Name: Fluorescencyjna hybrydyzacja RNA in situ dla długiej lokalizacji niekodującego RNA w ludzkich komórkach kostniakomięsaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Poznaj metodę RNA FISH do lokalizacji długich niekodujących RNA w ludzkich komórkach kostniakomięsaka. Protokół ten umożliwia wizualizację lncRNA SNHG6 w cytoplazmie i stanowi wiarygodne źródło dla badaczy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez granty z (1) Narodowego Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Chin (2020YFE0201600); (2) Narodowa Fundacja Nauk o Przyrodzie (81973877 i 82174408); (3) Szanghajskie Centrum Innowacji Współpracy w zakresie Transformacji Przemysłowej Przygotowania TCM Szpitala; (4) Projekty badawcze w ramach budżetu Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Szanghaju (2021LK047).

Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i instrumentów używanych w tym protokole. Rysunek 1 pokazuje ogólny protokół dla RNA FISH; Tabela 1 zawiera skład wszystkich roztworów, a tabela 2 zawiera sekwencje starterów stosowane w tym protokole.
1. Przygotowanie sondy
<ol>
	<li>Zidentyfikuj i uzyskaj sekwencję FASTA docelowego lncRNA będącego przedmiotem zainteresowania, na przykład z GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Postępując zgodnie ze wskazówkami na stronie internetowej, zaprojektuj sondy ISH online19 i zapoznaj się z sugestiami algorytmu projektowego, aby wyświetlić listę sond, które należy zamówić z etykietą Cy3.</li>
	<li>Inkubować bufor do hybrydyzacji w temperaturze 37 °C przez 2 godziny wcześniej.</li>
	<li>Rozpuścić sondę o 4 gęstościach optycznych (OD) w 160 μl ddH2O nasączony dietylowęglanem (DEPC) w stężeniu 1 mg/ml z dala od światła. 
	UWAGA: Gęstość optyczna (OD) reprezentuje jednostkę miary DNA i RNA. Zwykle 1 jednostka OD = 33 μg/ml DNA.</li>
	<li>Przygotuj 200 μl mieszaniny sondy dla każdej studzienki (1,2 μl-10 μl sondy, 70 μl buforu hybrydyzacyjnego, uzupełnij objętość ddH2O poddanych działaniu DEPC do 200 μl) i ustaw serię 50 μg/ml, 25 μg/ml, 12,5 μg/ml i 6 μg/mL. 
	UWAGA: Stężenie sondy musi być wcześniej zbadane eksperymentalnie. Wysokie stężenie w sondzie doprowadzi do niespecyficznego wiązania lncRNA, podczas gdy niskie stężenie w sondzie doprowadzi do niewrażliwego lub nieudanego wykrycia lncRNA.</li>
	<li>Denaturacja mieszanki sondy w temperaturze 73 °C przez 5 minut 
	UWAGA: Jeśli sonda DNA znakowana Cy3 jest dwuniciowa, denaturuj sondę do jednoniciowego DNA w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie szybko schładzaj przez 2 minuty na lodzie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Wysiewać 50 000 komórek 143B na basenie na sterylnych szklanych szkiełkach nakrywkowych na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowych i inkubować je przez 24 godziny (37 °C, 5% CO2) w DMEM. 
	UWAGA: Konkretna liczba komórek zasianych w tym miejscu różni się w zależności od wielkości komórki, co jest odpowiednie dla komórek zasianych, aby osiągnąć konfluencję 50% po inkubacji przez 24 godziny. Szkiełka nakrywkowe ze sterylnego szkła są okrągłe, aby pasowały do płytki 12-dołkowej.</li>
