Mysi kręg lędźwiowy Jednoosiowe badanie ściskania z osadzeniem powierzchni ładunkowej
December 1st, 2023
W tym protokole opisane są dwa podejścia, które ułatwiają jednoosiowe testowanie kompresji kręgów lędźwiowych myszy. W pierwszej kolejności opisano konwersję giętarki trzypunktowej na maszynę do prób ściskania. Po drugie, metoda osadzania w celu przygotowania powierzchni ładunkowej, która wykorzystuje cement kostny, jest dostosowana do kręgów lędźwiowych myszy.
Nasze badania koncentrują się na badaniach wytrzymałości mechanicznej kości małych zwierząt. W szczególności naszym celem jest przedstawienie metody osadzania do badania uciskowego kręgów lędźwiowych. Zastosowania w tym obszarze badawczym obejmują lepsze zrozumienie wpływu starzenia się i diety na właściwości mechaniczne kości kręgów.
Z natury mały rozmiar kręgu jest wyzwaniem dla testów kompresji, ale metoda osadzania poprawia dostępność, ponieważ głównym przygotowaniem jest usunięcie tylko wyrostków kręgowych z głównego ciała, pozostawiając inne struktury nienaruszone. Mały rozmiar kręgów myszy sprawia, że trudno jest przygotować je do testów kompresji. Nasza metoda zapewnia prostszy sposób przygotowania powierzchni ładunkowej do jednoosiowej próby ściskania.
Ponadto prezentujemy budowę maszyny do prób ściskania z giętarki trzypunktowej w celu łatwej konwersji między nimi. Nasza metoda pozwala naukowcom na proste połączenie trzypunktowego testowania zginania i kompresji, co może pozwolić naukowcom lepiej dostrzec wpływ terapii farmakologicznej, wymiaru dietetycznego lub innych zabiegów na most korowy w porównaniu z bogatą kością gąbczastą w modelu gryzonia. Badamy możliwości testowania kompresji dla innych rodzajów próbek biologicznych.
Na przykład opracowujemy metody badania żuchwy myszy w połączeniu z innymi technikami oceny kości. Umożliwi to bardziej kompleksowe podejście do badania czynników wpływających na właściwości kości, takich jak starzenie się i dieta. Aby rozpocząć, odkręć belkę poprzeczną przymocowaną do czujnika obciążenia na giętarce trzypunktowej.
Przykręć samonastawną górną płytę dociskową do czujnika obciążenia z gwintem identycznym jak belka poprzeczna. Włącz maszynę ze stałą prędkością opuszczania, aby rozpocząć test kompresji. Za pomocą gwintowanych sześciokątnych przymocuj dolną płytę dociskową do dwóch dolnych wsporników i dokręć je, aż zostaną bezpiecznie zamocowane.
Następnie, aby określić przemieszczenie maszyny, opuść górną płytę na dolną płytę, aż do uzyskania lekkiego kontaktu bez badanego materiału pomiędzy nimi. Korzystaj z oprogramowania do gromadzenia danych cyfrowych, aby zbierać pomiary obciążenia i przemieszczenia podczas testów mechanicznych. Kontynuuj opuszczanie górnej płyty na dolną płytę ze stałą prędkością, aż zostaną osiągnięte siły większe niż siły wytwarzane przez wszystkie próbki kości.
Wykreśl dane dotyczące przemieszczenia systemu w stosunku do przyłożonego obciążenia. Skoryguj zarejestrowane przemieszczenie dla każdego punktu danych z próbek kręgów myszy uzyskanych w kolejnych krokach. Na początek wykonaj małe nacięcie na grzbietowej linii środkowej tuszy myszy w pobliżu podstawy ogona.
Przedłuż nacięcie na każdej tylnej kończynie i delikatnie pociągnij, aby usunąć skórę z podstawy ogona w kierunku głowy zwierzęcia. Odetnij mięśnie ściany brzucha, aż kręgosłup stanie się łatwo widoczny. Pod mikroskopem preparacyjnym zidentyfikuj dwa stawy krzyżowo-biodrowe i zlokalizuj czaszkowy koniec kości krzyżowej.
