Name: Celowy knockdown genów w splocie naczyniówkowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 43 s
Description: Poznaj metody celowego knockdownu genów w splocie naczyniówkowym myszy przy użyciu wstrzyknięć ICV i wektorów AAV2/5. Techniki te umożliwiają badanie funkcji immunologicznej w chorobach neurologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 31800903, przyznany W. Zhengowi) oraz Wenzhou Science and Technology Project (nr Y2020426, przyznany Y. Y. Weng) za tę pracę.

Wszystkie procedury na zwierzętach opisane w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zawartymi w Przewodniku NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Medycznym w Wenzhou.
1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Kup samce myszy C57BL/6 w wieku 8-12 tygodni i wadze 20-22 g.</li>
	<li>Uzyskaj transgeniczną linię myszy Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) i samce myszy A2ARflox / flox.</li>
	<li>Losowo przypisz myszy do dwóch grup i trzymaj je w klatkach, z maksymalnie pięcioma myszami na klatkę, w standardowym cyklu 12 godzin światła/12 godzin ciemności przez 1 tydzień.</li>
	<li>Zapewnić myszom wystarczającą ilość pożywienia i wody oraz utrzymywać je w stałej temperaturze 25 °C.</li>
</ol>
2. Specyficzne dla CHP knockdown A2ARs z AAV2/5-shRNA
<ol>
	<li>Zważ każdą mysz i zapisz wartości.</li>
	<li>Znieczulenie myszy dootrzewnowo 1% pentobarbitalu sodu w dawce 6-8 ml/kg odpowiadającej 60-80 mg/kg pentobarbitalu i umieszczenie myszy na poduszce grzewczej, aby utrzymać ją w cieple. 
	UWAGA: Aby zapewnić udaną operację, bardzo ważne jest podanie odpowiedniej dawki pentobarbitalu sodu w zależności od wagi myszy. Znieczulenie nie powinno być zbyt głębokie, ponieważ może to skutkować śmiercią, ale nie powinno być zbyt płytkie, ponieważ mysz może się obudzić w trakcie zabiegu, co potencjalnie wpływa na skuteczność wstrzyknięcia wirusa. Sprawdź, czy dawka znieczulenia jest właściwa, szczypiąc palec u nogi i upewniając się, że myszy nie reagują.</li>
	<li>Użyj specjalistycznej golarki do myszy, aby przyciąć górne włosy znieczulonych myszy.</li>
	<li>Nałóż maść na oczy na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu, i przymocuj myszy do aparatu stereotaktycznego, aby unieruchomić mózg. Przykryj zwierzę sterylną zasłoną.</li>
	<li>Dokładnie wysterylizuj skórę głowy i szyi myszy trzema rundami środka dezynfekującego jodoforu i 75% alkoholem, aby zmniejszyć infekcję pooperacyjną. Następnie nałóż miejscowo 1% lidokainy na skórę głowy myszy i wykonaj małe nacięcie, aby w pełni odsłonić czaszkę pod mikroskopem. 
	UWAGA: Przez cały czas trwania zabiegu należy używać sterylnych narzędzi.</li>
	<li>Przygotuj dwie strzykawki 10 μL: jedną z zakupionym AAV2/5-A2AR-shRNA (miano: 6,27 × 109 vg/μL), a drugą z zakupionym AAV2/5-Scramble (miano: 6,21 × 109 vg/μL). 
	UWAGA: Podczas korzystania ze strzykawki przedni koniec musi być podłączony do szklanej kapilary, a zakres 10 μl można uzyskać, kontrolując długość szklanej kapilary.</li>
	<li>Użyj mikroskopu, aby zlokalizować bregmę i lambdę i ustawić punkt współrzędnych (AP: -0.58; ML: ±1.10; DL: -2,20) na strzykawce 10 μl (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1). Punkt współrzędnych jest oparty na stereotaktycznym atlasie mózgu myszy class15.</li>
	<li>Wywierć mały otwór w czaszce w dostosowanym punkcie współrzędnych. 
	UWAGA: Pod mikroskopem wiercenie odbywa się za pomocą sterylnego mikrowiertła na powierzchni czaszki. Po wierceniu, poprzez usunięcie opon mózgowych pokrywających mózg i odsłonięcie leżącego pod spodem miąższu mózgu, zapobiega się uszkodzeniom naczyń krwionośnych. Ten krok zapobiega odłamaniu końcówki szklanej kapilary przez opony mózgowe. Średnica wywierconego otworu powinna być wystarczająca, aby końcówka igły mogła wejść w tkankę mózgową.</li>
