Name: Szybka ocena cytotoksyczności in vitro receptora antygenu chimerycznego z ekspresją Jurkata przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj metodę szybkiego przesiewania konstruktów CAR z wykorzystaniem komórek Jurkata i obrazowania fluorescencyjnego. Protokół umożliwia ilościową ocenę cytotoksyczności w formacie 96-well, przyspieszając optymalizację terapii komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

MDA-MB-231 były miłym prezentem od Dr. Shane'a Steckleina. Autorzy potwierdzają finansowanie z University of Kansas Cancer Center na przeprowadzenie tych badań.

UWAGA: Wszystkie prace związane z hodowlą komórkową są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, w fartuchu laboratoryjnym, rękawicach i zgodnie ze standardowymi technikami aseptycznymi.
1. Generowanie CAR wyrażającego Jurkats (CAR-J)
<ol>
	<li>Kup komórki Jurkat, klon E6-1 od ATCC. Rozmrozić 1 x 106 komórek w kolbie T-75 i wyhodować je w kolbach T-75. Utrzymuj je w zawiesinie na poziomie 0,6 x 106 komórek na ml, używając pożywek Roswell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnionych 10% FBS w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Płytka 1 x 105 komórek Jurkat na studzienkę hodowli tkankowej poddanej działaniu 24-dołkowej płytki w 500 μl pożywki wzrostowej RPMI zawierającej 4 μg/ml polibrenu, co zwiększa wydajność lentiwirusa. Zliczanie komórek za pomocą laboratoryjnego analizatora komórek z detekcją fluorescencyjną na bazie lasera. Liczba odwiertów zależy od liczby konstrukcji, które mają być oceniane. W tym przykładzie zostaną użyte 4 konstrukcje i kontrolka nietransdukowana. Obliczenia konstrukcji CAR przedstawiono w tabeli 1.</li>
	<li>Dodać 10 μl lentiwirusa/studzienki z każdego konstruktu CAR. Projekt konstrukcji CAR i produkcja lentiwirusa zostały wykonane zgodnie z wcześniejszym opisem12.</li>
	<li>Następnego dnia dodać 1 ml pożywki wzrostowej RPMI do każdej studzienki i kontynuować hodowlę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Zbierz komórki 2 dni później (łącznie 72 godziny po transdukcji Jurkata) i policz je.</li>
	<li>Weź 1 x 104 komórki do przepływu bieżącego, aby potwierdzić ekspresję CAR na komórkach Jurkata. Krótko mówiąc, przemyj komórki 2x roztworem barwiącym FACS (FSS) przed oznaczeniem CAR-J przeciwciałami skierowanymi do znacznika Flag używanego do wykrywania dodatniego wyniku CAR przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C. Przemyj 2x ponownie FSS i przepuść komórki przez cytometr przepływowy, jak wcześniej opisano12. Stężenie przeciwciał należy stosować zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Komórki Jurkata są łatwe do transdukcji i prawie zawsze wykazują >90% ekspresji CAR. Wyprodukować CAR-J na długo przed testem cytotoksyczności w kokulturze i zamrozić do późniejszego wykorzystania.</li>
</ol>
2. Posiewanie komórek nowotworowych oznaczonych znakiem CFSE
UWAGA: KOMÓRKI MDA-MB-231 (od ATCC, HTB-26) były prezentem od współpracownika, a komórki EGFR KO MDA-MB-231 zostały stworzone zgodnie z wcześniejszym opisem12.
<ol>
	<li>Rozmrozić 1 x 106 komórek w kolbie T-75 i wyhodować je w kolbach T-75. Utrzymuj komórki nowotworowe MDA-MB-231 i komórki nowotworowe CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 w 14 ml zmodyfikowanego podłoża orła (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i podzielone, gdy około 70% zlewa się.</li>
	<li>Obserwuj przylegające komórki nowotworowe pod zwykłym mikroskopem jasnego pola, aby zapewnić prawie 70% zbieżność.</li>
