Name: Zmodyfikowany test in vivo Matrix Gel Plug Test do badań angiogenezy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj zmodyfikowany test matrix gel plug do badania angiogenezy i przepuszczalności naczyń in vivo bez konieczności barwienia. Ta metoda umożliwia wizualizację nowych naczyń krwionośnych u myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Zhejiang (LY22H020005) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81873466).

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Medycznego w Wenzhou (XMSQ2021-0057, 19 lipca 2021r.). Wszystkie odczynniki i materiały eksploatacyjne są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie podłoża hodowlanego
<ol>
	<li>10x pożywka hodowlana M199: Rozpuść proszek M199 do 10-krotnego stężenia w 90 ml wody dejonizowanej i dodaj 10 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), a następnie przepuść przez filtr 0,22 μm. Pożywkę należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.</li>
	<li>Kompletna pożywka do hodowli śródbłonka: Dodać 50 ml FBS, 5 ml penicyliny/streptomycyny i 5 ml suplementu do wzrostu komórek śródbłonka do 460 ml pożywki z komórek śródbłonka (ECM). Przechowywać podłoże w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek naczyniowych
<ol>
	<li>Hodowla 1 x 105 komórek naczyniowych (pierwotne komórki progenitorowe śródbłonka z hodowlą<klasa sup = "xref">14, komórki śródbłonka lub linie komórkowe śródbłonka) z 8 ml kompletnej pożywki do hodowli śródbłonka w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm w temperaturze 37 °C i zbieganiu 5% CO2 do 70%.</li>
	<li>Usuń pożywkę hodowlaną i opłucz naczynie 2x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), aby usunąć nieprzyłączone komórki i zanieczyszczenia. Usunąć PBS i dodać 3 ml 0,25% trypsyny zawierającej 2,21 mM EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 minutę.</li>
	<li>Zneutralizuj trypsynę za pomocą 7 ml kompletnej pożywki do hodowli śródbłonka i delikatnie spłucz komórki z naczynia hodowlanego. Potwierdź odłączenie komórek pod mikroskopem świetlnym (40-krotne powiększenie).</li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórek w probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 400 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 5 ml kompletnej pożywki do hodowli śródbłonka.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i przenieś zawiesinę zawierającą 2 x 106 komórek do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml. Każda wtyczka zawiera 1,5 x 106 ogniw, dodatkowe 25% ogniw jest używane w przypadku odpadów. Każda grupa zawiera co najmniej 3 wtyczki. 
	UWAGA: Po próbach stwierdzono, że 1,5 x 106 komórek w 300 μl żelu macierzowego doprowadziło do prawidłowego rozwoju angiogenezy i dlatego zostało wybrane do eksperymentów.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek o sile 400 x g przez 5 minut w celu osadzenia komórek, a następnie usunąć supernatant.</li>
</ol>
3. Przygotowanie żelu Matrix
<ol>
	<li>Sterylne probówki o pojemności 1,5 ml zawierające osad komórkowy schłodzić w łaźni wodnej o temperaturze 4 °C. Strzykawki insulinowe 30 g o pojemności 1 ml należy schłodzić w lodówce o temperaturze 4°C.</li>
	<li>Całkowicie rozmrozić żel matrycowy w łaźni wodnej o temperaturze 4 °C. Nie mieszać ani nie wirować. Wstępnie schłodzić 10x M199 i przetestować odczynnik/lek w łaźni wodnej o temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wymieszaj wstępnie schłodzony żel matrycowy z 10x M199 zawierającym 10% FBS i odczynnikiem do badania w stosunku objętościowym 8,8:1:0,2, aby uzyskać mieszaninę żelu matrycowego i M199 zawierającą 1% FBS i odczynnik.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki za pomocą 400 μl mieszaniny żelu matrycowego, delikatnie wymieszać, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Trzymaj probówkę na lodzie, dopóki myszy nie będą gotowe do wstrzyknięcia. Mieszaninę żelu matrycowego należy cały czas trzymać na lodzie, aby uniknąć krzepnięcia. 