Za pomocą żyletki lub skalpela wykonaj precyzyjne cięcie, aby oddzielić ostatni kręg lędźwiowy od czaszkowego końca kości krzyżowej. Ponownie przeciąć przestrzeń międzykręgową, usunąć L6 i L5 z kręgosłupa i odłożyć L5 do analizy. Zbadaj kręg pod mikroskopem preparacyjnym i usuń wszystkie tkanki miękkie z kości, w tym krążek międzykręgowy, za pomocą gazików i, w razie potrzeby, delikatnie kleszczami.
Na początek przeanalizuj piąty kręg lędźwiowy odizolowany od zamrożonej tuszy myszy. Za pomocą diamentowej tarczy tnącej przymocowanej do narzędzia obrotowego, przetnij każdą szypułkę, aby usunąć wyrostki poprzeczne i kolczyste. Delikatnie przeszlifuj ogonowy koniec kręgu za pomocą drobnego papieru ściernego o ziarnistości 120, aby wyeliminować wszystkie krążki międzykręgowe, tkanki miękkie i nierówności.
Następnie oznacz szlifowany koniec ogona trwałym markerem, aby ułatwić późniejszą identyfikację. Przygotuj cement kostny PMMA zgodnie z instrukcjami producenta. Nałóż niewielką ilość półmiękkiego cementu kostnego PMMA na górną stronę nieoznaczonego końca czaszki kręgu i nawodnij solą fizjologiczną.
Podczas gdy PMMA jest nadal półmiękki, umieść kręg na dolnej płycie ogonowej stroną ogonową skierowaną w dół. Teraz włącz maszynę, aby włączyć koła zębate napędowe i stopniowo opuszczaj górną płytę dociskową na kręg i kompleks cementu kostnego PMMA, aż zetknie się z cementem kostnym. Pozwól, aby cement kostny PMMA całkowicie stwardniał, podczas gdy górna płyta delikatnie go dociska.
Korzystaj w czasie rzeczywistym z oprogramowania cyfrowego przeznaczonego do zbierania danych z badań mechanicznych, aby zbierać dane dotyczące obciążenia i przemieszczenia z czujników do arkusza kalkulacyjnego. Po zebraniu linii podstawowej przez pięć sekund, przyłożonej z minimalną siłą napięcia wstępnego mniejszą niż 0,5 niutona, stopniowo opuszczaj górną warstwę platyny na próbkę ze stałą i z góry określoną prędkością opuszczania, aby rozpocząć próbę ściskania. Przerwij gromadzenie danych, gdy zaobserwujesz znaczne zmniejszenie obciążenia wskazujące na awarię materiału.
Skoryguj każdy punkt danych dla przemieszczenia systemu, korzystając z równania uzyskanego w poprzednich krokach. Aby utworzyć krzywą przemieszczenia obciążenia z obciążeniem na osi y i skorygowanym przemieszczeniem próbki na osi x, najpierw utwórz tabelę, klikając Windows, a następnie wybierając Nowa tabela, a następnie Zrób to. Skopiuj skorygowane dane o przemieszczeniu i obciążeniu z arkusza kalkulacyjnego danych pierwotnych do nowej tabeli.
Następnie, aby wygenerować przebieg reprezentujący surowe dane, kliknij Dane i wybierz XY Pair to Waveform. Wybierz skorygowane dane przemieszczenia dla X-Wave i dane obciążenia dla Y-Wave. Upewnij się, że w polu Liczba punktów znajdują się poprawne punkty danych.
Nazwij przebieg i kliknij przycisk Utwórz przebieg. Po utworzeniu przebiegu zwizualizuj krzywą przemieszczenia obciążenia, klikając Windows i wybierając Nowy wykres. Umieść przebieg na osi y i oblicz go na osi x, aby wygenerować wykres.
