Zmodyfikowany test in vivo Matrix Gel Plug Test do badań angiogenezy

Nasze badania dotyczą angiogenezy, czyli procesu powstawania nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących naczyń. Odgrywa kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych, takich jak nieprawidłowy rozwój, miażdżyca, rozwój guza i tak dalej. Skonstruowanie wiarygodnego modelu do oceny zakresu angiogenezy ma kluczowe znaczenie dla badań medycznych lub odkrywania leków na choroby zależne od angiogenezy.

Jednak większość istniejących modeli jest złożona, droga i wymaga specjalistycznego sprzętu. Tutaj przedstawiamy zmodyfikowany test zatyczki żelowej matrycy, który można wykorzystać do badania angiogenezy i przepuszczalności naczyń bez barwienia, w jeden, bardziej intuicyjny, a także skuteczny sposób. Zacznij od przygotowania kompletnej pożywki do hodowli śródbłonka, używając 460 mililitrów pożywki z komórek śródbłonka i dodając do niej 50 mililitrów FBS, pięć mililitrów penicyliny streptomycyny i pięć mililitrów suplementu wzrostu komórek śródbłonka.

Tak przygotowane podłoża można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez miesiąc. Następnie do 100-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego 0,1 miliona komórek naczyniowych dodaj osiem mililitrów przygotowanej kompletnej pożywki do hodowli śródbłonka. I hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż do osiągnięcia 70% konfluencji.

Następnie wyjmij pożywkę hodowlaną z naczynia i dwukrotnie przepłucz komórki PBS, aby wyeliminować nieprzyczepione komórki i zanieczyszczenia. Po usunięciu PBS dodaj trzy mililitry 0,25% trypsyny zawierającej 2,21 milimolowego EDTA do komórek i inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Sprawdź oderwanie komórek pod mikroskopem świetlnym przy 40-krotnym powiększeniu.

Zneutralizuj trypsynę siedmioma mililitrami kompletnej pożywki do hodowli śródbłonka i delikatnie spłucz komórki z naczynia hodowlanego. Odwirować zawiesinę komórkową po zebraniu jej w 15-mililitrowej probówce o natężeniu 400 G przez 10 minut. Ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach kompletnej pożywki do hodowli śródbłonka po usunięciu supernatantu.

Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru i przenieś obliczoną objętość zawiesiny zawierającej 2 miliony komórek do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Osadzać komórki, odwirowując zawiesinę o sile 400 G przez pięć minut przed usunięciem supernatantu. Komórki naczyniowe są teraz gotowe do zmieszania z żelem macierzowym do testu czopów żelowych macierzy.

Na początek przygotuj 10-krotną pożywkę hodowlaną M199, rozpuszczając proszek M199 do 10-krotnego stężenia w 90 mililitrach wody dejonizowanej, a następnie dodaj 10 mililitrów FBS. Przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 mikrona. Przefiltrowane podłoże można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dwóch miesięcy.

Do przygotowania żelu macierzowego z komórkami naczyniowymi należy użyć około 2 milionów komórek naczyniowych. Schłodź sterylną 1,5 mililitrową probówkę zawierającą odpowiednio przygotowany osad komórkowy w łaźni lodowej. Całkowicie rozmrozić żel matrycowy w łaźni lodowej bez mieszania lub wirowania.

Podobnie, schłodzić przygotowane 10-krotne podłoże hodowlane M199 wraz z odczynnikiem testowym lub lekiem będącym przedmiotem zainteresowania do czterech stopni Celsjusza. Następnie, utrzymując stosunek objętości 8,8:1,0:0,2, połącz wstępnie schłodzony żel matrycowy z wstępnie schłodzonymi 10-krotnymi mediami M199 zawierającymi 10% FBS i wstępnie schłodzonym odczynnikiem testowym, aby uzyskać mieszaninę żelu matrycowego. Na koniec ponownie zawieś wstępnie schłodzone ogniwa w 400 mikrolitrach przygotowanej mieszanki żelu matrycowego, delikatnie mieszając, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.

Probówkę zawierającą komórki w żelu do matrycy należy przechowywać na lodzie, aż myszy będą gotowe do wstrzyknięcia żelu matrycowego. Na początek umieść strzykawki insulinowe o rozmiarze 30 mililitrów w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu schłodzenia. Świeżo przygotowaną mieszankę żelu macierzowego zawierającą komórki naczyniowe należy przechowywać na lodzie do czasu, aż mysz będzie gotowa do wstrzyknięcia.

Następnie należy umieścić odpowiednio znieczuloną mysz na tablicy operacyjnej w pozycji leżącej i przymocować jej kończyny do tablicy za pomocą taśmy. Załaduj wstępnie schłodzoną strzykawkę insulinową 300 mikrolitrami mieszaniny żelu matrycowego, unikając tworzenia się pęcherzyków. Zdezynfekuj skórę z tyłu myszy za pomocą 75% wacików nasączonych alkoholem.

Następnie wstrzyknąć podskórnie 300 mikrolitrów mieszaniny żelu matrycowego w strzykawce po jednej stronie grzbietu zwierzęcia. Delikatnie wyjąć igłę z miejsca wstrzyknięcia, aby zapobiec wyciekowi mieszaniny żelu. Upewnij się, że w miejscu wstrzyknięcia utworzy się mały garb.

Umieść mysz na poduszce grzewczej na dwie minuty, aby mieszanina żelu matrycowego uległa koagulacji i utworzyła korek. Powtórz pokazane kroki, aby utworzyć wtyczkę po drugiej stronie pleców myszy. Zaznacz krawędzie garbu za pomocą markera.

Zwierzę należy umieścić w specjalnym laboratorium dla zwierząt doświadczalnych wolnych od patogenów w temperaturze od 20 do 24 stopni, z 12-godzinnymi cyklami światła i 12-godzinnymi cyklami ciemności przez siedem dni. Aby wstrzyknąć myszy dekstran FITC siedem dni po wstrzyknięciu żelu matrycowego, należy ponownie zawiesić 0,5 miligrama dekstranu FITC w 500 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody. Dokładnie go zwirować, aby uzyskać jeden mikrogram na mikrolitr roztworu dekstranu FITC.

Napełnij strzykawkę o rozmiarze 29 50 mikrolitrami roztworu dekstranu FITC. Przymocuj mysz do przyrządu do wstrzykiwania żyły ogonowej. Zdezynfekuj ogon wacikiem nasączonym 75% alkoholem, a następnie ostrożnie wstrzyknij 50 mikrolitrów roztworu dekstranu FITC w strzykawce do żyły ogonowej.

Uciskać miejsce wstrzyknięcia wacikiem przez jedną minutę, aby zatamować krwawienie. Umieść mysz z powrotem w klatce i pozwól jej się zrelaksować przez 30 minut przed pobraniem zatyczki żelowej matrycy. Aby zebrać zatyczkę żelową, przeciąć skórę myszy poddanej eutanazji wzdłuż zaznaczonej granicy zatyczki za pomocą nożyczek chirurgicznych i usunąć skórę nad zatyczką żelową matrycy.

Zebrać zatyczkę i opłukać ją w zlewce z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, aby zmyć nadmiar krwi. Następnie przykryj spód kasety do zatapiania tkanek około 0,5 mililitra żelu do zatapiania tkanek. Następnie szybko umieść zatyczkę żelową matrycy na żelu do zatapiania tkanek w zaplanowanej orientacji.

Zanurz zatyczkę w dodatkowym żelu do zatapiania tkanek. Zestal kasetę w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Po wyjęciu zestalonego bloku zatyczki, wytnij odcinki o grubości 12 mikronów za pomocą mikrotomu zamrażającego.

Następnie zamontuj sekcje na szkiełkach mikroskopowych.