Podstawowy trójwymiarowy (3D) model jelitowy z komponentem odpornościowym

Zakres badań polega na wykorzystaniu tych in vitro trójwymiarowych modeli ludzkich linii komórkowych do badania faktu obecności korzystnych i pomocnych związków na tkankach jelit. Modele te mogą być wykorzystywane do pogłębiania badań nad zrozumieniem, a także jako podstawowe modele leków. Stosując związki pochodzenia roślinnego, spermidynę i eugenol, zarówno osobno, jak i razem w formie suplementów, mierzymy korzystne zwiększenie autofagii oraz wzrost stanu zapalnego za pomocą tych modeli.

Dodatkowo mogliśmy pokazać potencjalnie szkodliwy wpływ glutenu ekstrahowanego z niektórych odmian pszenicy na tkanki jelit. Obecnie stosujemy ekonomiczny, standaryzowany, łatwo powtarzalny system in vitro, który lepiej odzwierciedla fizjologię ludzkiego jelita jako alternatywę dla modeli zwierzęcych. Ponieważ używamy także komercyjnej linii komórkowej ludzkiej zamiast komórek pochodzących z roślin, odpowiedzi z badania są bardziej przydatne dla ogólnej populacji.

Protokół opiera się całkowicie na użyciu trzech różnych linii. Dzięki temu model jest bardziej ustandaryzowany i powtarzalny. Ponadto najbardziej równoczesna hodowla trzech różnych linii komórkowych: enterocytów, fibroblastów i komórek układu odpornościowego pozwala na reakcje komórkowe bliższe tym, które dzieją się u pacjenta.

Aby zacząć, wybierz płytkę z 24 dołkami zawierającą wkłady z filtrami 0,4 mikrona. Za pomocą pipety dodaj 500 mikrolitrów HBSS poniżej i powyżej wkładów filtracyjnych. Następnie zamykam płytę wielodołową i umieszczam ją w inkubatorze na dwie godziny. Po inkubacji ostrożnie zasysaj HBSS z płytki.

Przygotuj bezkomórkowy roztwór kolagenu w sterylnej probówce 50-mililitrowej w DMEM na lodzie. Dodaj 250 mikrolitrów kolagenu nad filtr membranowy i umieść pokrywkę na talerzu. Pozwól roztworowi zpolimeryzować tę temperaturę pokojową.

Następnie usuń hodowlę komórek fibroblastu L929 z inkubatora. Dodaj do kolby dwa mililitry podgrzanego roztworu trypsyny-EDTA i umieść ją w inkubatorze na trzy do pięciu minut. Przenieś zawiesinę ogniwa do sterylnej rurki 15-mililitrowej i wiruj w 645 g przez pięć minut.

Za pomocą pompy próżniowej zasysaj supernatant i ponownie zawiesij pellet w jednym mililitrze DMEM. Dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do probówki zawierającej 20 mikrolitrów roztworu Trypan Blue i użyj komory liczącej komórki do oceny gęstości komórek. Następnie usuń hodowlę komórek monocytów U937 z inkubatora.

Wiruj zawiesinę ogniwową i ponownie zawiesij granulkę w jednym mililitrze RPMI. Po upewnieniu się, że komórki są jednorodnie zawieszone, licz je za pomocą komory do liczenia komórek. Następnie przygotuj zawiesiny komórkowe zawierające odpowiednio 50 000 komórek L929 i 15 000 U937 w 50 mikrolitrach DMEM.

Każdą zawiesinę o pojemności 50 mikrolitrów należy dodać do 450 mikrolitrów kolagenu i dokładnie wymieszać. Nałóż na wcześniej powlekaną bezkomórkową laminę proprię 500 mikrolitrów roztworu komórek kolagenowych. Zamknij talerz i umieść go w inkubatorze na dwie godziny, aby roztwór się zwiesnął.

Następnie usuń hodowlę komórek Caco-2 z inkubatora. Za pomocą pompy próżniowej zasysaj podłoże i przepłucz ogniwa 10 mililitrami PBS. Dodaj pięć mililitrów roztworu PBS Trypsin-EDTA i umieść go w inkubatorze na pięć do ośmiu minut.

Następnie odwiruj zawiesinę komórkową i ponownie zawiesij pellet w jednym mililitrze DMEM. Po liczeniu przygotuj zawiesinę komórkową zawierającą 150 000 komórek Caco-2 i 50 mikrolitrów DMEM. Umieść talerz w laminarnym okapie na 10 minut, zanim przeniesiesz go do inkubatora.

Po 30 minutach należy dodać 500 mikrolitrów DMEM powyżej zrekonstruowanego modelu i 500 mikrolitrów pod filtr, a następnie zwrócić płytkę do inkubatora. Następnego dnia ostrożnie wymień podłoże na 500 mikrolitrów świeżego DMEM odpowiednio nad i pod filtrem. Aby osadzić komórki w parafinie, ustaw maszynę do parafiny na 58 stopni Celsjusza.

Za pomocą szczypiec przenieś wkładki membranowe do czyszczących dołków sterylnej płyty z 24 dołkami. Dodaj 500 mikrolitrów 37% buforowanej formaliny i PBS nad filtrem oraz jeden mililitr poniżej filtra. Zamknij pokrywę i zostaw talerz w okapie na dwie godziny.

Po odłączeniu lamina propria od wkładu błonowego należy przenieść błonę śluzową do zlewki zawierającej 25 mililitrów 35% etanolu i inkubować przez 10 minut. Po odwodnieniu i zwiększeniu stężenia etanolu należy umieścić próbki w 50 mililitrach ksylenu lub histologicznego środka oczyszczającego na 10 do 20 minut. Gdy próbki są przezroczyste, umieść je w metalowym otucie na kasetę na papier i zanurz w ciekłej parafinie wewnątrz podgrzewanej maszyny.

Po 45 minutach użyj mikrotomu, aby wyciąć cztery mikronowe sekcje. Połóż wyciętą część na przekładkach i susz je w piecu w 37 stopniach Celsjusza przez 24 godziny. Akceptowalny trójwymiarowy model błony śluzowej jelitowej składa się z komórek Caco-2 utworzonych w ciasnej i regularnej monowarstwie nad warstwą bogatą w matrycę zewnątrzkomórkową.

Nieakceptowalne modele obejmują te wykazujące nadmierny wzrost, nieuporządkowane warstwy nabłonka, deformacje lub brak formowania się warstwy nabłonkowej. Prozapalny efekt białka pszennego o wysokiej zawartości glutenu zakłócał monowarstwę komórkową i zmniejszał grubość warstwy nabłonkowej w porównaniu z grupą kontrolną. Zawartość białka okludyny była istotnie wyższa w grupie kontrolnej niż w grupie wystawionej na białko glutenowe. Barwienia CD14 i CD11b monoocytów U937 wykazały, że białko pszenne o wysokiej zawartości glutenu aktywowało monocyty i indukowało ich migrację oraz różnicowanie się w makrofagi.

W ramach wyzwania lipopolisacharydowego komórki Caco-2 zwiększały produkcję śluzu i uwalnianie markera zapalnego – midkine.