Model kriouszkodzeń do badania regeneracji mięśni szkieletowych szypułki ogonowej u dorosłych danio pręgowanych

Modele danio pręgowanego mogą pomóc nam zrozumieć naturalne mechanizmy efektywnej regeneracji narządów. Nasze laboratorium opracowało wcześniej metodę kriouszkodzeń do badania, w jaki sposób danio pręgowany przywraca serce i płetwy. Dzięki temu nowemu protokołowi zamierzamy rozszerzyć nasze badania na inny narząd, a mianowicie mięśnie.

Nie wiemy jeszcze, dlaczego regeneracja narządów jest bardziej efektywna u danio pręgowanego niż u ludzi. Protokół ten stanowi obiecujące podejście do badania pomyślnego przywrócenia muskulatury, pomimo stosunkowo dużego rozmiaru rany w ciele ryby. Ten model kriouszkodzeń ma co najmniej trzy zalety.

Po pierwsze, mięśnie są uszkadzane szybko i bez naruszania integralności organizmu. Po drugie, rana jest powtarzalna i oczyszczona przez naturalne gojenie. I wreszcie, ryby mogą normalnie pływać po kriourazie, co sugeruje łagodny wpływ tej procedury na zwierzęta.

Nasze odkrycia wprowadziły szypułkę ogonową danio pręgowanego do dziedziny biologii regeneracyjnej. Ta ścieżka badawcza przyczyni się do rozszyfrowania mechanizmów molekularnych, które kierują programem miogenezy w celu rekonstrukcji złożonej muskulatury u dorosłego danio pręgowanego. Do wykonania kriouszkodzenia mięśnia myo-mere na danio pręgowanym należy użyć specjalnie wyprodukowanej kriosondy ze stali nierdzewnej.

Aby uniknąć odmrożeń podczas obchodzenia się z sondą podczas zabiegu, włóż uchwyt sondy do końcówki pipety i zabezpiecz go, owijając go taśmą. Przed rozpoczęciem procedury kriourazów należy przygotować zlewkę na roztwór roboczy do znieczulenia, łyżkę do obchodzenia się z rybą, wilgotną gąbkę oraz zbiornik z wodą systemową do rekonwalescencji ryb po zabiegu. Przygotuj podstawowy roztwór znieczulenia, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.

Następnie dodać cztery mililitry przygotowanego roztworu podstawowego do 100 mililitrów wody systemowej w zlewce, aby przygotować roztwór roboczy trikainy. Aby rozpocząć procedurę kriouszkodzenia, zanurz sondę w ciekłym azocie na co najmniej trzy minuty. Zwilż gąbkę w wodzie systemowej i umieść ją na płaskiej powierzchni.

Następnie, jedną do dwóch minut po przeniesieniu pojedynczego dorosłego danio pręgowanego do roztworu roboczego tricainy, potwierdź jego brak reakcji, delikatnie dotykając ryby łyżką. Umieść znieczuloną rybę na mokrej gąbce. Zlokalizuj szypułkę ogonową za płetwą odbytową i przed płetwą ogonową.

Na tym etapie wyjmij kriosondę z ciekłego azotu. Delikatnie potrząśnij sondą, aby upewnić się, że na końcówce nie pozostały resztki ciekłego azotu. Umieść krawędź szpatułki prostopadle do ciała na szypułce ogonowej.

Utrzymuj sondę w tej pozycji przez sześć sekund bez wywierania nacisku przed uwolnieniem kriosondy z tkanki, a następnie przenieś rybę do wody systemowej w zbiorniku regeneracyjnym. Monitoruj rybę, gdy wznawia oddychanie i pływanie po przebudzeniu ze znieczulenia. Jeśli ruchy uszne nie wystąpią po 30 sekundach, stymuluj rybę, pipetując wodę systemową do skrzeli, aż zwierzę samo rozpocznie oddychanie.

Nagranie wideo ryb kontrolnych i kriouszkodzonych w ciągu jednego dnia po kriourazie lub DPCI ujawniło, że chociaż ryby z kriouszkodzeniami pływały mniej aktywnie, nie wykazywały żadnych nieprawidłowych ruchów, takich jak wirowanie, skręt lub zmniejszona równowaga. W systemie hodowlanym ich pozycja w zbiorniku i pobieranie pokarmu były podobne do tych, które mają ryby nieranne. Jak zaobserwowano w pięciu DPCI, normalne zachowanie było nadal trwałe, co wskazuje, że procedura kriouszkodzenia nie wpłynęła poważnie na dobrostan zwierząt.

Na początek przygotuj dwa mililitry 4% formaliny lub innego odpowiedniego utrwalacza. Przed rozpoczęciem zabiegu przygotuj również szalkę Petriego, kleszcze i nożyczki chirurgiczne. Umieść odpowiednio uśpioną rybę w kriotanazji na szalce Petriego zawierającej zjonizowaną wodę.

Za pomocą nożyczek wykonaj cięcie przez ciało, przednią i tylną do szypułki ogonowej. Pozwól tkance wykrwawić się w dejonizowanej wodzie wewnątrz szalki Petriego. Za pomocą kleszczy zbierz i przenieś szypułkę ogonową do przygotowanego roztworu utrwalającego w probówce z mikrowirówką.

Ostrożnie odwróć rurkę kilka razy. Przed montażem umyj utrwaloną chusteczkę w PBS przez 10 minut na bujaku. Następnie przenieś go do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej zawierającej roztwór 30% sacharozy w wodzie dejonizowanej, wstępnie schłodzonej do czterech stopni Celsjusza i delikatnie odwróć probówkę kilka razy.

Pozostaw probówkę pionowo w temperaturze czterech stopni Celsjusza na co najmniej 24 godziny. Napełnij formę do zatapiania pięciomilimetrową warstwą medium montażowego OCT. Za pomocą kleszczy umieść szypułkę ogonową na dnie formy, dostosuj jej orientację do przekroju poprzecznego lub koronalnego.

Pozwól pożywce zamarznąć w pudełku z suchym lodem. Gdy tylko tkanka ustabilizuje się w żądanej pozycji, wypełnij resztę formy, zanim OCT całkowicie zamarznie. Przechowuj formę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę przed pocięciem tkanki za pomocą kriostatu.

Zakres kriouszkodzenia w różnych dniach po kriourazie lub DPCI analizowano w przekrojach szypułki ogonowej za pomocą barwienia trójchromowego, składającego się z błękitu anellonowego, kwaśnej fixyny i pomarańczowego G. Uszkodzone obszary określono na podstawie braku pomarańczowego zabarwienia. Przy czwartym i siódmym DPCI przekrój poprzeczny wykazywał rozlegle zdegenerowane mięśnie szkieletowe w kriouszkodzonym boku ciała. Analiza immunofluorescencyjna wykazała, że przy czterech DPCI uszkodzona strona szypułki ogonowej zawierała obfite komórki dodatnie DAPI, ale niewiele lub nie było ich wcale F-aktyna i tropomiozyna 1, co wskazuje na zdegenerowane mięśnie.

Przy siedmiu DPCI tropomiozynę 1 i F-aktynę można było wykryć w ranie w pobliżu pionowej linii środkowej ciała, co wskazuje na początek tworzenia nowego włókna mięśniowego. Przy 30 DPCI obie strony ciała wykazywały podobny rozkład barwienia f-aktonem, co wskazuje na skuteczną odbudowę mięśni szkieletowych.