Name: RGBradford: Kwantyfikacja białka za pomocą aparatu w smartfonie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Poznaj metodę ilościowego oznaczania białka za pomocą testu Bradford z wykorzystaniem smartfona jako urządzenia analitycznego. Protokół umożliwia pomiar stężenia białka w warunkach ograniczonych zasobów laboratoryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Narodową Radę Rozwoju Naukowego i Technologicznego (CNPq, Brazylia) [numery grantów 428048/2018-8 i 402556/2022-4] oraz Uniwersytet w Brasilii (Brazylia). Autor dziękuje dr Duarte Nuno Carvalho i dr Evelyn Santos (i3s, Porto, Portugalia) za udostępnienie ich smartfonów używanych w tym badaniu.

1. Przygotowanie odczynnika do oznaczenia białek metodą Bradforda
<ol>
	<li>Rozpuścić 100 mg Coomassie Brilliant Blue G w 50 mL 95% (w/v) etanolu. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia Coomassie Brilliant Blue G. 
	OSTROŻNIE: Etanol jest łatwopalny i powoduje podrażnienie oczu. Unikać kontaktu z otwartym ogniem i używać okularów ochronnych.</li>
	<li>Do poprzedniego roztworu ostrożnie dodać 100 mL 85% (w/v) kwasu fosforowego. 
	OSTROŻNIE: Kwas fosforowy jest żrący dla metali i powoduje oparzenia skóry, poważne uszkodzenia oczu oraz ostrą toksyczność przy połknięciu. Należy stosować rękawice i okulary ochronne.</li>
	<li>Powoli dodać roztwór zawierający Coomassie Brilliant Blue G, etanol i kwas fosforowy do 600 mL wody dejonizowanej.</li>
	<li>Dopełnić roztwór do objętości końcowej 1 000 mL. Zmienić skalę przygotowania w zależności od liczby próbek do analizy. Zgodnie z opisem w oryginalnej metodzie7, stężenia końcowe w roboczym odczynniku Bradforda powinny wynosić: 0,01% (w/v) Coomassie Brilliant Blue G, 4,7% (w/v) etanolu i 8,5% (w/v) kwasu fosforowego.</li>
	<li>Usunąć nierozpuszczone cząstki poprzez filtrowanie przy użyciu papieru filtracyjnego (papier Whatman nr 1 lub odpowiednik).</li>
	<li>Odczynnik jest stabilny przez kilka tygodni przy przechowywaniu w temperaturze pokojowej (RT) i ochronie przed światłem. Filtrować w razie potrzeby, ponieważ z czasem mogą tworzyć się osady. 
	UWAGA: Alternatywnie dostępne są komercyjne odczynniki Bradforda gotowe do rozcieńczenia i użycia. Należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania odczynnika i przejść do następnego kroku.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów standardowych białek
<ol>
	<li>Przygotować roztwór zapasowy (patrz krok 2.4) wyizolowanego białka, które będzie służyć jako standard. Przystępnym i powszechnie stosowanym białkiem jest albumina surowicy bydlęcej (BSA). Innymi opcjami są owalbumina oraz gamma globulina bydlęca.</li>
	<li>Jeśli znany jest współczynnik absorpcji molowej białka użytego jako standard, należy sprawdzić stężenie roztworu zapasowego za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>W przypadku BSA powszechnie stosowany wzór to BSA (mg/mL) = (A280/6.6) × 10, gdzie A280 to absorbancja przy 280 nm dla drogi optycznej 1 cm, zmierzona względem odpowiedniej próbki ślepej (tj. ε2801% = 6.6)7. Na przykład BSA o stężeniu 0,8 mg/mL wykazuje absorbancję 0,528 przy 280 nm.</li>
	<li>Aby wyznaczyć krzywą wzorcową, należy przygotować kilka rozcieńczeń BSA w zakresie od 0,025 mg/mL do 1,0 mg/mL. Po dodaniu objętości próbki wynoszącej 10 µL na dołek, pozwoli to uzyskać od 0,25 do 10 µg BSA na dołek. 
	UWAGA: Roztwory standardowe białek powinny być przygotowane w medium o takim samym składzie (stężeniu końcowym) co medium użyte do przygotowania próbek.</li>
</ol>
3. Analiza
<ol>
	<li>Rozcieńczyć próbki tak, aby uzyskać stężenie białka w zakresie krzywej wzorcowej od 0,025-1,0 mg/mL. Należy przygotować kilka (co najmniej 3) rozcieńczeń próbek w tym zakresie. 
	UWAGA: Próbki można rozcieńczać solą fizjologiczną buforowaną fosforanowo (PBS) lub jakimkolwiek innym składnikiem medium/buforu kompatybilnym z odczynnikiem Bradforda. Końcowe stężenie składników medium nie powinno się różnić pomiędzy wzorcami a próbkami.</li>
	<li>Do trzech studzienek (tj. w trzech powtórzeniach) płytki mikrotytryjnej 96-dołkowej dodać 10 µL każdego roztworu wzorca białka. Dla punktu zero (bez białka) dodać 10 µL buforu/medium użytego do przygotowania roztworów wzorcowych i rozcieńczeń próbek.</li>
	<li>Do innego zestawu studzienek tej samej płytki mikrotytryjnej 96-dołkowej dodać 10 µL każdego rozcieńczenia próbki do trzech studzienek (tj. w trzech powtórzeniach). Jednym ze sposobów jest dodanie różnych objętości próbki i uzupełnienie ich medium do objętości 10 µL na studzienkę (np. 0,5 µL, 1 µL, 2 µL, 4 µL i 8 µL próbki oraz odpowiednio 9,5 µL, 9 µL, 8 µL, 6 µL i 2 µL medium).</li>
	<li>Do wszystkich studzienek dodać 250 µL odczynnika do oznaczania białka metodą Bradforda. Typowy układ płytki mikrotytryjnej przedstawiono na Rysunku 2. W tym przykładzie dołączono zestaw pustych studzienek zawierających 260 µL (objętość końcowa na studzienkę) wody, aby służyły jako ślepa próba w czytniku płytek (krok 4.5). Jest to wymagane tylko w przypadku, gdy będą zbierane dane o absorbancji. 
	UWAGA: Przy każdym wykonywaniu testu należy przygotować krzywą wzorcową na tej samej płytce, co próbki. Innymi słowy, jeśli liczba próbek wymaga użycia kolejnej płytki, należy przygotować kolejną krzywą wzorcową na drugiej płytce i tak dalej.</li>
	<li>Odczytać wyniki (sekcja 4) w czasie od 5-15 min.</li>
</ol>
<img alt="Schemat układu mikropłytki do badania próbek; rzędy A-H, kolumny 1-12; obejmuje próbki ślepe i standardy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65547/65547fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Typowy układ płytki dla oznaczania białek metodą Bradforda. Próbka ślepa (Blank) odnosi się do trzech studzienek zawierających 260 µL wody, służących jako tło w czytniku mikropłytek. STD odnosi się do standardów białek. S1-S6 to sześć różnych próbek. SX_1-SX_4 to cztery różne rozcieńczenia dla każdej próbki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65547/65547fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
4. Rejestrowanie wyników
<ol>
	<li>W dobrze oświetlonym pomieszczeniu, jedną ręką trzymaj mikropłytkę równolegle do blatu na jednolitym białym tle (np. arkuszu papieru). Aby zapewnić dokładne wyrównanie, umieść poziomicę na płytce.</li>
	<li>Drugą ręką trzymaj smartfon równolegle (niektóre aplikacje aparatów użytecznie wskazują nachylenie urządzenia) do blatu i mikropłytki, a następnie wykonaj jedno lub kilka zdjęć całej mikropłytki (Rysunek 3). W urządzeniach z systemem iOS włącz w ustawieniach aparatu wskaźnik poziomu, aktywując opcję Siatka. W urządzeniach z systemem Android włącz w ustawieniach aparatu wskaźnik poziomu, aktywując opcję Wskazówki kadrowania.</li>
	<li>Nie jest wymagana specjalna aparatura oświetleniowa, jednak należy zadbać o uniknięcie cieni i odbić. Na przykład unikaj zasłaniania płytki lub tła smartfonem oraz zasłaniania tła mikropłytką. Małe odblaski na krawędziach obszaru studzienek nie stanowią problemu; dane o kolorze mogą być pobierane z bardzo małego obszaru w centrum każdej studzienki.</li>
	<li>Krótko sprawdź zdjęcie pod kątem jednolitości tła, cieni i odbić. Zwróć również uwagę na kąt widzenia studzienek; centrum każdej studzienki powinno być bezpośrednio widoczne (tzn. nie powinno znajdować się za ściankami studzienki).</li>
	<li>Jeśli planowane jest porównanie odczytów absorbancji mikropłytki z danymi kolorystycznymi ze zdjęć, odczytaj wartości dla mikropłytki przy 590 nm i 450 nm w czytniku mikropłytek21.</li>
</ol>
<img alt="Eksperyment laboratoryjny z mikropłytką do testu ELISA; badacz rejestruje dane za pomocą smartfona." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65547/65547fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Rejestrowanie wyników analizy białek metodą Bradforda. W dobrze oświetlonym pomieszczeniu mikropłytka zostaje ustawiona równolegle do blatu na jednolitym tle przy pomocy jednej ręki. Drugą ręką trzymamy smartfon równolegle do blatu i mikropłytki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65547/65547fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
5. Automatyczna ekstrakcja danych kolorymetrycznych
<ol>
	<li>Pobierz program ImageJ oraz wtyczkę ReadPlate22, dostępną pod adresem https://imagej.nih.gov/ij/plugins/readplate/index.html (jest to plik .txt).</li>
	<li>Otwórz program ImageJ, kliknij Plugins &gt; Install i wybierz plik pobrany w kroku 6.1.</li>
	<li>Ustaw parametry pomiarowe, klikając Analyze &gt; Set Measurements i zaznaczając następujące opcje: Area; Standard deviation; Min &amp; max gray value; Mean gray value; Modal gray value. Na dole okna ustaw Redirect to: None oraz Decimal places (0-9): 3.</li>
	<li>Przejdź do File &gt; Open i wybierz zdjęcie mikropłytki wykonane w kroku 4.</li>
	<li>Przejdź do Plugins &gt; ReadPlate. Zapoznaj się z instrukcjami, a następnie kliknij OK.</li>
	<li>Wybierz liczbę studni: 96.</li>
	<li>Używając narzędzia Rectangular selection, które zostanie automatycznie wczytane przez wtyczkę, wyznacz prostokąt zaczynający się w centrum studni A1 i kończący w centrum studni H12. Następnie kliknij OK.</li>
	<li>Wybierz kanał Blue i kliknij OK.</li>
	<li>Zatwierdź domyślne parametry, klikając OK.</li>
	<li>Sprawdź, czy oprogramowanie wyznaczyło obszar wewnątrz każdej studni oraz czy zaznaczone obszary nie pokrywają miejsc z nienaturalnymi cieniami lub odblaskami. Kliknij OK.</li>
	<li>Zapisz wyniki i powtórz kroki 5.8–5.10 dla kanału zielonego.</li>
	<li>Oblicz stosunek sygnału niebieskiego do zielonego, wykorzystując wartość modalną dla każdego koloru. 
	UWAGA: Obliczenia można wykonać ręcznie lub przy użyciu preferowanego oprogramowania, np. R, Microsoft Excel lub GraphPad Prism.</li>
</ol>
6. RęczneB ekstrakcja danych o kolorze
<ol>
	<li>Pobierz program Inkscape, bezpłatny edytor grafiki o otwartym kodzie źródłowym. 
	UWAGA: Do identyfikacji koloru i wyodrębnienia danych RGB można użyć dowolnego oprogramowania z narzędziem wyboru koloru (zazwyczaj przedstawionym jako pipeta).</li>
	<li>Uruchom program Inkscape, przejdź do Plik &gt; Otwórz. Wybierz zdjęcie mikropłytki wykonane w Kroku 4.</li>
	<li>Wybierz narzędzie Zaznacz i przekształć obiekty (S), przedstawione jako strzałka w górnym lewym rogu, a następnie kliknij zdjęcie. Zaznaczenie zostanie wskazane przez przerywaną linię obramowania.</li>
	<li>Wybierz narzędzie Próbnik kolorów obrazu (D), przedstawione jako pipeta po lewej stronie.</li>
	<li>Kliknij w centrum studzienki. Kolor w dolnym panelu („Wypełnienie:”) zmieni się odpowiednio. Kliknij kolor, aby po prawej stronie pojawiła się karta Wypełnienie i kontur.</li>
	<li>Zmień rozwijane menu Kolor jednolity na RGB. Zapisz wartości wyświetlane dla kanałów niebieskiego i zielonego dla każdej studzienki.</li>
	<li>Oblicz stosunek koloru niebieskiego do zielonego, korzystając z zapisanych wartości. 
	​UWAGA: Obliczeń można dokonać ręcznie lub za pomocą preferowanego oprogramowania do analizy danych, takiego jak R, Microsoft Excel lub GraphPad Prism.</li>
</ol>
7. Tworzenie krzywych wzorcowych i ekstrapolacja nieznanych wartości
<ol>
	<li>Nanieś na wykres średni stosunek intensywności zielonej do niebieskiej w funkcji stężenia standardu białka. 
	UWAGA: Wykres należy sporządzić ręcznie lub za pomocą preferowanego oprogramowania, np. R, Microsoft Excel lub GraphPad Prism.</li>
	<li>Oblicz średni stosunek intensywności zielonej do niebieskiej dla każdej próbki i każdego rozcieńczenia.</li>
	<li>Sprawdź, czy sygnał uzyskany dla próbki mieści się w zakresie liniowym standardu białka.</li>
	<li>Zignoruj wszelkie wartości poniżej lub powyżej wartości minimalnej lub maksymalnej krzywej wzorcowej.</li>
	<li>Wykorzystaj równanie liniowe opisujące krzywą wzorcową, aby ekstrapolować ilość białka w próbce. Obliczone wartości pomnóż odpowiednio przez czynnik rozcieńczenia.</li>
</ol>

Smartphone as an Analytical Device to Quantify Protein Using Bradford Assay

<ol><li>Zaguri, M., Kandel, S., Rinehart, S. A., Torsekar, V. R., Hawlena, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quantification+in+ecological+studies%3A+A+literature+review+and+empirical+comparisons+of+standard+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Protein quantification in ecological studies: A literature review and empirical comparisons of standard methodologies.</a> Methods in Ecology and Evolution. 12 (7), 1240-1251 (2021).</li>
<li>Koga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+electrical+stimulation+and+heat+shock+ameliorates+progressive+proteinuria+and+renal+inflammation+in+mouse+model+of+Alport+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mild electrical stimulation and heat shock ameliorates progressive proteinuria and renal inflammation in mouse model of Alport syndrome.</a> PLoS One. 7 (8), e43852(2012).</li>
<li>Peterson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+total+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determination of total protein.</a> Methods in Enzymology. 91, 95-119 (1983).</li>
<li>Goldfarb, A. R., Saidel, L. J., Mosovich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultraviolet+absorption+spectra+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The ultraviolet absorption spectra of proteins.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 397-404 (1951).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Datki, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+BisANS+fluorescent+dye+for+developing+a+novel+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Application of BisANS fluorescent dye for developing a novel protein assay.</a> PLoS One. 14 (4), e0215863(2019).</li>
<li>Van Noorden, R., Maher, B., Nuzzo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+top+100+papers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The top 100 papers.</a> Nature. 514 (7524), 550-553 (2014).</li>
<li>Elsevier, B. V. Scopus. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.scopus.com/">https://www.scopus.com/</a> (2022).</li>
<li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Analytical Biochemistry. 151 (2), 369-374 (1985).</li>
<li>Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectral+study+of+the+charge+forms+of+Coomassie+Blue+G%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G.</a> Analytical Biochemistry. 209 (2), 258-266 (1993).</li>
<li>Pande, S. V., Murthy, M. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+micro-Bradford+procedure+for+elimination+of+interference+from+sodium+dodecyl+sulfate%2C+other+detergents%2C+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A modified micro-Bradford procedure for elimination of interference from sodium dodecyl sulfate, other detergents, and lipids.</a> Analytical Biochemistry. 220 (2), 424-426 (1994).</li>
<li>Gogstad, G. O., Krutnes, M. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+in+cell+suspensions+using+the+Commassie+brilliant+blue+dye-binding+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein in cell suspensions using the Commassie brilliant blue dye-binding assay.</a> Analytical Biochemistry. 126 (2), 355-359 (1982).</li>
<li>Friedenauer, S., Berlet, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+variability+of+the+Bradford+protein+assay+in+the+presence+of+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents.</a> Analytical Biochemistry. 178 (2), 263-268 (1989).</li>
<li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+uniformity+in+the+response+of+the+Coomassie+blue+G+protein+assay+to+different+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Increased uniformity in the response of the Coomassie blue G protein assay to different proteins.</a> Analytical Biochemistry. 184 (1), 111-116 (1990).</li>
<li>Zor, T., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+protein+assay+increases+its+sensitivity%3A+Theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: Theoretical and experimental studies.</a> Analytical Biochemistry. 236 (2), 302-308 (1996).</li>
<li>Gee, C. T., Kehoe, E., Pomerantz, W. C. K., Penn, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+protein+concentrations+using+smartphone+colorimetry%3A+A+new+method+for+an+established+test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Education%22%5BJournal%5D)">Quantifying protein concentrations using smartphone colorimetry: A new method for an established test.</a> Journal of Chemical Education. 94 (7), 941-945 (2017).</li>
<li>de Camargo, C., Vicentini, M., Gobbi, A., Martinez, D., Lima, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smartphone+for+point-of-care+quantification+of+protein+by+Bradford+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Brazilian+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Smartphone for point-of-care quantification of protein by Bradford assay.</a> Journal of the Brazilian Chemical Society. 28 (4), 689-693 (2016).</li>
<li>Moreira, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGBradford%3A+Accurate+measurement+of+protein+concentration+using+a+smartphone+camera+and+the+blue+to+green+intensity+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">RGBradford: Accurate measurement of protein concentration using a smartphone camera and the blue to green intensity ratio.</a> Analytical Biochemistry. 655, 114839(2022).</li>
<li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+Protein+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford Protein Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (38), 1918(2010).</li>
<li>Angelani, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metabolic+control+analysis+approach+to+introduce+the+study+of+systems+in+biochemistry%3A+the+glycolytic+pathway+in+the+red+blood+cell%3A+Metabolic+control+analysis+and+the+glycolytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">A metabolic control analysis approach to introduce the study of systems in biochemistry: the glycolytic pathway in the red blood cell: Metabolic control analysis and the glycolytic pathway.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (5), 502-515 (2018).</li>
</ol>

Autor nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.

W tym artykule opisano RGBradford, metodę, która wykorzystuje kamerę smartfona do rejestrowania danych z testu białka Bradforda, wyodrębniania danych o kolorze i dokładnego ilościowego określania poziomów białka w próbkach biologicznych, jak pierwotnie opisano niedawno. Jedną z różnic w stosunku do oryginalnej metody RGBradford jest to, że tutaj zastosowano procedurę automatycznego uzyskiwania danych o kolorach za pomocą wtyczki ImageJ22 . Główną nowością metody RGBradford ...

Niezależnie od zastosowania w dalszych etapach analizy (np. ELISA, kinetyka enzymatyczna, western blotting, oczyszczanie białek oraz spektrometria mas), oznaczanie ilości białka jest kluczowe dla zapewnienia dokładności analiz w laboratoriach nauk biologicznych. Poza wykorzystaniem w charakterze wtórnych odczytów (tj. do obliczenia względnych poziomów analitów w przeliczeniu na masę białka), poziom białka w próbce może być również samym pożądanym wynikiem analizy. Przykładem może być badanie zawartości białka w zasobach żywności.1 lub w moczu2Dostępnych jest wiele metod pomiaru stężenia białek w próbkach.3, w tym bezpośrednie pomiary absorbancji w UV4, chelatowanie białek przez miedź5,6, kolorymetryczne testy wiązania białka z barwnikiem7, oraz fluorescencyjne testy wiązania białko-barwnik8Znaczenie oznaczania ilości białek potwierdza obecność dwóch publikacji opisujących metody pomiaru białek.5,7 wśród trzech najczęściej cytowanych publikacji9,10Mimo że wielu autorów pomija właściwe cytowanie, powołując się na źródła wtórne lub nie podając żadnych odniesień, oryginalne prace opisujące metodę Lowry’ego oraz metodę Bradforda do oznaczania białek &gt;po 200 000 cytowań każde10.
Popularność metody Bradforda wynika z jej przystępności cenowej, prostoty, szybkości i czułości. Metoda ta opiera się na oddziaływaniu białek z barwnikiem Coomassie Brilliant Blue G w warunkach kwasowych. W warunkach przeprowadzania analizy (tzn. przy niskim pH) barwnik występuje w trzech formach: czerwonej formie kationowej z λmax przy 470 nm; zielonej formie neutralnej z λmax przy 650 nm oraz niebieskiej formie anionowej z λmax przy 590 nm11,12 (Rycina 1). W nieobecności białek dominuje forma kationowa. W wyniku oddziaływania białek z barwnikiem stabilizowana jest niebieska forma anionowa, co powoduje wyraźną zmianę barwy roztworu z brązowawej na niebieską. Zazwyczaj zmianę stężenia niebieskiej formy barwnika określa się spektrofotometrycznie; jej absorbancja przy 590-595 nm jest proporcjonalna do ilości białka w badanej próbce.
<img alt="Wykres widm absorpcyjnych; piki przy 470, 590, 650 nm; wynik badania optycznego; analiza spektroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65547/65547fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Widma absorpcyjne Coomassie brilliant blue G w warunkach testu Bradforda. Trzy główne piki są oznaczone strzałkami wskazującymi λmax dla formy czerwonej (470 nm), zielonej (650 nm) i niebieskiej (590 nm) barwnika. Widma zarejestrowano w nieobecności białka (linia żółta) oraz w obecności 3 µg (linia szara) i 10 µg (linia niebieska) albuminy surowicy bydlęcej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65547/65547fig01large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
Powszechne zastosowanie metody Bradforda doprowadziło do zidentyfikowania kilku ograniczeń (np. zmiennych odpowiedzi dla różnych białek11 oraz interferencji lipidów13 i detergentów7) oraz opracowania modyfikacji mających na celu poprawę jej wydajności (np. dodanie detergentów14,15, alkalinizację14,16 oraz wykorzystanie stosunku absorbancji17). Oprócz modyfikacji samego testu opisano również stosowanie alternatywnych urządzeń, takich jak smartfony lub aparaty fotograficzne, do rejestracji sygnałów analitycznych18,19,20. Rzeczywiście, rozwój metod wykorzystujących smartfony jako przenośne analizatory chemiczne stał się aktywnym obszarem badań. Motywacją do stosowania smartfonów jest przystępność cenowa, przenośność, łatwość obsługi oraz powszechna dostępność tych urządzeń.
Niniejsza praca przedstawia protokół ilościowego oznaczania białek z wykorzystaniem testu RGBradford20, w którym smartfon służy jako urządzenie analityczne. W przeciwieństwie do oryginalnej publikacji dotyczącej metody RGBradford20, wprowadzono tutaj procedurę usprawniającą proces ekstrakcji koloru. Polega ona na wykorzystaniu bezpłatnej aplikacji programistycznej do automatycznego wyodrębniania informacji o kolorze z każdego dołka zdjęcia mikropłytki, co pozwala zaoszczędzić znaczną ilość czasu i wysiłku. Stanowi to alternatywę dla poprzedniej metody ręcznego pozyskiwania danych o kolorze z każdego dołka pojedynczo za pomocą aplikacji edytora graficznego20. W rezultacie poziom białek w próbkach może być określony ilościowo na podstawie danych o kolorze wyekstrahowanych ze zdjęcia mikropłytki wykonanego smartfonem.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowe płaskie płytki do mikromiareczkowania z polistyrenu&nbsp;</td><td>Jet Biofil, Guangzhou, Chiny</td><td>TCP011096</td><td>Wystarczy dowolna mikropłytka z płaskim dnem kompatybilna z odczytem optycznym.&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol</td><td></td><td></td><td></td>etylowy</tr><tr><td>iPhone 11</td><td>Apple</td><td>MWM02BR/A</td><td>Można zastąpić innym smartfonem wyposażonym w aparat</td></tr><tr><td>iPhone 14 Pro</td><td>Apple</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric kwas</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>695017</td><td></td></tr><tr><td>Redmi Note 9 Pro</td><td>XIAOMI&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>S22 Ultra</td><td>Samsung&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 384 Plus. Czytnik mikropłytek.</td><td>Molecular Devices, San Jose, CA</td><td>PLUS 384</td><td>Będzie działał każdy czytnik mikropłytek zdolny do odczytu przy 450 nm i 590 nm. Jest to opcjonalne. Metoda ta została stworzona, aby wyeliminować potrzebę korzystania z czytnika mikropłytek.</td></tr></tbody></table>

rgbradford: kwantyfikacja białka za pomocą aparatu w smartfonie

RGBradford: Protein Quantitation with a Smartphone Camera

Oznaczanie ilościowe białka jest podstawową procedurą w badaniach z zakresu nauk przyrodniczych. Wśród kilku innych metod, test Bradforda jest jednym z najczęściej stosowanych. Ze względu na jego powszechność, ograniczenia i zalety testu Bradforda zostały wyczerpująco opisane, w tym kilka modyfikacji oryginalnej metody w celu poprawy jej wydajności. Jedną ze zmian w oryginalnej metodzie jest wykorzystanie aparatu w smartfonie jako instrumentu analitycznego. Wykorzystując trzy formy barwnika Coomassie Brilliant Blue, które występują w warunkach testu Bradforda, w artykule opisano, jak dokładnie określić ilościowo białko w próbkach przy użyciu danych o barwie wyekstrahowanych z pojedynczego obrazu mikropłytki. Po wykonaniu testu na mikropłytce, zdjęcie jest wykonywane za pomocą aparatu w smartfonie, a dane kolorów RGB są ekstrahowane z obrazu za pomocą bezpłatnej aplikacji do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym. Następnie stosunek intensywności koloru niebieskiego do zielonego (w skali RGB) próbek o nieznanych stężeniach białka jest wykorzystywany do obliczenia zawartości białka w oparciu o krzywą standardową. Nie obserwuje się znaczącej różnicy między wartościami obliczonymi przy użyciu danych kolorów RGB a tymi obliczonymi przy użyciu konwencjonalnych danych absorbancji.

Rysunek 4 przedstawia zdjęcie mikropłytki, z której wyekstrahowano dane o kolorze oraz zarejestrowano absorbancję przy 450 nm i 590 nm. Przedstawione tutaj reprezentatywne dane kolorystyczne RGB uzyskano automatycznie, zgodnie z opisem w sekcji 5. Typowy wzorzec danych kolorystycznych to wzrost wartości niebieskiej oraz spadek wartości czerwonej i zielonej (Rysunek 5). Należy zauważyć, że mimo wyraźnych odbić we wszystkich dołkach oraz niedoskonałego wyrównania ...

Ten artykuł zawiera protokół do oznaczania ilościowego białek przy użyciu testu Bradforda i smartfona jako urządzenia analitycznego. Poziomy białka w próbkach można określić ilościowo za pomocą danych o kolorach uzyskanych ze zdjęcia mikropłytki wykonanego smartfonem.

RGBradford: Kwantyfikacja białka za pomocą aparatu w smartfonie

Protein quantitation is an essential procedure in life sciences research. Amongst several other methods, the Bradford assay is one of the most used. ...

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu na poziomie biochemicznym, w jaki sposób zwierzęta przystosowują się do ekstremalnych warunków i środowiska. Badamy pytania dotyczące ich reakcji na brak tlenu i zahamowanie tempa przemiany materii. W szczególności badamy endogenne przeciwutleniacze, stres oksydacyjny i reakcję na stres komórkowy stosowane przez zwierzęta w niekorzystnym środowisku, i w tym celu często określamy ilościowo poziomy białka w naszych próbkach.Protokół ten odpowiada na potrzebę alternatywnej metody uzyskiwania danych ilościowych dotyczących białka w przypadku ograniczonych zasobów, dzięki czemu jest on dostępny zarówno w kontekście edukacyjnym, jak i badawczym. Zakres RG do oznaczania oferuje praktyczne i niezawodne rozwiązanie do pomiaru stężenia białka, które jest dostępne, proste i dokładne w scenariuszach, w których konwencjonalny sprzęt, taki jak czytnik mikropłytek, może być niedostępny. Aby rozpocząć przygotowanie próbki do testu białka Bradforda, należy rozcieńczyć próbki białek, aby uzyskać stężenia białka w standardowym zakresie krzywej od 0,025 do 1,0 miligramów na mililitr.Utwórz wiele rozcieńczeń próbki na próbkę w tym zakresie. Do punktu zerowego białka dodać 10 mikrolitrów buforu lub pożywki użytej do przygotowania roztworów wzorcowych do wyznaczonych studzienek, a następnie dodać 10 mikrolitrów każdego wzorcowego roztworu białka do zestawu trzech dołków, służąc jako trzy tryplekaty w 96-dołkowej mikropłytce. W oddzielnym zestawie studzienek na tej samej 96-dołkowej mikropłytce dodać 10 mikrolitrów każdej próbki rozcieńczonej w trzech egzemplarzach.Następnie dodaj 250 mikrolitrów odczynnika do oznaczania białek Bradforda do wszystkich studzienek. Na ekranie wyświetlany jest układ ostatecznej konfiguracji mikropłytki. Przystąp do zapisywania wyników w dobrze oświetlonym pomieszczeniu w ciągu pięciu do 15 minut od dodania odczynnika testowego.Jedną ręką trzymaj mikropłytkę na jednolitym białym tle, upewniając się, że jest równoległa do stołu roboczego, a drugą ręką trzymaj smartfon równolegle do stołu i mikropłytki. Kontynuuj robienie kilku zdjęć całej mikropłytki. W przypadku urządzeń z systemem iOS włącz opcję siatki w ustawieniach aparatu, aby włączyć wskaźnik poziomu kamery.W przypadku urządzeń z systemem Android aktywuj linie siatki w ustawieniach aparatu, aby osiągnąć to samo. Chociaż nie jest wymagane żadne specjalne urządzenie oświetleniowe, należy zachować ostrożność podczas prawidłowego robienia zdjęć. Unikaj cieniowania płyty lub tła i zapobiegaj nadmiernemu odbiciu.Upewnij się również, że nie przechylasz płyty. Sprawdź obraz pod kątem jednolitości tła, cieni i odbić. Sprawdź także kąt studzienek.Środek każdej studzienki powinien być bezpośrednio widoczny. W razie potrzeby odczytaj mikropłytkę w czytniku mikropłytek, aby porównać dane dotyczące koloru obrazu z odczytami absorbancji mikropłytki. Aby wyodrębnić dane testowe Bradforda z obrazów mikropłytki zarejestrowanych za pomocą kamery smartfona, należy pobrać oprogramowanie ImageJ i wtyczkę do odczytu płytki dostępną w postaci pliku tekstowego.po otwarciu ImageJ kliknij wtyczki, a następnie zainstaluj i wybierz pobrany plik tekstowy wtyczki Read Plate. Ustaw parametry pomiaru, klikając na analizuj, a następnie ustaw pomiary w sprawdzaniu opcji, obszar, odchylenie standardowe, minimalna i maksymalna wartość szarości, średnia wartość szarości, modalna wartość szarości. U dołu okna ustaw przekierowanie na wartość Brak, a liczba dziesiętna umieszcza od zera do dziewięciu jako trzy.Przejdź do pliku, kliknij otwórz i wybierz zdjęcie mikropłytki wykonane smartfonem. Przejdź do wtyczek, a następnie odczytaj płytę. Przeczytaj instrukcje, a następnie kliknij przycisk OK.Wybierz liczbę studzienek jako 96. Korzystając z narzędzia do zaznaczania prostokątnego automatycznie ładowanego przez wtyczkę, utwórz prostokąt zaczynający się w środku studni A1 i kończący się na środku studni H12, a następnie kliknij OK. Wybierz niebieski kanał i kliknij OK, a następnie potwierdź domyślne parametry, klikając OK.Sprawdź, czy oprogramowanie wyznaczyło obszar wewnątrz każdej studzienki i czy wybrane obszary nie pokrywają obszarów z nietypowymi cieniami lub odbiciami. Po sprawdzeniu kliknij OK. Zapisz wyniki przed powtórzeniem tego samego dla kanału zielonego.Oblicz stosunek niebieskiego do zielonego, korzystając z trybu dla każdego koloru. Dane kolorów RGB uzyskane automatycznie z obrazu mikropłytki wykazały typowy wzrost wartości koloru niebieskiego oraz spadek wartości koloru czerwonego i zielonego dla standardu BSA. Co więcej, dane dotyczące kolorów wydobyte z obrazu dokładnie odzwierciedlały odczyty absorbancji zarejestrowane przy 450 i 590 nanometrach.Stwierdzono, że krzywa standardowa uzyskana na podstawie wyodrębnionych danych kolorystycznych przedstawiających sygnał w stosunku do stężenia BSA jest liniowa, zgodnie z oczekiwaniami. Liniową zależność między rozcieńczeniem próbki a sygnałem uzyskano zarówno dla odczytów absorbancji, jak i dla wyekstrahowanych danych dotyczących barwy w dwóch różnych próbkach białek. W przypadku obu próbek białek część rozcieńczenia nie mieściła się w zakresie liniowym krzywej wzorcowej.Jednak po zignorowaniu tych punktów, poziomy białka obliczone przy użyciu danych RGB dla obu próbek odpowiadały tym obliczonym przy użyciu odczytów absorbancji. Aby ręcznie wyodrębnić dane testowe Bradforda z obrazów mikropłytki zarejestrowanych za pomocą aparatu w smartfonie, pobierz Inkscape, darmowy edytor graficzny o otwartym kodzie źródłowym. Otwórz Inkscape, przejdź do pliku i kliknij otwórz, aby wybrać zdjęcie mikropłytki zrobione smartfonem.Wybierz narzędzie S do zaznaczania i przekształcania obiektów, które jest przedstawione jako strzałka w lewym górnym rogu, i kliknij obraz. Obramowanie linią przerywaną wskaże zaznaczenie, a następnie wybierz narzędzie wyboru kolorów z obrazu D, które jest przedstawione jako kroplomierz po lewej stronie. Następnie kliknij na środku studni.Kolor na dolnym panelu, wypełnienie, zmieni się odpowiednio. Kliknij kolor, a po prawej stronie pojawi się zakładka wypełnienia i obrysu. Zmień menu rozwijane płaskiego koloru na RGB.Zapisz wartości pokazane dla kanałów niebieskiego i zielonego dla każdej studzienki. Oblicz stosunek koloru niebieskiego do zielonego, korzystając z zarejestrowanych wartości.

rgbradford-protein-quantitation-with-a-smartphone-camera

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Dokładność i czułość oznaczania białek za pomocą szybkiej i wygodnej metody Bradforda są ograniczone przez wewnętrzną nieliniowość. Przedstawiamy prostą procedurę linearyzacji, która znacznie zwiększa dokładność, poprawia czułość analizy około 10-krotnie i istotnie redukuje interferencje wywołane przez detergenty.

Linearyzacja testu Bradforda na oznaczenie białek

Film demonstruje technikę western blottingu opartą na normalizacji całkowitego białka do ilościowego określania docelowej ekspresji białka w próbce. Wykorzystując całkowite barwienie białka w próbce, przeprowadza się analizę ratiometryczną w celu określenia względnego poziomu ekspresji białka docelowego.

Ilościowe Western Blot w celu oszacowania poziomów ekspresji białka

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać bezwzględne testy kwantyfikacyjne docelowych białek w złożonych próbkach biologicznych przy użyciu monitorowania wybranych reakcji. Wykorzystano go do dokładnego ilościowego określenia białek szlaku sygnałowego chemotaksji makrofagów myszy. Szczegółowo opisano wybór peptydów docelowych, opracowywanie testów oraz testy jakościowe i ilościowe.

Spektrometria mas do monitorowania wybranych reakcji do bezwzględnej kwantyfikacji białek

Opisujemy metodę ilościowego określania agregacji nieprawidłowo sfałdowanych białek. Nasz protokół szczegółowo opisuje indukowane lentiwirusem stabilne generowanie linii komórkowych, automatyczne obrazowanie konfokalne i analizę obrazu agregatów białkowych. Jako przykładowe zastosowanie, zbadaliśmy wpływ małych cząsteczek na promowanie agregacji SOD1 w sposób zależny od czasu i dawki.

Opracowanie testu do oznaczania ilościowego wysokiej zawartości zmutowanego białka Sod1 w tworzeniu agregatów w żywych komórkach

Ten protokół opisuje bezkalibracyjne podejście do ilościowego określania homo-oligomeryzacji białek in vitro na podstawie spektroskopii fluktuacji fluorescencji przy użyciu komercyjnej mikroskopii skaningowej światła. Wyświetlane są prawidłowe ustawienia akwizycji i metody analizy.

Kwantyfikacja homooligomeryzacji białek in vitro bez kalibracji przy użyciu komercyjnego oprzyrządowania i bezpłatnego oprogramowania do analizy jasności typu open source

Protokół ten opisuje produkcję rekombinowanej ludzkiej rybonukleazy SLFN14 oraz jej stechiometryczną analizę za pomocą fotometrii masowej.<br...

Szybka produkcja rekombinowanego rybonukleazy SLFN14 u człowieka oraz analiza stechiometryczna za pomocą fotometrii masowej

Interakcje białek są sercem funkcji komórki. Do ich scharakteryzowania powszechnie stosuje się techniki kalorymetryczne i spektroskopowe. Tutaj opisujemy anizotropię fluorescencji jako narzędzie do badania interakcji między białkiem zmutowanym w zespole Shwachmana-Diamonda (SBDS) a GTPazą podobną do czynnika elongacji 1 (EFL1).

Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Przedstawiono protokół do badania online relacji sekwencja-struktura-dynamika białek za pomocą Bio3D-web.

Badanie zależności między sekwencją, strukturą i dynamiką białek za pomocą Bio3D-web

Poznaj metodę ilościowego oznaczania białka za pomocą testu Bradford z wykorzystaniem smartfona jako urządzenia analitycznego. Protokół umożliwia pomiar stężenia białka w warunkach ograniczonych zasobów laboratoryjnych.

RGBradford: Kwantyfikacja białka za pomocą aparatu w smartfonie

Przeglądaj więcej filmów