Kwantyfikacja, ocena żywotności i strategie wizualizacji biofilmów Acinetobacter

Biofilmy składają się z żywych komórek drobnoustrojów i są trudne do usunięcia z powierzchni. Szczepy Acinetobacter, powszechnie występujące w naszym środowisku, powodujące te powszechne infekcje, są również znane z tworzenia biofilmów na powierzchniach. Dlatego naszym celem jest opracowanie metod zarówno ilościowego, jak i wizualizacji biofilmów Acinetobacter.

Nasz protokół zapewnia prostą i łatwą metodę ilościowego oznaczania i wizualizacji biofilmów Acinetobacter. Żywotną liczbę komórek wewnątrz biofilmów określa się ilościowo przy użyciu metody liczenia żywotnych. Wyniki naszych badań pokazują, że naturalnie występujące szczepy Acinetobacter mają dość różny potencjał tworzenia biofilmu.

Istnieją również wyraźne różnice morfologiczne w obrębie różnych biofilmów. Utorowało to drogę do badań skupiających się na przyczynach tak dużej zmienności między szczepami Acinetobacter. Aby rozpocząć proces przygotowania inokulum bakteryjnego, należy pobrać od 2 do 10 mikrolitrów szczepu bakteryjnego z fiolki za pomocą sterylnej końcówki pipety i zaszczepić nią dostępną w handlu płytkę z agarem do krwi.

Za pomocą sterylnej pętli rozprowadź smugi na powierzchni agaru, rozrzedzając ją przerywanym płomieniem. Inkubować przygotowaną płytkę agarową w pozycji odwróconej do góry nogami w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez około 20 do 24 godzin. Następnie wybierz pojedynczą kolonię kultury bakteryjnej za pomocą sterylnej igły i zaszczep pięć mililitrów sterylnego bulionu BHI tą kulturą.

Zaszczepiony bulion inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza, z prędkością 150 obrotów na minutę, przez około 20 do 24 godzin. Następnie przenieś jeden mililitr kultury do sterylnej probówki do mikrowirówki i odwiruj w temperaturze 6 000 g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po odwirowaniu odrzucić sklarowany osad.

Dodaj jeden mililitr sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS do granulki i ponownie ją zawiesić za pomocą wiru. Odwirować zawieszony osad o masie 6 000 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant. Tym razem ponownie zawieś powstały osad w sterylnym, dziesięciokrotnie rozcieńczonym bulionie BHI za pomocą wiru.

Upewnij się, że osiągniesz gęstość optyczną około 0,1 przy 600 nanometrach. Na początek dodaj 200 mikrolitrów inokulum bakteryjnego do każdej studzienki sterylnej polistyrenowej 96-dołkowej płytki. Następnie dodaj 200 mikrolitrów wody dejonizowanej do najbardziej zewnętrznych studni, aby zapobiec wysychaniu studni wewnętrznych.

Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji wyrzucić supernatant z każdej studzienki za pomocą pipety. Ostrożnie dodaj 300 mikrolitrów PBS do każdej studzienki i ponownie usuń PBS za pomocą pipety.

Dodaj 200 mikrolitrów 1% roztworu fioletu krystalicznego do każdego dołka przed inkubacją płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie, po dozowaniu 200 mikrolitrów absolutnego etanolu do każdej studzienki, pozostaw płytkę na 15 minut w temperaturze pokojowej. Zapewnić dokładne wymieszanie, wielokrotnie pipetując zawartość w każdym dołku w górę i w dół.

Za pomocą czytnika mikropłytek zmierz absorbancję studzienek przy 595 nanometrach, aby określić masę biofilmu. Liczba biofilmów różniła się znacznie w zależności od szczepów, wahając się od gęstości optycznej lub OD od 0,04 do 1,69. Spośród Acinetobacter izolaty, z wyjątkiem A. bouvetii, utworzyły biofilmy.

Tam, gdzie A.radioresistens utworzyły słaby biofilm, A.junii i A.bohemicus utworzyły umiarkowane biofilmy, a A.pittii i A.ursingii utworzyły silne biofilmy. Zacznij od dodania jednego mililitra inokulum bakteryjnego do każdej studzienki sterylnej 12-dołkowej płytki polistyrenowej. Inkubować płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Następnie usunąć supernatant za pomocą pipety. Ostrożnie dodaj 1,5 mililitra sterylnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS do każdej studzienki. I ponownie usuń supernatant za pomocą pipety.

Po ponownym dodaniu jednego mililitra sterylnego PBS do każdej studzienki, użyj dopasowanych skrobaków do komórek, aby zeskrobać dolne i ścienne powierzchnie studzienek. Przenieś zawiesinę pobranych komórek do sterylnej plastikowej probówki oznaczonej jako 10 do ujemnej 1, zawierającej dziewięć mililitrów soli fizjologicznej i 10 do 20 szklanych kulek. Obracaj rurkę przez 60 sekund z maksymalną prędkością.

Następnie wykonaj dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie, przenosząc jeden mililitr zawiesiny komórek z poprzedniej probówki do innej sterylnej probówki oznaczonej od 10 do ujemnej 2, zawierającej dziewięć mililitrów roztworu soli fizjologicznej. Kontynuować ten proces seryjnego rozcieńczania do probówki 10 do ujemnej 7. Rozprowadzić 100 mikrolitrów z każdego rozcieńczenia na oddzielnych płytkach agarowych Acinetobacter.

Inkubować płytki agarowe w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 do 42 godzin. Następnie ręcznie policz liczbę typowych czerwonych kolonii na każdej płytce. Biorąc pod uwagę te w zakresie od 10 do 250.

Wszystkie izolaty Acinetobacter, z wyjątkiem A. bouvetii, miały komórki odpowiadające siedmiu do ośmiu log CFU na studzienkę w swoich biofilmach. Gdzie A.bouvetii miał znacznie niższą liczbę komórek na poziomie 4,4 log CFU. Rozpocznij od dodania 200 mikrolitrów inokulum bakteryjnego do każdej studzienki sterylnej 96-dołkowej płytki przygotowanej do analizy mikroskopowej.

Inkubować płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 godziny przed usunięciem supernatantu za pomocą pipety. Następnie ostrożnie dodaj 300 mikrolitrów sterylizowanej filtrem wody dejonizowanej do każdej studzienki. Ponownie usunąć supernatant za pomocą pipety.

W innej probówce przygotuj rozcieńczoną mieszaninę SYTO9 i jodku propidyny oraz sterylizowaną filtrem wodę dejonizowaną do odpowiednich pożądanych stężeń końcowych. Następnie dodaj 200 mikrolitrów mieszaniny do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemnym otoczeniu. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa wykazała, że tworzenie biofilmu znacznie różniło się w zależności od szczepów.

U Acinetobacter junii, Acinetobacter baumannii i Acinetobacter ursingii stwierdzono znaczną ilość biofilmu o odrębnej morfologii biofilmu.