Metody osadzania bezkomórkowych reakcji syntezy białek w hydrożelach w makroskali

Wiemy, że żywe systemy nieustannie integrują informacje z wielu różnych źródeł i że sygnały te wywołują złożone i subtelne reakcje. Duża część tego przetwarzania informacji zachodzi na poziomie molekularnym. Jesteśmy zainteresowani eksploatacją tych procesów w obrębie materiałów, ale bez komórek.

Celem jest nadanie materiałom nowatorskiej funkcjonalności. Wyzwania związane z tą pracą są przede wszystkim związane z reakcją syntezy białek komórkowych, a nie z pracą z hydrożelem. Reakcja bezkomórkowa wymaga wysokiej jakości lizatu komórkowego, a także wysokiej jakości i czystości DNE, aby dobrze funkcjonować.

Protokół ten pozwala naukowcom osadzić reakcje biologii molekularnej w fizycznym materiale biodegradowalnym, który można zabrać poza laboratorium. Ponadto, ponieważ wynik reakcji oddziałuje bezpośrednio z materiałowym podwoziem, istnieje potencjał do opracowania materiałów o nowatorskich możliwościach wykrywania i reagowania. W perspektywie krótkoterminowej postrzegamy te metody jako nową drogę do wdrożenia bezkomórkowych urządzeń diagnostycznych.

Protokół ten pozwala na stworzenie wielu urządzeń i ich przestrzenną organizację w sposób, który nie jest możliwy w przypadku reakcji cieczy. Nasze przyszłe interesy są dwojakie. Po pierwsze, jesteśmy zainteresowani rozszerzeniem charakteru używanych przez nas hydrożeli, aby nadać pracy większą funkcjonalność materiału.

Po drugie, jesteśmy zainteresowani zwiększeniem złożoności i wydajności sieci genów, które obsługujemy w żelach, rozszerzając biologiczną funkcjonalność tych systemów. Na początek przenieś hydrożele do 1,5-mililitrowych mikroprobówek wirówek, w razie potrzeby przycinając żele skalpelem, aby zmieściły się w studzienkach. W innej 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej połącz 10 mikrolitrów ekstraktu bezkomórkowego z 25 mikrolitrami buforu do syntezy białek 2X bez komórek i czterema mikrogramami plazmidowego DNA.

Uzupełnić do całkowitej objętości 50 mikrolitrów wodą podwójnie destylowaną, aby przygotować bezkomórkowy roztwór do syntezy białek. Odpipetować roztwór na liofilizowane hydrożele i pozostawić żele do wchłonięcia w bezkomórkowy system syntezy białek przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść żele na czarną 384-dołkową płytkę do mikromiareczkowania za pomocą szpatułki.

Następnie przenieś płytkę do mikromiareczkowania do czytnika płytek i użyj ustawień czytnika płytek pokazanych na ekranie do wykrywania i analizy fluorescencji. W 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej na lodzie połącz 10 mikrolitrów ekstraktu bezkomórkowego z czterema mikrogramami plazmoidalnego DNA i 25 mikrolitrami bezkomórkowego buforu do syntezy białek 2X. Uzupełnić do całkowitej objętości 50 mikrolitrów wodą podwójnie destylowaną.

Aby przygotować bezkomórkowy roztwór do syntezy białek, odważ 0,75 grama agarozy i dodaj go do 100 mililitrów podwójnie destylowanego buforu wodnego, aby przygotować 0,75% agarozy. Podgrzej w kuchence mikrofalowej 0,75% agarozy w 30-sekundowych seriach z dużą mocą. i odpipetować 50 mikrolitrów stopionej agarozy do 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówkowych lub do form o pożądanym kształcie.

Umieść stopioną agarozę na bloku grzewczym ustawionym na 50 stopni Celsjusza i pozwól agarozie ostygnąć, ale nie polimeryzować. Następnie wymieszaj stopioną agarozę z bezkomórkowym roztworem do syntezy białek, pipetując i mieszając końcówką pipety. Pozostaw żele do ostygnięcia do temperatury pokojowej i polimeryzuj przez około dwie minuty.

Przenieś spolimeryzowaną agarozę do 1,5-mililitrowych mikroprobówek wirówkowych za pomocą szpatułki i błyskawicznie zamroź w ciekłym azocie. Umieść zamrożone hydrożele w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na godzinę. Następnie zdejmij pokrywki probówek z mikrowirówkami.

Przykryj probówki folią woskową i przebij folię, aby wilgoć mogła wyschnąć. Ustaw temperaturę liofilizatora na minus 20 stopni Celsjusza i ciśnienie na 0,1 milibara i liofiluj bezkomórkowe urządzenia do syntezy białek przez 18 godzin lub przez noc. Ponownie nawodnić liofilizowane urządzenia przez 30 minut 50 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody bez nadmiaru płynu i przenieść żele na czarną 384-dołkową płytkę do mikromiareczkowania za pomocą szpatułki.

Na koniec umieść płytkę mikromiareczkową na czytniku płytek i użyj ustawień czytnika płytek pokazanych na ekranie do wykrywania i analizy fluorescencji. Bezkomórkowa synteza białek eGFP i mCherry w hydrożelu przy użyciu lizatów komórkowych E. coli pokazano na tym rysunku. 0,75% żele agarozowe przygotowano bez matrycy DNA z czterema mikrogramami matrycy eGFP lub mCherry lub z czterema mikrogramami zarówno matrycy eGFP, jak i mCherry.

Pokazana jest również nakładka dwóch kanałów, a nakładka zawiera obraz kontrastu różnicowego interferencyjnego. Wyniki potwierdziły koekspresję zarówno mCherry, jak i eGFP w agarozie.