	<li>Usunąć pożywkę i płukać przez 2 x 5 minut 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). 
	UWAGA: Przygotuj 1x PBS z ddH2O. PBS bez leczenia DEPC nie może być używany, ponieważ zawiera RNazę. Wykonaj wszystkie poniższe kroki w warunkach wolnych od RNaz.</li>
	<li>Usuń 1x PBS i dodaj 200 μl 100% etanolu do każdej studzienki, aby utrwalić przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć etanol, dodać 200 μl 0,1% Triton X-100 (w 1x PBS) do każdej studzienki i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Czas musi być ściśle kontrolowany za pomocą przepuszczalności Triton X-100 i nie może być zbyt długi.</li>
	<li>Usunąć 0,1% Triton X-100 i umyć 2 x 5 min 1x PBS. 
	UWAGA: Jeśli protokół musi zostać wstrzymany w tym miejscu, należy zastąpić PBS 70% etanolem (rozcieńczenie 100% etanolu z ddH2O bez RNaz) i przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.</li>
	<li>Usunąć 1x PBS, dodać 200 μl 2x buforu cytrynianu soli sodowej (SSC) (rozcieńczenie 20x SSC z ddH2O, wolnym od RNaz) do każdego dołka i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usuń 2x bufor SSC, dodaj 200 μl 70% etanolu do każdej studzienki i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić 70% etanol, dodać 200 μl 85% etanolu (rozcieńczenie 100% etanolu z wolnym od RNaz ddH2O) do każdego dołka i inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyrzuć 85% etanol, dodaj 200 μl 100% etanolu do każdej studzienki i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wchłonąć i wyrzucić 100% etanol; pozostawić studzienki do wyschnięcia.</li>
</ol>
3. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)
<ol>
	<li>Dodać 200 μl mieszaniny sondy (denaturowanej jak w kroku 1.5) do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (16-18 godzin). 
	UWAGA: Istnieje silna dodatnia korelacja między temperaturą hybrydyzacji a stężeniem sondy; Dlatego, aby zoptymalizować tło, należy zmniejszyć zarówno temperaturę hybrydyzacji, jak i stężenie sondy.</li>
	<li>Następnego dnia należy pobrać próbki o temperaturze 37 °C i wyrzucić mieszaninę sondy. Dodać 200 μl 0,4x SSC/0,3% buforu Tween-20 do każdej studzienki (podgrzanej do 65 °C) i myć przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń 0,4x bufor SSC/0,3% Tween-20, dodaj 200 μl 2x buforu SSC/0,1% Tween-20 do każdej studzienki i myj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń 2x bufor SSC/0,1% Tween-20, dodaj 200 μl roztworu barwiącego 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) (1 μg/ml) i barwić przez 20 minut z dala od światła.</li>
	<li>Wyrzuć roztwór barwnika DAPI i myj 1x PBS przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 50 μl podłoża mocującego zawierającego gumę na szkiełko podstawowe i umieścić szklane szkiełko nakrywkowe na szkiełku w celu zamocowania. 
	UWAGA: Pamiętaj, aby umieścić szkiełko nakrywkowe na szkiełku stroną z komórką do dołu.</li>
	<li>Obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym. 
	UWAGA: Użyj mikroskopu fluorescencyjnego lub laserowego mikroskopu konfokalnego; Ten ostatni zapewnia wyższą czułość i klarowność obrazowania.</li>
</ol>

