Name: Kwantyfikacja, ocena żywotności i strategie wizualizacji biofilmów Acinetobacter (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-04T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Poznaj metody kwantyfikacji i wizualizacji biofilmów Acinetobacter przy użyciu barwnika krystalicznej fioletowej oraz mikroskopii konfokalnej. Protokół umożliwia ocenę żywotności komórek i analizę morfologii różnych szczepów bakterii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Główny Program Badawczy (E0210702-03) Koreańskiego Instytutu Badań nad Żywnością (KFRI), finansowany przez Ministerstwo Nauki i Technologii Informacyjnych.

1. Przygotowanie inokulum bakteryjnego
<ol>
	<li>Wyjąć fiolkę z glicerolem przechowywaną w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Usunąć szczep bakteryjny (2-10 μl) z fiolki za pomocą sterylnej końcówki pipety. 
	UWAGA: W tym protokole stosuje się szczepy Acinetobacter, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) i A. ursingii (24-1).</li>
	<li>Zaszczepić bakteriami dostępną w handlu płytkę z agarem z krwią (tryptyczny agar sojowy uzupełniony 5% krwią owczą, patrz Tabela Materiałów) bakteriami. 
	UWAGA: Można również użyć innych pożywek, takich jak agar odżywczy lub agar MacConkey.</li>
	<li>Smuguj powierzchnię agaru za pomocą sterylnej pętli z przerywanym płomieniem, aby ją rozrzedzić.</li>
	<li>Umieścić płytkę agarową do góry nogami w inkubatorze i inkubować w temperaturze 30 °C przez noc przez 20-24 godziny.</li>
	<li>Pobrać pojedynczą kolonię kultury bakteryjnej za pomocą sterylnej igły i zaszczepić 5 ml sterylnego bulionu do infuzji serca mózgu (BHI, patrz tabela materiałów) kulturą.</li>
	<li>Zaszczepiony bulion inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przez noc przez 20-24 godziny przy około 150 obr./min.</li>
	<li>Przenieść 1 ml kultury przez noc do sterylnej probówki mikrowirówkowej i odwirować nocną kulturę w temperaturze 6 000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Za pomocą wiru ponownie zawiesić osad w 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Odwirować przy 6 000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w sterylnym, dziesięciokrotnie rozcieńczonym BHI za pomocą wiru do gęstości optycznej około 0,1 przy 600 nm. 
	UWAGA: Gęstość optyczna około 0,1 odpowiada około 107 jtk/ml.</li>
</ol>
2. Kwantyfikacja biofilmu za pomocą fioletu krystalicznego
<ol>
	<li>Dodać 200 μl inokulum do każdej studzienki sterylnej polistyrenowej płytki 96-dołkowej (patrz Tabela Materiałów) i dodać 200 μl wody dejonizowanej do każdej z najbardziej zewnętrznych studzienek, aby zapobiec wysychaniu studzienek wewnętrznych15.</li>
	<li>Dodać 200 μl dziesięciokrotnie rozcieńczonego BHI do każdego dołka tej samej płytki jako kontrolę ujemną.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą pipety. 
	UWAGA: Pipeta wielokanałowa jest często wygodniejsza w przypadku wielu próbek.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 300 μl PBS do każdego dołka i usunąć supernatant za pomocą pipety. 
	UWAGA: Pipeta wielokanałowa jest często wygodniejsza w przypadku wielu próbek.</li>
	<li>Powtórz krok 2.5 jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworu fioletu krystalicznego (1%) (patrz tabela materiałów) do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.4-2.6.</li>
	<li>Dodać 200 μl absolutnego etanolu do każdego dołka i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dokładnie wymieszać, pipetując kilka razy w górę i w dół.</li>