	<li>Podać 2 μl wirusa AAV2/5-A2AR-shRNA do komory mózgu poprzez wstrzyknięcie boczne ze stałą szybkością 100 nL/min. Przytrzymaj igłę na miejscu przez 10 minut przed pobraniem. Należy pamiętać, że wirus był podawany w jednostronnym wstrzyknięciu.</li>
	<li>Natychmiast uszczelnij zranioną skórę za pomocą medycznego kleju biofibrynowego, aby zapobiec utracie wirusa, który można wypłukać płynem mózgowo-rdzeniowym po wyjęciu igły, jeśli klej nie zostanie szybko nałożony. Nie używaj również patyczków kosmetycznych do wycierania płynu mózgowo-rdzeniowego, ponieważ może to również spowodować utratę wirusów.</li>
	<li>Aby ułatwić regenerację, umieść mysz na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37,0 ± 0,5 °C, a następnie nałóż miejscowo 1% lidokainy na skórę głowy myszy. Pozwól myszom na regenerację przez 2 tygodnie przed indukcją modelu EAE, ponieważ okres ten jest niezbędny do ekspresji wirusa AAV2 / 5-A2AR-shRNA i późniejszego knockdownu A2AR.</li>
</ol>
3. Specyficzne dla ChP powalenie A2AR z Cre/locus systemu X-overP1 (Cre/LoxP)
UWAGA: Następujące procedury można wykonać za pomocą metody opisanej wcześniej. Patrz kroki 2.1-2.11, aby uzyskać szczegółowe metody wstrzykiwania.
<ol>
	<li>Wstrzyknąć 2 μl rekombinazy CRE-TAT do każdej bocznej komory myszy Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato jako grupy eksperymentalnej i 2 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) jako grupy kontrolnej. Stosując ten sam protokół, co powyżej (sekcja 2), wstrzyknąć 2 μl rekombinazy CRE-TAT do każdej z bocznych komór myszy A2ARflox/flox wraz z 2 μl sterylnego PBS jako grupy kontrolnej.</li>
	<li>Przygotować zamrożone skrawki tkanek i wykonać barwienie jądrowe 2 tygodnie po wstrzyknięciu rekombinazy CRE-TAT. Zobacz kroki 4.1-4.3, aby uzyskać więcej informacji.</li>
</ol>
4. Perfuzja przezsercowa u myszy
<ol>
	<li>Podaj 60-80 mg/kg pentobarbitalu sodu w celu głębokiego znieczulenia myszy. Potwierdzić płaszczyznę znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi i przeprowadzić perfuzję przezsercową przy użyciu 40 ml sterylnego roztworu PBS, a następnie 20 ml 4% paraformaldehydu (PFA). 
	UWAGA: O udanej perfuzji świadczy biały kolor w wątrobie, natomiast obecność powiększonych płuc lub odpływu PBS z ust podczas perfuzji sugeruje niepowodzenie zabiegu.</li>
	<li>Szybko wyodrębnij mózg myszy, zapewniając minimalną degradację białka.</li>
	<li>Zanurz mózg myszy w 4% PFA/PBS na noc w celu późniejszego utrwalenia, a następnie zastąp 30% roztworem sacharozy PB przez 72 godziny 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby uniknąć nadmiernego odwodnienia tkanki mózgowej, dlatego mózg nie powinien być pozostawiany w roztworze sacharozy PB zbyt długo.</li>
</ol>
5. Cięcie i barwienie zamrożonych tkanek
<ol>
	<li>Osadź wcześniej odwodniony mózg myszy w kleju o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), zamroź osadzony mózg i użyj przesuwanego mikrotomu do wycięcia przekrojów koronalnych o grubości 20 μm.</li>
	<li>Umieść skrawki mózgu na szklanym szkiełku. Gdy skrawki mózgu wyschną, przechowuj je w lodówce o temperaturze -20 °C do kolejnych eksperymentów.</li>
	<li>Umieść każdy szkiełko w etui na ramkę i zanurz ramkę w pojemniku wypełnionym PBS, aby dokładnie wypłukać szkiełko. Delikatnie przepłukać szkiełka mózgowe roztworem PBS trzy razy, za każdym razem przez 10 minut. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby sekcje mózgu nie spadły ze szklanego szkiełka.</li>
	<li>Zabarwić szkiełka mózgowe roztworem 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) przez 10 min.</li>
	<li>Przepłukać szkiełka mózgowe roztworem PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Nałóż jedną kroplę środka mocującego zapobiegającego blaknięciu na części mózgu.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na skrawkach mózgu, uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci i przeanalizuj skrawki za pomocą konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
