Bezznacznikowa bioanaliza rozpraszania Ramana ze wzmocnieniem powierzchniowym oparta na nanosondach Au@Carbon dot
9 czerwca 2023
W tym badaniu opracowaliśmy tanią nanosondę odcisków palców opartą na powierzchniowo wzmocnionym rozpraszaniu Ramana (SERS) o korzystnej biokompatybilności, aby pokazać bezznacznikowe bioobrazowanie żywych komórek i wykryć dwa szczepy bakterii, pokazując szczegółowo, jak uzyskać widma SERS żywych komórek w sposób nieniszczący.
W ramach tych badań opracowaliśmy tanią nanosondę odcisków palców opartą na powierzchniowo wzmocnionym rozpraszaniu Ramana o korzystnej biokompatybilności. Nasza sonda umożliwia obrazowanie jelit grubych z żywych komórek bez znaczników i może wykryć dwie ciągi bakteryjne, dostarczając informacji o molekularnych odciskach palców. Przeprowadziliśmy również analizę głównych składowych pojedynczych żywych komórek.
Naukowcy skupili się ostatnio na poprawie czułości, odtwarzalności i opracowaniu braku źródła śladów i technik w celu zapewnienia wiarygodnych informacji molekularnych, dzięki czemu mogą umożliwić przesyłanie i wykrywanie wielu analiz, a także można je połączyć z analizą danych maszynowych w celu poprawy wydajności. Uzyskanie specyficznych sygnałów Ramana z komórek może być trudne ze względu na obecność wielu innych substancji chemicznych w próbce, które mogą zakłócać sygnał tła W porównaniu z detekcją zamrożoną, źródło bez etykiety miało rzeczywistą wysoką czułość powierzchniową i mogło realizować kierunkowe wykrywanie błędów przestrzeni w komórkach. Co ważniejsze, może zapewnić wewnętrzną chemię wlotu i wyjścia na poziomie pojedynczej komórki w nieograniczony sposób w warunkach naturalnych.
W przyszłości nasze prace będą koncentrować się na kompletnej architekturze systemu opartego na kropkach węglowych, w tym na wytwarzaniu nanostruktur i próżni źródłowej. Koncentrujemy się również na biomedycznym wytwarzaniu tego systemu źródłowego, takim jak badania nad komórkami i aplikacje niezależne od komórek. Zacznij od dodania 100 mikrolitrów przygotowanego roztworu kropek węglowych do 200 mikrolitrów kwasu chloroaurowego w temperaturze pokojowej przez 10 sekund, aż powstanie fioletowa zawiesina.
Następnie odwirować fioletową zawiesinę o sile 4 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie usunąć supernatant za pomocą pipety, jeśli usunięcie koloidów z kompozytowych nanocząstek złota kropek węglowych jest trudne. Ponownie zawiesić nanocząstki kompozytowe złotych kropek węglowych w 200 mikrolitrach wody dejonizowanej, aby zmyć nadmiar kropek węglowych.
Ponownie odwirować zawiesinę, usunąć supernatant i uzyskać nanocząstki otoczki rdzenia poprzez ponowne zdyspergowanie ich w 100 mikrolitrach wody dejonizowanej. Przechowuj mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wytworzeniu nanocząstek kompozytowych ze złotymi kropkami węglowymi, umieść sterylny szafirowy chip w 24-dołkowych płytkach i komórkach nasiennych z jednym mililitrem pożywki w jednym dołku.
Inkubuj płytki w wilgotnym środowisku, aby osiągnąć 70 do 80% konfluencji. Dodaj nanocząstki kompozytowe złotych kropek węglowych do pojedynczego dołka i inkubuj przez cztery do sześciu godzin. Pod koniec inkubacji usuń pożywkę z wiórów szafirowych.
Delikatnie opłucz chipy PBS i zanurz szafirowe chipsy w PBS w celu wykrycia SERS. Aby przeprowadzić eksperyment SERS, włącz komputer, spektrometr Ramana i laser 785 nanometrów. Następnie uruchom dołączone oprogramowanie i wykonaj kalibrację za pomocą płytek krzemowych.
