Name: Obrazowanie żywymi komórkami mózgów larwalnych Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj protokół obrazowania żywych mózgów larwalnych Drosophila melanogaster w celu badania asymetrycznego podziału komórkowego w komórkach macierzystych nerwowych. Ta metoda umożliwia długoterminową obserwację bez utraty jakości próbki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie jest wspierane przez R35GM148160 (C. C.) oraz National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R. C. S)

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia materiały niezbędne do przeprowadzenia tego badania.
1. Rozważania i przygotowania do eksperymentu
<ol>
	<li>Zapobiegaj przeludnieniu larw. 
	UWAGA: Jakość eksplantów mózgów larw jest bezpośrednio związana ze stanem zdrowia i jakością larw przed sekcją. Larwy niedożywione na skutek przeludnienia zazwyczaj dają mózgi o niższej jakości30.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że w każdym naczyniu typu meal cap znajduje się nie więcej niż 20-30 larw, aby uniknąć niedożywienia. Przykłady takich naczyń widoczne są na Ryc. 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przefiltruj i rozdziel na alikwoty medium Schneidera przed użyciem.
	<ol>
		<li>Do każdej sekcji przygotuj świeże medium do obrazowania i sekcji, uzupełniając alikwoty medium dla owadów Schneidera 1% bydlęcym serum wzrostowym (BGS). Objętość 5 mL medium do sekcji i obrazowania jest zazwyczaj wystarczająca dla jednego eksperymentu obrazowania.</li>
		<li>Przed użyciem ogrzej uzupełnione medium do temperatury pokojowej (RT).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uwzględnij planowaną długość nagrania filmu i na tej podstawie dobierz skład uzupełniający medium do obrazowania, metodę montażu oraz ustawienia akwizycji mikroskopu. 
	UWAGA: W optymalnych warunkach neuroblasty (NBs) w mózgach uzupełnionych samym BGS będą intensywnie dzielić się przez ponad 3 h.
	<ol>
		<li>W przypadku eksperymentów wymagających dłuższych filmów, uzupełnij medium do obrazowania, dodając do niego tkanki ciał tłuszczowych larw, aby wspomóc podziały powyżej 4 h. 
		​UWAGA: Ciała tłuszczowe wydzielają mitogeny wspierające proliferację NB31, a całe ciała tłuszczowe od 10 larw są wystarczające do utrzymania czterech lub pięciu mózgów. Ponadto wykazano, że próbki obrazowane na szkiełkach z membraną dzielą się przez ponad 10 h13,32, podczas gdy próbki obrazowane na szkiełkach wielodołkowych zazwyczaj dzielą się rzadziej (obserwacje niepublikowane).</li>
		<li>Alternatywnie, w przypadku dłuższych filmów, zastosuj bardziej złożone medium do obrazowania, zgodnie z wcześniejszym opisem33. Aby uzyskać najlepsze wyniki, zminimalizuj fotouszkodzenia poprzez dostosowanie czasu ekspozycji, mocy lasera i częstotliwości próbkowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Określanie stadiów rozwojowych i zbieranie larw (Rycina 2)
<ol>
	<li>Skrzyżuj 1-5 dniowe dziewicze samice much z 1-7 dniowymi dorosłymi samcami, aby uzyskać potomstwo o pożądanym genotypie. W celu uzyskania optymalnej wydajności skrzyżuj 10-15 dziewiczych samic z 5-10 samcami. Umieść muchy w klatce z nakrętką z pożywką (Rysunek 2A-C) i inkubuj w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Wymieniaj nakrętkę z pożywką codziennie. Zapobiega to nadmiernemu zagęszczeniu larw w nakrętce, co obniża jakość wypreparowanych mózgów.</li>
	<li>Jeśli nakrętka z pożywką jest w znacznym stopniu wypełniona larwami (tj. &gt;30), podziel nakrętkę na pół i zastąp jedną połową świeżą nakrętką, również przeciętą na pół. Alternatywnie można wymieniać nakrętki z pożywką częściej (tj. co 12 h zamiast co 24 h). Przykłady nadmiernie zaludnionych nakrętek z pożywką przedstawiono na Rysunku 2E, F.</li>
	<li>Inkubuj nakrętkę z pożywką i larwami w temperaturze 25 °C, aż larwy osiągną pożądany wiek.</li>
</ol>
3. Disekcja ciała tłuszczowego larwy (Rycina 3)
UWAGA: Niniejszy protokół opisuje sekcje z wykorzystaniem 3-dołkowej płytki do sekcji.
<ol>