	<li>Przenieść 100 μl elucji z każdej studzienki na nową 96-dołkową płytkę.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję przy długości fali 595 nm za pomocą czytnika mikropłytek (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Gdy absorbancja przekracza 2,0, należy odpowiednio rozcieńczyć próbkę do poziomu poniżej 2,0 w absolutnym etanolu i zmierzyć ją jak w kroku 2.11. Następnie należy obliczyć absorbancję próbki (wartość końcową), mnożąc wartość obserwowaną przez współczynnik rozcieńczenia.</li>
	<li>Obliczyć rzeczywistą absorbancję próbek, odejmując średnią wartość kontroli ujemnej od wartości każdego dołka z badanych próbek na tej samej płytce studzienki.</li>
</ol>
3. Liczba żywotności biofilmu
<ol>
	<li>Dodaj 1 ml inokulum (krok 1) do każdego dołka sterylnej polistyrenowej płytki 12-dołkowej15. Inkubować płytkę w temperaturze 25 °C przez 24 godziny. Usunąć supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 1,5 ml sterylnego PBS do każdej studzienki i usunąć supernatant za pomocą pipety. Dodaj 1 ml sterylnego PBS do każdej studzienki.</li>
	<li>Zeskrob dolną i ścienną powierzchnię studni za pomocą zamontowanych skrobaków do komórek.</li>
	<li>Zawiesinę pobranych komórek przenieść do sterylnej plastikowej probówki (10-1) zawierającej 9 ml soli fizjologicznej (0,85% NaCl) i 10-20 szklanych kulek (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Aby zebrać wszelkie resztki biofilmu pozostawione na dnie studni, można je ponownie zawiesić i przenieść za pomocą pipety przy użyciu soli fizjologicznej z probówki 10-1.</li>
	<li>Obracaj rurkę 10-1 przez 60 s z maksymalną prędkością.</li>
	<li>Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenie, przenosząc 1 ml do następnej sterylnej probówki (10-2) zawierającej 9 ml soli fizjologicznej (0,85% NaCl) do 10-7.</li>
	<li>Rozprowadzić 100 μl z każdego rozcieńczenia na agarze Acinetobacter (patrz tabela materiałów) i inkubować płytki agarowe w temperaturze 30 °C przez 24-42 godziny.</li>
	<li>Policz ręcznie liczbę typowych czerwonych kolonii na każdej płytce w zakresie od 10 do 250.</li>
	<li>Oblicz liczbę żywotnych komórek w biofilmie każdej studzienki, korzystając z poniższego równania: 
	Komórki żywotne = liczba kolonii × Współczynniki rozcieńczenia × 10</li>
</ol>
4. Wizualizacja biofilmu za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM)
<ol>
	<li>Dodać 200 μl inokulum do każdego dołka sterylnej 96-dołkowej płytki przeznaczonej do analizy mikroskopowej.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 25 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Ostrożnie dodaj 300 μl wysterylizowanej wodą dejonizowaną z filtrem do każdej studzienki i usuń supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Powtórz krok 4.4.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę SYTO 9 i jodku propidyny (patrz tabela materiałów) rozcieńczoną w sterylizowanej filtrem wodzie dejonizowanej do końcowego stężenia odpowiednio 10 μM i 60 μM.</li>
	<li>Dodać mieszaninę do każdego dołka o pojemności 200 μl i inkubować płytkę przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.3-4.4</li>
	<li>Wizualizacja biofilmów przyczepionych do dolnej powierzchni za pomocą CLSM o długości fali wzbudzenia 488 nm i 561 nm oraz zakresie długości fali emisji odpowiednio 499-535 nm i 568-712 nm.</li>
</ol>