6. Indukcja EAE
UWAGA: Wykonaj indukcję EAE po 2 tygodniach iniekcji rekombinazy shRNA lub CRE-TAT11.
<ol>
	<li>Sporządzić roztwór wodny, mieszając 2,5 mg glikoproteiny oligodendrocytów mieliny (MOG35-55) z 2 ml PBS. Przygotować kompletny roztwór oleju z adiuwantem Freundsa (CFA), mieszając M. tuberculosis (H37Ra) z niekompletnym adiuwantem Freundsa (IFA).</li>
	<li>Wymieszaj roztwór wodny i olejowy w stosunku 1:1. Użyj trójnika, aby ubić mieszaninę do stanu oleju w wodzie. 
	UWAGA: Rura trójnikowa jest również nazywana rurą trójdrożną. Jest to plastikowa rurka, która może kontrolować kierunek przepływu roztworu, aby w pełni wymieszać MOG35-55 i CFA.</li>
	<li>Użyj homogenizatora wysokoobrotowego, aby przygotować emulsję antygenową MOG dla modelu EAE w warunkach łaźni lodowej.</li>
	<li>Znieczulenie myszy dootrzewnowo 1% pentobarbitalu sodu w dawce 6-8 ml / kg odpowiadającej 60-80 mg / kg pentobarbitalu.</li>
	<li>Emulsję antygenową MOG należy wstrzyknąć podskórnie w cztery różne punkty (szyja, plecy, lewe i prawe biodro) w objętości 10 ml/kg, co daje w sumie cztery wstrzyknięcia każdy. 
	UWAGA: Ważne jest, aby starannie wybrać miejsce wstrzyknięcia, ponieważ różne miejsca mogą mieć różny wpływ na zachorowalność i śmiertelność myszy. Ponadto powtarzające się zastrzyki MOG mogą prowadzić do tolerancji immunologicznej, więc zespół badawczy wybrał metodę pojedynczego wstrzyknięcia, aby zapobiec temu potencjalnemu problemowi.</li>
	<li>Natychmiast wstrzyknąć dootrzewnowo 500 ng/ml toksyny krztuścowej (PT) w dawce 5 mg/kg po wstrzyknięciu MOG. 
	UWAGA: PT zwiększa przepuszczalność bariery krew-mózg (BBB) i ułatwia infiltrację limfocytów T do mózgu.</li>
	<li>Po 48 godzinach wstrzyknąć dootrzewnowo roztwór PT o tej samej objętości.</li>
</ol>
7. Wynik deficytu neurologicznego
<ol>
	<li>Oceniaj i oceniaj myszy codziennie, używając skali ocen16 w zakresie od 0 do 15, aby ocenić częstość występowania i nasilenie EAE zgodnie z następującymi deficytami neurologicznymi: 
	Ogon: 0 oznacza brak znaków, 1 oznacza półsparaliżowany ogon, a 2 oznacza całkowicie sparaliżowany ogon. 
	Kończyny: 0 oznacza brak objawów, 1 oznacza słaby lub zmieniony chód, 2 oznacza niedowład, a 3 oznacza w pełni sparaliżowaną kończynę.</li>
	<li>Przypisz zwierzęciu z porażeniem czterokończynowym z całkowitym paraliżem wynik 12, a śmiertelności przypisz wynik 15.</li>
</ol>
8. Barwienie hematoksyliną-eozyną (H&E)
<ol>
	<li>Weź odwodniony mózg myszy i zanurz go w stopionej parafinie. Pozwól blokowi parafiny ostygnąć i zestalić się do późniejszego użycia. 
	UWAGA: Blok parafinowy powinien być całkowicie suchy i chłodny, aby uniknąć uszkodzenia tkanki.</li>
	<li>Pokrój blok parafiny mózgu myszy na szkiełka o grubości 5 μm. Umieść wycinek mózgu myszy parafinowej na szkiełku podstawowym i susz w piekarniku o temperaturze 60 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Zanurz szkiełka kolejno w roztworze ksylenu I na 10 min, roztworze ksylenu II na 10 min, 100% alkoholu I na 3 min, 100% alkoholu II na 3 min, 95% alkoholu na 3 min, 90% alkoholu na 3 min, 80% alkoholu na 3 min, 70% alkoholu na 3 min i wodzie destylowanej na 1 min.</li>
</ol>
9. Ilościowa analiza reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR)
<ol>
	<li>Po perfuzji myszy za pomocą PBS usuń ChP z komór i wyekstrahuj RNA za pomocą Trizolu. Zsyntetyzuj cDNA za pomocą pierwszego zestawu do syntezy nici cDNA.</li>
	<li>Przeprowadź analizę qPCR przy użyciu zielonego premiksu Ex Taq SYBR i systemu PCR w czasie rzeczywistym. Użyj następujących starterów A2AR: forward - GCCATCCCATTCGCCATCA; rewers - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.</li>
</ol>

