Szybka ocena cytotoksyczności in vitro receptora antygenu chimerycznego z ekspresją Jurkata przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego
27 października 2023
Protokół do oceny ilościowego zabijania komórek nowotworowych przez komórki Jurkata wyrażające chimeryczny receptor antygenowy (CAR) ukierunkowany na pojedynczy antygen nowotworowy. Protokół ten może być wykorzystany jako platforma przesiewowa do szybkiej optymalizacji konstrukcji zawiasów CAR przed potwierdzeniem w limfocytach T pochodzących z krwi obwodowej.
Limfocyty CAR T są stale ulepszane, aby osiągnąć lepsze odpowiedzi w badaniach klinicznych na ludziach. Szukamy sposobów oceny tego w naszym laboratorium przy użyciu bezstronnej metody o wysokiej przepustowości, takiej jak wykorzystanie obrazowania fluorescencyjnego do badań przesiewowych, które działają najlepiej. Istnieje kilka kombinacji konstruktów, które można zaprojektować dla dowolnego fragmentu zmiennej z pojedynczym łańcuchem, modyfikując geometrię domen zewnątrzkomórkowych i zawiasowych.
Zaprojektowaliśmy ten protokół, aby zidentyfikować kombinacje o najlepszej skuteczności w eliminowaniu komórek docelowych za pomocą komórek Jurkat. Jest to szybki, wysokoprzepustowy protokół do badań przesiewowych konstruktów CAR w oparciu o cytotoksyczność komórek docelowych przy użyciu komórek Jurkat, które, po walidacji z konwencjonalnymi limfocytami T, kilkanaście różnych konstruktów CAR można jednocześnie testować na 96-dołkowej płytce przy użyciu tej techniki. Tutaj, w laboratorium Akhavan, określamy ilościowo w liczbach bezwzględnych bezpośrednie cytotoksyczności komórek docelowych przez komórki Jurkat eksprymujące CAR w sposób wysokoprzepustowy, aby przebadać wiele konstruktów CAR.
Głównym celem naszego laboratorium jest poprawa klinicznego przełożenia terapii komórkami CAR T na nowotwory mózgu o wysokim stopniu złośliwości. Wykorzystujemy wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków jako jedną z metod poprawy cytotoksyczności limfocytów CAR T, a także celujemy w mikrośrodowisko guza. Na początek, za pomocą pipety serologicznej, usuń pożywkę wzrostową z kolby T75 zawierającej 70% zlewającą się kulturę MDA-MB-231.
Dodaj trzy mililitry trypsyny do kolby i inkubuj w temperaturze 37 stopni z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy do pięciu minut, aby odłączyć komórki od kolby. Następnie, aby zneutralizować trypsynę, dodaj trzy mililitry DMEM do kolby. Zebrać zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej i wirować z prędkością 400 G przez cztery minuty.
Odrzucić supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach PBS. Za pomocą licznika komórek określ stężenie komórek. Przenieś osiem razy 10 do piątych komórek do 15-mililitrowej probówki i dodaj PBS, aby uzyskać objętość jednego mililitra.
Następnie dodaj dwa mikrolitry CFSE do probówki i dokładnie wymieszaj zawiesinę komórek za pomocą jednomililitrowej pipety. Umieść probówkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 20 minut. Następnie dodaj pięć mililitrów DMEM do probówki i odwiruj, aby osadzać komórki oznaczone CFSE.
Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze DMEM. Po ponownej ocenie stężenia komórek przenieś cztery razy 10 do piątych komórek do 25-mililitrowego zbiornika odczynnika. Dodaj DMEM, aby uzyskać objętość ośmiu mililitrów i wymieszaj zawiesinę komórek za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej.
Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdego rzędu po lewej połowie czarnej płytki 96-dołkowej. W podobny sposób dodać zawiesinę komórek wybijających EGFR na prawą połowę płytki. Aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek, przesuwaj płytkę do przodu i do tyłu oraz z boku na bok na platformie.
Inkubuj płytkę przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby komórki nowotworowe mogły się przyłączyć. Opierając się na liczbie nietransdukowanych i eksprymujących CAR komórek Jurkat, przenieś cztery razy 10 do piątych komórek CAR-J do zbiornika o pojemności 25 mililitrów. Dodaj DMEM do zbiornika do końcowej objętości dwóch mililitrów.