Assessment of Acinetobacter Biofilm Formation and Characterization of Biofilms

<ol><li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+pathophysiological+overview+of+Acinetobacter+infections%3A+a+century+of+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges.</a> Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).</li>
<li>Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+spp.+in+food+and+drinking+water+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter spp. in food and drinking water - A review.</a> Food Microbiology. 95, 103675(2021).</li>
<li>Towner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter%3A+an+old+friend%2C+but+a+new+enemy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter: an old friend, but a new enemy.</a> Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).</li>
<li>Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+hospital+surfaces+in+the+transmission+of+emerging+health+care-associated+pathogens%3A+Norovirus%2C+Clostridium+difficile%2C+and+Acinetobacter+species%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species.</a> American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%3A+multitasking+in+a+shared+space%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix: multitasking in a shared space.</a> Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li>
<li>Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+microbial+%26%2334%3Bprotective+clothing%26%2334%3B+in+extreme+environments%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the microbial &#34;protective clothing&#34; in extreme environments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423(2019).</li>
<li>Gedefie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii+biofilm+formation+and+its+role+in+disease+pathogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+drug+resistance%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review.</a> Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).</li>
<li>Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii.</a> Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).</li>
<li>Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiologica%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii.</a> New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).</li>
<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li>
<li>Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+characteristics+and+transcriptomic+profiling+of+Acinetobacter+johnsonii+defines+signatures+for+planktonic+and+biofilm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells.</a> Environmental Research. 213, 113714(2022).</li>
<li>Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii%3A+genotype-phenotype+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation.</a> Molecules. 24 (10), 1849(2019).</li>
<li>Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-formation+in+clonally+unrelated+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates.</a> Pathogens. 9 (8), 630(2020).</li>
<li>Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+Acinetobacter+and+Bacillus+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+biofilms+against+sodium+hypochlorite+and+extracellular+matrix-degrading+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes.</a> Food Microbiology. 109, 104125(2023).</li>
<li>Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Salmonella+spp.+and+Listeria+monocytogenes+on+plastic+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface.</a> Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).</li>
<li>Boone, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+virulence+phenotypes+and+antibiotic+resistance+in+clinical+strains+of+Acinetobacter+baumannii+isolated+in+Nashville%2C+Tennessee%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee.</a> BMC Microbiology. 21 (1), 21(2021).</li>
<li>Otter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-attached+cells%2C+biofilms+and+biocide+susceptibility%3A+implications+for+hospital+cleaning+and+disinfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection.</a> Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).</li>
<li>Ravishankar, S., Juneja, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+or+resistance+responses+of+microorganisms+to+stresses+in+the+food+processing+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Stress+Adaptation+and+Food+Safety%22%5BJournal%5D)">Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment.</a> Microbial Stress Adaptation and Food Safety. Yousef, A. E., Juneja, V. K. , (2003).</li>
<li>Dewanti, R., Wong, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+culture+conditions+on+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7.</a> International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).</li>
<li>McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii%3A+human+infections%2C+factors+contributing+to+pathogenesis+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).</li>
<li>McQueary, C. N., Actis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii+biofilms%3A+variations+among+strains+and+correlations+with+other+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties.</a> The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Korzystając z opisanego protokołu, zmierzono, zwizualizowano tworzenie się biofilmu izolatów Acinetobacter o różnym stopniu i oszacowano żywotne komórki w biofilmach (ryc. 1, ryc. 2 i ryc. 3).
W protokole tym zastosowano dwie różne temperatury: 30 °C do wzrostu i 25 °C do tworzenia biofilmu Acinetobacter. Zastosowano 30 °C, ponieważ w wielu badaniach stosowano więcej niż 30 °C dla optyma...