	<li>Usunąć pożywkę wzrostową z kolby za pomocą pipety serologicznej. Dodać 3 ml trypsyny do kolby T75 i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 3-5 minut w celu odłączenia komórek od kolby.</li>
	<li>Zneutralizuj trypsynę za pomocą równej ilości (3 ml) pożywki wzrostowej. Zebrać zawiesinę komórek do probówki wirówkowej i wirować komórki w temperaturze 400 x g przez 4 minuty, aby rozpruć komórki.</li>
	<li>Odrzucić supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić komórki w 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Określ stężenie komórek za pomocą licznika komórek.</li>
	<li>Przenieś 8 x 105 komórek do innej probówki o pojemności 15 ml i dodaj PBS, aby uzyskać objętość 1 ml.</li>
	<li>Dodać 2 μl estru sukcynimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE; stężenie podstawowe 5 μM) do każdej probówki i dobrze wymieszać za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Inkubować komórki z CFSE przez 20 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Po 20 minutach wyjmij probówki z inkubatora i dodaj do probówki 5 ml pożywki wzrostowej.</li>
	<li>Odwirować probówki o masie 400 x g przez 4 minuty, aby rozdrobnić komórki oznaczone CFSE. Odrzucić supernatant za pomocą pipety i dodać 1 ml świeżej pożywki w celu ponownego zawieszenia komórek.</li>
	<li>Ponownie oceń stężenie komórek za pomocą licznika komórek. Przenieś 4 x 105 komórek do zbiornika na odczynnik o pojemności 25 ml i dodaj pożywkę o łącznej objętości 8 ml.
	<ol>
		<li>Aby zapewnić objętość wystarczającą do wysiewu 5000 komórek nowotworowych/studzienki w 100 μl pożywki, objętość potrzebną do pipetowania za pomocą pipety wielokanałowej, a w celu skompensowania utraty kilku komórek w kroku 1.7 należy przygotować 10%-20% dodatkowych komórek i objętości pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesinę komórkową należy dokładnie wymieszać za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Używając pipety wielokanałowej o pojemności 100 μl, odpipetuj 100 μl zawiesiny komórek do każdego rzędu przezroczystej, czarnej 96-dołkowej płytki z płaskim dnem po lewej połowie. Przykładową strategię powlekania można znaleźć w tabeli 2.</li>
	<li>Pipetować komórki EGFR KO podobnie na prawej połowie płytki. Po pokryciu całej płytki przeciągnij płytkę do przodu i do tyłu oraz na boki na platformę okapu do hodowli tkankowych, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek nowotworowych w studzienkach.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 4 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w celu przyłączenia komórek nowotworowych.</li>
</ol>
3. Współhodowla CAR wyrażająca Jurkats z komórkami nowotworowymi znakowanymi CFSE
<ol>
	<li>Korzystając z liczby nietransdukowanych i eksprymujących CAR komórek Jurkat, przenieś 4 x 105 komórek każdego CAR-J do zbiornika o pojemności 25 ml. Dodaj pożywkę wzrostową DMEM o całkowitej objętości 2 ml.</li>
	<li>W przypadku E:T 4:1, 2 x 104 CAR-J dodano na studzienkę w 100 μl pożywki za pomocą wielokanałowej pipety delikatnie wzdłuż boku każdej studzienki, aby nie naruszyć dołączonych komórek nowotworowych.</li>
	<li>Dodaj kolejne 100 μl pożywki wzrostowej za pomocą pipety wielokanałowej do boku studzienek zawierających komórki nowotworowe i komórki Jurkata. Grupy nowotworowe otrzymują tylko 200 μl pożywki, co daje w sumie 300 μl pożywki we wszystkich studzienkach.</li>
	<li>Przeciągnij płytkę wzdłuż platformy w przód iw tył oraz w ruch na boki, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek Jurkata na komórkach nowotworowych.</li>
	<li>Pozostawić hodowlę CO w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48 godzin.</li>
</ol>
4. Przygotowanie płytki do obrazowania