FISH for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

<ol><li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Li, C. H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+role+of+long+noncoding+RNA+in+cancer+development+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).</li>
<li>Pan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+FBXL19-AS1+regulates+osteosarcoma+cell+proliferation%2C+migration+and+invasion+by+sponging+miR-346%5BTitle%5D)+AND+%22OncoTargets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).</li>
<li>Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+C2dat1+promotes+cell+proliferation%2C+migration%2C+and+invasion+by+targeting+miR-34a-5p+in+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Research%22%5BJournal%5D)">lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells.</a> Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).</li>
<li>Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+MATN1-AS1+for+prediction+of+prognosis+in+osteosarcoma+patients+and+its+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function.</a> Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).</li>
<li>Luo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+long+noncoding+RNA+biology+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods to study long noncoding RNA biology in cancer.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).</li>
<li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+TUSC7+inhibits+osteosarcoma+progression+through+the+miR-181a%2FRASSF6+axis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis.</a> International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).</li>
<li>Tong, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+RUSC1-AS1+promotes+osteosarcoma+progression+through+regulating+the+miR-340-5p+and+PI3K%2FAKT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway.</a> Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ceRNA+in+cancer%3A+possible+functions+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications.</a> Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).</li>
<li>Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).</li>
<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).</li>
<li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+%28bDNA%29+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li>
<li>Hazra, R., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+RNA+transcripts+and+proteins+in+whole-mount+mouse+preimplantation+embryos+using+single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261(2022).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+SNHG6+regulates+EZH2+expression+by+sponging+miR-26a%2Fb+and+miR-214+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer.</a> Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3(2019).</li>
<li>Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+SNHG6+is+associated+with+poor+prognosis+of+gastric+cancer+and+promotes+cell+proliferation+and+EMT+through+epigenetically+silencing+p27+and+sponging+miR-101-3p%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%3A+International+Journal+of+Experimental+Cellular+Physiology%2C+Biochemistry%2C+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).</li>
<li>Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+SNHG6+induced+cell+autophagy+by+targeting+miR-26a-5p%2FULK1+signaling+pathway+in+human+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma.</a> Cancer Cell International. 19, 82(2019).</li>
<li>Birgani, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+SNHG6+as+a+potential+biomarker+for+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+Oncology+Research%3A+POR%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma.</a> Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).</li>
<li>Nielsen, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+lncRNA+by+LNA-based+in+situ+hybridization+in+paraffin-embedded+cancer+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids.</a> Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+SNHG6+regulates+p21+expression+via+activation+of+the+JNK+pathway+and+regulation+of+EZH2+in+gastric+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells.</a> Life Sciences. 208, 295-304 (2018).</li>
<li>Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+techniques+for+paraffin-embedded+adult+coral+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853(2018).</li>
<li>Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+RNA+FISH+%28smFISH%29+in+whole-mount+mouse+embryonic+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79(2019).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ten protokół RNA FISH może nie tylko wykrywać lokalizację lncRNA w komórkach, ale także wykrywać kolokalizację innych RNA, DNA lub białek w komórkach, co można również wykorzystać do wykrywania lokalizacji lncRNA w tkankach osadzonych w parafinie. Jednak konkretny protokół w takich przypadkach jest inny, ponieważ tkanki zatopione w parafinie muszą zostać odparafinowane21. Ta eksperymentalna procedura może być stosowana na płytkach 48- lub 96-dołkowych, ale płytki 384-dołkowe są zbyt małe, aby możn...