Acinetobacter jest znany z wywoływania infekcji szpitalnych, a jego zakażenie u ludzi, szczególnie w placówkach służby zdrowia, jest coraz częściej zgłaszane1. Jest szeroko rozpowszechniony w szpitalach, placówkach opieki zdrowotnej i środowiskach związanych z żywnością2,3,4. Może przetrwać przez długi czas w środowiskach, w tym na powierzchniach szpitalnych, takich jak poręcze łóżek, stoliki nocne, powierzchnia wentylatorów i zlewozmywaki4. Takie utrzymywanie się na powierzchniach środowiskowych może być jednym z istotnych czynników przyczyniających się do zakażeń szpitalnych Acinetobacter4.
Biofilm jest formą życia mikrobiologicznego i jest mikrobiologiczną matrycą złożoną z żywych komórek mikrobiologicznych i zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS) z komórek5. Komórki mikrobiologiczne są osadzone w matrycy i często są wysoce odporne na stresy środowiskowe, takie jak ciepło, sole, suchość, antybiotyki, środki dezynfekujące i siły ścinające6,7.
Acinetobacter może tworzyć biofilmy na powierzchniach, co sugeruje, że może przyczynić się do wydłużenia przeżywalności na powierzchniach środowiskowych, w tym na powierzchniach szpitalnych, oraz do zwiększenia odporności na leczenie antybiotykami8,9. Ponadto tworzenie się biofilmu przez Acinetobacter może być silnie związane z wynikami klinicznymi u ludzi8. W związku z tym zdolność do formowania biofilmu szczepów Acinetobacter może być jednym ze wskaźników w przewidywaniu przeżycia w środowisku i zakażeń u ludzi8,10.
Biofilmy przyczepione do powierzchni mogą być określone ilościowo i zobrazowane w celu oceny formowalności biofilmu. Aby określić ilościowo biofilmy przyczepione do powierzchni, biofilmy są zwykle barwione barwnikami barwiącymi biofilm, takimi jak fiolet krystaliczny, a barwniki są eluowane w roztworze i mierzone pod kątem gęstości optycznej11. Wizualizacja biofilmów to kolejne dobre podejście do oceny odkształcalności biofilmu11. Metoda wizualizacji konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) wykorzystująca specyficzność przy użyciu barwników fluorescencyjnych może być bardziej przydatna do scharakteryzowania morfologii biofilmu w porównaniu z innymi technikami, takimi jak SEM12,13.
Zdolne do życia komórki w biofilmach można policzyć w celu oszacowania liczby żywotnych komórek w biofilmach11. Żywe komórki osadzone w biofilmach są odłączane, rozcieńczane, rozprowadzane na płytkach agarowych, inkubowane i liczone. Ponieważ większa liczba komórek prawdopodobnie spełni dawkę zakaźną, może dostarczyć bardziej szczegółowych informacji na temat biofilmów, takich jak potencjały infekcji związane z liczbą komórek13,14.
Ten artykuł przedstawia krok po kroku protokoły do (1) ilościowego oznaczania biofilmów przyczepionych powierzchniowo, (2) liczenia żywotnych komórek w biofilmach oraz (3) wizualizacji biofilmów za pomocą CLSM Acinetobacter. Przedstawione protokoły opisują metody oceny formowalności biofilmu izolatów Acinetobacter oraz charakteryzują ich biofilmy.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>SPL</td><td>30096</td><td>Polistyren 96-dołkowa płytka</td></tr><tr><td>BHI (Brain Heart Infusion) bulion</td><td>Merck KGaA</td><td>1.10493.0500</td><td></td></tr><tr><td>Płytka bazowa agaru z krwią</td><td>KisanBio</td><td>MB-B1005-P50</td><td>Pożywka wzrostowa dla Acinetobacter</td></tr><tr><td>CHROMagar Acinetobacter</td><td>CHROMagar</td><td>AC092</td><td>Selektywna płytka do Acinetobacter</td></tr><tr><td>Crystal violet rozwiązanie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V5265</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer LIVE/DEAD Zestaw do żywotności biofilmu</td><td>Invitrogen</td><td>L10316</td><td>SYTO9 i jodek propidyny</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200 PRO NanoQuant</td><td>Pomiar biofilmu</td></tr><tr><td>Koraliki szklane</td><td>RBC</td><td>RBC RG001</td><td>Koraliki szklane</td></tr><tr><td>&mu;-Płytka 96 Well</td><td>ibidi</td><td>89621</td><td>Mikropłytka przeznaczona do CLSM</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja, ocena żywotności i strategie wizualizacji biofilmów acinetobacter

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter powoduje infekcje szpitalne, a tworzenie się jego biofilmu może przyczynić się do przetrwania na suchych powierzchniach, takich jak szpitale. W związku z tym kwantyfikacja i wizualizacja biofilmu są ważnymi metodami oceny potencjału szczepów Acinetobacter do wywoływania zakażeń szpitalnych. Biofilmy tworzące się na powierzchni mikropłytki można określić ilościowo pod względem objętości i liczby komórek. Objętość biofilmu można określić ilościowo poprzez barwienie za pomocą fioletu krystalicznego, mycie, odbarwianie za pomocą etanolu, a następnie pomiar rozpuszczonego barwnika za pomocą czytnika mikropłytek. Aby określić ilościowo liczbę komórek osadzonych w biofilmach, biofilmy są zeskrobywane za pomocą skrobaków do komórek, zbierane w roztworze soli, energicznie mieszane w obecności szklanych kulek i rozprowadzane na agarze Acinetobacter. Następnie płytki inkubuje się w temperaturze 30 °C przez 24-42 godziny. Po inkubacji czerwone kolonie są liczone w celu oszacowania liczby komórek w biofilmach. Ta realna metoda liczenia może być również przydatna do liczenia komórek Acinetobacter w biofilmach mieszanych gatunków. Biofilmy Acinetobacter można wizualizować za pomocą barwników fluorescencyjnych. Dostępna na rynku mikropłytka przeznaczona do analizy mikroskopowej jest wykorzystywana do tworzenia biofilmów. Następnie biofilmy przyczepione do dolnej powierzchni są barwione barwnikami SYTO9 i jodku propydyny, przemywane, a następnie wizualizowane za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Zgodnie z protokołem, biofilmy izolatów Acinetobacter, pierwotnie wyizolowanych z powierzchni kuchennych, utworzono na polistyrenowej płytce 96-dołkowej, zabarwiono fioletem krystalicznym, a następnie rozpuszczono barwniki w etanolu i zmierzono masę biofilmu (Rysunek 1). Ilość biofilmu znacznie różniła się w zależności od szczepów, przyjmując wartości OD od 0,04 do 1,69 (Rysunek 1). Na podstawie kryteriów ustalonych przez Stepanovicia i wsp.<sup class="...