	<li>Do każdego dołka 3-dołkowej szalki do sekcji pipetuj ~400 µL medium do sekcji i obrazowania.</li>
	<li>Wypłucz dziesięć dobrze odżywionych larw typu dzikiego w wieku 72-96 h, delikatnie trzymając je pęsetą sekcyjną i zanurzając wielokrotnie w roztworze do sekcji w najniższym dołku, aż do całkowitego usunięcia cząsteczek pokarmu. Po wypłukaniu przenieś oczyszczone larwy do środkowego dołka.</li>
	<li>Używając jednej pęsety, przytrzymaj larwę za haczyki gębowe. Drugą pęsetą przerwij ciągłość kutykuli larwy z jednej strony.</li>
	<li>Przerwanie kutykuli spowoduje wypłynięcie ciał tłuszczowych z wnętrza larwy. Ciała tłuszczowe mają kolor złamanej bieli, są półprzezroczyste i posiadają strukturę przypominającą kratownicę (Rysunek 3I). Ciała tłuszczowe mają również tendencję do zlepiania się oraz przywierania do pęsety sekcyjnej. Po zidentyfikowaniu zebrać jak największą ilość ciała tłuszczowego z każdej larwy i przenieść je pęsetą do najwyższego dołka zawierającego 400 µL medium do sekcji w temperaturze pokojowej (RT).</li>
</ol>
4. Disekcja mózgu larwy (Rysunek 3)
<ol>
	<li>Przemyj larwy doświadczalne w medium do sekcji i obrazowania, zgodnie z powyższą instrukcją, aby usunąć resztki pożywki. Dla uzyskania najlepszych wyników należy unikać przechowywania niesekcjonowanych larw w roztworze do sekcji. Spowoduje to „utonięcie” larw i negatywnie wpłynie na jakość wysektorenowanych mózgów.</li>
	<li>Używając jednej pęsety, przytrzymaj larwę za haczyki gębowe. Używając drugiej pęsety, delikatnie odetnij lub oderwij około 1/3 larwy od strony tylnej (Rysunek 3A). Spowoduje to „wypłynięcie” elementów przewodu pokarmowego, ciał tłuszczowych, tkanki łącznej i układu nerwowego przez rozerwaną stronę larwy (Rycina 3B).</li>
	<li>Za pomocą jednej pęsety należy chwycić larwę za haczyki gębowe. Drugą pęsetą należy delikatnie przesuwać kutykulę w stronę haczyków gębowych, jednocześnie „popychając” do wewnątrz pęsetą trzymającą haczyki, aż cała larwa zostanie wywinięta na drugą stronę. Ruch ten przypomina wywijanie skarpetki na lewą stronę (Rycina 3C, D).</li>
	<li>Odwróć larwę tak, aby ośrodkowy układ nerwowy i pozostałe tkanki były skierowane na zewnątrz, pozostając jednocześnie połączonymi z kutykulą. Na tym etapie zlokalizuj ośrodkowy układ nerwowy (OUN), aby uniknąć jego przypadkowego usunięcia. Za pomocą pęsety delikatnie usuń wszystkie tkanki inne niż OUN, pozostawiając jedynie OUN i mózg przytwierdzone do kutykuli (Rycina 3E).</li>
	<li>Mózg zostanie przymocowany do kutykuli poprzez połączenia aksonalne. Używając nożyczek do mikrodysekcji, przetnij te połączenia aksonalne, aby uwolnić mózg z kutykuli. W tym celu najpierw ostrożnie przetnij obszar pod płatami mózgu (Rysunek 3F). Powtórz czynność w przypadku połączeń pod brzusznym sznurem nerwowym. 
	UWAGA: Ten krok można wykonać za pomocą pęsety, jeśli niedostępne są nożyczki do mikrodyssekcji. Podczas używania pęsety należy zachować szczególną ostrożność, aby nie nadmiernie rozciągać tkanki mózgowej podczas usuwania jej z kutykuli, ponieważ stres mechaniczny negatywnie wpłynie na stan mózgu.</li>
	<li>Przenieś wypreparowany mózg do dołka zawierającego medium do preparowania i obrazowania. W przypadku eksperymentów obrazowych trwających powyżej 3 h należy stosować medium do preparowania i obrazowania uzupełnione o ciała tłuszczowe, zgodnie z powyższym opisem. Preparuj larwy partiami, aby czas preparacji nie przekroczył 20 min.</li>
</ol>
5. Montowanie i obrazowanie (Rysunek 4)
<ol>
	<li>W przypadku obrazowania z użyciem szkiełka z membraną34:
	<ol>
		<li>Zebrać zarówno wypreparowane mózgi, jak i wyizolowane ciała tłuszczowe do ostatniego dołka naczynia do preparowania.</li>
		<li>Złożyć połowę szkiełka, kładąc membranę przepuszczalną dla gazów na tylnej części szkiełka, a następnie docisnąć pierścień rozdzielający do środka, utrzymując go w miejscu (Rysunek 4A-C).</li>
		<li>Za pomocą mikropipety 200 µL przenieść do 10 wypreparowanych mózgów oraz jak największą ilość ciała tłuszczowego (patrz wyżej) w ~130-140 µL medium do preparowania i obrazowania na membranę. Należy upewnić się, że medium wraz z próbkami zostało naniesione na środek membrany przepuszczalnej dla gazów (Rysunek 4D, E).</li>