<ol>
	<li>Sporządzić roztwór jodku propydyny (PI) w stężeniu 1 μg/ml w pożywce fluorescencyjnej o niskim tle, w oparciu o liczbę studzienek, z których każda otrzymuje 100 μl pożywki.</li>
	<li>Na 84 dołki przygotuj 9 ml pożywki zawierającej PI. Dokładnie wymieszaj podłoże za pomocą pipety.</li>
	<li>Przygotować 10 ml 20% roztworu Triton-X, rozcieńczając Triton-X wodą dejonizowaną. Po 48 godzinach hodowli ko-zasypowej odrzucić supernatant zawierający CAR-J poprzez pojedyncze odwrócenie płytki i postukanie w ręcznik papierowy.</li>
	<li>Następnie delikatnie dodać 100 μl wyżej przygotowanej pożywki (krok 4.2) zawierającej PI do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej, aby nie naruszyć przylegających komórek nowotworowych.</li>
	<li>Dodaj 20 μl 20% roztworu Triton-X do pierwszego dołka każdego typu nowotworu, który działa jako całkowita martwa kontrola.</li>
	<li>Pozostawić płytkę w inkubatorze na 20 minut. Zobrazować płytkę za pomocą cytometru do obrazowania fluorescencyjnego. Dane są przechowywane na komputerze i mogą być analizowane w późniejszym czasie.</li>
</ol>
5. Analiza obrazów fluorescencyjnych
<ol>
	<li>Użyj tylko jednej z komórek guza, aby ustawić zielony kanał fluorescencyjny.</li>
	<li>Zmniejsz maskę studzienki do 98%, aby usunąć komórki na krawędzi studzienki, ponieważ sygnał nie jest idealny na krawędzi.</li>
	<li>Zidentyfikuj komórki nowotworowe znakowane CFSE na zielonym, fluorescencyjnym kanale CFSE. Zmodyfikuj wartość progową intensywności fluorescencji, aby zebrać wszystkie komórki w studzience.</li>
	<li>Ustaw minimalną średnicę kuwety na 25 μm, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia wykryte na kanale CFSE. Różni się to w zależności od typu analizowanej komórki.</li>
	<li>Włącz opcję Oddzielne dotykające się obiekty, aby identyfikować poszczególne komórki, gdy się ze sobą stykają.</li>
	<li>Wybierz CFSE na wyświetlaczu obrazu i spójrz na nakładkę graficzną, aby dowiedzieć się, co jest wybierane przez system.</li>
	<li>Gdy komórki oznaczone CFSE są prawidłowo pobierane, ustaw bramki, aby zdefiniować populację żywych i martwych komórek.</li>
	<li>Wybierając komórki oznaczone CFSE, wygeneruj histogram zliczeń na osi y w funkcji średniej intensywności PI na osi x.</li>
	<li>Opierając się na studzince, w której dodaliśmy Triton-X (krok 4.5), narysuj rozdzielacz, aby odróżnić komórki o niskiej i wysokiej liczbie PI. Ta studnia powinna mieć większość komórek w regionie o wysokim poziomie PI. 
	UWAGA: PI pokazuje sygnał podstawowy na żywych komórkach. W związku z tym dodanie Triton-X zabija wszystkie komórki i barwią się one na jasno w czerwonym kanale fluorescencyjnym. Ułatwia to rysowanie bramek w celu oddzielenia martwych komórek od żywych komórek.</li>
	<li>Dostosuj wartość osi x, aby lepiej wyświetlać komórki. Teraz oznacz komórki o niskiej liczbie PI jako żywe komórki.</li>
	<li>Wybierając Aktywne komórki, ustaw kolejny histogram z obszarem na osi x i zliczeniami na osi y.</li>
	<li>Narysuj kolejny rozdzielacz, używając guza tylko do wychwytywania komórek, a nie gruzu. Studnie poddane działaniu Jurkata zaczną gromadzić zanieczyszczenia, które zostaną poplamione CFSE i będą musiały zostać usunięte z liczenia. Pozostałe odpadki są oznaczone jako "Duże komórki".</li>
	<li>Uruchom analizę na całej płycie i wyeksportuj arkusz kalkulacyjny zawierający liczby.</li>
	<li>Wykreśl duże liczby, aby określić liczbę żywych komórek nowotworowych znakowanych CFSE, które pozostały w studni po ekspozycji na CAR-J. Określanie statystyk przy użyciu jednokierunkowej usługi ANOVA.</li>
</ol>