Kliknij nowy pomiar, a następnie akwizycję spektralną i dostosuj zakres widma, a następnie przejdź do zakładki akwizycji, dostosuj czas ekspozycji i moc lasera, a następnie kliknij OK, aby zainicjować nową akwizycję spektralną. Użyj soczewki obiektywu 20-krotnego, aby uzyskać wyraźny obraz komórkowy, a następnie przełącz się na soczewkę 50-krotną. Po wybraniu punktu na komórkach do pomiaru, kliknij uruchom, aby rozpocząć proces, a następnie zapisz widma.
Aby uzyskać obrazowanie SERS komórek A549, kliknij przycisk nowy usprawnij pozyskiwanie obrazu, wybierz zakres do sfotografowania, a następnie kliknij przycisk OK. Ustaw opływ krawędzi na 785 nanometrów, środek na 1, 200 centymetrów odwrotnie, czas ekspozycji na pięć sekund, a moc lasera na 50%Parametr można modyfikować zgodnie z wymaganiami. Kliknij nowy lub obrazowanie na żywo, wybierz sygnał do linii bazowej i ustaw pierwszy limit na 725, a drugi limit na 1, 700, a następnie przejdź do ustawień obszaru, ustaw odpowiednie kroki i kliknij w porządku.
Na koniec kliknij uruchom, aby rozpocząć wykonywanie obrazowania SERS. Widma SERS wykazały, że nawet gdy stężenie błękitu metylenowego wynosi zaledwie 10 do minus dziewięciu molowych, nanocząstki kompozytowe ze złotymi kropkami węglowymi wykazują doskonałą wydajność SERS w porównaniu z nanocząstkami złota. Widma SERS uzyskane w 20 punktach wykazywały duże podobieństwo.
Miesiąc po umieszczeniu nanocząstek kompozytowych ze złotymi kropkami węglowymi w temperaturze czterech stopni Celsjusza, średnia aktywność SERS na poziomie 951, 185 i 1 620 centymetrów wstecznych wykazała stopień rozpadu odpowiednio około 5,43%11,44% i 13,94%. Nanocząstki kompozytowe złotych kropek węglowych ledwo wykazywały cytotoksyczność dla komórek A549. Przedstawiono średnie widmo komórek A549.
Kompozytowe agregaty nanocząstek ze złotymi kropkami węglowymi wykazują oczywiste sygnały SERS bez tła szumów w mapowaniu SERS komórek A549. Widma z różnych punktów komórkowych wykazały niejednorodność składników w różnych regionach cytoplazmatycznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia niskokosztową nanoprobę do tworzenia „odcisków palców” opartą na powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramanowskiej (SERS), zaprojektowaną do bezznacznikowego obrazowania biologicznego żywych komórek. Sonda wykazuje korzystną biozgodność oraz zdolność do wykrywania dwóch szczepów bakteryjnych, dostarczając szczegółowych widm SERS żywych komórek w sposób niedestrukcyjny.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biofizyka
- Biologia komórki
- Chemia analityczna
Wstęp
- Spektroskopia Ramana wzmocniona powierzchniowo (SERS) jest potężną techniką detekcji molekularnej.
- Techniki obrazowania bez użycia znaczników są kluczowe dla badania żywych komórek bez zmiany ich stanu.
- Istnieją trudności w uzyskaniu wyraźnych sygnałów Ramana ze względu na interferencje tła pochodzące od innych substancji chemicznych.
- Ostatnie postępy koncentrują się na poprawie czułości i powtarzalności w analizie molekularnej.
Cel badania
- Opracowanie ekonomicznie opłacalnej nanosondy opartej na metodzie SERS do obrazowania żywych komórek.
- Umożliwienie wykrywania szczepów bakteryjnych za pomocą molekularnego fingerprintingu.
- Umożliwienie nieniszczącej analizy żywych komórek.
Zastosowane metody
- Opracowanie nanosondy do identyfikacji odcisków palca w oparciu o SERS.
- Obrazowanie żywych komórek bez użycia znaczników.
