Celowy knockdown genów w splocie naczyniówkowym
16 czerwca 2023
Tutaj opisujemy metodę selektywnej zmiany ekspresji genów w splocie naczyniówkowym, unikając jednocześnie jakiegokolwiek wpływu na inne obszary mózgu.
Celem badań jest poznanie technik manipulowania ekspresją genów w splocie naczyniówkowym. W naszych badaniach wprowadzono dwie metody, które pozwalają na technikę wyłącznie w splocie naczyniówkowym bez zauważalnego wpływu na inne obszary. Nasze odkrycia mogą potencjalnie wzbogacić przyszłe badania funkcji splotu naczyniówkowego w neurobiologii.
Nasze badania wykazały, że hamowanie infiltracji limfocytów T przez splot naczyniówkowy poprzez selektywne blokowanie adenozyny do receptora jest wystarczające, aby chronić myszy przed patologią EAE. Odkrycie to potwierdza pogląd, że wykrycie aktywności bramki w splocie naczyniówkowym może stanowić obiecującą nową strategię leczenia stwardnienia rozsianego. W pracy przedstawiono dwie alternatywne metody manipulacji ekspresją genów w splocie naczyniówkowym.
Wstrzyknięcie ICV rekombinazy Cre do tych transgenicznych myszy lub wstrzyknięcie ICV AAV2 / 5 lub ukierunkowane SHI u myszy WT. Metody te rozwiązują problemy związane z promowaniem swoistości i transgenetycznej hodowli myszy. Na początek umieść znieczulone myszy na platformie chirurgicznej.
Po przycięciu włosów nałóż maść na oczy na oba oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu. Następnie przymocuj myszy do aparatu stereotaktycznego w celu unieruchomienia. Wykonaj małe nacięcie pod mikroskopem, aby w pełni odsłonić czaszkę.
Przygotuj dwie strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów, jedną zawierającą shRNA receptora AAV2/5 adenozyny 2A, a drugą zawierającą mieszankę AAV2/5. Następnie użyj mikroskopu, aby zlokalizować bregmę i lambdę i ustaw punkt współrzędnych na strzykawce o pojemności 10 mikrolitrów w oparciu o atlas stereotaktyczny mózgu myszy. Wywierć mały otwór w czaszce w ustalonym punkcie współrzędnych.
Wstrzyknąć dwa mikrolitry wirusa shRNA receptora adenozyny 2A AAV2/5 do komory mózgu poprzez wstrzyknięcie boczne ze stałą szybkością 100 nanolitrów na minutę. Trzymać igłę na miejscu przez 10 minut przed pobraniem. Natychmiast uszczelnij zranioną skórę za pomocą medycznego kleju biofibrynowego, aby zapobiec utracie wirusa.
Umieść mysz na poduszce grzewczej, utrzymując temperaturę ciała na poziomie około 37 stopni Celsjusza, aby ułatwić regenerację. Wstrzyknąć dwa mikrolitry rekombinazy CRE-TAT do każdej bocznej komory myszy pomidorowej Rosa-LDL-td dla grupy eksperymentalnej i dwa mikrolitry sterylnego PBS dla grupy kontrolnej. Dwa tygodnie po wstrzyknięciu rekombinazy CRE-TAT należy przygotować zamrożone skrawki tkanki, wykonać barwienie jądrowe i przygotować szkiełko do obrazowania.
Osłabienie receptora adenozyny 2A w splocie naczyniówkowym u myszy z homozygotycznym receptorem adenozyny 2A za pomocą CRE-TAT doprowadziło do obniżenia wyników klinicznych EAE. Podobnie, powalenie splotu naczyniówkowego i receptora adenozyny 2A u myszy typu dzikiego za pomocą AAV2 / 5-shRNA zmniejszyło wyniki kliniczne EAE. Analiza QPCR wykazała, że poziomy mRNA receptora adenozyny 2A zmniejszyły się w grupach AAV2/5-shRNA i CRE-TAT w porównaniu z każdą kontrolą.
Wyciszenie receptora adenozyno2A specyficznie w splocie naczyniówkowym zmniejszyło infiltrację komórek odpornościowych do rdzenia kręgowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje techniki selektywnej modyfikacji ekspresji genów w splotach naczyniowych nie wpływając na inne obszary mózgu. W pracy przedstawiono dwie metody manipulowania ekspresją genów specyficznie w tym regionie, co może dostarczyć wiedzy na temat jego funkcji oraz znaczenia dla chorób takich jak stwardnienie rozsiane.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Manipulacja ekspresją genów
- Badania nad stwardnieniem rozsianym
Wstęp
- Splot naczyniowy odgrywa kluczową rolę w homeostazie mózgu i odpowiedziach immunologicznych.
- Zrozumienie jego funkcji może dostarczyć cennych informacji na temat chorób neurologicznych.
- Poprzednie badania wskazują na jego udział w takich stanach jak patologia EAE.
- Specyficzne metody manipulacji genetycznej są niezbędne do prowadzenia ukierunkowanych badań.