Ten protokół opisuje przygotowanie inokulum, kwantyfikację biofilmu na płytkach mikromiareczkowych za pomocą barwnika fioletu krystalicznego, liczenie żywotnych w biofilmach oraz wizualizację biofilmów Acinetobacter.

Kwantyfikacja, ocena żywotności i strategie wizualizacji biofilmów Acinetobacter

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

Biofilmy składają się z żywych komórek drobnoustrojów i są trudne do usunięcia z powierzchni. Szczepy Acinetobacter, powszechnie występujące w naszym środowisku, powodujące te powszechne infekcje, są również znane z tworzenia biofilmów na powierzchniach. Dlatego naszym celem jest opracowanie metod zarówno ilościowego, jak i wizualizacji biofilmów Acinetobacter.Nasz protokół zapewnia prostą i łatwą metodę ilościowego oznaczania i wizualizacji biofilmów Acinetobacter. Żywotną liczbę komórek wewnątrz biofilmów określa się ilościowo przy użyciu metody liczenia żywotnych. Wyniki naszych badań pokazują, że naturalnie występujące szczepy Acinetobacter mają dość różny potencjał tworzenia biofilmu.Istnieją również wyraźne różnice morfologiczne w obrębie różnych biofilmów. Utorowało to drogę do badań skupiających się na przyczynach tak dużej zmienności między szczepami Acinetobacter. Aby rozpocząć proces przygotowania inokulum bakteryjnego, należy pobrać od 2 do 10 mikrolitrów szczepu bakteryjnego z fiolki za pomocą sterylnej końcówki pipety i zaszczepić nią dostępną w handlu płytkę z agarem do krwi.Za pomocą sterylnej pętli rozprowadź smugi na powierzchni agaru, rozrzedzając ją przerywanym płomieniem. Inkubować przygotowaną płytkę agarową w pozycji odwróconej do góry nogami w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez około 20 do 24 godzin. Następnie wybierz pojedynczą kolonię kultury bakteryjnej za pomocą sterylnej igły i zaszczep pięć mililitrów sterylnego bulionu BHI tą kulturą.Zaszczepiony bulion inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza, z prędkością 150 obrotów na minutę, przez około 20 do 24 godzin. Następnie przenieś jeden mililitr kultury do sterylnej probówki do mikrowirówki i odwiruj w temperaturze 6 000 g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po odwirowaniu odrzucić sklarowany osad.Dodaj jeden mililitr sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS do granulki i ponownie ją zawiesić za pomocą wiru. Odwirować zawieszony osad o masie 6 000 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant. Tym razem ponownie zawieś powstały osad w sterylnym, dziesięciokrotnie rozcieńczonym bulionie BHI za pomocą wiru.Upewnij się, że osiągniesz gęstość optyczną około 0,1 przy 600 nanometrach. Na początek dodaj 200 mikrolitrów inokulum bakteryjnego do każdej studzienki sterylnej polistyrenowej 96-dołkowej płytki. Następnie dodaj 200 mikrolitrów wody dejonizowanej do najbardziej zewnętrznych studni, aby zapobiec wysychaniu studni wewnętrznych.Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji wyrzucić supernatant z każdej studzienki za pomocą pipety. Ostrożnie dodaj 300 mikrolitrów PBS do każdej studzienki i ponownie usuń PBS za pomocą pipety.Dodaj 200 mikrolitrów 1% roztworu fioletu krystalicznego do każdego dołka przed inkubacją płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie, po dozowaniu 200 mikrolitrów absolutnego etanolu do każdej studzienki, pozostaw płytkę na 15 minut w temperaturze pokojowej. Zapewnić dokładne wymieszanie, wielokrotnie pipetując zawartość w każdym dołku w górę i w dół.Za pomocą czytnika mikropłytek zmierz absorbancję studzienek przy 595 nanometrach, aby określić masę biofilmu. Liczba biofilmów różniła się