		<li>Zorientować mózgi w zależności od populacji NBs przeznaczonej do obrazowania oraz rodzaju używanego mikroskopu (Rysunek 4E). Umieścić próbkę jak najbliżej obiektywu mikroskopu. Na przykład, aby obrazować NBs w centralnych płatach mózgu, zorientować mózgi tak, aby płaty mózgu znajdowały się najbliżej obiektywu (Rysunek 4H).</li>
		<li>Po zorientowaniu mózgów delikatnie położyć szkiełko nakrywkowe na roztworze na membranie. Spowoduje to rozprzestrzenienie się roztworu zawierającego mózgi i ciała tłuszczowe na całej powierzchni membrany (Rysunek 4F).</li>
		<li>Odsączyć nadmiar roztworu, przykładając chusteczkę laboratoryjną blisko krawędzi nakrywki. Optymalną ilość roztworu uzyskuje się, gdy mózgi dotykają nakrywki, ale nie są zgniatane. Jeśli na tym etapie wymagana jest ponowna orientacja, należy ostrożnie przesuwać nakrywkę, aby przesunąć mózgi.</li>
		<li>Unieruchomić nakrywkę, nakładając roztopioną wazelinę wzdłuż jej krawędzi za pomocą pędzla. Pozostawić wazelinę do zastygnięcia (Rysunek 4G).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku obrazowania z użyciem wielodołkowego szkiełka do obrazowania (Rysunek 4):
	<ol>
		<li>Dodać 400 µL medium do obrazowania do dołka szkiełka wielodołkowego (w przeprowadzonym tutaj eksperymencie użyto komorowego szkiełka mikro[µ]-8-dołkowego; Rysunek 4I). Przenieść wcześniej wypreparowane ciała tłuszczowe do tego dołka (patrz krok 3.4).</li>
		<li>Umieścić do 10 mózgów w skupisku w pobliżu środka dołka (Rysunek 4J).</li>
		<li>Zorientować mózgi w zależności od populacji NBs przeznaczonej do obrazowania oraz rodzaju używanego mikroskopu, zgodnie z opisem w kroku 5.1.4 (Rysunek 4K). Rozmieścić próbki tak, aby znajdowały się blisko siebie. Zminimalizuje to dystans, o jaki musi przesunąć się stolik między próbkami, co ogranicza dryft próbki podczas akwizycji.</li>
		<li>Po zorientowaniu mózgów w dołku pozostawić je na 2-5 min, aby osiadły. Zwiększa to ich stabilność podczas transportu/obrazowania. W tym czasie przygotować mikroskop do akwizycji.</li>
		<li>Przykryć µ-szkiełko pokrywą i przenieść je pod mikroskop. Rozpocząć akwizycję przy najniższej możliwej mocy lasera i czasie ekspozycji, aby zminimalizować fotoblaknięcie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Najlepsze praktyki przetwarzania i zarządzania danymi
<ol>
	<li>Przetworzyć dane zgodnie z wymaganiami dostępnego oprogramowania analitycznego.
	<ol>
		<li>W prezentowanym przykładzie nabyte dane należy zapisać w oprogramowaniu SlideBook jako plik obrazu SlideBook (.sld).</li>
		<li>Aby przekonwertować pliki na własnościowy format Imaris (.ims) za pomocą programu Imaris File Converter, należy uruchomić Imaris File Converter w osobnym oknie. Następnie należy kliknąć i przeciągnąć pliki .sld do sekcji „input” w programie Imaris File Converter.</li>
		<li>Określić pożądaną lokalizację plików wyjściowych po konwersji, a następnie kliknąć „Start all.”.</li>
		<li>Po konwersji dane należy przejrzeć i opisać w oprogramowaniu Imaris. 
		UWAGA: Zamiast programu Imaris można zastosować alternatywne narzędzia do analizy obrazów, takie jak Fiji (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html), Aivia (https://www.aivia-software.com/), Volocity (https://www.volocity4d.com/) lub inne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu właściwej archiwizacji należy zachować jak największą ilość oryginalnych danych. Na przykład, jeśli oprogramowanie do akwizycji zapisuje dane w jednym formacie, a są one konwertowane na inny format do analizy, należy zachować wersję danych pozyskaną podczas akwizycji.</li>
	<li>Podczas analizy danych należy prowadzić szczegółową dokumentację dotyczącą próbki oraz ustawień akwizycji. Kluczowe informacje do zachowania to genotyp preparowanych larw, wiek larw przed preparowaniem, stan pożywki (meal cap), w której były hodowane, moc lasera użyta podczas obrazowania, czas ekspozycji, czas trwania akwizycji oraz rozdzielczość czasowa.</li>