Cel badania
- Zbadanie metod ukierunkowanej zmiany ekspresji genów w splotach naczyniówkowych.
- Opracowanie technik minimalizujących efekty poza docelowe w innych obszarach mózgu.
- Zbadanie potencjału terapeutycznego modulowania odpowiedzi odpornościowych w schorzeniach neurologicznych.
Zastosowane metody
- W badaniu wykorzystano iniekcje dokomorowe (ICV) w celu dostarczenia genów.
- Do oceny manipulacji genetycznej zastosowano modele mysie, w tym myszy transgeniczne oraz typu dzikiego.
- Kluczowe metody obejmowały wykorzystanie rekombinazy Cre oraz wektorów AAV2/5.
- Protokoły eksperymentalne obejmowały procedury chirurgiczne u znieczulonych myszy oraz następującą po nich analizę tkanek.
- Po zastosowaniu leczenia przeprowadzono analizę QPCR w celu oceny zmian w ekspresji genów.
Główne wyniki
- ukierunkowane wyciszenie receptora adenozyny 2A w splotach naczyniowych obniżyło wyniki kliniczne w modelach EAE.
- wyciszenie genu specyficznie zmniejszyło infiltrację komórek odpornościowych do rdzenia kręgowego.
- wyniki qPCR wykazały znaczną redukcję poziomów mRNA receptora adenozyny 2A.
- obie metody z sukcesem wykazały specyficzność w manipulacji genetycznej.
Wnioski
- Niniejsze badanie wykazuje, że specyficzna manipulacja ekspresją genów w splotach naczyniowych może wpływać na odpowiedzi immunologiczne w chorobach neurologicznych.
- Wyniki sugerują potencjalną nową strategię terapeutyczną w leczeniu schorzeń takich jak stwardnienie rozsiane.
- Praca ta pogłębia zrozumienie regulacji odpornościowej w obrębie ośrodkowego układu nerwowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Selektywne wyciszanie genów w splotach naczyniowych (ChP) umożliwia precyzyjne badanie mechanizmów immunologicznych bram wejściowych do OUN, rozwiązując kluczowy problem walidacji celów w neuroimmunologii. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w zakresie oddziaływania na cel oraz minimalizuje ryzyko mechanistyczne we wczesnych etapach opracowywania terapii zaburzeń OUN. Metoda ta wspiera decyzje portfelowe, umożliwiając funkcjonalne badania roli genów specyficznych dla ChP bez wpływu czynników zakłócających pochodzących z innych obszarów mózgu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia walidację funkcjonalną celów specyficznych dla ChP zaangażowanych w regulację odporności w OUN.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację funkcji genu w obrębie istotnej dla danej choroby bariery OUN.
- Ułatwia badanie opartych na hipotezach dróg infiltracji komórek odpornościowych w modelach neurostanów zapalnych.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Zapewnia zwalidowany system do ilościowego określania efektów wyciszania genów w procesie ruchu komórek odpornościowych.
- Umożliwia powtarzalny pomiar poziomów mRNA oraz fenotypów klinicznych po przeprowadzonej interwencji.
- Wspiera standaryzację analiz dla późniejszego screeningu związków celujących w szlaki zależne od ChP.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z istotnymi dla przebiegu choroby modelami neurozapalenia, takimi jak EAE, co umożliwia opracowanie biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość procesu – od manipulacji genetycznych po przedkliniczne odczyty skuteczności w zakresie modulacji odporności OUN.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój hipotez terapeutycznych celowanych w ChP.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda wyciszania genów łączy etap wczesnego odkrywania z walidacją przedkliniczną w odniesieniu do celów immunologicznych w OUN.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wnikania komórek odpornościowych za pośrednictwem ChP oraz funkcji celu.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych wyników mRNA i wyników klinicznych do analizy porównawczej.
- Analityka: Umożliwia pomiar wyciszania genów i punktów końcowych infiltracji immunologicznej w oparciu o QPCR.
- Badania translacyjne: Łączy badania mechanistyczne z istotnymi dla choroby modelami przedklinicznymi neurostanów zapalnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do modulacji genów celowanych w ChP w różnych wskazaniach dotyczących OUN.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów ChP i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad układem odpornościowym OUN.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowany, powtarzalny wyciszanie genów przy minimalnych efektach poza docelowych.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu programów ukierunkowanych na ChP i optymalizuje alokację zasobów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów modulujących odporność OUN z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w przeprowadzaniu chirurgii stereotaksycznej oraz dostarczaniu genów do ośrodkowego układu nerwowego (CNS).
- Konieczny jest dostęp do produkcji wektorów AAV lub odczynników rekombinazy Cre oraz analityki QPCR.
- Niezbędna jest standaryzacja współrzędnych iniekcji i przetwarzania tkanek pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja dla różnych szczepów myszy lub modeli chorób CNS.
- Potencjalne ograniczenia obejmują wydajność dostarczania oraz zmienność w wyciszaniu genów pomiędzy osobnikami.