Evaluating Quantitative Tumor Cell Killing by CAR-Expressing Jurkat Cells

<ol><li>Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bench+to+bedside%3A+the+history+and+progress+of+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy.</a> Front Immunol. 14, 1188049(2023).</li>
<li>Labanieh, L., Mackall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+immune+cells%3A+design+principles%2C+resistance+and+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation.</a> Nature. 614, 635-648 (2023).</li>
<li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+therapy%3A+current+limitations+and+potential+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+J%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).</li>
<li>Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLisby%2C+AN+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. 167, Academic Press. 81-98 (2022).</li>
<li>Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+assays+to+measure+CAR+T-cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).</li>
<li>Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+EBV-genome+negative+%26%2334%3Bnull%26%2334%3B+and+%26%2334%3BT%26%2334%3B+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of EBV-genome negative &#34;null&#34; and &#34;T&#34; cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).</li>
<li>Abraham, R. T., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jurkat+T+cells+and+development+of+the+T-cell+receptor+signalling+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm.</a> Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).</li>
<li>Bloemberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+characterizing+novel+chimeric+antigen+receptors+in+Jurkat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).</li>
<li>Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+tumor+antigen-specific+single-chain+variable+fragments+using+a+chimeric+antigen+receptor+bicistronic+retroviral+vector+in+a+Mammalian+screening+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol.</a> Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).</li>
<li>Alonso-Camino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CARbodies%3A+Human+antibodies+against+cell+surface+tumor+antigens+selected+from+repertoires+displayed+on+T+cell+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93(2013).</li>
<li>Jahan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Jurkat+reporter+T+cell+line+for+evaluating+the+functionality+of+novel+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors.</a> Front Mol Med. 3, 1070384(2023).</li>
<li>Subham, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+as+a+potent+CAR+T+target+in+triple+negative+breast+cancer+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases.</a> Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).</li>
<li>Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D. Jr, Maus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+Design+of+Chimeric+Antigen+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).</li>
<li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Vaccines%22%5BJournal%5D)">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).</li>
<li>Shan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+PTEN+in+Jurkat+T+cells+causes+constitutive+localization+of+Itk+to+the+plasma+membrane+and+hyperresponsiveness+to+CD3+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation.</a> Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).</li>
<li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+signaling+roles+of+CD3%CE%B5+and+its+application+in+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy.</a> Cell. 182 (4), 855-871 (2020).</li>
<li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma-targeted+CD4%2B+CAR+T+cells+mediate+superior+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity.</a> JCI Insight. 3 (10), e99048(2018).</li>
<li>Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screening+assay+to+identify+agents+that+enhance+T-cell+recognition+of+human+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas.</a> Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).</li>
<li>Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+media+for+fluorescence+imaging%3A+Striking+the+right+balance+between+signal+strength+and+long-term+cell+health%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic+Engineer+Biotech+News%22%5BJournal%5D)">Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health.</a> Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).</li>
<li>Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis. , 	https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023).</li>
<li>Kessel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+3D+tumor+spheroid+screening+method+for+cancer+drug+discovery+using+celigo+image+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Technol%22%5BJournal%5D)">High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry.</a> SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj zaproponowaliśmy szybką metodę skutecznej oceny specyficznej dla celu aktywności cytolitycznej indukowanej ekspresją CAR w komórkach Jurkat. Wszystkie konstrukty CAR mają ten sam scFv, ale różne domeny zawiasowe i transbłonowe, które, jak wykazano, wpływają na siłę działania komórek CAR-T13. Dalsza ocena nieswoistego zabijania przez te CAR-J została przeprowadzona poprzez hodowlę ich za pomocą komórek z nokautem antygenowym (KO). Pokazuje to, że zabijanie jest specyficzne dla antygenu nowotw...