- Analiza głównych składowych pojedynczych żywych komórek.
- Porównanie sygnałów SERS z tradycyjnymi metodami detekcji w zamrożeniu.
Główne wyniki
- Nanosonda pomyślnie wykryła dwa szczepy bakteryjne.
- Osiągnięto wysoką czułość powierzchniową w analizie żywych komórek.
- Niedestrukcyjne metody dostarczyły wewnętrznych informacji chemicznych na poziomie pojedynczych komórek.
- Analiza głównych składowych ujawniła istotne szczegóły molekularne żywych komórek.
Wnioski
- Opracowana nanosonda oparta na SERS jest obiecującym narzędziem do bioobrazowania żywych komórek.
- Oferuje ona nieinwazyjne podejście do badania procesów komórkowych.
- Technologia ta może usprawnić detekcję i analizę wielu analitów w próbkach biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Beznacznikowa bioanaliza SERS z wykorzystaniem nanosond Au@carbon dot umożliwia wysokoczułe tworzenie molekularnych odcisków palców żywych komórek i bakterii, co wspiera wczesną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w profilowaniu komórkowym i mikrobiologicznym, ułatwiając podejmowanie decyzji skorygowanych o ryzyko w procesach odkrywania leków i badaniach translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie tworzenie odcisków molekularnych składników komórkowych i mikrobiologicznych w celu weryfikacji hipotez.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów poprzez rozróżnianie heterogeniczności komórkowej na poziomie pojedynczej komórki.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki bezznakowej detekcji wewnętrznych profili chemicznych.
- Zwiększa pewność prognostyczną podczas selekcji portfolio, dostarczając powtarzalnych, ilościowych wyników SERS.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane, aktywne w SERS systemy biologiczne do dalszych etapów procesów przesiewowych.
- Zapewnia standaryzowane, powtarzalne i ilościowe widma Ramana do opracowywania testów.
- Umożliwia detekcję analitów o wysokiej czułości w stężeniach nanomolarnych, wspierając gotowość do wiarygodnych badań przesiewowych.
- Pozwala na ponowne wykorzystanie platformy w różnorodnych zastosowaniach do profilowania komórek i bakterii.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia analizę systemową istotną dla przebiegu chorób poprzez bezetykietowe profilowanie komórek nowotworowych i bakterii.
- Wspiera odkrywanie biomarkerów translacyjnych dzięki analizie głównych składowych widm SERS.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez utrzymanie natywnych warunków komórkowych podczas analizy.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne dzięki umożliwieniu niedestrukcyjnego, w czasie rzeczywistym prowadzonego profilowania chemicznego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda nanosondy oparta na SERS integruje proces od wczesnego etapu odkrywania, przez identyfikację wiodących związków, aż po badania przedkliniczne, wspierając testowanie hipotez oraz analitykę ilościową na każdym etapie procesu.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków metabolicznych poprzez molekularne odciskowanie żywych komórek i bakterii.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki SERS w celu standaryzacji testów i oceny związków.
- Analityka: Umożliwia analizę głównych składowych dla rzetelnego porównywania widm komórkowych i mikrobiologicznych.
- Badania translacyjne: Zachowuje istotność chorobową i zgodność biomarkerów dzięki profilowaniu in situ bez użycia znaczników.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, wielokrotnego użytku platformę dla różnorodnych zastosowań bioanalitycznych w badaniach i rozwoju (R&D).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy w bioanalizie SERS.
- Wartość strategiczna: Wspiera świadome decyzje typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez ograniczanie ryzyka biologicznego na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów badawczych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie aparatury SERS oraz analizy danych widmowych.
- Wymaga dostępu do spektrometrów Ramanowskich i kompatybilnej infrastruktury obrazowania.
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowania próbek i pozyskiwania widm pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do adaptacji do różnych modeli komórkowych i bakteryjnych, przy zaobserwowaniu minimalnej cytotoksyczności.
- W celu zapewnienia powtarzalnych wyników należy monitorować długoterminową stabilność nanosond oraz zanik sygnału.
