Analogowe badanie przesiewowe fentanylu przy użyciu LC-TIMS-TOF MS/MS
8 listopada 2024
Metoda badania analogów fentanylu na podstawie czasu ich retencji, mobilności i wzorca fragmentacji spektrometrii mas.
Zakres naszych badań polega na opracowaniu metody rozróżniania i charakteryzowania analogów izomerycznych. Badania te mają na celu zbadanie, czy można opracować metodę pozwalającą na pewne różnicowanie dużej ilości, zwłaszcza izomerów strukturalnych. Protokół ten obejmuje cztery tryby charakteryzacji, które wcześniej nie były sprzężone.
Zastosowanie czterech ortogonalnych metod identyfikacji analogów powinno poprawić zdolność do różnicowania izomerów, które są trudne do rozróżnienia przy użyciu obecnych standardowych procedur. Tytan jest dużym problemem społecznym w związku z epidemią opioidów. Każdego dnia odkrywane są nowe analogi tworzące laboratoria laserowe, a posiadanie metodologii, która szybko i poufnie pomaga określić każdy wariant analogu w próbce, może poprawić wydajność i egzekwowanie prawa antynarkotykowego.
Rozpocznij od przygotowania faz ruchomych do wysokosprawnej chromatografii cieczowej lub HPLC. W przypadku ruchomej fazy A lub MPA należy użyć pięciomilimolowego mrówczanu amonu w wodzie z 0,05% kwasem mrówkowym. W przypadku ruchomej fazy B lub MPB należy użyć 0,05% kwasu mrówkowego w mieszaninie metanolu i acetonitrylu jeden do jednego.
Aby rozpocząć opracowywanie metody HPLC, otwórz oprogramowanie do chromatografii cieczowej lub LC i utwórz nowy protokół. Następnie kliknij przycisk edycji metody, aby edytować gradient binarny. Na karcie gradientu binarnego ustaw znaczniki czasu i stężenia MPA i MPB.
Ustaw czas zatrzymania na 18 minut, natężenie przepływu na 0,400 mililitra na minutę, a minimalne i maksymalne limity ciśnienia odpowiednio na zero i 6 000 PSI. Aby zainicjować HPLC, wstaw kolumnę LC i osłony kolumny w sekcji kolumny HPLC. Uważnie obserwuj minimalne i maksymalne ciśnienie w kolumnie.
Aby rozpocząć, opracowanie metody TIMS-TOF MS/MS otwórz aplikację sterującą TIMS, w ustawieniach MS ustaw wartości początkowe i końcowe skanowania odpowiednio na 50 stosunek masy do ładunku i 1 800 stosunek masy do ładunku. Wybierz tryb polaryzacji jonów jako dodatni, a tryb skanowania jako akumulację równoległą, fragmentację szeregową lub PASEF. Następnie przejdź do wypustek pod źródłem i ustaw przesunięcie płyty końcowej na 500 woltów, kapilar na 4,500 woltów, nebulizator na 3,0 bar, suchy gaz na 10,0 litrów na minutę i suchą temperaturę na 200 stopni Celsjusza W ustawieniach pompy strzykawkowej przypisz strzykawkę jako Hamilton jeden mililitr.
Włącz opcję aktywną i ustaw natężenie przepływu na 80,0 mikrolitrów na godzinę. W zakładce MS/MS w sekcji jony prekursorowe ustaw liczbę ramp PASEF na osiem, minimalny ładunek na jeden, a maksymalny ładunek na pięć. W ustawieniach planowania włącz powtórzenia prekursora i w obszarze aktywne wykluczenie zaznacz pole wyboru, aby włączyć i ustaw zwolnienie na 0,40 minuty po.
Nie zmieniaj ustawień energii zderzenia i ustawień szerokości izolacji. Następnie kliknij, aby włączyć pole kroku TIMS. Aby przeprowadzić kalibrację zarówno dla stosunku masy do ładunku, jak i dla dziedziny mobilności, w ustawieniach kalibracji stosunku masy do ładunku wybierz jeden z wstępnie załadowanych profili tuningu mix z listy referencyjnej.
Aby przeprowadzić kalibrację, należy załadować strzykawkę do TOF roztworem mieszanki strojącej. W trybie kalibracji po prawej stronie okna wybierz między liniowym, kwadratowym i ulepszonym kwadratowym, aby uzyskać najlepszy wynik. I kliknij kalibruj, aby zbliżyć się jak najbardziej do 100%.
