Obrazowanie żywymi komórkami mózgów larwalnych Drosophila melanogaster

Tutaj omawiamy proces przygotowania, sekcji, montażu i obrazowania żywych mózgów eksplantatów z larw trzeciego stadium rozwojowego Drosophila melanogaster, aby obserwować dynamikę komórkową i subkomórkową w warunkach fizjologicznych.

Nasze badania koncentrują się na badaniu wpływu asymetrycznego podziału komórek (ACD) na proliferację i różnicowanie komórek macierzystych. Wykorzystujemy neuronalne komórki macierzyste Drosophila lub neuroblasty jako model do zrozumienia mechanizmów, regulacji i wpływu asymetrycznego podziału komórek na rozwój i neurogenezę. Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie sztucznej inteligencji poczyniły znaczne postępy w kwantyfikacji i analizie obrazów, co znacznie posunęło naprzód w dziedzinie obrazowania żywych komórek.

Utrzymanie jakości próbki w przypadku filmu długoterminowego jest długotrwałym wyzwaniem. Chociaż obserwacja próbki przez osiem do 10 godzin jest wnikliwa, ograniczenia logistyczne, takie jak wymagania dotyczące obrazowania próbki i dostępne narzędzia do obrazowania, utrudniają to. Nasz protokół rozwiązuje ten problem, demonstrując długoterminowe obrazowanie bez wpływu na jakość próbki.

Nasza technika może być łatwo zaadoptowana i zastosowana w terenie przez nowicjuszy. Przy odrobinie czasu i wprawy można realnie generować krótko- i długoterminowe filmy, które mają potencjał, aby dostarczyć wnikliwych i znaczących danych. Zacznij od skrzyżowania samic dziewic w wieku od jednego do pięciu dni z dorosłymi samcami w wieku od jednego do siedmiu dni, aby uzyskać potomstwo o pożądanym genotypie.

Aby to zrobić, umieść muchy w klatce na muchy z nakrętką do posiłku. Użyj od 10 do 15 dziewic żeńskich i od pięciu do 10 samców, aby uzyskać optymalną wydajność. Inkubować klatkę na muchy zawierającą muchy w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Codziennie zmieniaj nasadkę posiłku, aby zapobiec przepełnieniu larw, co obniża jakość wypreparowanych mózgów. Jeśli nakrętka mączki ma więcej niż 30 larw, podziel ją na pół i zastąp jedną porcję świeżą nakrętką mączki przeciętą na pół. Wysiaduj kapelusze mączki z larwami w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aż larwy osiągną pożądany wiek.

Rozpocznij od odpipetowania około 400 mikrolitrów pożywki do rozwarstwiania i obrazowania do każdej studzienki trzydołkowego naczynia do rozwarstwiania. Pod mikroskopem umyj 10 dobrze odżywionych larw typu dzikiego, delikatnie przytrzymując je kleszczami preparacyjnymi i zanurzając je w pożywce preparacyjnej w najgłębszym dołku, aby usunąć wszystkie cząstki pokarmu. Kontynuując pracę pod mikroskopem preparacyjnym, przenieś czyste larwy do środkowej studzienki.

Przytrzymaj larwy za haczyki do ust za pomocą jednego zestawu pęsety. Za pomocą kolejnego zestawu pęsety rozerwij jedną stronę naskórka larwy, aby wylać tłuste ciała. Za pomocą kleszczy zbierz jak najwięcej tłuszczu z każdej larwy i przenieś ją do najwyższej studni zawierającej 400 mikrolitrów pożywki preparacyjnej w temperaturze pokojowej.

Rozpocznij od odpipetowania około 400 mikrolitrów pożywki do rozwarstwiania i obrazowania do każdej studzienki trzydołkowego naczynia do rozwarstwiania. Pracując pod mikroskopem preparacyjnym, umyj eksperymentalne larwy podczas sekcji w pożywce do obrazowania, aby usunąć resztki jedzenia. Kontynuując pracę pod mikroskopem preparacyjnym, trzymaj larwy za haczyki ustne za pomocą jednego zestawu pęsety.

Za pomocą innego zestawu pęsety ostrożnie odetnij około jednej trzeciej larw od tylnej strony. Następnie, trzymając larwy za haczyki do ust za pomocą jednego zestawu pęsety, użyj drugiego zestawu pęsety, aby delikatnie przeczesać naskórek w kierunku haczyków do ust. Jednocześnie wepchnij pęsetą do środka, przytrzymując haczyki do ust, aż całe larwy zostaną wywrócone na lewą stronę.

