Podstawowy trójwymiarowy (3D) system modelowania jelit z komponentem immunologicznym

Zakres prac polega na wykorzystaniu tych trójwymiarowych modeli linii komórkowych człowieka in vitro do zbadania faktu obecności korzystnych i pomocnych związków w tkance jelitowej. Modele te mogą być wykorzystane do pogłębienia wiedzy badawczej, a także jako podstawowe modele leków. Używając związków pochodzenia roślinnego, spermidyny i eugenolu, zarówno osobno, jak i razem w postaci suplementu, mierzymy korzystny wzrost autofagii i wzrost stanu zapalnego za pomocą tych modeli.

Wtedy też udało nam się wykazać potencjalnie szkodliwy wpływ glutenu ekstrahowanego z niektórych odmian pszenicy na tkanki jelitowe. Obecnie korzystamy z ekonomicznego, ustandaryzowanego, łatwo powtarzalnego systemu in vitro, który lepiej odzwierciedla fizjologię ludzkiego jelita jako alternatywę dla modeli zwierzęcych. Ponieważ używamy również komercyjnej ludzkiej linii komórkowej, a nie komórek pochodzenia roślinnego, odpowiedzi z badania są bardziej odpowiednie dla populacji ogólnej.

Protokół opiera się w całości na wykorzystaniu trzech różnych linii. Dzięki temu model jest bardziej ustandaryzowany i powtarzalny. Co więcej, najbardziej jednoczesna hodowla trzech różnych linii komórkowych, enterocytów, fibroblastów i komórek układu odpornościowego, pozwala na odpowiedzi komórkowe, które są bliższe temu, co dzieje się u pacjenta.

Aby rozpocząć, wybierz 24-dołkową płytkę zawierającą wkładki z filtrami 0,4 mikrona Za pomocą pipety dodaj 500 mikrolitrów HBSS poniżej i powyżej wkładów filtracyjnych. Następnie zamknij płytkę wielodołkową i umieść ją w inkubatorze na dwie godziny. Po inkubacji ostrożnie odessać HBSS z płytki.

Przygotuj bezkomórkowy roztwór kolagenu w sterylnej 50-mililitrowej probówce w DMEM na lodzie. Dodaj 250 mikrolitrów kolagenu nad filtrem membranowym i umieść pokrywkę na płytce. Pozwól, aby roztwór spolimeryzował tę temperaturę pokojową.

Następnie należy usunąć hodowlę komórek fibroblastów L929 z inkubatora. Dodaj dwa mililitry podgrzanego roztworu trypsyny-EDTA do kolby i umieść ją w inkubatorze na trzy do pięciu minut. Przenieś zawiesinę komórek do sterylnej 15-mililitrowej probówki i odwiruj przy 645 g przez pięć minut.

Za pomocą pompy próżniowej odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze DMEM. Dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do probówki zawierającej 20 mikrolitrów roztworu błękitu trypanowego i użyj komory do zliczania komórek, aby ocenić gęstość komórek. Następnie wyjmij hodowlę komórek monocytów U937 z inkubatora.

Odwirować zawiesinę ogniw i ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze RPMI. Po upewnieniu się, że komórki są jednorodnie zawieszone, policz je za pomocą komory do liczenia komórek. Następnie przygotuj zawiesiny komórek zawierające odpowiednio 50 000 komórek L929 i 15 000 komórek U937 w 50 mikrolitrach DMEM.

Dodaj każdą 50 mikrolitrową zawiesinę komórkową do 450 mikrolitrów kolagenu i dokładnie wymieszaj. Na wstępnie pokrytą, bezkomórkową blaszkę właściwą nałożyć 500 mikrolitrów roztworu komórek kolagenowych. Zamknij płytkę i umieść ją w inkubatorze na dwie godziny, aby roztwór stężał.

Następnie wyjmij kulturę komórkową Caco-2 z inkubatora. Za pomocą pompy próżniowej odessać pożywkę i przepłukać komórki 10 mililitrami PBS. Dodaj pięć mililitrów roztworu PBS Trypsin-EDTA i umieść go w inkubatorze na pięć do ośmiu minut.

Następnie odwirować zawiesinę komórek i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze DMEM. Po zliczeniu należy przygotować zawiesinę komórkową zawierającą 150 000 komórek Caco-2 i 50 mikrolitrów DMEM. Umieść płytkę w okapie z przepływem laminarnym na 10 minut przed przeniesieniem jej do inkubatora.

Po 30 minutach dodać 500 mikrolitrów DMEM powyżej zrekonstruowanego modelu i 500 mikrolitrów poniżej filtra i zwrócić płytkę do inkubatora. Następnego dnia ostrożnie zastąp pożywkę 500 mikrolitrami świeżego DMEM odpowiednio powyżej i poniżej filtra. W celu zatapiania komórek w parafinie należy ustawić maszynę do parafiny na 58 stopni Celsjusza.

Za pomocą szczypiec przenieś wkładki membranowe do czystych studzienek sterylnej płytki 24-dołkowej. Dodaj 500 mikrolitrów 37% buforowanej formaliny i PBS powyżej filtra i jeden mililitr poniżej filtra. Zamknij pokrywkę i pozostaw płytkę w dygestorium na dwie godziny.

Po odłączeniu blaszki właściwej od wkładu membranowego przenieś błonę śluzową jelita do zlewki zawierającej 25 mililitrów 35% etanolu i inkubuj przez 10 minut. Po odwodnieniu i zwiększeniu stężenia etanolu należy umieścić próbki w 50 mililitrach ksylenu lub histologicznego środka czyszczącego na 10 do 20 minut. Gdy próbki staną się przezroczyste, umieść je w metalowym uchwycie na chusteczki higieniczne i zanurz je w ciekłej parafinie wewnątrz rozgrzanej maszyny.

Po 45 minutach za pomocą mikrotomu przeciąć cztery mikronowe odcinki. Ułóż wycięty fragment na szkiełkach i susz je w piekarniku w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Akceptowalny model 3D równoważnej błony śluzowej jelita składa się z komórek Caco-2 utworzonych w ciasnej i regularnej monowarstwie nad bogatą w macierz zewnątrzkomórkową blaszką właściwą.

Niedopuszczalne modele obejmują te wykazujące nadmierny wzrost, zdezorganizowane warstwy nabłonka, wady rozwojowe lub brak tworzenia warstwy nabłonkowej. Prozapalne działanie białka pszenicy o wysokiej zawartości glutenu zaburzyło monowarstwę komórkową i zmniejszyło grubość warstwy nabłonkowej w porównaniu z grupą kontrolną Zawartość białka okludyny była istotnie wyższa w grupie kontrolnej niż w grupie narażonej na białko glutenowe. Barwienie CD14 i CD11b monocytów U937 wykazało, że białko pszenicy o wysokiej zawartości glutenu aktywowało monocyty i indukowało ich migrację i różnicowanie do makrofagów.

Pod wpływem prowokacji lipopolisacharydowej komórki Caco-2 zwiększyły produkcję śluzu i uwalnianie markera stanu zapalnego midkiny.