</ol>
7. Przykładowe wyznaczenie długości cyklu komórkowego (Rycina 5)
UWAGA: w tym przykładzie obrazowano larwy wykazujące ekspresję markeru polarności Pins (Pins::EGFP16) oraz białka wiążącego mikrotubule Jupiter25 (cherry::Jupiter13). Następna analiza została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania Imaris.
<ol>
	<li>Otwórz film za pomocą wybranego oprogramowania do analizy obrazu. Przewiń cały film, aby zidentyfikować dzielące się neuroblasty (NB), i oznacz je dla przyszłych odniesień. Dzielące się NB identyfikuje się po charakterystycznych wrzecionach mitotycznych (Rysunek 5C-E).</li>
	<li>Wybierz referencyjną fazę cyklu komórkowego w celu wyznaczenia długości cyklu. W tym przykładzie jako referencję przyjęto metafazę.</li>
	<li>Ręcznie określ liczbę klatek pomiędzy kolejnymi metafazami, a następnie przelicz ją na minuty lub godziny, aby wyznaczyć czas trwania jednego cyklu komórkowego.
	<ol>
		<li>Zrób to, mnożąc rozdzielczość czasową filmu przez liczbę klatek między metafazami. Na przykład, jeśli rozdzielczość czasowa filmu wynosi jedna klatka co 5 min, a metafazy obserwuje się w klatce 13 i klatce 35, czas między tymi metafazami wyniesie 110 min ([35 − 13] × 5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nanieś dane na wykres za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Dane przedstawione tutaj zostały opracowane przy użyciu oprogramowania PRISM.</li>
</ol>
8. Przykład ilościowego określenia orientacji wrzecion komórkowych (Rysunek 5)
UWAGA: W tym przykładzie analiza jest przeprowadzana przy użyciu oprogramowania Imaris.
<ol>
	<li>Otwórz plik wideo w programie Imaris lub innym wybranym oprogramowaniu. Przejrzyj cały film, aby zidentyfikować dzielące się neuroblasty (NB) i oznacz je dla późniejszego odniesienia.</li>
	<li>Wyznacz wektor utworzony przez bieguny wrzeciona, wykorzystując apikalne i bazalne centrosomy (oznaczone jako m), w następujący sposób: 
	<img alt="Równanie matematyczne przedstawiające odejmowanie wektorów w trzech wymiarach, symbole: m(x₁,y₁,z₁)." src="/files/ftp_upload/65538/65538eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> 
	gdzie Ax, Ay i Az są współrzędnymi centrosomu apikalnego, a Bx, By i Bz są współrzędnymi centrosomu bazalnego. Podobnie oś wektora podziału (oznaczoną jako n) wyznacza się poprzez punkt środkowy apikalnego półksiężyca Pins::EGFP oraz korę bazalną: 
	<img alt="Równanie odejmowania wektorów n(x₂,y₂,z₂) = (Aₓ−Bₓ,Aᵧ−Bᵧ,A𝓏−B𝓏), formuła matematyczna." src="/files/ftp_upload/65538/65538eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"> 
	gdzie Ax, Ay i Az są współrzędnymi punktu środkowego półksiężyca Pins::EGFP, a Bx, By i Bz są współrzędnymi punktu środkowego kory bazalnej.</li>
	<li>Wyznacz długość wektorów m i n: 
	Długość m: <img alt="Wzór na długość \|m\|=\sqrt{x_1^2+y_1^2+z_1^2}\), koncepcja matematyki wektorowej, format równania." src="/files/ftp_upload/65538/65538eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3"> 
	Długość n: <img alt='Wzór na długość wektora, |n|=√(x²+y²+z²), formuła dla reprezentacji współrzędnych 3D.' src="/files/ftp_upload/65538/65538eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 4"></li>
	<li>Wyznacz iloczyn skalarny (oznaczony jako k) wektorów m i n: 
	<img alt="Wzór na iloczyn skalarny, równanie dla k jako m·n=(x₁*x₂)+(y₁*y₂)+(z₁*z₂), koncepcja matematyki wektorowej" src="/files/ftp_upload/65538/65538eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 5"></li>
	<li>Wykorzystując iloczyn skalarny k oraz długości wektorów m i n, wyznacz kąt między wektorami: 
	<img alt="Obliczanie kąta: θ = cos⁻¹(k/|m||n|); formuła trygonometryczna, zastosowanie edukacyjne." src="/files/ftp_upload/65538/65538eq06.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 6"></li>
	<li>Przedstaw dane w wybranym oprogramowaniu. Dane zaprezentowane tutaj zostały przygotowane w programie Microsoft Excel i zwizualizowane w programie PRISM.</li>
</ol>