Nasze zrozumienie ludzkiego genomu znacznie się poszerzyło dzięki niedawnym postępom w technologii całego genomu. Około 93% ludzkiego genomu można transkrybować na RNA, ale tylko 2% RNA może zostać przetłumaczone na białka; pozostałe 98% RNA, które nie mają funkcji translacji białek, nazywa się niekodującymi RNA (ncRNA)1. Jako klasa niekodujących RNA (ncRNA), długie ncRNA (lncRNA), zawierające ponad 200 nukleotydów2, przyciągają coraz większą uwagę ze względu na ich udział w wielu fizjologicznych i patologicznych procesach komórek, takich jak różnicowanie, kontrola cyklu, apoptoza, migracja i inwazja3,4,5. LncRNA odgrywają swoją rolę poprzez różne mechanizmy, takie jak regulacja struktury chromatyny i ekspresji genów jądrowych, kontrolowanie procesu splicingu mRNA i modyfikacja potranskrypcyjna6. LncRNA regulują występowanie, rozwój i przerzuty nowotworów złośliwych zarówno na poziomie transkrypcyjnym, jak i potranskrypcyjnym. Regulacja transkrypcji jest realizowana w jądrze poprzez wpływ na transkrypcję RNA poprzez wiązanie się ze strukturami chromosomalnymi, podczas gdy regulacja potranskrypcyjna jest realizowana w cytoplazmie poprzez kontrolowanie docelowych genów za pomocą endogennego konkurencyjnego mechanizmu RNA (ceRNA) 5, 7, 8. CeRNA ujawniło nowy mechanizm interakcji RNA, a mianowicie, że lncRNA mogą działać jak gąbka do adsorpcji miRNA i hamowania degradacji powiązanych genów docelowych za pośrednictwem miRNA9. Dlatego informacje dotyczące subkomórkowej lokalizacji lncRNA, niezależnie od tego, czy określony lncRNA znajduje się w cytoplazmie, czy w jądrze, są ważne, aby pomóc w identyfikacji ich funkcji biologicznych.
Obecnie lokalizacja lncRNA jest głównie wykrywana za pomocą dwóch metod, jedna to test izolacji frakcji jądra/cytoplazmy, a druga to test RNA FISH. W pierwszym przypadku RNA we frakcji cytoplazmatycznej i jądrowej są ekstrahowane odpowiednio, a następnie amplifikacja PCR jest wykonywana za pomocą specyficznych starterów lncRNA w celu wykrycia stosunku lncRNA w cytoplazmie i jądrze. Zaletą tej metody jest efektywność czasowa, natomiast wadą jest to, że rzeczywista lokalizacja lncRNA nie jest bezpośrednio odzwierciedlona przez względną proporcję lncRNA w cytoplazmie i jądrze. RNA FISH może wykrywać lokalizację lncRNA w komórkach poprzez projektowanie specyficznych dla lncRNA sekwencji łańcuchów antysensownych, a następnie znakowanie barwnikami fluorescencyjnymi10. Metody RNA FISH zostały ulepszone dzięki postępom w technikach sondowania i metodach wykrywania, w tym znakowanych fluoroforem zestawów wielu sond oligologicznych11, LNA probes12 i sondy rozgałęzionego DNA (bDNA)13. RNA FISH może nie tylko wykrywać lokalizację lncRNA, ale także wykrywać kolokalizację innych RNA, DNA lub białek za pomocą dwukolorowej lub wielokolorowej immunofluorescencji14.
W tej pracy dołączyliśmy jako przykład szczegółowy protokół wykrywania lokalizacji wewnątrzkomórkowej genu gospodarza lncRNA małego jąderkowego RNA 6 (SNHG6) w komórkach kostniakomięsaka (143B) przez RNA FISH. SNHG6 to lncRNA nukleotydu 600-730 w swojej dojrzałej postaci splicingowej i zidentyfikowany jako nowy onkogen w różnych nowotworach u ludzi, w tym raku jelita grubego, raku żołądka, raku jasnokomórkowym jajnika, kostniakomięsaku i raku wątrobowokomórkowego15,16,17,18. Badania potwierdziły udział SNHG6 w zachowaniach biologicznych komórek nowotworowych, takich jak proliferacja, EMT i autofagia, oraz wykazały cytoplazmatyczną lokalizację SNHG6 w miejscu, w którym może wpływać na geny docelowe poprzez wiązanie (gąbczaste) miRNAs15,16,17. Ten szczegółowy protokół wykrywania wewnątrzkomórkowej lokalizacji SNHG6 przez RNA FISH jest przedstawiony w niniejszym dokumencie.

