Mysi kręg lędźwiowy Jednoosiowe badanie ściskania z osadzeniem powierzchni ładunkowej
1 grudnia 2023
W tym protokole opisane są dwa podejścia, które ułatwiają jednoosiowe testowanie kompresji kręgów lędźwiowych myszy. W pierwszej kolejności opisano konwersję giętarki trzypunktowej na maszynę do prób ściskania. Po drugie, metoda osadzania w celu przygotowania powierzchni ładunkowej, która wykorzystuje cement kostny, jest dostosowana do kręgów lędźwiowych myszy.
Nasze badania koncentrują się na badaniach wytrzymałości mechanicznej kości małych zwierząt. W szczególności naszym celem jest przedstawienie metody osadzania do badania uciskowego kręgów lędźwiowych. Zastosowania w tym obszarze badawczym obejmują lepsze zrozumienie wpływu starzenia się i diety na właściwości mechaniczne kości kręgów.
Z natury mały rozmiar kręgu jest wyzwaniem dla testów kompresji, ale metoda osadzania poprawia dostępność, ponieważ głównym przygotowaniem jest usunięcie tylko wyrostków kręgowych z głównego ciała, pozostawiając inne struktury nienaruszone. Mały rozmiar kręgów myszy sprawia, że trudno jest przygotować je do testów kompresji. Nasza metoda zapewnia prostszy sposób przygotowania powierzchni ładunkowej do jednoosiowej próby ściskania.
Ponadto prezentujemy budowę maszyny do prób ściskania z giętarki trzypunktowej w celu łatwej konwersji między nimi. Nasza metoda pozwala naukowcom na proste połączenie trzypunktowego testowania zginania i kompresji, co może pozwolić naukowcom lepiej dostrzec wpływ terapii farmakologicznej, wymiaru dietetycznego lub innych zabiegów na most korowy w porównaniu z bogatą kością gąbczastą w modelu gryzonia. Badamy możliwości testowania kompresji dla innych rodzajów próbek biologicznych.
Na przykład opracowujemy metody badania żuchwy myszy w połączeniu z innymi technikami oceny kości. Umożliwi to bardziej kompleksowe podejście do badania czynników wpływających na właściwości kości, takich jak starzenie się i dieta. Aby rozpocząć, odkręć belkę poprzeczną przymocowaną do czujnika obciążenia na giętarce trzypunktowej.
Przykręć samonastawną górną płytę dociskową do czujnika obciążenia z gwintem identycznym jak belka poprzeczna. Włącz maszynę ze stałą prędkością opuszczania, aby rozpocząć test kompresji. Za pomocą gwintowanych sześciokątnych przymocuj dolną płytę dociskową do dwóch dolnych wsporników i dokręć je, aż zostaną bezpiecznie zamocowane.
Następnie, aby określić przemieszczenie maszyny, opuść górną płytę na dolną płytę, aż do uzyskania lekkiego kontaktu bez badanego materiału pomiędzy nimi. Korzystaj z oprogramowania do gromadzenia danych cyfrowych, aby zbierać pomiary obciążenia i przemieszczenia podczas testów mechanicznych. Kontynuuj opuszczanie górnej płyty na dolną płytę ze stałą prędkością, aż zostaną osiągnięte siły większe niż siły wytwarzane przez wszystkie próbki kości.
Wykreśl dane dotyczące przemieszczenia systemu w stosunku do przyłożonego obciążenia. Skoryguj zarejestrowane przemieszczenie dla każdego punktu danych z próbek kręgów myszy uzyskanych w kolejnych krokach. Na początek wykonaj małe nacięcie na grzbietowej linii środkowej tuszy myszy w pobliżu podstawy ogona.
Przedłuż nacięcie na każdej tylnej kończynie i delikatnie pociągnij, aby usunąć skórę z podstawy ogona w kierunku głowy zwierzęcia. Odetnij mięśnie ściany brzucha, aż kręgosłup stanie się łatwo widoczny. Pod mikroskopem preparacyjnym zidentyfikuj dwa stawy krzyżowo-biodrowe i zlokalizuj czaszkowy koniec kości krzyżowej.