Imaging Live Brain Explants from Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

<ol><li>Delgado, M. K., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+cell+size%2C+fate%2C+and+behavior+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division.</a> Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).</li>
<li>Sunchu, B., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+mechanisms+of+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Principles and mechanisms of asymmetric cell division.</a> Development. 147 (13), (2020).</li>
<li>Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts%3A+A+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li>
<li>Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+neuroblasts%3A+A+model+for+asymmetric+stem+cell+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).</li>
<li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Where+does+asymmetry+come+from%3F+Illustrating+principles+of+polarity+and+asymmetry+establishment+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts.</a> Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).</li>
<li>Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+temporal+patterning+to+neuronal+connectivity+in+Drosophila+type+I+neuroblast+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).</li>
<li>Oon, C. H., Prehoda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+recruitment+and+actin+dependent+cortical+flows+drive+the+neuroblast+polarity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle.</a> eLife. 8, e45815(2019).</li>
<li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li>
<li>Oon, C. H., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phases+of+cortical+actomyosin+dynamics+coupled+to+the+neuroblast+polarity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle.</a> eLife. 10, e66574(2021).</li>
<li>LaFoya, B., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-dependent+membrane+polarization+reveals+the+mechanical+nature+of+the+neuroblast+polarity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle.</a> Cell Reports. 35 (7), 109146(2021).</li>
<li>Siller, K. H., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lis1%2Fdynactin+regulates+metaphase+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Developmental Biology. 319 (1), 1-9 (2008).</li>
<li>Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NuMA-related+Mud+protein+binds+Pins+and+regulates+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical%2Fbasal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).</li>
<li>Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spindle-independent+cleavage+furrow+positioning+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway.</a> Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).</li>
<li>Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+cortical+extension+shifts+cleavage+furrow+position+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).</li>
<li>Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+regulates+biased+myosin+activity+and+dynamics+during+asymmetric+cell+division+via+Drosophila+rho+kinase+and+protein+kinase+N%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N.</a> Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).</li>
<li>Montembault, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+efflux+promotes+cell+elongation+to+coordinate+chromosome+segregation+with+cell+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage.</a> Nature Communications. 8 (1), 326(2017).</li>
<li>Roubinet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporally+separated+cortical+flows+and+spindle+geometry+establish+physical+asymmetry+in+fly+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 1383(2017).</li>
<li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrobin+controls+mother-daughter+centriole+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).</li>
<li>Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts+retain+the+daughter+centrosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome.</a> Nature Communications. 2 (1), 243(2011).</li>
<li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+Drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li>
<li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li>
<li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).</li>
<li>Lerit, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphase+centrosome+organization+by+the+PLP-Cnn+scaffold+is+required+for+centrosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function.</a> Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).</li>
<li>Gallaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+centriolar+localization+of+Polo+and+Centrobin+in+early+mitosis+primes+centrosome+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry.</a> PLoS Biology. 18 (8), e3000762(2020).</li>
<li>Ramdas Nair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microcephaly-associated+protein+Wdr62%2FCG7337+is+required+to+maintain+centrosome+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).</li>
<li>Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centriolar+protein+Bld10%2FCep135+is+required+to+establish+centrosome+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).</li>
<li>LaFoya, B., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consumption+of+a+polarized+membrane+reservoir+drives+asymmetric+membrane+expansion+during+the+unequal+divisions+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells.</a> Developmental Cell. 1534 (23), 00159(2023).</li>
<li>Sunchu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+chromatin+retention+and+nuclear+envelopes+separate+chromosomes+in+fused+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo.</a> Communications Biology. 5 (1), 953(2022).</li>
<li>Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+animal+development%3A+How+hormones+and+metabolism+regulate+developmental+transitions+and+brain+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation.</a> Developmental Biology. 475, 256-264 (2021).</li>
<li>Britton, J. S., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila%3A+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).</li>
<li>Lee, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Aurora-A+kinase+inhibits+neuroblast+self-renewal+by+regulating+aPKC%2FNumb+cortical+polarity+and+spindle+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation.</a> Genes & Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).</li>
<li>Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+Drosophila+neuroblast+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages.</a> PLoS ONE. 8 (11), e79588(2013).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li>
<li>Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jupiter%2C+a+new+Drosophila+protein+associated+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).</li>
<li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745(2018).</li>
<li>Bostock, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immobilization+technique+for+long-term+time-lapse+imaging+of+explanted+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych ujawnień finansowych do zadeklarowania.