Selective Gene Silencing in the Choroid Plexus

<ol><li>Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+secretion+by+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus.</a> Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).</li>
<li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li>
<li>Wolburg, H., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus: biology and pathology.</a> Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).</li>
<li>Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease.</a> Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35(2020).</li>
<li>Marques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+in+health+and+in+disease%3A+dialogues+into+and+out+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain.</a> Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).</li>
<li>Myung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+is+an+important+circadian+clock+component%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus is an important circadian clock component.</a> Nature Communications. 9 (1), 1062(2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+FOXJ1-Cre+system+for+gene+inactivation+in+ciliated+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).</li>
<li>Johansson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Otx2+regulates+choroid+plexus+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Otx2 regulates choroid plexus development and function.</a> Development. 140 (5), 1055-1066 (2013).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+NKCC1+mediates+cerebrospinal+fluid+clearance+during+mouse+early+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus NKCC1 mediates cerebrospinal fluid clearance during mouse early postnatal development.</a> Nature Communications. 12 (1), 447(2021).</li>
<li>Spatazza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid-plexus-derived+Otx2+homeoprotein+constrains+adult+cortical+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity.</a> Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).</li>
<li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus-selective+inactivation+of+adenosine+A2A+receptors+protects+against+T+cell+infiltration+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52(2022).</li>
<li>Steffensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotransporter-mediated+water+transport+underlying+cerebrospinal+fluid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation.</a> Nature Communications. 9 (1), 2167(2018).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klotho+controls+the+brain-immune+system+interface+in+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Klotho controls the brain-immune system interface in the choroid plexus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (48), E11388-E11396 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+serotypes+of+adeno-associated+virus+vector-+and+lentivirus-mediated+tropism+in+choroid+plexus+by+intracerebroventricular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery.</a> Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).</li>
<li>Konsman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">The mouse brain in stereotaxic coordinates.</a> Psychoneuroendocrinology. 6 (28), 827-828 (2003).</li>
<li>Weaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elevated+matrix+metalloproteinase+%28MMP%29+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis+is+protective+by+affecting+Th1%2FTh2+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">An elevated matrix metalloproteinase (MMP) in an animal model of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization.</a> FASEB J. 19 (12), 1668-1670 (2005).</li>
<li>Kertser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroid+signaling+at+the+brain-immune+interface+impedes+coping+with+severe+psychological+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress.</a> Science Advances. 5 (5), 4111(2019).</li>
<li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li>
<li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Reboldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-C+chemokine+receptor+6-regulated+entry+of+TH-17+cells+into+the+CNS+through+the+choroid+plexus+is+required+for+the+initiation+of+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE.</a> Nature Immunology. 10 (5), 514-523 (2009).</li>
<li>Jovanova-Nesic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus+connexin+43+expression+and+gap+junction+flexibility+are+associated+with+clinical+features+of+acute+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus connexin 43 expression and gap junction flexibility are associated with clinical features of acute EAE.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1173, 75-82 (2009).</li>
<li>Jovanova-Nesic, K., Jovicic, S., Sovilj, M., Spector, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+brain+stimulation+upregulates+adhesion+and+prevents+Eae%3A+MMP-2%2C+ICAM-1%2C+and+VCAM-1+in+the+choroid+plexus+as+a+target%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Magnetic brain stimulation upregulates adhesion and prevents Eae: MMP-2, ICAM-1, and VCAM-1 in the choroid plexus as a target.</a> International Journal of Neuroscience. 119 (9), 1399-1418 (2009).</li>
<li>Mills, J. H., Alabanza, L. M., Mahamed, D. A., Bynoe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+adenosine+signaling+induces+CX3CL1+expression+in+the+brain+to+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Extracellular adenosine signaling induces CX3CL1 expression in the brain to promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 193(2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych ani innych ujawnień, które mogliby zadeklarować.