Terapia komórkowa CAR-T okazała się bardzo obiecująca w przypadku nowotworów hematologicznych, co widać po 6 zatwierdzonych przez FDA produktach CAR-T od 2017 roku, jak donosi National Cancer Institute1. W badaniach klinicznych prowadzonych jest wiele komórek CAR-T przeznaczonych do zwalczania guzów litych. Opracowanie nowatorskich celów CAR i optymalizacja konstrukcji CAR ma zasadnicze znaczenie dla skuteczności ogniwa CAR-T. Wybór idealnej konstrukcji CAR dla każdego zastosowania jest niezbędny do dokładnego celowania w antygeny związane z nowotworem (TAA) przy jednoczesnym unikaniu niskich poziomów ekspresji TAA w normalnych tkankach2.
Konstrukt CAR składa się głównie z pięciu przedziałów: (1) zewnątrzkomórkowej domeny jednołańcuchowej zmiennej fragmentu (scFv) ukierunkowanej na antygen nowotworowy; (2) domena zawiasów; (3) domena transbłonowa; (4) wewnątrzkomórkowa domena kostymulująca cytoplazmatycznych komórek T; oraz (5) domena sygnalizacji. Modyfikacja każdej z tych domen wpływa na precyzję interakcji komórki CAR-T z komórką docelową3. W związku z tym ocena cytotoksyczności i reaktywności krzyżowej tych konstruktów CAR in vitro ma kluczowe znaczenie dla wyboru odpowiedniego konstruktu do przejścia do eksperymentów in vivo. Obecne metody oceny cytolizy przez limfocyty T obejmują test uwalniania 51Cr, test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej, test obrazowania bioluminescencyjnego, analizę komórek w czasie rzeczywistym opartą na impedancji oraz test cytometrii przepływowej opartej na komórkach4,5. Opisana tutaj platforma oparta na obrazowaniu fluorescencyjnym identyfikuje liczbę żywych i martwych komórek, co jest bezpośrednią kwantyfikacją cytolizy limfocytów T, w przeciwieństwie do pośredniej metody oceny cytolizy przez limfocyty T.
Oto prosta, opłacalna, szybka i wysokoprzepustowa technika z minimalną interwencją do oceny cytotoksyczności komórek Jurkat wyrażających receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) CAR przeciwko potrójnie ujemnym komórkom raka piersi (TNBC) MDA-MB-231 i EGFR CRISPR nokautują komórki MDA-MB-231. Komórki Jurkat to unieśmiertelnione ludzkie limfocyty T6, które są szeroko stosowane do badania aktywacji limfocytów T i mechanizmów sygnalizacji7. Ponadto komórki Jurkat zostały wykorzystane do testów CAR in vitro w wielu badaniach8,9,10,11. Komórki Jurkata są łatwo transdukowane przez lentiwirusa i mają trwałą proliferację, a system ten został wykorzystany do optymalizacji domeny zawiasów różnych konstruktów EGFR CAR.
Ten test może być używany do badania przesiewowego wielu konstruktów CAR ukierunkowanych na różne antygeny nowotworowe i używany przeciwko wielu przylegającym liniom komórek nowotworowych oraz w różnych proporcjach efektorowych do guza (E:T). Dodatkowo, można ocenić wiele punktów czasowych, a liczbę powtórzeń można zmodyfikować w celu zidentyfikowania najlepszego zabijania spośród różnych konstrukcji CAR. Najlepsze konstrukty muszą zostać potwierdzone przy użyciu limfocytów T CD3 pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Ogólnym celem opracowania tej metody jest szybka optymalizacja geometrii zawiasów CAR w sposób wysokoprzepustowy, pokonując bariery, takie jak niska wydajność transdukcji, a następnie potwierdzenie w limfocytach T pochodzących z PBMC.