	UWAGA: W tym przypadku do utworzenia czopa żelowego użyto 300 μl mieszaniny żelu matrycowego zawierającej 1,5 x 106 komórek. Przygotuj 25% dodatkowego żelu zgodnie z 25% dodatkowymi komórkami w kroku 2.</li>
</ol>
4. Przygotowanie myszy
<ol>
	<li>Znieczulić 6-8 tygodniowego samca myszy Nu/Nu (18-25 g) w komorze urządzenia do znieczulania zwierząt izofluranem (3% izofluranu w 100% tlenu przy natężeniu przepływu 1 l/min). Po udanym znieczuleniu, potwierdzonym brakiem odruchu prostowania i odruchu szczypania palców u stóp, należy wysunąć mysz z komory, wysunąć mysz z komory i założyć myszce maskę znieczulającą oraz zmienić stężenie izofluranu na 1,5% w 100% tlenu przy natężeniu przepływu 1 L/min. 
	UWAGA: Zapewnij zwierzęciu wsparcie termiczne za pomocą poduszki grzewczej przez cały czas trwania zabiegu.</li>
	<li>Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Przyklej kończyny myszy na tablicy operacyjnej w pozycji leżącej.</li>
</ol>
5. Wstrzykiwanie mieszanki żelowej Matrix
<ol>
	<li>Załadować 300 μl mieszaniny żelu matrycowego do strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml za pomocą igły 30G. Unikaj tworzenia się pęcherzyków. Szybko załaduj żel matrycowy (w ciągu 2 minut), aby uniknąć zestalenia w tym czasie. Natychmiast umieścić strzykawkę insulinową wypełnioną żelem matrycowym na lodzie.</li>
	<li>Oczyść skórę na grzbiecie myszy za pomocą wacików nasączonych 75% alkoholem. Podskórnie wstrzyknąć 300 μl mieszaniny żelu matrycowego po jednej stronie grzbietu myszy.</li>
	<li>Delikatnie wyjąć igłę z miejsca wstrzyknięcia, aby zapobiec wyciekowi mieszaniny żelu matrycowego. Sprawdzić, czy w miejscu wstrzyknięcia nie ma małego garbu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Umieść mysz na poduszce grzewczej na 2 minuty, aby mieszanina żelu matrycowego skoagulowała i utworzyła korek.</li>
	<li>Powtórz kroki od 5.2. do 5.4., aby utworzyć wtyczkę po drugiej stronie tylnej części myszy. Zaznacz krawędzie garbów za pomocą markera.</li>
	<li>Obserwuj mysz, dopóki nie odzyska wystarczającej świadomości, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Umieść mysz w osobnej klatce, aż w pełni wyzdrowieje. Myszy należy trzymać w laboratorium dla zwierząt doświadczalnych klasy SPF w temperaturze 22 ± 2 °C z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności przez 7 dni.</li>
</ol>
6. Wstrzyknięcie Dextran-FITC przez żyłę ogonową
<ol>
	<li>Po 7 dniach od wstrzyknięcia żelu matrycowego ponownie zawiesić 0,5 mg dextran-FITC z 500 μl podwójnie destylowanej wody (ddH2O), a następnie gwałtownie przetrząsnąć, aby otrzymać roztwór dektranu-FITC o końcowym stężeniu 1 μg/μL. 
	UWAGA: Użyj dextran-FITC o masie cząsteczkowej ~150 kDa do testu angiogenezy i użyj dextran-FITC o masie cząsteczkowej ~4 kDa do testu przepuszczalności naczyń.</li>
	<li>Umieścić 50 μl roztworu dextran-FITC w strzykawkach 29G.</li>
	<li>Zamocuj mysz na przyrządzie do wstrzykiwania żyły ogonowej. Oczyść ogon wacikiem nasączonym 75% alkoholem i delikatnie wstrzyknij 50 μl dextran-FITC przez żyłę ogonową.</li>
	<li>Ściskaj miejsce wstrzyknięcia bawełnianym wacikiem przez 1 minutę, aby zatamować krwawienie, a następnie umieść myszy z powrotem w klatce na 30 minut.</li>
	<li>Powtarzać kroki 6.3 i 6.4 do momentu, aż wszystkie myszy otrzymają wstrzyknięcie dekstranu-FITC.</li>
</ol>
7. Kolekcja zatyczek żelowych Matrix
<ol>
	<li>Dootrzewnowo wstrzyknąć 1% pentobarbital sodu do PBS (200 mg/kg masy ciała) i poddać myszy eutanazji za pomocą procedury zatwierdzonej przez IACUC.</li>
	<li>Przeciąć skórę wzdłuż zaznaczonej granicy zatyczki za pomocą nożyczek chirurgicznych i usunąć skórę nad zatyczką żelową matrycy.</li>
	<li>Zbierz korek i spłucz w małej zlewce z 1x PBS, aby zmyć nadmiar krwi (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Kolor czopa może z grubsza określać stopień obfitości krwi i zawartość naczyń krwionośnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
</ol>
8. Osadzanie zatyczki żelowej matrycy i przygotowanie sekcji
<ol>
	<li>Przykryj przycisk kasety do zatapiania tkanek około 0,5 ml żelu do zatapiania tkanek, a następnie natychmiast umieść zatyczkę żelu matrycowego na żelu do zatapiania tkanek w żądanej orientacji, jak pokazano na <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2B. Następnie zanurz zatyczkę w dodatkowym żelu do zatapiania tkanek.</li>
	<li>Włóż kasety do zamrażarki w temperaturze -80 °C na 12 godzin, aby zastygły.</li>