Protokół ten przedstawia jedno z podejść do obrazowania żywych mózgów eksplantatów z larw Drosophila melanogaster . Opisany tutaj protokół pozwala na obserwację mózgów eksplantatów przez 12-20 godzin w odpowiednich warunkach eksperymentalnych. Szczególną uwagę należy zwrócić na przygotowanie próbek i projekt pożądanych doświadczeń. Jak wspomniano powyżej, jednym z najważniejszych czynników decydujących o jakości wypreparowanej tkanki jest zdrowie larw. Aby osiągnąć najwyższą możliwą jakość, należy upewnić się, ż...

Asymetryczny podział komórek (ACD) to proces, w którym składniki subkomórkowe, takie jak RNA, białka i organelle, są nierówno dzielone między komórki potomne1,2. Proces ten jest powszechnie obserwowany w komórkach macierzystych, które ulegają ACD, aby dać początek komórkom potomnym o różnych losach rozwojowych. Drosophila Nanocząsteczki dzielą się asymetrycznie, tworząc jeden NB, który zachowuje swoją łodygę, i jedną komórkę macierzystą zwoju (GMC). GMC przechodzi dalsze podziały w celu wytworzenia neuronów różnicujących lub gleju3. Asymetrycznie dzielące się NB występują obficie w rozwijających się mózgach larw trzeciego stadium rozwojowego, które można łatwo zaobserwować pod mikroskopem. W trzecim stadium larwalnym stadium rozwojowym w każdym centralnym płacie mózgu znajduje się około 100 NB3,4,5,6.
Asymetryczny podział komórek to bardzo dynamiczny proces. Protokoły obrazowania żywych komórek zostały wykorzystane do pomiaru i ilościowego określenia dynamiki polaryzacji komórek7,8,9,10, orientacja wrzeciona11,12,13, dynamika kory aktomiozynowej 14,15,16,17,18, Biologia mikrotubul i centrosomów19,20,21,22,23,24,25,26,27, oraz membrane10,28 oraz chromatyna dynamics29. Jakościowe i ilościowe opisy ACD opierają się na solidnych metodach i protokołach do obrazowania podziału NB w nienaruszonych żywych mózgach. Poniższy protokół przedstawia metody przygotowania, preparowania i obrazowania mózgów larw trzeciego stadium rozwojowego do obrazowania żywych komórek in vivo przy użyciu dwóch różnych podejść montażowych. Metody te najlepiej sprawdzają się w badaniach zainteresowanych czasoprzestrzenną dynamiką podziałów komórek macierzystych, a także podziałów w innych komórkach mózgu, ponieważ pozwalają na krótko- i długoterminowe obserwacje zdarzeń komórkowych. Ponadto techniki te są łatwo dostępne dla nowicjuszy w tej dziedzinie. Wykazujemy skuteczność i zdolność adaptacyjną tego podejścia w przypadku mózgów larw wykazujących ekspresję fluorescencyjnie znakowanych mikrotubul i korowych białek fuzyjnych. Dodatkowo omówiono metody analizy i rozważania dotyczące zastosowania w innych badaniach.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m Membrana polieterosulfonowa (PES)</td><td>Genesee</td><td>25-231</td><td>Filtry</td></tr> próżniowe <tr><td>Agar</td><td>Genesee</td><td>20-248</td><td>agar granulowany</td></tr><tr><td>Komputer analityczny</td><td>Dell</td><td>NA</td> Intel <td>Xeon Gold 5222 z dwoma procesorami 3,80 GHz z systemem Windows 10 w 64-bitowym systemie operacyjnym</td></tr> Szkiełka <tr><td></td><td></td><td></td> obrazowe z komorą bydlęcej surowicy wzrostu SH30541.02 <td></td></tr><tr><td></td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko metalowe</td><td>obrabiane na zamówienie NA</td><td>NA Specyfikacje</td><td>znajdują się w Cabernard i Doe 2013 (Ref. 34)</td></tr><tr><td>Naczynia preparacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>5024343</td><td>3-dołkowa porcelanowa płytka mikropunktowa</td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne</td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #5</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Nożyczki</td> do rozwarstwiania Leica <td>NA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Klatka do pobierania zarodków</td><td>Genesee</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>Flypad z dostępem do CO2 do znieczulenia dorosłych much</td><td>Genesee</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>Membrana przepuszczająca gaz</td><td>YSI</td><td>98095</td><td>Membrana przepuszczająca gaz</td></tr><tr><td>Szklana osłona Szkiełka</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72204-03</td><td># 1.5; szkiełka nakrywkowe 22 mm x 40 mm</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td>NA</td><td>Alternatywy: Fidżi, Volocity,</td></tr><tr><td>Aivia Imaris File Converter</td><td>Oxford Instruments</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże instant</td><td>Saf-Instant</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Melasa</td><td>Genesee</td><td>62-117</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628161</td><td>60 mm x 15 mm szalka Petriego</td></tr><tr><td>Wazelina</td><td></td><td>z</td> wazeliny NA <td></td></tr><tr><td>Pożywka owadobójcza Schneidera z płynną L-glutaminą i wodorowęglanem sodu</td> Oprogramowanie do akwizycji <td>Millipore Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>SlideBook</td><td>3i</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtracji sterowana próżnią z 0,22 i mikro; &mikro; m Filtr membranowy PES</td><td>Genesee Scientific, GenClone</td><td>25-231</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywymi komórkami mózgów larwalnych drosophila melanogaster

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Nerwowe komórki macierzyste Drosophila (neuroblasty, dalej NB) przechodzą asymetryczne podziały, regenerując samoodnawiający się neuroblast, jednocześnie tworząc różnicującą się komórkę macierzystą zwoju (GMC), która przejdzie jeden dodatkowy podział, aby dać początek dwóm neuronom lub glejowi. Badania nad nanocząsteczkami pozwoliły odkryć mechanizmy molekularne leżące u podstaw polaryzacji komórek, orientacji wrzeciona, samoodnawiania się nerwowych komórek macierzystych i różnicowania. Te asymetryczne podziały komórkowe są łatwo widoczne za pomocą obrazowania żywych komórek, co sprawia, że larwy NB idealnie nadają się do badania czasoprzestrzennej dynamiki asymetrycznego podziału komórek w żywej tkance. Po prawidłowym wypreparowaniu i zobrazowaniu w pożywce uzupełnionej składnikami odżywczymi, NB w mózgach eksplantatów solidnie dzielą się przez 12-20 godzin. Poprzednio opisane metody są technicznie trudne i mogą stanowić wyzwanie dla osób początkujących w tej dziedzinie. W tym miejscu opisano protokół przygotowania, preparacji, montażu i obrazowania żywych eksplantatów mózgu larw trzeciego stadium rozwoju przy użyciu suplementów tłuszczowych. Omówiono również potencjalne problemy i podano przykłady, w jaki sposób można zastosować tę technikę.

Disekcja i obrazowanie neuroblastów (NB) środkowego płata mózgu wykazujących ekspresję Pins::EGFP i Cherry::Jupiter 
W celu zaprezentowania tego protokołu, larwy wykazujące ekspresję Cherry::Jupiter pod kontrolą UAS13 oraz endogennie znakowane Pins::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pins::EGFP/TM6B, Tb) obrazowano przez 4 h zgodnie z opisanym protokołem, wykorzystując wielodołkowe szkiełka do obrazowania (Rysunek 5C</stron...

Tutaj omawiamy proces przygotowania, sekcji, montażu i obrazowania żywych mózgów eksplantatów z larw trzeciego stadium rozwojowego Drosophila melanogaster, aby obserwować dynamikę komórkową i subkomórkową w warunkach fizjologicznych.