<table><tbody><tr><td>Probówka stożkowa 15 ml (sterylna)</td> <td>Midwest Scientific</td><td>#C15B</td><td>Każda podobna będzie działać</td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 50 ml (sterylna)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td>Każda podobna będzie działać</td></tr><tr><td>/przezroczysta płytka 96-dołkowa</td><td>Falcon</td><td>353219</td><td>Celligo posiada listę kompatybilnych płytek</td></tr><tr><td>Celigo 4-kanałowe obrazowanie Cytomenter</td><td>Nexcelcom Bioscience</td><td>200-BFFL-5C</td><td>Dowolny podobny będzie działać</td></tr><tr><td>Celigo Software</td><td>Nexcelcom Bioscience</td><td>Wersja 5.3.0.0</td><td>Każdy podobny będzie działał</td></tr><tr><td>Inkubator Kultur Komórkowych</td><td>Thermo Scientific</td><td>HeraCell 160i</td><td>Każdy podobny będzie działał</td></tr><tr><td>Kolby poddane hodowli komórkowej (T75, różne rozmiary, sterylne)</td><td>TPP</td><td>90076</td><td>Każdy podobny będzie działał</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Tonbo</td><td>13-0850-U500</td><td>Każdy podobny będzie działał</td></tr><tr><td>Cytek Muse Cell Analyzer</td><td>Cytek</td><td>0500-3115</td><td>Każdy podobny będzie działał</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-040</td><td>Każdy podobny będzie działał</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini bio-products</td><td>900-108</td><td>Każdy podobny będzie działał</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>Cytek, BD itp</td><td>Aurora, LSR II, itp</td><td>Każdy podobny będzie działał</td></tr><tr><td>FlowJo Sortware</td><td>Becton Dickinson & Firma&nbsp;</td><td>Wersja 10.7.1</td><td>Każdy podobny będzie działał</td></tr><tr><td>Fluorobrite DMEM</td><td>Gibco</td><td>A18967-01</td><td>Każdy podobny będzie działał</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td>GraphPad</td><td>GraphPad Wersja 9.3.1 (471)</td><td>Każdy podobny będzie działał</td></tr><tr><td>Multichanel Pipette</td><td>Thermo</td><td>Scientific Finnpipette F2</td><td>Każdy podobny będzie działać</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td>Każdy podobny będzie działać</td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>Każdy podobny będzie działać</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (sterylne, filtrowane, 1 mL, różne rozmiary)</td><td>Pr1ma</td><td>PR-1250RK-FL, itp</td><td>Każde podobne będą działać</td></tr><tr><td>Pipetory&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>Finnpipette F2</td><td>Każdy podobny będzie działał</td></tr><tr><td>Propidium Jodek</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td>Każdy podobny będzie działał</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-041-cv</td><td>Każdy podobny będzie działał</td></tr><tr><td>Serological Pipette Aid</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-105</td><td>Każdy podobny będzie działał</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne (sterylne, różne rozmiary)</td><td>Pr1ma</td><td>PR-SERO-25, itp</td><td>Każdy podobny będzie działał</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td>Każdy podobny będzie działał</td></tr><tr><td>Sterylne zbiorniki</td><td>Midwest Scientific</td><td>RESE-2000</td><td>Każdy podobny będzie działał</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Każdy podobny będzie działać</td></tr></tbody></table>

szybka ocena cytotoksyczności in vitro receptora antygenu chimerycznego z ekspresją jurkata przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego

Rapid In Vitro Cytotoxicity Evaluation of Jurkat Expressing Chimeric Antigen Receptor using Fluorescent Imaging