Za pomocą żyletki lub skalpela wykonaj precyzyjne cięcie, aby oddzielić ostatni kręg lędźwiowy od czaszkowego końca kości krzyżowej. Ponownie przeciąć przestrzeń międzykręgową, usunąć L6 i L5 z kręgosłupa i odłożyć L5 do analizy. Zbadaj kręg pod mikroskopem preparacyjnym i usuń wszystkie tkanki miękkie z kości, w tym krążek międzykręgowy, za pomocą gazików i, w razie potrzeby, delikatnie kleszczami.
Na początek przeanalizuj piąty kręg lędźwiowy odizolowany od zamrożonej tuszy myszy. Za pomocą diamentowej tarczy tnącej przymocowanej do narzędzia obrotowego, przetnij każdą szypułkę, aby usunąć wyrostki poprzeczne i kolczyste. Delikatnie przeszlifuj ogonowy koniec kręgu za pomocą drobnego papieru ściernego o ziarnistości 120, aby wyeliminować wszystkie krążki międzykręgowe, tkanki miękkie i nierówności.
Następnie oznacz szlifowany koniec ogona trwałym markerem, aby ułatwić późniejszą identyfikację. Przygotuj cement kostny PMMA zgodnie z instrukcjami producenta. Nałóż niewielką ilość półmiękkiego cementu kostnego PMMA na górną stronę nieoznaczonego końca czaszki kręgu i nawodnij solą fizjologiczną.
Podczas gdy PMMA jest nadal półmiękki, umieść kręg na dolnej płycie ogonowej stroną ogonową skierowaną w dół. Teraz włącz maszynę, aby włączyć koła zębate napędowe i stopniowo opuszczaj górną płytę dociskową na kręg i kompleks cementu kostnego PMMA, aż zetknie się z cementem kostnym. Pozwól, aby cement kostny PMMA całkowicie stwardniał, podczas gdy górna płyta delikatnie go dociska.
Korzystaj w czasie rzeczywistym z oprogramowania cyfrowego przeznaczonego do zbierania danych z badań mechanicznych, aby zbierać dane dotyczące obciążenia i przemieszczenia z czujników do arkusza kalkulacyjnego. Po zebraniu linii podstawowej przez pięć sekund, przyłożonej z minimalną siłą napięcia wstępnego mniejszą niż 0,5 niutona, stopniowo opuszczaj górną warstwę platyny na próbkę ze stałą i z góry określoną prędkością opuszczania, aby rozpocząć próbę ściskania. Przerwij gromadzenie danych, gdy zaobserwujesz znaczne zmniejszenie obciążenia wskazujące na awarię materiału.
Skoryguj każdy punkt danych dla przemieszczenia systemu, korzystając z równania uzyskanego w poprzednich krokach. Aby utworzyć krzywą przemieszczenia obciążenia z obciążeniem na osi y i skorygowanym przemieszczeniem próbki na osi x, najpierw utwórz tabelę, klikając Windows, a następnie wybierając Nowa tabela, a następnie Zrób to. Skopiuj skorygowane dane o przemieszczeniu i obciążeniu z arkusza kalkulacyjnego danych pierwotnych do nowej tabeli.
Następnie, aby wygenerować przebieg reprezentujący surowe dane, kliknij Dane i wybierz XY Pair to Waveform. Wybierz skorygowane dane przemieszczenia dla X-Wave i dane obciążenia dla Y-Wave. Upewnij się, że w polu Liczba punktów znajdują się poprawne punkty danych.
Nazwij przebieg i kliknij przycisk Utwórz przebieg. Po utworzeniu przebiegu zwizualizuj krzywą przemieszczenia obciążenia, klikając Windows i wybierając Nowy wykres. Umieść przebieg na osi y i oblicz go na osi x, aby wygenerować wykres.
Użyj narzędzia kursora, aby zaznaczyć punkty lub obszary zainteresowania na wykresie w celu dalszej analizy.
Przegląd
Niniejsze badanie podejmuje problem testowania wytrzymałości mechanicznej kręgów lędźwiowych myszy, prezentując metodę zatapiania próbek oraz adaptację maszyny do zginania trójpunktowego do przeprowadzania testów ściskania jednowymiarowego. Celem badań jest lepsze zrozumienie czynników wpływających na właściwości mechaniczne kości kręgów, takich jak starzenie się i dieta.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Badanie wytrzymałości mechanicznej kości małych zwierząt
- Wpływ starzenia się i diety na właściwości kości
- Innowacyjne metody badania preparatów biologicznych
Wstęp
- Mały rozmiar kręgów myszy stanowi wyzwanie w przypadku standardowych testów kompresyjnych.