Odwróć larwy, aby odsłonić ośrodkowy układ nerwowy i inne tkanki, zachowując ich połączenie z naskórkiem. Zlokalizuj ośrodkowy układ nerwowy lub OUN, aby uniknąć przypadkowego usunięcia. Delikatnie usuń tkanki inne niż OUN za pomocą pęsety, pozostawiając tylko OUN i mózg przyczepione do naskórka.

Aby uwolnić mózg od naskórka poprzez przecięcie połączeń aksonalnych, za pomocą nożyczek do mikropreparacji delikatnie przetnij pod płatami mózgu. Następnie przetnij połączenia pod brzusznym rdzeniem nerwowym. Rozbioruj larwy partiami, aby czas rozbioru nie przekraczał 20 minut.

Przenieś wypreparowany mózg do studzienki zawierającej pożywkę do sekcji i obrazowania. W przypadku obrazowania trwającego dłużej niż trzy godziny należy uzupełnić podłoże o ciała tłuszczowe. Aby wykonać obrazowanie żywych komórek mózgu larwy w trzecim stadium rozwojowym, należy rozpocząć od zebrania wypreparowanych mózgów i wyizolowanych ciał tłuszczowych w ostatniej studzience trzydołkowej naczynia preparacyjnego zawierającej pożywkę do sekcji i obrazowania.

Umieść membranę przepuszczającą gaz z tyłu szkiełka i wciśnij dzielony pierścień do środka. Za pomocą mikropipety o pojemności 200 mikrolitrów przenieś do 10 wypreparowanych mózgów z maksymalną możliwą ilością ciał tłuszczowych i 130 do 140 mikrolitrów pożywki na środek membrany. Zorientuj mózgi zgodnie z populacją neuronalnych komórek macierzystych, które mają być zobrazowane, i typem mikroskopu, upewniając się, że próbki znajdują się blisko obiektywu mikroskopu.

Na przykład, aby zobrazować nerwowe komórki macierzyste w centralnych płatach mózgu, upewnij się, że płaty mózgowe znajdują się najbliżej celu. Następnie delikatnie umieść szklaną pokrywę na roztworze na membranie, aby rozprowadzić roztwór z mózgami i ciałami tłuszczowymi po całej membranie. Przytrzymaj tkankę laboratoryjną na krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby osuszyć nadmiar roztworu, aż mózg dotknie szkiełka nakrywkowego, nie zostając zgniecionym.

Następnie unieruchamić szkiełko nakrywkowe, nakładając stopioną wazelinę wzdłuż jej krawędzi za pomocą pędzla i pozwól galarecie zastygnąć. Dodać 400 mikrolitrów pożywki do obrazowania do studzienki w wielodołkowym mikroszkiełku. Przenieś wcześniej wypreparowane ciała tłuszczowe do tej studni.

Następnie umieść do 10 mózgów w skupisku w pobliżu środka studni. Zorientuj mózgi zgodnie z populacją neuronalnych komórek macierzystych, które mają być zobrazowane, i typem mikroskopu. Pozwól mózgom osiąść w studni przez dwie do pięciu minut.

Przykryj mikroszkiełko pokrywą szkiełka przed przeniesieniem go do mikroskopu. Rozpocznij proces akwizycji przy użyciu najniższej mocy lasera i czasu naświetlania, aby zminimalizować fotowybielanie. Obrazowanie mózgów larw wyrażających napędzaną przez UAS wiśnię Jowisza i endogennie znakowane szpilki GFP przy użyciu szkiełek do obrazowania wielodołkowego i bez suplementacji ciała tłuszczowego ujawniło, że szpilki tworzyły wyraźny sierp wierzchołkowy w dzielących się neuroblastach, do których wrzeciona mitotyczne konsekwentnie ustawiały się podczas mitozy.

W tych próbkach długość cyklu komórkowego zwiększała się wraz ze wzrostem czasu obrazowania. Próbki, które zostały zobrazowane w pożywce z dodatkiem tłuszczu na szkiełku połączonym błoną, nie wykazały wzrostu długości cyklu komórkowego. Ponadto na 10-godzinnym szkiełku związanym z błoną zaobserwowano neuroblasty z czterema podziałami.