znacznie w zależności od szczepów, wahając się od gęstości optycznej lub OD od 0,04 do 1,69. Spośród Acinetobacter izolaty, z wyjątkiem A. bouvetii, utworzyły biofilmy.Tam, gdzie A.radioresistens utworzyły słaby biofilm, A.junii i A.bohemicus utworzyły umiarkowane biofilmy, a A.pittii i A.ursingii utworzyły silne biofilmy. Zacznij od dodania jednego mililitra inokulum bakteryjnego do każdej studzienki sterylnej 12-dołkowej płytki polistyrenowej. Inkubować płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 godziny.Następnie usunąć supernatant za pomocą pipety. Ostrożnie dodaj 1,5 mililitra sterylnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS do każdej studzienki. I ponownie usuń supernatant za pomocą pipety.Po ponownym dodaniu jednego mililitra sterylnego PBS do każdej studzienki, użyj dopasowanych skrobaków do komórek, aby zeskrobać dolne i ścienne powierzchnie studzienek. Przenieś zawiesinę pobranych komórek do sterylnej plastikowej probówki oznaczonej jako 10 do ujemnej 1, zawierającej dziewięć mililitrów soli fizjologicznej i 10 do 20 szklanych kulek. Obracaj rurkę przez 60 sekund z maksymalną prędkością.Następnie wykonaj dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie, przenosząc jeden mililitr zawiesiny komórek z poprzedniej probówki do innej sterylnej probówki oznaczonej od 10 do ujemnej 2, zawierającej dziewięć mililitrów roztworu soli fizjologicznej. Kontynuować ten proces seryjnego rozcieńczania do probówki 10 do ujemnej 7. Rozprowadzić 100 mikrolitrów z każdego rozcieńczenia na oddzielnych płytkach agarowych Acinetobacter.Inkubować płytki agarowe w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 do 42 godzin. Następnie ręcznie policz liczbę typowych czerwonych kolonii na każdej płytce. Biorąc pod uwagę te w zakresie od 10 do 250.Wszystkie izolaty Acinetobacter, z wyjątkiem A. bouvetii, miały komórki odpowiadające siedmiu do ośmiu log CFU na studzienkę w swoich biofilmach. Gdzie A.bouvetii miał znacznie niższą liczbę komórek na poziomie 4,4 log CFU. Rozpocznij od dodania 200 mikrolitrów inokulum bakteryjnego do każdej studzienki sterylnej 96-dołkowej płytki przygotowanej do analizy mikroskopowej.Inkubować płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 godziny przed usunięciem supernatantu za pomocą pipety. Następnie ostrożnie dodaj 300 mikrolitrów sterylizowanej filtrem wody dejonizowanej do każdej studzienki. Ponownie usunąć supernatant za pomocą pipety.W innej probówce przygotuj rozcieńczoną mieszaninę SYTO9 i jodku propidyny oraz sterylizowaną filtrem wodę dejonizowaną do odpowiednich pożądanych stężeń końcowych. Następnie dodaj 200 mikrolitrów mieszaniny do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemnym otoczeniu. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa wykazała, że tworzenie biofilmu znacznie różniło się w zależności od szczepów.U Acinetobacter junii, Acinetobacter baumannii i Acinetobacter ursingii stwierdzono znaczną ilość biofilmu o odrębnej morfologii biofilmu.

quantification-viability-assessment-visualization-strategies-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Tay, S. B. i in. Antywirusowe zaburzenie biofilmów patogennych przy użyciu inżynierowanych laktonan gaśniczych kworum.  J. Vis. Exp. (2016)Film demonstruje metodę ilościowego określenia biomasy biofilmu w patogennej bakterii, porównując nieleczone grupy kontrolne z próbkami objętymi enzymem gaszczącym kworum. Enzym zakłóca sygnalizację bakteryjną podczas wczesnej inkubacji, zmniejszając przyczepność komórek. Po płukaniu i dalszej inkubacji studnie kontrolne tworzą gęste biofilmy,...