<table><tbody><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td><td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td><td>IC1000</td><td>Liczenie komórek</td></tr><tr><td>Płytka do hodowli komórkowych-12</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>3513,corning</td><td>Umieść szkiełka nakrywkowe w talerzu</td></tr><tr><td>&nbsp; Linia komórkowa (143B)</td><td>Bank komórek Chińskiej Akademii Nauk</td><td>CRL-8303</td><td>linia komórkowa raka kostniakomięsaka</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa (15 mL, 50 ml)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>&nbsp; 430790, Corning</td><td>Wirówka komórek</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>abs7026</td><td>Komórki są wysiewane na szkiełkach nakrywkowych</td></tr><tr><td>Cy3 etykieta Sonda DNA SNHG6</td><td>Shanghai GenePharma Co., Ltd</td><td>A10005</td><td>Wykryj lokalizację SNHG6</td></tr><tr><td>Pożywka DMEM</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>LM-E1141</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Inkubator</td> <td>do suchej kąpieliHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.</td><td>DKT200-2&nbsp;</td><td>Inkubacja w różnych wysokich temperaturach</td></tr><tr><td>Etanol 100%&nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10009218</td><td>odwodnienie</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD</td><td>Olympus BX43 wyposażony w kamerę Olympus U-TV0.5XC-3 (SN: 5J01719),</td> inkubator do <td>obserwacji i pozycjonowania</td></tr><tr><td></td><td>Olympus Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD</td><td>DHP-9051</td><td>Próbki inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Medium montażowe</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>E675004</td><td>Przymocuj szkiełka nakrywkowe do szkiełka</td></tr><tr><td>wytrząsarkowego</td><td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.</td><td>TS-8S Próbka</td><td>do mycia</td></tr><tr><td>Szkiełko</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>188105</td><td>Szkiełka nakrywkowe umieszcza się na szkiełku</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A600198</td><td>Membrana przepuszczalna i membrana jądrowa</td></tr><tr><td>&nbsp; Trypsyna (0,25%)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>25200056, Gibco</td><td>leczenie komórek trypsyną</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A600560</td><td>detergent</td></tr></tbody></table>

fluorescencyjna hybrydyzacja rna in situ dla długiej lokalizacji niekodującego rna w ludzkich komórkach kostniakomięsaka

RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

Zbadano ważne role długich niekodujących RNA (lncRNA) w raku, takie jak regulacja proliferacji, przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT), migracja, infiltracja i autofagia komórek nowotworowych. Wykrywanie lokalizacji lncRNA w komórkach może zapewnić wgląd w ich funkcje. Projektując specyficzną dla lncRNA sekwencję łańcucha antysensownego, a następnie znakowanie barwnikami fluorescencyjnymi, można zastosować fluorescencję RNA hybrydyzację in situ (FISH) do wykrywania lokalizacji komórkowej lncRNA. Wraz z rozwojem mikroskopii, techniki RNA FISH pozwalają obecnie nawet na wizualizację słabo eksprymowanych lncRNA. Ta metoda może nie tylko wykryć lokalizację samych lncRNA, ale także wykryć kolokalizację innych RNA, DNA lub białek za pomocą dwukolorowej lub wielokolorowej immunofluorescencji. W tym miejscu zamieściliśmy szczegółową eksperymentalną procedurę operacyjną i środki ostrożności RNA FISH przy użyciu lncRNA small nucleolar RNA host gen 6 (SNHG6) w ludzkich komórkach kostniakomięsaka (143B) jako przykład, aby zapewnić odniesienie dla badaczy, którzy chcą przeprowadzić eksperymenty RNA FISH, zwłaszcza lncRNA FISH.

Przedstawiono reprezentatywne obrazy FISH SNHG6 w ludzkich komórkach kostniakomięsaka (Rycina 2). Kontrola negatywna została poddana działaniu sondy negative Ctrl; kontrola pozytywna została poddana działaniu sondy U6 20. Sonda SNHG6 i sonda U6 są znakowane Cy3, który emituje czerwoną fluorescencję. DAPI to barwnik barwiący DNA, który emituje niebieską fluorescencję. Wynik ten pokazuje, że SNHG6 lokalizuje się głównie w cytoplazmie, a ta informacja może wskazać istotn...

Obecny protokół opisuje metodę hybrydyzacji in situ fluorescencji RNA w celu lokalizacji lncRNA w ludzkich komórkach kostniakomięsaka.