W badaniu przedstawiono dwa odrębne podejścia do ukierunkowanego knockdownu genów ChP. Pierwsze podejście polegało na wstrzyknięciu ICV CRE-TAT, który zawiera rekombinazę Cre, do myszy A2AR flox/flox. Drugie podejście polegało na wstrzyknięciu ICV AAV2/5 przenoszącego shRNA A2AR. Wykorzystując te dwie strategie, udało się osiągnąć selektywne wyłączenie A2AR w ChP i było w stanie wykazać ochronne działanie hamowania sygnalizacji A2AR w ChP na patologię EAE. Warto zauw...

Często uważano, że splot naczyniówkowy (ChP) pomaga utrzymać funkcjonalną homeostazę mózgu poprzez wydzielanie płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) i neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF)1,2. Coraz więcej badań w ciągu ostatnich trzech dekad wykazało, że ChP stanowi odrębną ścieżkę infiltracji komórek odpornościowych do ośrodkowego układu nerwowego (OUN).
Ścisłe połączenia (TJ) ChP, składające się z jednowarstwowego nabłonka ChP, utrzymują homeostazę immunologiczną, zapobiegając przedostawaniu się makrocząsteczek i komórek odpornościowych do mózgu3. Jednak w pewnych warunkach patologicznych tkanka ChP wykrywa i reaguje na wzorce molekularne związane z niebezpieczeństwem (DAMP) w płynie mózgowo-rdzeniowym i krwi, co prowadzi do nieprawidłowej infiltracji immunologicznej i dysfunkcji mózgu4,5. Pomimo swojej kluczowej roli, mały rozmiar ChP i unikalna lokalizacja w mózgu utrudniają badanie jego funkcji bez wpływu na inne obszary mózgu. Dlatego manipulowanie ekspresją genów specyficznie w ChP jest idealnym podejściem do zrozumienia jego funkcji.
Początkowo, transgeniczne linie enzymu rekombinacji cyklizacji (Cre), które wyrażają Cre pod kontrolą promotorów specyficznych dla genów wyrażanych w ChP, były powszechnie używane do usuwania docelowych genów poprzez krzyżowanie z floksowanymi genami kandydującymi6,7,8. Na przykład czynnik transkrypcyjny Forkhead box J1 (FoxJ1) ulega ekspresji wyłącznie w nabłonku ChP prenatalnej myszy brain7. Tak więc linia FoxJ1-Cre była często używana do usuwania genów zlokalizowanych w klasie ChP<sup="xref">6,9. Powodzenie tej strategii zależy jednak w dużej mierze od specyfiki promotora. Stopniowo odkryto, że wzorzec ekspresji FoxJ1 nie był wystarczająco charakterystyczny, ponieważ FoxJ1 był również obecny w rzęskowych komórkach nabłonkowych w innych częściach mózgu i układu obwodowego7. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, wykonano domózgowo-komorowe (ICV) wstrzyknięcie rekombinazy Cre w celu dostarczenia rekombinazy do komór floksowanych linii transgenicznych. Strategia ta wykazała wysoką swoistość, o czym świadczy obecność fluorescencji tdTomato wyłącznie w ChP tissue10,11. Jednak ta metoda jest nadal ograniczona przez dostępność floksowanych linii myszy transgenicznych. Aby rozwiązać ten problem, naukowcy zastosowali wstrzyknięcie ICV wirusa związanego z adenowirusem (AAV) w celu uzyskania specyficznego dla ChP knockdownu lub nadekspresji docelowych genów12,13. Kompleksowa ocena różnych serotypów AAV pod kątem zakażenia ChP wykazała, że AAV2/5 i AAV2/8 wykazują silne zdolności infekcyjne w ChP, nie infekując jednocześnie innych obszarów mózgu. Stwierdzono jednak, że AAV2/8 infekuje wyściółdza otaczające komory, podczas gdy grupa AAV2/5 nie wykazała infekcji14. Zaletą tej metody jest przezwyciężenie ograniczeń związanych z pozyskiwaniem zwierząt transgenicznych z floksami.
Ten artykuł opisuje krok po kroku protokół knockdownu genu w ChP przy użyciu dwóch metod: ICV AAV2/5 przenoszącego shRNA receptora adenozynyA 2A (A2AR) i białka rekombinazy Cre składającego się z sekwencji TAT (CRE-TAT) REKOMBINAZA w celu osiągnięcia specyficznego dla ChP knockdownu A2AR. Wyniki badania sugerują, że strącenie A2AR w ChP może złagodzić eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE). Ten szczegółowy protokół zawiera przydatne wskazówki dotyczące badań funkcji ChP i specyficznego knockdownu genów w ChP.