Aby uzyskać stosunek efektora do guza wynoszący cztery do jednego, dodaj dwa razy 10 do czwartej komórki CAR-J na studzienkę w 100 mikrolitrach pożywki wzdłuż boku studzienki, nie naruszając przyczepionych komórek nowotworowych. Następnie dodaj 100 mikrolitrów DMEM do boku studzienek zawierających komórki nowotworowe i Jurkat, aby uzyskać 300 mikrolitrów objętości na studzienkę. Przesuń płytkę, jak pokazano, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek Jurkat na komórkach nowotworowych.
Pozwól kokulturze ustabilizować się w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin. Po wspólnej hodowli Jurkatów wykazujących ekspresję CAR z komórkami nowotworowymi znakowanymi CFSE, delikatnie odwróć płytkę na ręczniku papierowym i postukaj, aby odrzucić supernatant zawierający CAR-J. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 mikrolitrów pożywki FluoroBrite DMEM zawierającej jod propidyny lub PI do studzienek bez naruszania przylegających komórek nowotworowych.
Następnie dodaj 20 mikrolitrów 20% Triton X do pierwszego dołka każdego typu nowotworu, służąc jako całkowita martwa kontrola. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 20 minut przed obrazowaniem. Po obrazowaniu fluorescencyjnym użyj jednej z dołków komórek tylko z guzem, aby skalibrować zielony kanał fluorescencyjny.
Aby wykluczyć komórki na krawędzi studzienek, zmniejsz maskę studzienki do 98%Zidentyfikuj komórki nowotworowe znakowane CFSE na zielonym kanale fluorescencyjnym i dostosuj wartość progową intensywności fluorescencji, aby uchwycić wszystkie komórki w studzience. Ustaw minimalną średnicę kuwety na 25 mikrometrów, aby wykluczyć zanieczyszczenia wykryte w kanale CFSE. Następnie włącz oddzielne dotykające się obiekty, aby zidentyfikować poszczególne komórki.
Następnie ustaw bramki, aby zdefiniować populacje żywych i martwych komórek. Wybierz komórki oznaczone CFSE i wygeneruj histogram zliczeń na osi y w funkcji średniej intensywności PI na osi x. Dostosuj wartość osi x, aby lepiej zwizualizować komórki i narysuj rozdzielacz, aby odróżnić komórki o niskiej liczbie PI od komórek o wysokiej zawartości PI.
Oznacz komórki o niskiej liczbie PI jako żywe komórki. Następnie ustaw kolejny histogram na żywych komórkach z obszarem na osi x i zlicza na osi y. Oznacz komórki, które nie są gruzem, jako duże żywe komórki.
Następnie narysuj kolejny rozdzielacz, używając studzienki tylko z guzem, aby wychwycić komórki i odfiltrować zanieczyszczenia. Po przeprowadzeniu analizy na całej płycie, wyeksportuj arkusz kalkulacyjny zawierający liczby. Wykreśl liczbę dużych komórek, aby określić liczbę żywych komórek nowotworowych znakowanych CFSE, które pozostały w studzience po ekspozycji na CAR-J.
Na koniec przeprowadź analizę statystyczną przy użyciu jednokierunkowej ANOVA. Cytotoksyczność CAR-J1 zwiększała się wraz z wyższym stosunkiem efektorów do guza i zaobserwowano ponad 50% zabijanie przy stosunku efektorów do guza wynoszącym cztery do jednego. EGFR ukierunkowane na konstrukty CAR ze zmodyfikowanymi domenami zawiasowymi wykazały specyficzne dla antygenu zabijanie przeciwko komórkom MDA-MB-231 eksprymującym EGFR i nie zaobserwowano znaczącego zabijania przeciwko komórkom nokautującym EGFR.
Konstrukty CAR ulegały również ekspresji na limfocytach T CD3 pochodzących z PBMC. Nie stwierdzono jednak ekspresji EGFR CAR zawierającego zawiasy CD8. Krótka IgG wykazała najmniejszą siłę cytotoksyczną wobec komórek MDA-MB-231 w porównaniu z długimi IgG i pożywką IgG.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę o wysokiej wydajności do oceny cytotoksyczności komórek Jurkat ekspresujących CAR wobec komórek nowotworowych. Umożliwia szybkie przesiewanie różnych konstrukcji CAR w celu zidentyfikowania najskuteczniejszych kombinacji do atakowania określonych antygenów nowotworowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia nowotworów
- Terapia komórkowa
Tło
- Komórki CAR T są udoskonalane w celu poprawy wyników klinicznych.