Fluorescencyjna hybrydyzacja RNA in situ dla długiej lokalizacji niekodującego RNA w ludzkich komórkach kostniakomięsaka

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition ...

Zakres naszych badań polega na dostarczeniu szczegółowego protokołu RNA FISH, który stanowi odniesienie dla naukowców, którzy chcą przeprowadzić eksperymenty RNA FISH. Nasze badania wykazały, że RNA FISH może być używany do lokalizacji IncRNA w ludzkich komórkach kostniakomięsaka. Nasz protokół zapewnił kompleksową procedurę eksperymentalną i środki ostrożności RNA FISH przy użyciu IncRNA SNHG6 w ludzkich komórkach kostniakomięsaka jako odniesienie.Na początek, po uzyskaniu długiego, niekodującego RNA, który Cię interesuje, inkubuj bufor hybrydyzacyjny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie rozpuść cztery sondy gęstości optycznej w 160 mikrolitrach dejonizowanej wody poddanej pirowęglanowi dietylu z dala od światła. Przygotuj 200 mikrolitrów mieszaniny sondy dla każdej studzienki i ustaw serię 50, 25, 12,5 i sześciu mikrogramów na mililitr.Denaturuj mieszankę sondy w temperaturze 73 stopni Celsjusza przez pięć minut. Pobrać 12-dołkową płytkę do hodowli komórkowej zawierającą komórki 143B na sterylnych szkiełkach nakrywkowych. Usuń podłoże i umyj dwukrotnie przez pięć minut PBS.Umieść komórki na shakerze. Następnie wyjmij PBS i dodaj 200 mikrolitrów 100% etanolu do każdej studzienki, utrwalając przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usuń etanol, dodaj 200 mikrolitrów 0,1% Triton X-100 do każdej studzienki i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Usuń 0,1%Triton X-100 i umyj dwa razy przez pięć minut za pomocą PBS. Następnie usuń PBS. Dodaj 200 mikrolitrów 2X cytrynianu soli sodowej lub buforu SSC do każdej studzienki i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Usuń bufor 2X SSC. Dodaj 200 mikrolitrów 70% etanolu do każdej studzienki i inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Wyrzuć 70% etanol, a następnie dodaj 200 mikrolitrów 85% etanolu do każdej studzienki i inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.Następnie wyrzuć 85% etanolu. Dodaj 200 mikrolitrów 100% etanolu do każdej studzienki i inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Następnie zaabsorbuj i wyrzuć 100% etanol i pozostaw studzienki do wyschnięcia.Następnie dodaj 200 mikrolitrów zdenaturowanej mieszaniny sondy do każdej studzienki. Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia usuń próbki z 37 stopni Celsjusza, wyrzuć mieszaninę sondy i dodaj 200 mikrolitrów podgrzanego buforu 0,4X SSC 0,3% Tween-20 do każdej studzienki i myj przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.Usuń bufor 0,4X SSC 0,3%Tween-20. Dodaj 200 mikrolitrów buforu 2X SSC 0,1%Tween-20 do każdej studzienki i myj przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Następnie wyrzuć bufor 2X SSC 0,1%Tween-20, dodaj 200 mikrolitrów roztworu barwiącego DAPI i barwij przez 20 minut w ciemności na shakerze.Po zabarwieniu wyrzuć roztwór DAPI i myj go PBS przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Na koniec dodaj 50 mikrolitrów podłoża montażowego zawierającego gumę do szkiełka i umieść szklane szkiełko nakrywkowe, aby zamocować szkiełko. Pokazano reprezentatywne obrazy SNHG6 FISH w ludzkich komórkach kostniakomięsaka.Sonda SNHG6 znakowana Cy3, która emituje czerwoną fluorescencję, wykazała, że SNHG6 jest głównie zlokalizowany w cytoplazmie. Kolor tła zaobserwowano przy użyciu sondy o wysokim stężeniu.