Następnie należy przeprowadzić kalibrację pod kątem mobilności, postępując zgodnie z krokami przedstawionymi wcześniej w celu kalibracji stosunku masy do ładunku. Po kalibracji zapisz metodę MS, wybierając zakładkę metody na górnym pasku. Z menu rozwijanego wybierz opcję Zapisz jako, aby wygenerować nowy plik metody MS.
Po zebraniu zestawu danych TIMS-TOF MS/MS w trybie akwizycji zależnej od danych lub DDA PASEF, uruchom akwizycję niezależną od danych lub DIA w aplikacji oprogramowania do mobilności jonów. Aby to zrobić, najpierw załaduj wcześniej zapisaną metodę DDA. Zmień spektrometrię mas na pasywną fragmentację DIA.
Pozostaw wszystkie inne ustawienia bez zmian. W zakładce MS/MS wybierz edytuj okna, a następnie użyj przycisku otwórz analizę znajdującego się w górnej części wyskakującego okienka DIA i załaduj wcześniej zapisany zestaw danych DDA. Gdy w lewym dolnym rogu pojawi się mapa skupień z wielokątem okien biegnących po przekątnej wykresu, kliknij i przeciągnij, aby zmienić rozmiar wielokąta tak, aby pasował do danych na mapie skupień.
Ustaw liczbę okien ruchomości w przeliczeniu na szerokość masy i nakładanie się. Kliknij przycisk Oblicz okna w prawym dolnym rogu wyskakującego okienka, aby wyświetlić okna z nowymi ustawieniami. Gdy będzie odpowiedni, kliknij Zastosuj.
Aby przetworzyć dane TOF ruchliwości jonów HPLC z badań przesiewowych analogu fentanylu, należy rozpocząć od sprawdzenia kalibracji w oprogramowaniu do analizy danych. W tym celu należy kliknąć prawym przyciskiem myszy na nazwę pliku pod polem analizy i wybrać właściwości. Gdy pojawi się okno z etykietą filename_analysis właściwości, wybierz stan kalibracji.
Z listy rozwijanej wybierz kalibrację przyrządu dla spektrometru mas i potwierdź, że błąd nie jest większy niż jeden PPM. Następnie wybierz wstępną kalibrację ruchliwości i potwierdź, że błąd nie jest większy niż 1%Aby przygotować chromatogram w oprogramowaniu do analizy danych, kliknij prawym przyciskiem myszy chromatogram pod nazwą pliku i wybierz edytuj chromatogram. W polu Wpisz pole rozwijane i wybierz wyodrębniony chromatogram jonowy.
W obszarze filtr zaznacz wszystkie MS, a w polu Tryb skanowania zaznacz wszystko. Jeśli używasz mas do ekstrakcji jonu, wprowadź teoretyczny stosunek masy do ładunku interesującej nas cząsteczki. Ustaw polaryzację na tryb dodatni i dodaj jon do listy.
Jeśli używasz formuły do ekstrakcji jonu, wprowadź wzór dla cząsteczki, a także formy jonów będące przedmiotem zainteresowania dla chromatogramu. W przypadku widma masowego upewnij się, że chromatogram jest zaznaczony i kliknij prawym przyciskiem myszy linię bazową jednej krawędzi piku złożonego i przeciągnij do drugiej krawędzi piku. Aby wygenerować mobiligram, kliknij prawym przyciskiem myszy na lewą zakładkę zatytułowaną mobiligram i wybierz edytuj mobiligram.
Gdy pojawi się okno zatytułowane edytuj ślady mobiligramu, rozpocznij edycję chromatogramu. W danych wejściowych czasu przechowywania dodaj zakres czasu przechowywania szczytu zainteresowania. Po wybraniu parametrów kliknij dodaj, a następnie w porządku w prawym górnym rogu.
Aby wygenerować widma złożone, w dolnej części okna widoku widma wybierz kolejno profil MS i fragment MS.At widoku widma, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz kopiuj widma złożone. Aby przetworzyć dane, kliknij znajdź, a następnie wybierz związki ręcznie, chromatogram lub mobiligram. Kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij, aby podświetlić żądany pik, aby uzyskać ważne informacje o interesującej nas cząsteczce.
Badania przesiewowe czterech izomerów w konkretnym zestawie do badań przesiewowych analogu fentanylu wykazały, że metoksyacetylofentanyl i karbaminian fentanylu dobrze oddzieliły się w domenach LC i ruchliwości od para-metoksyacetylofentanylu i B-hydroksyfentanylu. Udało się jednak osiągnąć wyraźne rozdzielenie tych dwóch ostatnich we wzorcach fragmentacji. Badania przesiewowe trzech izomerów w innym zestawie wykazały, że alfa-metylotiofentanyl i trans-3-metylotiofentanyl rozdzieliły się w domenie LC, ale nie w domenie mobilności.