<table><tbody><tr><td>Myszy A2ARflox/flox</td><td>Państwowe Kluczowe Laboratorium Okulistyki, Optometrii i Nauk Wizualnych, Uniwersytet</td><td></td><td></td>Medyczny w Wenzhou</tr><tr><td>AAV2/5-A2AR-ShRNA</td><td>Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD</td><td>PT-4828</td><td></td></tr><tr><td>medium do montażu zapobiegającego blaknięciu</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>kapilara ze szkła borokrzemianowego</td><td>Beijing Meiyaxian Technology Co., Ltd</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>aparat stereotaktyczny mózgu</td><td>RWD, Shenzhen</td><td>69100</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 myszy</td><td>Pekin Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRE-TAT rekombinaza</td><td>Millipore</td><td>SCR508</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Absin</td><td>B25A031</td><td></td></tr><tr><td>krajalnica do mrożonek</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>H37Ra</td><td>Becton Dickinson and company</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td><td>Hamilton, amerykański</td><td>P/N:&nbsp; 86259</td><td></td></tr><tr><td>Niekompletny adiuwant Freundsa</td><td>Sigma</td><td>F5506</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM900</td><td></td></tr><tr><td>MOG35-55</td><td>Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD</td><td>4010006243</td><td></td></tr><tr><td>Klej OCT</td><td>Epredia</td><td>6502p</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Chengdu Kelong Chemical Reagent Company</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>pentobarbital sodowy</td><td>Boyun Biotech</td><td>PC13003</td><td></td></tr><tr><td>Pistolet do pipet</td><td>Eppendorf</td><td>N45014F</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy 1. nici cDNA</td><td>PrimeScript Takara</td><td>&nbsp; 6110A</td><td></td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdMyszy pomidorowe</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Sangon Biotech</td><td>A502792-0500</td><td></td></tr><tr><td>super szybki homogenizator</td><td>IKA</td><td>3737025</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>roztworze</td> <td>ksylenuFirma odczynników chemicznych Chengdu Kelong</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

celowy knockdown genów w splocie naczyniówkowym

Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus

Splot naczyniówkowy (ChP) służy jako krytyczna brama do infiltracji komórek odpornościowych do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. Ostatnie badania wykazały, że regulacja aktywności ChP może zapewnić ochronę przed zaburzeniami OUN. Jednak badanie biologicznej funkcji ChP bez wpływu na inne obszary mózgu jest trudne ze względu na jego delikatną strukturę. W pracy przedstawiono nowatorską metodę knockdownu genów w tkance ChP przy użyciu wirusów związanych z adenowirusami (AAV) lub białkiem rekombinazy enzymu rekombinacji cyklizacji (Cre) składającego się z sekwencji TAT (CRE-TAT). Wyniki pokazują, że po wstrzyknięciu AAV lub CRE-TAT do komory bocznej, fluorescencja była skoncentrowana wyłącznie w ChP. Stosując to podejście, badanie z powodzeniem obaliło receptor adenozyny A2A (A2AR) w ChP za pomocą interferencji RNA (RNAi) lub Cre/locus układów X-overP1 (Cre / LoxP) i wykazało, że ten knockdown może złagodzić patologię eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Technika ta może mieć ważne implikacje dla przyszłych badań nad rolą ChP w zaburzeniach OUN.

Wyciszenie A2AR specyficzne dla ChP poprzez wstrzyknięcie do komór mózgu (ICV) AAV2/5-shRNA lub CRE-TAT 
Rola A2AR w ChP jako silnego regulatora informacji neuronalnej w patogenezie EAE pozostaje niewyjaśniona. Wyciszenie specyficznej dla ChP ekspresji A2AR mogłoby rzucić światło na efekty regulacyjne A2AR w obrębie centralnego układu odpornościowego w EAE i innych stanach zapalnych układu nerwowego. W niniejszym badaniu zastosowano wstrzyknięcie ICV CRE-TAT...

Tutaj opisujemy metodę selektywnej zmiany ekspresji genów w splocie naczyniówkowym, unikając jednocześnie jakiegokolwiek wpływu na inne obszary mózgu.

Celowy knockdown genów w splocie naczyniówkowym

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and ...