Obrazowanie żywymi komórkami mózgów larwalnych Drosophila melanogaster

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Nasze badania koncentrują się na badaniu wpływu asymetrycznego podziału komórek (ACD) na proliferację i różnicowanie komórek macierzystych. Wykorzystujemy neuronalne komórki macierzyste Drosophila lub neuroblasty jako model do zrozumienia mechanizmów, regulacji i wpływu asymetrycznego podziału komórek na rozwój i neurogenezę. Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie sztucznej inteligencji poczyniły znaczne postępy w kwantyfikacji i analizie obrazów, co znacznie posunęło naprzód w dziedzinie obrazowania żywych komórek.Utrzymanie jakości próbki w przypadku filmu długoterminowego jest długotrwałym wyzwaniem. Chociaż obserwacja próbki przez osiem do 10 godzin jest wnikliwa, ograniczenia logistyczne, takie jak wymagania dotyczące obrazowania próbki i dostępne narzędzia do obrazowania, utrudniają to. Nasz protokół rozwiązuje ten problem, demonstrując długoterminowe obrazowanie bez wpływu na jakość próbki.Nasza technika może być łatwo zaadoptowana i zastosowana w terenie przez nowicjuszy. Przy odrobinie czasu i wprawy można realnie generować krótko- i długoterminowe filmy, które mają potencjał, aby dostarczyć wnikliwych i znaczących danych. Zacznij od skrzyżowania samic dziewic w wieku od jednego do pięciu dni z dorosłymi samcami w wieku od jednego do siedmiu dni, aby uzyskać potomstwo o pożądanym genotypie.Aby to zrobić, umieść muchy w klatce na muchy z nakrętką do posiłku. Użyj od 10 do 15 dziewic żeńskich i od pięciu do 10 samców, aby uzyskać optymalną wydajność. Inkubować klatkę na muchy zawierającą muchy w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Codziennie zmieniaj nasadkę posiłku, aby zapobiec przepełnieniu larw, co obniża jakość wypreparowanych mózgów. Jeśli nakrętka mączki ma więcej niż 30 larw, podziel ją na pół i zastąp jedną porcję świeżą nakrętką mączki przeciętą na pół. Wysiaduj kapelusze mączki z larwami w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aż larwy osiągną pożądany wiek.Rozpocznij od odpipetowania około 400 mikrolitrów pożywki do rozwarstwiania i obrazowania do każdej studzienki trzydołkowego naczynia do rozwarstwiania. Pod mikroskopem umyj 10 dobrze odżywionych larw typu dzikiego, delikatnie przytrzymując je kleszczami preparacyjnymi i zanurzając je w pożywce preparacyjnej w najgłębszym dołku, aby usunąć wszystkie cząstki pokarmu. Kontynuując pracę pod mikroskopem preparacyjnym, przenieś czyste larwy do środkowej studzienki.Przytrzymaj larwy za haczyki do ust za pomocą jednego zestawu pęsety. Za pomocą kolejnego zestawu pęsety rozerwij jedną stronę naskórka larwy, aby wylać tłuste ciała. Za pomocą kleszczy zbierz jak najwięcej tłuszczu z każdej larwy i przenieś ją do najwyższej studni zawierającej 400 mikrolitrów pożywki preparacyjnej w temperaturze pokojowej.Rozpocznij od odpipetowania około 400 mikrolitrów pożywki do rozwarstwiania i obrazowania do każdej studzienki trzydołkowego naczynia do rozwarstwiania. Pracując pod mikroskopem preparacyjnym, umyj eksperymentalne larwy podczas sekcji w pożywce do obrazowania, aby usunąć resztki jedzenia. Kontynuując pracę pod mikroskopem preparacyjnym, trzymaj larwy za haczyki ustne za pomocą jednego zestawu pęsety.Za pomocą innego zestawu pęsety ostrożnie odetnij około jednej trzeciej larw od tylnej strony. Następnie, trzymając larwy za haczyki do ust za pomocą jednego zestawu pęsety, użyj drugiego zestawu pęsety, aby delikatnie przeczesać naskórek w kierunku haczyków do ust. Jednocześnie wepchnij pęsetą do środka, przytrzymując haczyki do ust, aż całe larwy zostaną wywrócone na lewą stronę.Odwróć larwy, aby odsłonić ośrodkowy układ nerwowy i inne tkanki, zachowując ich połączenie z naskórkiem. Zlokalizuj ośrodkowy układ nerwowy lub OUN, aby uniknąć przypadkowego usunięcia. Delikatnie usuń tkanki inne niż OUN za pomocą pęsety, pozostawiając tylko OUN i mózg przyczepione do naskórka.Aby uwolnić mózg od naskórka poprzez przecięcie połączeń aksonalnych, za pomocą nożyczek do mikropreparacji delikatnie przetnij pod płatami mózgu. Następnie przetnij połączenia pod brzusznym rdzeniem nerwowym. Rozbioruj larwy partiami, aby czas rozbioru nie przekraczał 20 minut.Przenieś wypreparowany mózg do studzienki zawierającej pożywkę do sekcji i obrazowania. W przypadku obrazowania trwającego dłużej niż trzy godziny należy uzupełnić podłoże o ciała tłuszczowe. Aby wykonać obrazowanie żywych komórek mózgu larwy w trzecim stadium rozwojowym, należy rozpocząć od zebrania wypreparowanych mózgów i wyizolowanych ciał tłuszczowych w ostatniej studzience trzydołkowej naczynia preparacyjnego zawierającej pożywkę do sekcji i obrazowania.Umieść membranę przepuszczającą gaz z tyłu szkiełka i wciśnij dzielony pierścień do środka. Za pomocą mikropipety o pojemności 200 mikrolitrów przenieś do 10 wypreparowanych mózgów z maksymalną możliwą ilością ciał tłuszczowych i 130 do 140 mikrolitrów pożywki na środek membrany. Zorientuj mózgi zgodnie z populacją neuronalnych komórek macierzystych, które mają być zobrazowane, i typem mikroskopu, upewniając się, że próbki znajdują się blisko obiektywu mikroskopu.Na przykład, aby zobrazować nerwowe komórki macierzyste w centralnych płatach mózgu, upewnij się, że płaty mózgowe znajdują się najbliżej celu. Następnie delikatnie umieść szklaną pokrywę na roztworze na membranie, aby rozprowadzić roztwór z mózgami i ciałami tłuszczowymi po całej membranie. Przytrzymaj tkankę laboratoryjną na krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby osuszyć nadmiar roztworu, aż mózg dotknie szkiełka nakrywkowego, nie zostając zgniecionym.Następnie unieruchamić szkiełko nakrywkowe, nakładając stopioną wazelinę wzdłuż jej krawędzi za pomocą pędzla i pozwól galarecie zastygnąć. Dodać 400 mikrolitrów pożywki do obrazowania do studzienki w wielodołkowym mikroszkiełku. Przenieś wcześniej wypreparowane ciała tłuszczowe do tej studni.Następnie umieść do 10 mózgów w skupisku w pobliżu środka studni. Zorientuj mózgi zgodnie z populacją neuronalnych komórek macierzystych, które mają być zobrazowane, i typem mikroskopu. Pozwól mózgom osiąść w studni przez dwie do pięciu minut.Przykryj mikroszkiełko pokrywą szkiełka przed przeniesieniem go do mikroskopu. Rozpocznij proces akwizycji przy użyciu najniższej mocy lasera i czasu naświetlania, aby zminimalizować fotowybielanie. Obrazowanie mózgów larw wyrażających napędzaną przez UAS wiśnię Jowisza i endogennie znakowane szpilki GFP przy użyciu szkiełek do obrazowania wielodołkowego i bez suplementacji ciała tłuszczowego ujawniło, że szpilki tworzyły wyraźny sierp wierzchołkowy w dzielących się neuroblastach, do których wrzeciona mitotyczne konsekwentnie ustawiały się podczas mitozy.W tych próbkach długość cyklu komórkowego zwiększała się wraz ze wzrostem czasu obrazowania. Próbki, które zostały zobrazowane w pożywce z dodatkiem tłuszczu na szkiełku połączonym błoną, nie wykazały wzrostu długości cyklu komórkowego. Ponadto na 10-godzinnym szkiełku związanym z błoną zaobserwowano neuroblasty z czterema podziałami.