Jednak trans-3-metylotiofentanyl i cis-3-metylotiofentanyl rozdzieliły się w domenie ruchliwości, a nie w domenie LC. Dane te wskazują na komplementarność ortogonalnych domen LC i ruchliwości w poprawie identyfikacji gatunków izometrycznych.
Przegląd
Badania te opracowują metodę do rozróżniania i charakteryzowania analogów izomerycznych fentanylu. Poprzez zastosowanie czterech ortogonalnych trybów charakteryzacji, badanie ma na celu poprawę rozróżniania izomerów strukturalnych, które są trudne do zidentyfikowania za pomocą standardowych procedur.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Chemia analityczna
- Wymuszanie prawa w zakresie narkotyków
Tło
- Epidemia opioidów jest istotnym problemem społecznym.
- Ciągle pojawiają się nowe analogi fentanylu.
- Obecne metody mogą nie być skuteczne w rozróżnianiu izomerów.
- Ulepszone metodologie mogłyby zwiększyć wysiłki wymuszania prawa w zakresie narkotyków.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody rozróżniania analogów fentanylu.
- Zbadanie skuteczności łączenia wielu metod charakteryzacji.
- Rozwiązanie wyzwań w identyfikacji izomerów strukturalnych.
Zastosowane metody
- Analiza czasu retencji
- Pomiar mobilności
- Analiza wzorców fragmentacji spektrometrii mas
- Integracja czterech ortogonalnych metod identyfikacji
Główne wyniki
- Proponowana metoda poprawia zdolność do rozróżniania izomerów.
- Łączenie wielu technik charakteryzacji poprawia dokładność identyfikacji.
- Metodologia wykazuje obiecujące zastosowania w praktycznym wymuszaniu prawa w zakresie narkotyków.
- Wyniki wskazują potencjał dla szybkiej analizy analogów fentanylu.
Wnioski
- Opracowano nową metodę przesiewowego badania analogów fentanylu.
- To podejście może znacząco pomóc w radzeniu sobie z kryzysem opioidowym.
- Wymagane są dalsze badania w celu zweryfikowania i udoskonalenia metodologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid emergence of fentanyl analogs presents a critical challenge for drug discovery and forensic screening pipelines. High-throughput LC-TIMS-TOF MS/MS enables confident differentiation of isomeric analogs, directly impacting predictive confidence and mechanistic de-risking in early-stage compound triage. This capability supports portfolio-wide risk reduction and accelerates actionable decision-making in both pharmaceutical R&D and public health surveillance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust discrimination of structural isomers, reducing ambiguity in compound identification.
- Supports mechanistic de-risking by integrating orthogonal analytical dimensions for target validation.
- Improves predictive confidence in analog assignment, informing early go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated compound libraries for downstream screening workflows by confirming analog identity.
- Delivers reproducible, quantitative outputs through retention time, mobility, and fragmentation data.
- Facilitates scalable, high-throughput screening of complex analog mixtures.
Translational & Preclinical Research
- Aligns analytical rigor with translational biomarker strategies by ensuring compound specificity.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting accurate analog tracking.
- Reduces risk of false positives in disease-relevant system studies involving opioid analogs.
Pipeline & Workflow Integration
This LC-TIMS-TOF MS/MS protocol integrates at the interface of early discovery, screening, and preclinical workflows, providing a reusable analytical platform for analog differentiation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving isomeric ambiguity.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible compound identification for high-throughput workflows.
- Analytics: Provides quantitative retention, mobility, and fragmentation outputs for robust comparison.
- Translational Research: Ensures analytical continuity for analog tracking across preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable platform for ongoing analog surveillance and screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in analog identification.
- Operational Value: Standardizes high-throughput workflows with reproducible, multi-dimensional data.
- Strategic Value: Enables informed portfolio triage and capital-efficient advancement decisions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by minimizing late-stage identification failures.
Implementation Considerations
- Requires expertise in LC, ion mobility, and tandem MS operation and data analysis.
- Demands access to advanced instrumentation and robust analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of calibration and data processing protocols.
- Adaptation across diverse analog classes may require method optimization.
- Instrument calibration and error thresholds must be tightly controlled for reliable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:01
HPLC Method Development for Screening of Fentanyl Analogs
2:26
TIMS‐TOF MS/MS Method Development and Calibration of Mobility and Mass for Fentanyl Analog Screening
5:02
Data Independent Acquisition (dia) Parallel Accumulation‐Serial Fragmentation Method for Screening of Fentanyl Analogs
6:20
Processing HPLC Ion Mobility TOF Data of Fentanyl Analog Screening