Celem badań jest poznanie technik manipulowania ekspresją genów w splocie naczyniówkowym. W naszych badaniach wprowadzono dwie metody, które pozwalają na technikę wyłącznie w splocie naczyniówkowym bez zauważalnego wpływu na inne obszary. Nasze odkrycia mogą potencjalnie wzbogacić przyszłe badania funkcji splotu naczyniówkowego w neurobiologii.Nasze badania wykazały, że hamowanie infiltracji limfocytów T przez splot naczyniówkowy poprzez selektywne blokowanie adenozyny do receptora jest wystarczające, aby chronić myszy przed patologią EAE. Odkrycie to potwierdza pogląd, że wykrycie aktywności bramki w splocie naczyniówkowym może stanowić obiecującą nową strategię leczenia stwardnienia rozsianego. W pracy przedstawiono dwie alternatywne metody manipulacji ekspresją genów w splocie naczyniówkowym.Wstrzyknięcie ICV rekombinazy Cre do tych transgenicznych myszy lub wstrzyknięcie ICV AAV2 / 5 lub ukierunkowane SHI u myszy WT. Metody te rozwiązują problemy związane z promowaniem swoistości i transgenetycznej hodowli myszy. Na początek umieść znieczulone myszy na platformie chirurgicznej.Po przycięciu włosów nałóż maść na oczy na oba oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu. Następnie przymocuj myszy do aparatu stereotaktycznego w celu unieruchomienia. Wykonaj małe nacięcie pod mikroskopem, aby w pełni odsłonić czaszkę.Przygotuj dwie strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów, jedną zawierającą shRNA receptora AAV2/5 adenozyny 2A, a drugą zawierającą mieszankę AAV2/5. Następnie użyj mikroskopu, aby zlokalizować bregmę i lambdę i ustaw punkt współrzędnych na strzykawce o pojemności 10 mikrolitrów w oparciu o atlas stereotaktyczny mózgu myszy. Wywierć mały otwór w czaszce w ustalonym punkcie współrzędnych.Wstrzyknąć dwa mikrolitry wirusa shRNA receptora adenozyny 2A AAV2/5 do komory mózgu poprzez wstrzyknięcie boczne ze stałą szybkością 100 nanolitrów na minutę. Trzymać igłę na miejscu przez 10 minut przed pobraniem. Natychmiast uszczelnij zranioną skórę za pomocą medycznego kleju biofibrynowego, aby zapobiec utracie wirusa.Umieść mysz na poduszce grzewczej, utrzymując temperaturę ciała na poziomie około 37 stopni Celsjusza, aby ułatwić regenerację. Wstrzyknąć dwa mikrolitry rekombinazy CRE-TAT do każdej bocznej komory myszy pomidorowej Rosa-LDL-td dla grupy eksperymentalnej i dwa mikrolitry sterylnego PBS dla grupy kontrolnej. Dwa tygodnie po wstrzyknięciu rekombinazy CRE-TAT należy przygotować zamrożone skrawki tkanki, wykonać barwienie jądrowe i przygotować szkiełko do obrazowania.Osłabienie receptora adenozyny 2A w splocie naczyniówkowym u myszy z homozygotycznym receptorem adenozyny 2A za pomocą CRE-TAT doprowadziło do obniżenia wyników klinicznych EAE. Podobnie, powalenie splotu naczyniówkowego i receptora adenozyny 2A u myszy typu dzikiego za pomocą AAV2 / 5-shRNA zmniejszyło wyniki kliniczne EAE. Analiza QPCR wykazała, że poziomy mRNA receptora adenozyny 2A zmniejszyły się w grupach AAV2/5-shRNA i CRE-TAT w porównaniu z każdą kontrolą.Wyciszenie receptora adenozyno2A specyficznie w splocie naczyniówkowym zmniejszyło infiltrację komórek odpornościowych do rdzenia kręgowego.

targeted-knockdown-of-genes-in-the-choroid-plexus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego w siatkówce dorosłego danio-zebry, która polega na dokonywaniu iniekcji domięśniowych morfolino antysensownych oraz ich elektroporacji do siatkówki. W wyniku tego procesu ekspresja białka jest wyciszona przez kilka dni, co umożliwia zbadanie roli tego białka w regenerującej się lub nienaruszonej siatkówce.

In vivo elektroporacja morfolin do siatkówki dorosłego danio pręgowanego

W tym filmie demonstrujemy metodę przeprowadzania transdukcji wektorów lentiwirusowych shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown w unieśmiertelnionych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (iHSPC).

