikropłytce. Na początek dodaj sześć mililitrów roztworu do powlekania pokrywki na wewnętrzną powierzchnię sterylnej 96-dołkowej pokrywki mikropłytki, trzymając ją za krawędzie. Obróć pokrywkę, aby zapewnić całkowite pokrycie roztworu.
Pozostaw roztwór na 20 sekund przed wylaniem. Odwróć pokrywkę na autoklawowany ręcznik papierowy pod kątem i pozostaw do wyschnięcia na 35 do 45 minut. Schłodzić stopioną agarozę do temperatury od 50 do 60 stopni Celsjusza.
Następnie odpipetować 100 mikrolitrów 0,1% roztworu agarozy do przestrzeni między dołkami płytki. Następnie odpipetować 200 mikrolitrów agarozy do studzienek znajdujących się w rzędzie A, rzędzie H, kolumnie pierwszej, kolumnie drugiej, kolumnie 11 i kolumnie 12. Weź wcześniej przygotowaną mikropłytkę z roztworem przeciwmgielnym i agarozą.
Odpipetować 75 mikrolitrów bakterii do kolumn od trzech do 10. Następnie dodaj 75 mikrolitrów sterylnego buforu fagowego do studzienek w kolumnach trzeciej i czwartej jako kontrolę pozytywną bez faga. Wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół po każdym dodaniu, następnie dodać 75 mikrolitrów faga o różnych stężeniach do kolumn i wymieszać każdy roztwór, pipetując ponownie w górę i w dół po każdym dodaniu.
Przyklej oba krótsze boki tabliczki za pomocą taśmy opisowej 0,5 cala, która częściowo uszczelni płytkę, umożliwiając jednocześnie wymianę gazową. Inkubować płytkę na wytrząsarce do mikropłytek i mierzyć gęstość optyczną za pomocą czytnika mikropłytek. Następnie, za pomocą pomiarów gęstości optycznej, wygeneruj krzywe wzrostu kontrolne i zainfekowane.
Krzywa wzrostu przedstawia produktywną infekcję fagową objawiającą się zmniejszoną absorbancją bakterii w czasie w studzienkach z dodatkiem faga, to zmniejszenie gęstości bakterii nie będzie widoczne, jeśli bakteria znajduje się poza zakresem gospodarza faga.
Przegląd
To badanie przedstawia nową metodę mikroplatek opartą na gęstości optycznej do ilościowego określania długotrwałego wzrostu bakterii w obecności bakteriofagów, specjalnie przystosowaną do wolno rosnących bakterii, takich jak aktinomicety. Ten protokół radzi sobie z wyzwaniami związanymi z pomiarem dynamiki infekcji bakteriofagami w takich gospodarzach bakteryjnych, umożliwiając współhodowlę przez dłuższy czas i ułatwiając szczegółową analizę metryk infekcji.
Kluczowe komponenty badania
Obszar badań
- Interakcje bakteriofagów i ich gospodarzy
- Współewolucja bakterii i bakteriofagów
- Ilościowe określenie wzrostu bakterii
Tło
- Wyzwania w badaniu wolno rosnących bakterii
- Potrzeba rozszerzonych metodologii hodowlańczych
- Znaczenie pomiaru dynamiki infekcji fagowej
Zastosowane metody
- Pomiar gęstości optycznej za pomocą czytnika mikroplatek
- Wolno rosnące aktinomicety jako system biologiczny
- Zastosowanie agarozy dla dłuższych czasów hodowlańczych
Główne wyniki
- Opracowano metodę nadającą się do ilościowego określania wzrostu bakterii w obecności fagów
- Zgenerowano opisowe metryki infekcji, takie jak krzywe wzrostu
- Wyznaczono wpływ infekcji faga na gęstość bakteryjną
Konkluzje
- Badanie dostarcza niezawodnej metody ilościowego określania interakcji fagi-bakterie w wolno rosnących bakteriach
- Przyczynia się do zrozumienia dynamiki współewolucji w systemach bakteriofag-gospodarz
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying bacteriophage infection dynamics in slow-growing actinomycetes is critical for understanding host-pathogen interactions and de-risking early discovery in antimicrobial R&D. This adapted optical density-based microplate assay enables high-throughput, reproducible measurement of infection metrics over extended periods, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. The protocol's scalability and quantitative outputs position it as a reusable asset for portfolio-wide evaluation of phage-bacteria systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of phage-host interactions in slow-growing bacteria.
- Supports functional target validation by measuring infection progression and host specificity.
- Facilitates mechanistic de-risking through descriptive infection metrics such as growth inhibition and relative virulence.
- Provides data to inform predictive confidence and triage of antimicrobial candidates.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microplate-based systems for high-throughput screening of phage efficacy.
- Standardizes assay conditions for reproducibility and cross-lab comparability.
- Generates quantitative optical density outputs for robust compound or phage evaluation.
- Enables scalable, multi-replicate workflows for efficient screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns infection metrics with translational endpoints relevant to antimicrobial development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling long-term infection studies.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in phage therapy pipelines.
- Enhances predictive de-risking for candidate selection in disease-relevant bacterial systems.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and infection metric quantification in slow-growing bacterial models.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of phage infectivity and host range.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for comparative analysis of phage or compound effects.
- Analytics: Provides infection metrics such as percent growth inhibition and Stacy-Ceballos index for data-driven decisions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by modeling long-term infection dynamics in relevant hosts.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable platform adaptable across diverse phage-bacteria systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in phage-host studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput for infection assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust infection metrics.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of antimicrobial candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microplate assay setup and optical density measurement.
- Needs access to spectrophotometric microplate readers and R-based analytical tools.
- Demands cross-team standardization of assay conditions and data analysis protocols.
- Adaptation may be necessary for different slow-growing bacterial models.
- Evaporation and condensation control are critical for extended-duration assays.