Limfocyty T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) znajdują się w czołówce onkologii. CAR jest zbudowany z domeny docelowej (zwykle pojedynczego fragmentu zmiennej łańcucha, scFv) z towarzyszącym łącznikiem wewnątrzłańcuchowym, po którym następuje domena zawiasowa, transbłonowa i kostymulująca. Modyfikacja linkera wewnątrzłańcuchowego i domeny zawiasów może mieć znaczący wpływ na zabijanie za pośrednictwem CAR. Biorąc pod uwagę wiele różnych opcji dla każdej części konstrukcji CAR, istnieje duża liczba permutacji. Wytwarzanie ogniw CAR-T jest czasochłonnym i kosztownym procesem, a wytwarzanie i testowanie wielu konstrukcji to duża inwestycja czasowa i materiałowa. Protokół ten opisuje platformę do szybkiej oceny zoptymalizowanych pod kątem zawiasów konstrukcji CAR w komórkach Jurkata (CAR-J). Komórki Jurkat to unieśmiertelniona linia limfocytów T o wysokim wychwycie lentiwirusa, pozwalająca na wydajną transdukcję CAR. W tym miejscu przedstawiamy platformę do szybkiej oceny CAR-J za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, a następnie potwierdzenia cytolizy w limfocytach T pochodzących z PBMC.

W ciągu 72 h oceniono zakres stosunku E:T od 1:8 do 8:1 dla CAR-J1 nakierowanego na EGFR w komórkach TNBC MDA-MB-231. Komórki Jurkat przetransdukowano lentiwirusem CAR z dodatkiem polybrenu w celu wytworzenia komórek CAR-J, zgodnie z opisem w kroku 2. Cytotoksyczność CAR-J1 istotnie wzrosła przy wyższym stosunku E:T, przy czym nie stwierdzono różnic w aktywności cytotoksycznej przy stosunku 1:8 (Rycina 1). Obserwowano ponad 50% śmiertelności przy stosunku E:T 4:1 w ciągu 72 h. Ten stosunek E...

Protokół do oceny ilościowego zabijania komórek nowotworowych przez komórki Jurkata wyrażające chimeryczny receptor antygenowy (CAR) ukierunkowany na pojedynczy antygen nowotworowy. Protokół ten może być wykorzystany jako platforma przesiewowa do szybkiej optymalizacji konstrukcji zawiasów CAR przed potwierdzeniem w limfocytach T pochodzących z krwi obwodowej.

Szybka ocena cytotoksyczności in vitro receptora antygenu chimerycznego z ekspresją Jurkata przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego

Chimeric antigen receptor (CAR) T cells are at the forefront of oncology. A CAR is constructed of a targeting domain (usually a single chain variable ...

Limfocyty CAR T są stale ulepszane, aby osiągnąć lepsze odpowiedzi w badaniach klinicznych na ludziach. Szukamy sposobów oceny tego w naszym laboratorium przy użyciu bezstronnej metody o wysokiej przepustowości, takiej jak wykorzystanie obrazowania fluorescencyjnego do badań przesiewowych, które działają najlepiej. Istnieje kilka kombinacji konstruktów, które można zaprojektować dla dowolnego fragmentu zmiennej z pojedynczym łańcuchem, modyfikując geometrię domen zewnątrzkomórkowych i zawiasowych.Zaprojektowaliśmy ten protokół, aby zidentyfikować kombinacje o najlepszej skuteczności w eliminowaniu komórek docelowych za pomocą komórek Jurkat. Jest to szybki, wysokoprzepustowy protokół do badań przesiewowych konstruktów CAR w oparciu o cytotoksyczność komórek docelowych przy użyciu komórek Jurkat, które, po walidacji z konwencjonalnymi limfocytami T, kilkanaście różnych konstruktów CAR można jednocześnie testować na 96-dołkowej płytce przy użyciu tej techniki. Tutaj, w laboratorium Akhavan, określamy ilościowo w liczbach bezwzględnych bezpośrednie cytotoksyczności komórek docelowych przez komórki Jurkat eksprymujące CAR w sposób wysokoprzepustowy, aby przebadać wiele konstruktów CAR.

rapid-vitro-cytotoxicity-evaluation-jurkat-expressing-chimeric

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisujemy protokół monitorowania ruchliwości radialnej nieprzylegających komórek odpornościowych in vitro za pomocą kolektora sedymentacyjnego/suwaka komórkowego. Migracja komórek jest śledzona na monowarstwach komórek nowotworowych lub na białkach macierzy zewnątrzkomórkowej. Badanie za pomocą mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej pozwala na obserwację ruchliwości komórek i funkcjonalności cytotoksycznej.