Knockdown genów za pośrednictwem RNA za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów w iHSPC in vitro: system ekspresji shRNA oparty na lentiwirusie dostarczany do iHSPC w celu wyeliminowania określonej ekspresji genów

Prezentujemy minimalnie inwazyjną technikę określaną jako elektroporacja strefy podkomorowej noworodka. Technika ta polega na wstrzyknięciu plazmidowego DNA do bocznych komór nowonarodzonych młodych i zastosowaniu prądu elektrycznego w celu dostarczenia i genetycznej manipulacji nerwowych komórek...

Elektroporacja strefy podkomorowej noworodka

W tym artykule demonstrujemy metodę manipulowania ekspresją genów w komórkach komorowych dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego za pomocą antysensownych oligonukleotydów morfolino. Przedstawiamy tę metodę jako skuteczny i szybki protokół, który można wykorzystać do badań funkcjonalnych w mózgu dorosłego kręgowca.

Mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej

Reporterowe linie komórkowe oferują sposób na wizualizację, śledzenie i izolowanie interesujących komórek z heterogenicznych populacji. Jednak celowanie w geny za pomocą konwencjonalnej rekombinacji homologicznej w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych jest wyjątkowo nieefektywne. W tym miejscu opisujemy celowanie w locus czynnika transkrypcyjnego PITX3 specyficznego dla OUN za pomocą EGFP przy użyciu rekombinacji homologicznej wzmocnionej nukleazą palca cynkowego.

Ukierunkowanie genów na nukleazę palca cynkowego w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Okołokomorowa heterotopia guzkowa (PNH) jest najczęstszą formą wady rozwojowej kory mózgowej (MCD) w wieku dorosłym, ale jej podłoże genetyczne pozostaje nieznane w większości sporadycznych przypadków. Niedawno opracowaliśmy strategię identyfikacji nowych genów kandydujących do MCD i bezpośredniego potwierdzenia ich przyczynowej roli in vivo.

Nowatorska strategia łącząca macierz CGH, sekwencjonowanie całego eksomu i elektroporację in utero u gryzoni w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za wady rozwojowe mózgu

Ten protokół dostarcza przepływ pracy, jak połączyć sztuczną interferencję RNA za pośrednictwem mikroRNA z optogenetyką, aby stymulować specyficznie presynaptyczne butony ze zmniejszoną ekspresją selektywnych genów w nienaruszonych obwodach neuronalnych.

Połączenie optogenetyki ze sztucznymi mikroRNA w celu scharakteryzowania wpływu knockdownu genów na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych

W obecnym badaniu, wyrażenie dwóch dalszych komponentów sygnalizacyjnych szlaku PINK, cytoprotekcyjnej kalcyneuryny i proapoptotycznego CHOP, za pomocą specyficznych shRNA. W przeciwny sposób modulują one podatność pierwotnych neuronów korowych na atrofię neurytów po indukcji stresu retikulum endoplazmatycznego.

Modulacja molekularna przez specyficzne shRNA dostarczane przez lentiwirusa w neuronach zestresowanych retikulum endoplazmatycznym

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do utraty funkcji, które polega na wprowadzeniu i genomowej integracji sztucznych sekwencji mikro-RNA w zarodkach piskląt za pomocą elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2. Technika ta zapewnia solidną i stabilną metodologię knockdownu genów do badań funkcji genów podczas rozwoju.

Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

Elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych zapewnia precyzyjne i skuteczne podejście do wprowadzania przejściowych modyfikacji genetycznych do różnych typów progenitorów i neuronów w systemie modelowym zbliżonym do rozwoju (pato)fizjologicznej kory nowej naczelnych. Pozwala to na badanie procesów neurorozwojowych i ewolucyjnych, a także może być stosowane do modelowania chorób.

Ukierunkowana mikroiniekcja i elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych w celu modyfikacji genetycznej

Tutaj prezentujemy ostrą manipulację genetyczną pokrojonych ludzkich organoidów korowych za pomocą elektroporacji. Te korowe modele organoidów są szczególnie podatne na wstrzykiwanie, ponieważ struktury podobne do komór można łatwo zidentyfikować po pokrojeniu, co umożliwia funkcjonalne badanie rozwoju kory mózgowej człowieka, zaburzeń neurorozwojowych i ewolucji kory mózgowej.

Elektroporacja pokrojonych w plasterki organoidów korowych człowieka do badań funkcji genów

Poznaj metody celowego knockdownu genów w splocie naczyniówkowym myszy przy użyciu wstrzyknięć ICV i wektorów AAV2/5. Techniki te umożliwiają badanie funkcji immunologicznej w chorobach neurologicznych.

Celowy knockdown genów w splocie naczyniówkowym

Przeglądaj więcej filmów