- Metody przesiewające wysokowydajnie są niezbędne do optymalizacji konstrukcji CAR.
- Komórki Jurkat służą jako model do oceny skuteczności CAR.
- To badanie koncentruje się na cytotoksyczności konstrukcji CAR wobec komórek docelowych.
Cel badania
- Opracowanie protokołu do wydajnego przesiewania konstrukcji CAR.
- Ilościowa ocena efektów cytotoksycznych komórek Jurkat ekspresujących CAR.
- Zidentyfikowanie optymalnych konfiguracji CAR do atakowania antygenów nowotworowych.
Stosowane metody
- Fluorescencyjne obrazowanie do przesiewania wysokowydajnego.
- Ocena wielu konstrukcji CAR w formacie płytki 96-dołkowej.
- Ilościowa ocena zabijaniu komórek docelowych przez komórki Jurkat ekspresujące CAR.
- Porównanie z konwencjonalnymi odpowiedziami komórek T dla walidacji.
Główne wyniki
- Identyfikacja skutecznych konstrukcji CAR do zabijaniu komórek nowotworowych.
- Demonstracja możliwości przesiewania wysokowydajnego za pomocą komórek Jurkat.
- Ilościowa ocena cytotoksyczności dla różnych konstrukcji.
- Możliwość szybkiej optymalizacji projektów CAR przed zastosowaniem klinicznym.
Konkluzje
- Protokół umożliwia wydajne przesiewanie konstrukcji CAR.
- Komórki Jurkat zapewniają niezawodny model do oceny skuteczności CAR.
- To podejście może przyspieszyć rozwój terapii komórkami CAR T.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid, high-throughput cytotoxicity evaluation of CAR constructs in Jurkat cells enables early-stage de-risking and prioritization of CAR designs before resource-intensive primary T cell validation. This platform accelerates the identification of hinge-optimized CARs with superior target cell killing, supporting efficient portfolio triage in oncology cell therapy pipelines. By quantifying cytotoxicity across multiple constructs simultaneously, teams can make data-driven decisions at critical discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid interrogation of CAR construct permutations for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying direct cytotoxicity in a controlled system.
- Facilitates predictive confidence in construct selection prior to primary T cell engineering.
Screening & Assay Development
- Prepares validated CAR-Jurkat systems for downstream high-throughput screening workflows.
- Standardizes cytotoxicity assays with quantitative fluorescent imaging outputs.
- Enables reproducible, scalable evaluation of multiple CAR constructs in parallel.
- Supports reliable compound or construct evaluation in 96-well plate formats.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early cytotoxicity data with translational goals by confirming findings in PBMC-derived T cells.
- Provides continuity from discovery-stage construct optimization to preclinical validation steps.
- Reduces risk of late-stage attrition by filtering out suboptimal CAR designs early.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput cytotoxicity platform fits at the interface of early discovery and lead identification, bridging construct design with preclinical validation. It enables rapid hypothesis testing and construct triage before advancing to resource-intensive primary T cell or in vivo studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of hinge and extracellular domain modifications for CAR efficacy.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible cytotoxicity data for construct comparison and ranking.
- Analytics: Provides absolute cell counts and statistical outputs (e.g., one-way ANOVA) to inform decision-making.
- Translational Research: Confirms construct performance in PBMC-derived T cells, supporting translational continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for ongoing CAR construct optimization campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CAR construct selection.
- Operational Value: Standardizes and scales cytotoxicity evaluation, enabling efficient resource allocation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by filtering constructs early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CAR candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CAR construct design and lentiviral transduction of Jurkat cells.
- Needs access to fluorescent imaging instrumentation and analytical software for quantitative readouts.
- Demands cross-team standardization of assay setup and data analysis parameters.
- Adaptation to other cell models or antigens may require protocol optimization.
- Dependent on robust statistical analysis (e.g., ANOVA) for construct comparison.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Plating CFSE‐Labelled Tumor Cells and Co‐Culturing CAR‐Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
5:19
Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR‐Jurkat Co‐Culture with CFSE‐Labeled Tumor Cells
![Dynamiczne obrazowanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej [18F] tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A24%253A38.282Z&w=384&q=75)