Ruchliwość promieniowa i funkcja cytotoksyczna retrowirusowych limfocytów T transdukowanych wektorem replikującym, nieadherentnych alloreagujących limfocytów T

Tutaj prezentujemy metodę cytometrii przepływowej opartej na komórkach do wykrywania przeciwciał neutralizujących lub innych czynników, które zakłócają pobieranie przez komórkę enzymatycznych terapii zastępczych w ludzkiej matrycy, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) lub ludzka surowica.

Wykrywanie przeciwciał, które neutralizują wychwyt komórkowy enzymatycznych terapii zastępczych za pomocą testu komórkowego

Prezentujemy proces inżynierii genomu do generowania nowych modeli in vitro dla zakażenia HIV-1, które podsumowują integrację prowirusową w wybranych miejscach genomu. Ukierunkowanie na osoby zgłaszające pochodzące od wirusa HIV jest ułatwione dzięki manipulacji genomem specyficznej dla danego miejsca za pośrednictwem CRISPR-Cas9. Dostępne są szczegółowe protokoły generowania klonów pojedynczych komórek, badań przesiewowych i weryfikacji prawidłowego celowania.

Inżynieria genomu oparta na CRISPR-Cas9 do generowania modeli reporterowych Jurkat dla zakażenia HIV-1 z wybranymi miejscami integracji prowirusa

Opisujemy ilościowy system testów cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym, aby ocenić siłę działania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenu ukierunkowanych na płynne i lite komórki nowotworowe. Protokół ten można rozszerzyć w celu oceny innych komórek efektorowych układu odpornościowego, a także leczenia skojarzonego.

Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

Tutaj opisujemy metodę wspólnej hodowli in vitro do rekurencyjnego wyzwania limfocytów T ukierunkowanych na nowotwór, co pozwala na fenotypową i funkcjonalną analizę aktywności przeciwnowotworowych limfocytów T.

Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego

Ten protokół obrazuje zarówno powstawanie synaps immunologicznych, jak i późniejszy spolaryzowany ruch wydzielniczy w kierunku synapsy immunologicznej. Koniugaty komórkowe utworzono między komórką Raji impulsową superantygenem (działającą jako komórka prezentująca antygen) a klonem Jurkat (działającym jako limfocyt T wspomagający efektor).

Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej

Ten protokół opisuje metodologię nieinwazyjnego śledzenia limfocytów T genetycznie zmodyfikowanych do ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych in vivo za pomocą klinicznie dostępnej platformy.

Dynamiczne obrazowanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej [18F] tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Ten protokół zapewnia zstandaryzowany in vitro przepływ pracy dla spójnego pomiaru naturalnej, chimerycznej receptora antygenowego–pośredniczonej i zależnej od przeciwciał cytotoksyczności ludzkich naturalnych komórek zwanych zbójcami przy użyciu żywego obrazu komórkowego i cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórek NK potencjowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek i cytometrii przepływowej

Ten protokół opisuje metodę szybkiego przetwarzania pośmiertnego rozlanego wewnętrznego glejaka mostu w celu stworzenia modeli hodowli komórkowych pochodzących od pacjenta lub bezpośredniej charakterystyki komórek nowotworowych i mikrośrodowiskowych.

Protokół szybkiej pośmiertnej hodowli komórkowej rozlanego wewnętrznego glejaka mostu (DIPG)

Poznaj metodę szybkiego przesiewania konstruktów CAR z wykorzystaniem komórek Jurkata i obrazowania fluorescencyjnego. Protokół umożliwia ilościową ocenę cytotoksyczności w formacie 96-well, przyspieszając optymalizację terapii komórkowych.

Szybka ocena cytotoksyczności in vitro receptora antygenu chimerycznego z ekspresją Jurkata przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal

Szybka ocena cytotoksyczności in vitro receptora antygenu chimerycznego z ekspresją Jurkata przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego

Przeglądaj więcej filmów