	<li>W celu przygotowania grubych przekrojów należy wyjąć zestalony blok zatyczkowy i wyciąć odcinki o grubości 12 μm za pomocą mikrotomu do zamrażania zgodnie z instrukcją, a następnie zamontować na szkiełkach mikroskopowych.</li>
	<li>Pokrój 5-10 sekcji z każdego bloku wtyczki.</li>
</ol>
9. Kwantyfikacja angiogenezy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)
<ol>
	<li>Uzyskaj obrazy fluorescencji z 5 niezależnych pól przekroju za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego o długości fali 488 nm przy 10-krotnym powiększeniu.</li>
	<li>Otwórz plik obrazu za pomocą oprogramowania Image J (https://imagej.en.softonic.com/) i kliknij przycisk Analiza angiogenezy. Następnie kliknij przycisk Analizuj kontrast fazowy HUVEC i przełącz się na tabelę wyników statystyk, aby zebrać informacje. Zmierz wszystkie 5 uzyskanych obrazów fluorescencyjnych dla każdej sekcji.</li>
	<li>Przeanalizuj całkowitą długość naczyń neo-naczyniowych z różnych grup, aby statystycznie ocenić różnicę w angiogenezie między tymi grupami. 
	UWAGA: Całkowita długość segmentów głównych wskazuje całkowitą długość neo-naczyń. Odczynnik, który zwiększa długość naczyń neo-naczyniowych, jest określany jako pro-angiogenny, podczas gdy odczynnik zmniejszający długość naczyń neo-naczyniowych jest antyangiogenny.</li>
</ol>
10. Kwantyfikacja przepuszczalności naczyń krwionośnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 4)
<ol>
	<li>Uzyskaj obrazy fluorescencyjne z 5 niezależnych pól przekroju za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego o długości fali 488 nm przy 20-krotnym powiększeniu.</li>
	<li>Otwórz plik obrazu za pomocą oprogramowania Image J. Kliknij przycisk Wybór odręczny i zakreśl obszar wycieku, a następnie kliknij menu Analizuj i wybierz opcję Zmierz, aby uzyskać informacje o obszarze wycieku. Użyj stosunku powierzchni przecieku do obszaru obrazu, aby wskazać przepuszczalność naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Przeanalizuj stosunek powierzchni przecieku do powierzchni obrazu z różnych grup, aby statystycznie ocenić różnicę w przepuszczalności naczyń między tymi grupami.</li>
</ol>

Simplifying Angiogenesis Studies with a Modified Matrix Gel Plug Assay

<ol><li>Bikfalvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+and+conceptual+developments+in+vascular+biology+and+angiogenesis+research%3A+a+personal+view%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view.</a> Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).</li>
<li>Carmeliet, P., Jain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+mechanisms+of+vessel+normalization+for+cancer+and+other+angiogenic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases.</a> Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).</li>
<li>De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis.</a> Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).</li>
<li>Griffioen, A., Molema, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis%3A+potentials+for+pharmacologic+intervention+in+the+treatment+of+cancer%2C+cardiovascular+diseases%2C+and+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation.</a> Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).</li>
<li>Viallard, C., Larrivée, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+angiogenesis+and+vascular+normalization%3A+alternative+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets.</a> Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).</li>
<li>Craig, M., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETS+transcription+factors+in+embryonic+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">ETS transcription factors in embryonic vascular development.</a> Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).</li>
<li>Losordo, D., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+angiogenesis+and+vasculogenesis+for+ischemic+disease.+Part+I%3A+angiogenic+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines.</a> Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-angiogenesis-new+concept+for+therapy+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors.</a> Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer%2C+vascular%2C+rheumatoid+and+other+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease.</a> Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion+-+Angiogenesis%3A+an+organizing+principle+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).</li>
<li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).</li>