Ilościowe tłumienie biofilmu indukowanego enzymami u bakterii patogennych

Przedstawiono protokół jednoczesnej kwantyfikacji i porównania trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Metodologia obejmuje wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, oprogramowania do analizy strukturalnej i wizualizacji biofilmu oraz oprogramowania do analizy statystycznej.

Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Celem tego artykułu jest opisanie użycia systemu mikroprzepływowego do tworzenia wielogatunkowych biofilmów, które zawierają gatunki typowo identyfikowane w ludzkiej naddziąsłowej płytce nazębnej. Podkreślono metody opisu architektury biofilmu, żywotności biofilmu oraz podejścia do zbierania biofilmu do analiz zależnych od kultury lub niezależnych od kultury.

Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej

To badanie przedstawia rozwój powtarzalnych metodologii badania inhibitorów biofilmu i ich wpływu na wielokomórkowość Bacillus subtilis.

Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzującego małocząsteczkowe inhibitory biofilmu

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Ten protokół opisuje wizualizację rozwoju biofilmu po ekspozycji na czynniki gospodarza za pomocą modelu komory szkiełkowej. Model ten pozwala na bezpośrednią wizualizację rozwoju biofilmu, a także analizę parametrów biofilmu za pomocą programów komputerowych.

Wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu szkła nakrywkowego

Wywołane przez środki przeciwbakteryjne zmiany w architekturze biofilmu Pseudomonas aeruginosa różnią się między klinicznymi izolatami hodowanymi od pacjentów z mukowiscydozą i przewlekłą infekcją płuc. Po mikroskopii konfokalnej oprogramowanie COMSTAT może być wykorzystane do ilościowego określenia zmian w architekturze biofilmu (np. powierzchni, grubości, biomasy) dla poszczególnych izolatów w celu oceny skuteczności środków przeciwinfekcyjnych.

Kwantyfikacja wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych na architekturę biofilmu in vitro przy użyciu oprogramowania COMSTAT

Syntetyczne podłoże do mukowiscydozy (SCFM2) może być używane w połączeniu zarówno z konfokalną laserową mikroskopią skaningową, jak i aktywowanym fluorescencją sortowaniem komórek, aby obserwować agregaty bakteryjne w wysokiej rozdzielczości. W tym artykule szczegółowo opisano metody oceny zagregowanych populacji podczas leczenia przeciwdrobnoustrojowego jako platformę dla przyszłych badań.

Narzędzia do oceny w czasie rzeczywistym modelu zakażenia Pseudomonas aeruginosa

Ten protokół opisuje podejście łączące metody statyczne i dynamiczne do oceny skuteczności organicznych nadtlenokwasów w zwalczaniu biofilmów w przemyśle mleczarskim. Podejście to może być również wykorzystane do testowania skuteczności nowych preparatów biologicznych lub chemicznych w zwalczaniu biofilmów.

Ocena skuteczności organicznych nadtlenokwasów w zwalczaniu biofilmu mlecznego przy użyciu podejścia łączącego metody statyczne i dynamiczne

Protokół ten zapewnia modułowy workflow BSL-2, łączący testy biomasy kryształowo-fioletowej, kinetykę kontrastu fazowego poklatkowego, konfokalne mapowanie 3D/matrycowe macierzy, ultrastrukturę SEM oraz moduł in vivo dla infekcji chomików, aby kultywować, ilościować, charakteryzować i badać funkcjonalną rolę biofilmu Leptospira , umożliwiając standaryzowaną ocenę mutantów i interwencji antybiofilmowych w różnych laboratoriach.

Modułowy workflow do analizy ilościowej, strukturalnej i funkcjonalnej biofilmów Leptospira

Poznaj metody kwantyfikacji i wizualizacji biofilmów Acinetobacter przy użyciu barwnika krystalicznej fioletowej oraz mikroskopii konfokalnej. Protokół umożliwia ocenę żywotności komórek i analizę morfologii różnych szczepów bakterii.

Kwantyfikacja, ocena żywotności i strategie wizualizacji biofilmów Acinetobacter

Przeglądaj więcej filmów