- Tradycyjne metody często wymagają czasochłonnego przygotowania, które może uszkodzić próbkę.
- Znalezienie wydajnych metod może usprawnić badania porównawcze w różnych scenariuszach testowych.
Zastosowane metody
- Metoda zatapiania w celu przygotowania kręgów z użyciem cementu kostnego PMMA
- Przekształcenie maszyny do zginania trójpunktowego w maszynę do prób ściskania
- Cyfrowe gromadzenie danych dla pomiarów obciążenia i przemieszczenia
Główne wyniki
- Opracowano prostszą metodę przygotowania kręgów lędźwiowych do badań.
- Metoda ta umożliwia analizę porównawczą między warunkami badania zginania a ściskania.
- Techniki gromadzenia danych zostały zwalidowane, aby zapewnić dokładne oceny mechaniczne.
Wnioski
- Niniejsza praca prezentuje skuteczne modyfikacje metod badań mechanicznych małych kości.
- Wyniki te mają istotne znaczenie dla badaczy analizujących wpływ farmakologiczny i dietetyczny na zdrowie kości.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodne testy mechaniczne kości korowej i gąbczastej są kluczowe dla oceny wpływu interwencji farmakologicznych i dietetycznych na integralność szkieletu w modelach przedklinicznych. Opisane metody zatapiania i obróbki maszynowej umożliwiają równoległą, ilościową ocenę wytrzymałości kręgów oraz kości długich, co wspiera bardziej predykcyjne i istotne translacyjnie badania nad kośćmi. To podejście dwumodalne zwiększa pewność w walidacji celów oraz w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego w przypadku terapeutyków aktywnych w obrębie tkanki kostnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie porównanie efektów leczenia w obrębie tkanki kostnej korowej i gąbczastej.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie odpowiedzi konkretnych typów kości na interwencje.
- Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do przedklinicznych punktów końcowych wytrzymałości kości.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zestandaryzowanych próbek kręgów w celu zapewnienia powtarzalności testów kompresyjnych.
- Umożliwia konwersję istniejących systemów do zginania trójpunktowego na potrzeby dwutrybowych analiz mechanicznych.
- Generuje ilościowe dane dotyczące obciążenia i przemieszczenia, odpowiednie dla procesów przesiewowych związków chemicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica przedkliniczne pomiary wytrzymałości kości z punktami końcowymi istotnymi dla modeli osteoporozy i utraty masy kostnej.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną dzięki obsłudze metod zginania oraz ściskania.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, dostarczając wiarygodnych, porównawczych danych mechanicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie wytrzymałości kości korowej i gąbczastej w ramach tego samego schematu badawczego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących efektów leków specyficznych dla przedziałów kostnych oraz wpływów diety.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne próbki kręgów do ilościowej oceny mechanicznej.
- Analityka: Dostarcza krzywe obciążenie-przemieszczenie oraz progi uszkodzenia do analizy porównawczej w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkrywcze z modelami przedklinicznymi kruchości kości i odpowiedzią terapeutyczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalny, adaptowalny przepływ pracy dla zróżnicowanych badań wytrzymałości kości w modelach gryzoni.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach i rozwoju (R&D) ukierunkowanych na tkankę kostną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek i testowanie, poprawiając powtarzalność oraz przepustowość.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie bardziej świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach rozwoju terapii kostnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów aktywnych w tkance kostnej z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o solidne punkty końcowe o charakterze mechanicznym.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w sekcji małych zwierząt oraz w protokołach badań mechanicznych.
- Niezbędny jest dostęp do maszyn do zginania trójpunktowego oraz cyfrowych systemów akwizycji danych.
- Wymagana jest standaryzacja procesów przygotowania próbek i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metodę można zaadaptować do innych modeli małych kości po wprowadzeniu odpowiednich modyfikacji.
- Wielkość próby oraz precyzja ich przygotowania są kluczowe dla uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:36
Conversion of a Three‐Point Bending Machine to a Compression Testing Machine
3:00
Dissection of the 5th Lumbar Vertebra (L5) from the Mouse Carcass for Uniaxial Compression Testing
4:11
Preparing L5 Vertebra Loading Surface for Uniaxial Compression Testing Using the PMMA Bone Cement Embedding Method