<li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1%CE%B2+augments+the+angiogenesis+of+endothelial+progenitor+cells+in+an+NF-%CE%BAB%2FCXCR7-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).</li>
<li>Dai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+transcriptional+upregulation+of+IDH2+to+tune+mitochondrial+dynamics+and+rescue+angiogenic+function+of+diabetic+EPCs%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs.</a> Redox Biology. 56, 102449(2022).</li>
<li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liraglutide+Improves+the+Angiogenic+Capability+of+EPC+and+Promotes+Ischemic+Angiogenesis+in+Mice+under+Diabetic+Conditions+through+an+Nrf2-Dependent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism.</a> Cells. 11 (23), 3821(2022).</li>
<li>Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three+dimensional+collagen+matrix+models+of+endothelial+lumen+formation+during+vasculogenesis+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis.</a> Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).</li>
<li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).</li>
<li>Malinda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+matrigel+migration+and+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+NJ%29%22%5BJournal%5D)">In vivo matrigel migration and angiogenesis assay.</a> Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF21+promotes+ischaemic+angiogenesis+and+endothelial+progenitor+cells+function+under+diabetic+conditions+in+an+AMPK%2FNAD%2B-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).</li>
<li>Gavard, J., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+controls+endothelial-cell+permeability+by+promoting+the+beta-arrestin-dependent+endocytosis+of+VE-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin.</a> Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).</li>
<li>Birdsey, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+transcription+factor+ERG+promotes+vascular+stability+and+growth+through+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling.</a> Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).</li>
<li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+CXCR4+antagonist+enhances+angiogenesis+via+modifying+the+ischaemic+tissue+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiamy wiarygodną i wygodną metodę ilościowej oceny angiogenezy in vivo bez barwienia. W tym protokole komórki naczyniowe zmieszano z żelem macierzowym w obecności odczynników pro-angiogennych lub antyangiogennych, a następnie wstrzyknięto podskórnie w plecy myszy Nu / Nu w celu utworzenia czopa żelowego (ryc. 1). Po 7 dniach od tworzenia się czopa żelowego, dextran-FITC wstrzyknięto dożylnie i krążono przez 30 minut. Czop żelowy zebrano i zatopiono w żelu do zatapiania tkane...

Angiogeneza, proces tworzenia nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących naczyń, odgrywa kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych, takich jak rozwój embrionalny, gojenie się ran, miażdżyca, rozwój nowotworu, itp.1,2,3,4,5. Ten dynamiczny proces obejmuje kilka etapów, w tym degradację macierzy, proliferację komórek naczyniowych, migrację i samoorganizację w celu utworzenia struktur rurkowych oraz stabilizację neo-naczyń krwionośnych6. Wykazano, że promowanie angiogenezy ma kluczowe znaczenie w leczeniu zawału mięśnia sercowego, udaru mózgu i innych rodzajów chorób niedokrwiennych7, podczas gdy hamowanie angiogenezy zostało uznane za obiecującą strategię w leczeniu nowotworów8 i chorób reumatoidalnych9. Angiogeneza została uznana za zasadę organizacyjną odkrywania leków10. W związku z tym skonstruowanie wiarygodnej i wygodnej metody oceny stopnia angiogenezy ma kluczowe znaczenie dla badań mechanicznych lub odkrywania leków w chorobach zależnych od angiogenezy.
Opracowano kilka modeli in vitro i in vivo do oceny angiogenezy11. Wśród nich modele dwuwymiarowe (2-D), takie jak test tworzenia rurki żelowej z matrycą12, nie mogą tworzyć funkcjonalnych struktur rurowych. Modele zwierzęce, takie jak model niedokrwienia kończyn tylnych13,14, mogą odtworzyć proces angiogenezy, ale są złożone i wymagają laserowego systemu obrazowania przepływu krwi plamkowego. Modele 3D morfogenezy naczyń krwionośnych, takie jak test czopa żelowego matrycy, zapewniają prostą platformę, która może naśladować proces angiogenezy in vivo15, ale wykrycie angiogenezy wymaga immunohistochemii lub barwienia immunofluorescencyjnego16,17,18, które są zmienne i słabo zwizualizowane.