rna-fluorescence-situ-hybridization-for-long-non-coding-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Wizualizacja transportu RNA in vivo jest realizowana poprzez mikroiniekcję fluorescencyjnie znakowanych transkryptów RNA do oocytów Xenopus, a następnie za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wizualizacja lokalizacji RNA w oocytach Xenopus

Niniejszy protokół jest z powodzeniem stosowany do ilościowego wykrywania poziomów i wzorców przestrzennych ekspresji mRNA w wielu typach tkanek u różnych gatunków kręgowców. Metoda ta umożliwia wykrywanie transkryptów o niskiej zawartości oraz jednoczesne przetwarzanie setek preparatów. Przedstawiamy ten protokół na przykładzie profilowania ekspresji podczas formowania się embrionalnego mózgu ptaków.

Radioaktywna hybrydyzacja in situ w celu wykrywania różnorodnych wzorców ekspresji genów w tkance

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Hybrydyzacja in situ (ISH) RNA umożliwia wizualizację RNA w komórkach i tkankach. Tutaj pokazujemy, jak połączenie RNAscope ISH z immunohistochemią lub barwnikami histologicznymi może być z powodzeniem wykorzystane do wykrywania mRNA zlokalizowanych na aksonach w odcinkach mózgu myszy i człowieka.

Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w skrawkach mózgu za pomocą hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości

Tutaj opisujemy test hybrydyzacji in situ, który umożliwia czułe i specyficzne wykrywanie sekwencji tak krótkich jak 50 nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu na poziomie pojedynczej komórki. Test, który może być wykonywany ręcznie lub automatycznie, może umożliwić wizualizację wariantów splicingu, krótkich sekwencji i mutacji w kontekście tkanki.

Wizualizacja wariantów genetycznych, krótkich celów i mutacji punktowych w kontekście morfologicznym tkanki za pomocą testu hybrydyzacji RNA in situ

Aby w sposób powtarzalny zliczyć liczbę mRNA w poszczególnych oocytach, zoptymalizowano jednocząsteczkową fluorescencję RNA in situ (RNA-FISH) dla komórek nieprzylegających. Oocyty zebrano, zhybrydyzowano z sondami specyficznymi dla transkryptu i oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania do kwantyfikacji obrazu.

Zastosowanie jednocząsteczkowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (SM-FISH) do ilościowego oznaczania i lokalizacji mRNA w mysich oocytach

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Protokół ten oferuje szczegółowe podejście do oceny poziomów modyfikacji m6Aspecyficznego RNA za pomocą MeRIP-qPCR.

Test MeRIP-qPCR do wykrywaniapoziomówmodyfikacji specyficznego RNA w komórkach osteosarcoma

Ten eksperymentalny protokół zapewnia stabilną, opłacalną i efektywną metodę, łączącą knockdown lncRNA z testami tworzącymi kolonie, aby ilościowo określić wpływ lncRNA na proliferację komórek kostniaraka.

Test formowania kolonii wykrywający zdolność proliferacji komórek osteosaraka LncRNA-knockdown

Obecność nowotworowych komórek macierzystych (CSC) w mięsakach kostnych została ostatnio powiązana z ich patogenezą. W artykule przedstawiono izolację CSCs z pierwotnych kultur komórkowych uzyskanych z ludzkich biopsji konwencjonalnego kostniakomięsaka (OS) z wykorzystaniem zdolności CSC do wzrostu w warunkach niezakaźnych.

Ustanowienie hodowli nowotworowych komórek macierzystych z ludzkiego konwencjonalnego kostniakomięsaka

Poznaj metodę RNA FISH do lokalizacji długich niekodujących RNA w ludzkich komórkach kostniakomięsaka. Protokół ten umożliwia wizualizację lncRNA SNHG6 w cytoplazmie i stanowi wiarygodne źródło dla badaczy.

Fluorescencyjna hybrydyzacja RNA in situ dla długiej lokalizacji niekodującego RNA w ludzkich komórkach kostniakomięsaka

Przeglądaj więcej filmów