live-cell-imaging-drosophila-melanogaster-third-instar-larval

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy opisujemy protokół badania migracji komórek glejowych do rozwijającego się oka Drosophila za pomocą analizy mikroskopowej żywych tkanek z wykorzystaniem komórek glejowych znakowanych GFP.

Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Drosophila melanogaster larwy stanowią idealny model badawczy do analizy mechanizmów transportu aksonalnego w nerwach segmentowych larw. Stosując tę procedurę, 3Badania i rozwój larwy w stadium poczwarki niosące różne mutacje można porównać z larwami typu dzikiego.

Wizualizacja nerwów segmentowych larw w preparatach larw Drosophila w 3rd stadium zasiedlenia

Źródło: Hellerman, M. B., et al. Obrazowanie na żywo Drosophila Oko poczwarki. J. Vis. exp. (2015){{TAG_ 28}}Film demonstruje technikę obrazowania na żywo do badania wzorców oczu u poczwarki Drosophila melanogaster. Markery znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) umożliwiają wizualizację organizacji i różnicowania komórek podczas tworzenia rozwijającej się struktury oka.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Celem tego protokołu jest stworzenie ex vivo hodowli mózgu larw Drosophila zoptymalizowanej do monitorowania okołodobowych rytmów molekularnych za pomocą długoterminowego fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego. Omówiono również zastosowanie tej metody do testów farmakologicznych.

Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Przedstawiamy protokoły obrazowania wapnia dla larwalnego neuronu węchowego Drosophila , wykorzystując miejscowy klej tkankowy do unieruchomienia. Ta metoda zwiększa stabilność, ułatwiając wiarygodne eksperymenty in vivo i ex-vivo . Niestandardowe skrypty R analizują sygnały wapnia, zapewniając efektywną platformę do szczegółowych badań neurofizjologicznych.

Obrazowanie wapnia in vivo i ex vivo neuronu obwodu węchowego u larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium

Poznaj protokół obrazowania żywych mózgów larwalnych Drosophila melanogaster w celu badania asymetrycznego podziału komórkowego w komórkach macierzystych nerwowych. Ta metoda umożliwia długoterminową obserwację bez utraty jakości próbki.

Obrazowanie żywymi komórkami mózgów larwalnych Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów