RGBradford: Kwantyfikacja białka za pomocą aparatu w smartfonie

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu na poziomie biochemicznym, w jaki sposób zwierzęta przystosowują się do ekstremalnych warunków i środowiska. Badamy pytania dotyczące ich reakcji na brak tlenu i zahamowanie tempa przemiany materii. W szczególności badamy endogenne przeciwutleniacze, stres oksydacyjny i reakcję na stres komórkowy stosowane przez zwierzęta w niekorzystnym środowisku, i w tym celu często określamy ilościowo poziomy białka w naszych próbkach.

Protokół ten odpowiada na potrzebę alternatywnej metody uzyskiwania danych ilościowych dotyczących białka w przypadku ograniczonych zasobów, dzięki czemu jest on dostępny zarówno w kontekście edukacyjnym, jak i badawczym. Zakres RG do oznaczania oferuje praktyczne i niezawodne rozwiązanie do pomiaru stężenia białka, które jest dostępne, proste i dokładne w scenariuszach, w których konwencjonalny sprzęt, taki jak czytnik mikropłytek, może być niedostępny. Aby rozpocząć przygotowanie próbki do testu białka Bradforda, należy rozcieńczyć próbki białek, aby uzyskać stężenia białka w standardowym zakresie krzywej od 0,025 do 1,0 miligramów na mililitr.

Utwórz wiele rozcieńczeń próbki na próbkę w tym zakresie. Do punktu zerowego białka dodać 10 mikrolitrów buforu lub pożywki użytej do przygotowania roztworów wzorcowych do wyznaczonych studzienek, a następnie dodać 10 mikrolitrów każdego wzorcowego roztworu białka do zestawu trzech dołków, służąc jako trzy tryplekaty w 96-dołkowej mikropłytce. W oddzielnym zestawie studzienek na tej samej 96-dołkowej mikropłytce dodać 10 mikrolitrów każdej próbki rozcieńczonej w trzech egzemplarzach.

Następnie dodaj 250 mikrolitrów odczynnika do oznaczania białek Bradforda do wszystkich studzienek. Na ekranie wyświetlany jest układ ostatecznej konfiguracji mikropłytki. Przystąp do zapisywania wyników w dobrze oświetlonym pomieszczeniu w ciągu pięciu do 15 minut od dodania odczynnika testowego.

Jedną ręką trzymaj mikropłytkę na jednolitym białym tle, upewniając się, że jest równoległa do stołu roboczego, a drugą ręką trzymaj smartfon równolegle do stołu i mikropłytki. Kontynuuj robienie kilku zdjęć całej mikropłytki. W przypadku urządzeń z systemem iOS włącz opcję siatki w ustawieniach aparatu, aby włączyć wskaźnik poziomu kamery.

W przypadku urządzeń z systemem Android aktywuj linie siatki w ustawieniach aparatu, aby osiągnąć to samo. Chociaż nie jest wymagane żadne specjalne urządzenie oświetleniowe, należy zachować ostrożność podczas prawidłowego robienia zdjęć. Unikaj cieniowania płyty lub tła i zapobiegaj nadmiernemu odbiciu.

Upewnij się również, że nie przechylasz płyty. Sprawdź obraz pod kątem jednolitości tła, cieni i odbić. Sprawdź także kąt studzienek.

Środek każdej studzienki powinien być bezpośrednio widoczny. W razie potrzeby odczytaj mikropłytkę w czytniku mikropłytek, aby porównać dane dotyczące koloru obrazu z odczytami absorbancji mikropłytki. Aby wyodrębnić dane testowe Bradforda z obrazów mikropłytki zarejestrowanych za pomocą kamery smartfona, należy pobrać oprogramowanie ImageJ i wtyczkę do odczytu płytki dostępną w postaci pliku tekstowego.

po otwarciu ImageJ kliknij wtyczki, a następnie zainstaluj i wybierz pobrany plik tekstowy wtyczki Read Plate. Ustaw parametry pomiaru, klikając na analizuj, a następnie ustaw pomiary w sprawdzaniu opcji, obszar, odchylenie standardowe, minimalna i maksymalna wartość szarości, średnia wartość szarości, modalna wartość szarości. U dołu okna ustaw przekierowanie na wartość Brak, a liczba dziesiętna umieszcza od zera do dziewięciu jako trzy.

Przejdź do pliku, kliknij otwórz i wybierz zdjęcie mikropłytki wykonane smartfonem. Przejdź do wtyczek, a następnie odczytaj płytę. Przeczytaj instrukcje, a następnie kliknij przycisk OK.

Wybierz liczbę studzienek jako 96. Korzystając z narzędzia do zaznaczania prostokątnego automatycznie ładowanego przez wtyczkę, utwórz prostokąt zaczynający się w środku studni A1 i kończący się na środku studni H12, a następnie kliknij OK. Wybierz niebieski kanał i kliknij OK, a następnie potwierdź domyślne parametry, klikając OK.

Sprawdź, czy oprogramowanie wyznaczyło obszar wewnątrz każdej studzienki i czy wybrane obszary nie pokrywają obszarów z nietypowymi cieniami lub odbiciami. Po sprawdzeniu kliknij OK. Zapisz wyniki przed powtórzeniem tego samego dla kanału zielonego.

Oblicz stosunek niebieskiego do zielonego, korzystając z trybu dla każdego koloru. Dane kolorów RGB uzyskane automatycznie z obrazu mikropłytki wykazały typowy wzrost wartości koloru niebieskiego oraz spadek wartości koloru czerwonego i zielonego dla standardu BSA. Co więcej, dane dotyczące kolorów wydobyte z obrazu dokładnie odzwierciedlały odczyty absorbancji zarejestrowane przy 450 i 590 nanometrach.

Stwierdzono, że krzywa standardowa uzyskana na podstawie wyodrębnionych danych kolorystycznych przedstawiających sygnał w stosunku do stężenia BSA jest liniowa, zgodnie z oczekiwaniami. Liniową zależność między rozcieńczeniem próbki a sygnałem uzyskano zarówno dla odczytów absorbancji, jak i dla wyekstrahowanych danych dotyczących barwy w dwóch różnych próbkach białek. W przypadku obu próbek białek część rozcieńczenia nie mieściła się w zakresie liniowym krzywej wzorcowej.

Jednak po zignorowaniu tych punktów, poziomy białka obliczone przy użyciu danych RGB dla obu próbek odpowiadały tym obliczonym przy użyciu odczytów absorbancji. Aby ręcznie wyodrębnić dane testowe Bradforda z obrazów mikropłytki zarejestrowanych za pomocą aparatu w smartfonie, pobierz Inkscape, darmowy edytor graficzny o otwartym kodzie źródłowym. Otwórz Inkscape, przejdź do pliku i kliknij otwórz, aby wybrać zdjęcie mikropłytki zrobione smartfonem.

Wybierz narzędzie S do zaznaczania i przekształcania obiektów, które jest przedstawione jako strzałka w lewym górnym rogu, i kliknij obraz. Obramowanie linią przerywaną wskaże zaznaczenie, a następnie wybierz narzędzie wyboru kolorów z obrazu D, które jest przedstawione jako kroplomierz po lewej stronie. Następnie kliknij na środku studni.

Kolor na dolnym panelu, wypełnienie, zmieni się odpowiednio. Kliknij kolor, a po prawej stronie pojawi się zakładka wypełnienia i obrysu. Zmień menu rozwijane płaskiego koloru na RGB.

Zapisz wartości pokazane dla kanałów niebieskiego i zielonego dla każdej studzienki. Oblicz stosunek koloru niebieskiego do zielonego, korzystając z zarejestrowanych wartości.