Unikalne podejście do izolowania neutrofili szpiku kostnego szczurów o porównywalnej pojemności

Opracowaliśmy metodę izolowania neutrofili szczurów pod wpływem kolejnych ekstrakcji NET. Ta metoda zapewnia zoptymalizowaną dostępność do przeprowadzania eksperymentów związanych z NET zarówno na szczurach, jak i liniach komórkowych pochodzących od szczurów. W naszym badaniu przeprowadziliśmy porównanie neutrofili, które zostały wyizolowane z krwi obwodowej i szpiku kostnego szczurów.

Nasze odkrycia podkreślają wyższość neutrofili pochodzących ze szpiku kostnego, wykazując znaczną przewagę liczebną w liczbie izolowanych neutrofili wraz z ich sprawną zdolnością do synchronizacji. Nasza metoda izolacji neutrofili i NET szczurów oparta na szpiku kostnym wypełnia lukę badawczą, optymalizując techniki izolacji dla tych typów komórek. W przeciwieństwie do poprzednich metod, które wykorzystywały głównie krew obwodową, nasz protokół koncentruje się na szpiku kostnym, zwiększając liczbę neutrofili i dużych plonów oraz oferując dokładniejszy model szczura do badania biologii neutrofili i NET.

Aby rozpocząć pobieranie szpiku kostnego, namocz szczura poddanego eutanazji w 75% etanolu, aby wysterylizować futro i skórę. Połóż szczura na plecach i odetnij kończyny dolne w biodrze. Aby chronić głowę kości udowej.

Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć więzadło w stawie jastrzębia. Następnie złóż staw kolanowy do tyłu, aby odsłonić kość udową i piszczelową. Z parą kleszczy i nożyczek.

Ostrożnie usuń wszelkie mięśnie, ścięgna i inne tkanki połączone z kośćmi. Przebij szpik przez oba końce kości za pomocą pięciomilimetrowej strzykawki z igłą, aby poluzować macierz szpiku. Teraz użyj świeżej strzykawki, aby wypłukać szpik kostny za pomocą 10 do 15 mililitrów pożywki RPMI.

Odwirować komórki szpiku kostnego w stężeniu 300 G przez 10 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pięciu do 10 mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek. Po inkubacji zawiesiny dodać do mieszaniny czterokrotną objętość HBSS.

Następnie odwirować komórki w temperaturze 600 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, Powstały osad należy wykorzystać do dalszego wykorzystania. Najpierw wyizoluj neutrofile za pomocą zestawu do izolacji neutrofili szpiku kostnego szczura. Ułóż dwa mililitry odczynnika o stężeniu od 80 do 55% na wywołanie w 15-mililitrowej probówce wirówkowej, aby utworzyć gradient gęstości.

Następnie odpipetować wyizolowane neutrofile lub roztwór do reprodukcji komórek wyizolowanych za pomocą zestawu do izolacji neutrofili szpiku kostnego szczura do probówki. Odwirować probówkę o sile 800 g przez 40 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza za pomocą sterylnej pipety. Zbierz warstwę gradientu 70%, w tym warstwy komórek na granicy od 65 do 70%.

Przenieś zawiesinę komórek do nowej 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj 15 mililitrów HBSS do probówki i delikatnie odwróć, aby wymieszać jej zawartość. Na koniec odwirować probówkę o sile 300 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby granulować komórki do jednoetapowego procesu.

Po pipetowaniu zawiesiny szpiku kostnego bezpośrednio do wirówki z gradientem gęstości, jak pokazano wcześniej. Następnie odpipetuj warstwę gradientu 70%, w tym warstwy na granicy gradientu od 75% do 70%. Przenieś tę zawiesinę komórek do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej z 10 mililitrami HBSS.

Następnie odwirować probówkę o stężeniu 400 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby granulować komórki. Policz wyizolowane neutrofile za pomocą hemocytometru i oceń żywotność komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Metoda dwuetapowa charakteryzowała się zwiększonym poziomem czystości wynoszącym 90% w stosunku do 50% osiągniętych metodą jednoetapową.

Aby rozpocząć, ponownie zawiesić izolowane neutrofile szczurów w czterech mililitrach uzupełnionej pożywki DAR PMI na sterylnej 10-centymetrowej szalce Petriego. Następnie dodaj cztery mikrolitry PMA do zawiesiny neutrofili, aby wywołać tworzenie NET. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny w 5% dwutlenku węgla.