Użyj narzędzia kursora, aby zaznaczyć punkty lub obszary zainteresowania na wykresie w celu dalszej analizy.
Przegląd
Niniejsze badanie podejmuje wyzwanie testowania wytrzymałości mechanicznej kości krzyżowych myszy poprzez przedstawienie metody osadzenia i przekształcenie maszyny do zginania trójpunktowego do testowania kompresyjnego jednoosiowego. Badania mają na celu poprawę zrozumienia czynników wpływających na właściwości mechaniczne kości kręgowych, takich jak starzenie się i dieta.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Testowanie wytrzymałości mechanicznej kości małych zwierząt
- Wpływ starzenia się i diety na właściwości kości
- Innowacyjne metody testowania próbek biologicznych
Tło
- Mała wielkość kręgów mysich stanowi wyzwanie dla standardowych testów kompresyjnych.
- Tradycyjne metody często wymagają rozległych przygotowań, które mogą uszkodzić próbkę.
- Znalezienie efektywnych metod może poprawić badania porównawcze w różnych scenariuszach testowych.
Stosowane metody
- Metoda osadzenia do przygotowywania kręgów z wykorzystaniem cementu kościowego PMMA
- Przekształcenie maszyny do zginania trójpunktowego w maszynę do testowania kompresyjnego
- Cyfrowe zbieranie danych do pomiarów obciążenia i przemieszczenia
Główne wyniki
- Została opracowana prostsza metoda przygotowywania kości krzyżowych do testów.
- Metoda umożliwia analizę porównawczą między warunkami testowania zginania i kompresji.
- Techniki zbierania danych zostały zweryfikowane, aby zapewnić dokładne oceny mechaniczne.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia skuteczne modyfikacje metod testowania mechanicznego dla małych kości.
- Wyniki są istotne dla badaczy eksplorujących wpływ farmakologiczny i dietetyczny na zdrowie kości.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable mechanical testing of both cortical and cancellous bone is critical for evaluating the effects of pharmaceutical and dietary interventions on skeletal integrity in preclinical models. The described embedding and machine conversion methods enable parallel, quantitative assessment of vertebral and long bone strength, supporting more predictive and translationally relevant bone research. This dual-modality approach enhances confidence in target validation and mechanistic de-risking for bone-active therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct comparison of treatment effects on cortical versus cancellous bone compartments.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying bone-type specific responses to interventions.
- Improves predictive confidence in preclinical bone strength endpoints.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of standardized vertebral samples for reproducible compression testing.
- Allows conversion of existing three-point bending systems for dual-mode mechanical assays.
- Generates quantitative load-displacement data suitable for compound screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical bone strength measurements with disease-relevant endpoints for osteoporosis and bone loss models.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting both bending and compression modalities.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust, comparative mechanical data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling both cortical and cancellous bone strength testing within the same experimental pipeline.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on bone compartment-specific drug effects and dietary influences.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible vertebral samples for quantitative mechanical evaluation.
- Analytics: Delivers load-displacement curves and failure thresholds for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models of bone fragility and therapeutic response.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable workflow for diverse bone strength studies in rodent models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in bone-targeted R&D.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and testing, improving reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk for bone therapies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of bone-active candidates based on robust mechanical endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in small animal dissection and mechanical testing protocols.
- Needs access to three-point bending machines and digital data acquisition systems.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and data analysis workflows.
- Adaptable to other small bone models with appropriate modifications.
- Sample size and preparation precision are critical for reliable, reproducible results.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:36
Conversion of a Three‐Point Bending Machine to a Compression Testing Machine
3:00
Dissection of the 5th Lumbar Vertebra (L5) from the Mouse Carcass for Uniaxial Compression Testing
4:11
Preparing L5 Vertebra Loading Surface for Uniaxial Compression Testing Using the PMMA Bone Cement Embedding Method