W odniesieniu do kontroli ujemnej. Dodaj cztery do pięciu mikrolitrów Dnazy 1 do zawiesiny neutrofili, aby zdegradować wydzielane NET. Następnie dodaj cztery mililitry HBSS, aby umyć NET.

Przepłukać płytkę czterema mililitrami świeżej pożywki hodowlanej dla każdej płytki, aby odłączyć siatki. Następnie zebrać pożywkę płuczącą do nowej probówki i często pipetować, aby zapewnić całkowite ponowne zawieszenie NETs. Odwirować zawiesinę o sile 300 G przez 10 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby usunąć wszelkie pływające komórki.

Następnie zebrać pożywkę sklarowaną nad osadem z NET w nowej wirówce probówkowej, zawiesinę NET i pływające komórki. W 24-dołkowej płytce z 1,4 centymetra szklanej pokrywy umieszczonej w niej w celu osadzenia wszelkich pływających komórek. Następnie zamocuj komórki na szkiełkach nakrywkowych za pomocą 4% PFA i przystąp do weryfikacji obecności NET.

Następnie umieść kroplę HBSS na stojaku na probówkę pokrytą folią parafinową. Odwróć szkiełko nakrywkowe do kropelek HBSS, aby je umyć. Po umyciu inkubować komórki w 250 mikrolitrach 0,5 x tryton X 100 przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby je przepuszczalne.

Następnie umyj komórki trzy razy w HBSS przez jedną minutę. Zamknij komórki w 10% normalnej surowicy osła w temperaturze pokojowej na jedną godzinę. Na koniec inkubuj komórki z 70 do 90 mikrolitrami przeciwciał antyszczurzych przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Umyj szkiełko nakrywkowe w HBS S3 razy po pięć minut każdy. Teraz inkubować szkiełko nakrywkowe w przeciwciałach drugorzędowych w temperaturze pokojowej przez godzinę w ciemności przed umyciem HBSS. Wybarwić jądra komórkowe i szkielety NET w 70 do 90 mikrolitrach dappy.

Wykonaj pranie HBSS trzy razy po pięć minut każde. Aby rozpocząć, należy pipetować 50 mikrolitrów izolowanych szczurzych próbek NET do probówki z 450 mikrolitrami buforu tris EDTA. Teraz odpipetuj 100 mikrolitrów wzorców DNA i próbki do płytki 96-dołkowej.

Dodać równą objętość odczynnika do oznaczania do studzienek. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie do pięciu minut, unikając ekspozycji na bezpośrednie światło. Umieść płytkę w czytniku mikropłytek fluorescencyjnych ustawionym na widmo emisyjne około 530 nanometrów i widmo absorpcyjne około 480 nanometrów.

Inkubować komórki w jednym mikrolitrze barwienia jądra przez 30 minut. Następnie inkubuj komórki w jednym mikrolitrze bezkomórkowego szczepu DNA przez 10 minut. Delikatnie wymieszaj matryce fluorescencyjne.

Załaduj płytkę z próbką do cytometru, przełącz na zielony kanał cytox. Następnie wybierz kanał szesnastkowy. Ustaw podświetlenie na niebieskie 377/447 i dostosuj czas ekspozycji na 300 000 mikrosekund.

Kliknij konfigurację ukierunkowaną, a następnie kliknij opcję Zarejestruj automatycznie. Aby automatycznie dostosować ostrość, wybierz kanał ekranu OX i ustaw podświetlenie na zielony 483/536. Ustaw czas ekspozycji dla ekranu cytox na 30 000 mikrosekund.

Kliknij Rozpocznij skanowanie, aby rozpocząć proces skanowania. Porównywalne odpowiedzi w wydzielaniu NET były dostrzegalne między neutrofilami obwodowymi a szpikiem kostnym. Niezależnie od stymulacji PMA, szczurzość wykazywała również ograniczone zdolności do wzajemnego sieciowania.

Inkubacja z PMA doprowadziła do 10% wzrostu zawartości DNA bezkomórkowego po czterech godzinach, co wskazuje na większą skłonność do wywoływania tworzenia NET.