Tutaj opisujemy protokół zmodyfikowanego testu z zatyczką żelową matrycy, w którym komórki naczyniowe były mieszane z żelem macierzowym i podskórnie wstrzykiwane do grzbietu myszy w celu utworzenia czopki. W czopie komórki naczyniowe muszą degradować macierz, namnażać się, migrować i samoorganizować, aby ostatecznie utworzyć funkcjonalne naczynia z przepływem krwi w środowisku wewnętrznym. Następnie znakowany fluorescencyjnie dekstran jest wstrzykiwany przez żyłę ogonową, aby przepływać przez korek, a etykieta jest wizualizowana w celu wskazania naczyń krwionośnych. Zawartość angiogenezy można ilościowo ocenić na podstawie długości naczyń. Ta metoda może tworzyć funkcjonalne naczynia, których nie można wytworzyć w modelach angiogenezy 2D12 i nie wymaga skomplikowanego procesu barwienia, jak w zwykłym teście zatyczek żelowych matrycy11. Nie wymaga również drogich specjalistycznych instrumentów, takich jak laserowy system obrazowania przepływu krwi w modelu niedokrwienia kończyn tylnych13,14,19. Metoda ta jest wszechstronna, tania, policzalna i łatwa do wykonania, i może być stosowana do określania pro- lub antyangiogennych zdolności leków lub może być stosowana w badaniach mechanicznych związanych z angiogenezą.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka mikroskopu adhezyjnego</td><td>CITOTEST</td><td>188105</td><td></td></tr><tr><td>System anestezjologiczny</td><td>RWD</td><td>R640-S1</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Cryoslicer</td><td>Thermo Fisher</td><td>CryoStar NX50</td><td></td></tr><tr><td>Dextrans-FITC-150kDa</td><td>WEIHUA BIO</td><td></td><td></td>WH007N07</tr><tr><td>Dextrans-FITC-4kDa</td><td>WEIHUA BIO</td><td>WH007N0705</td><td></td></tr><tr><td>Kasety do zatapiania</td><td>CITOTEST</td><td>80203-0007</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże dla komórek śródbłonka</td><td>ScienCell</td><td>35809</td><td></td></tr><tr><td>Suplementy na wzrost śródbłonka</td><td>ScienCell</td><td>1025</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>10100147C</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Czynnik wzrostu 1</td><td>AtaGenix</td><td>9043P-082318-A01</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>fluorescencyjny</td> FGF1 <td>Podkładka</td> grzewcza Nikon <td>ECLIPSE Ni</td><td></td></tr><tr><td>Boruida</td><td>30-50-30</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>BD</td><td>300841</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD</td><td>R510-22-10</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorium&nbsp; Balance</td><td>Sartorius</td><td>BSA124S-CW</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>Matrix</td></tr><tr><td>żel Medium 199 proszek</td><td>Gibco</td><td>31100-035</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Optymalna temperatura cięcia (OCT) Związek</td><td>SUKURA</td><td>4583</td><td>Żel do zatapiania tkanek</td></tr><tr><td>Kwas palmityniowy</td><td>KunChuang</td><td>KC001</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna Płyn</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td></td></tr><tr><td>Instrumenty chirurgiczne</td><td>RWD</td><td>RWD</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd do wstrzykiwania żył ogonowych</td><td>KEW BASIS</td><td>KW-XXY</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Solarbio</td><td>T1320</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-niska temperatura Zamrażarka</td><td>eppendorf</td><td>U410</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych</td><td>CHAMOT</td><td>CM058-5HP</td><td>VEGF</td></tr></tbody></table>

zmodyfikowany test in vivo matrix gel plug test do badań angiogenezy

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

Kilka modeli zostało opracowanych do badania angiogenezy in vivo. Jednak większość z tych modeli jest złożona i kosztowna, wymaga specjalistycznego sprzętu lub jest trudna do wykonania w celu późniejszej analizy ilościowej. W tym miejscu przedstawiamy zmodyfikowany test czopa żelowego do oceny angiogenezy in vivo. W tym protokole komórki naczyniowe zmieszano z żelem macierzowym w obecności lub braku odczynników proangiogennych lub antyangiogennych, a następnie wstrzyknięto podskórnie w plecy myszy biorcy. Po 7 dniach przez żyłę ogonową wstrzykuje się sól fizjologiczną z buforem fosforanowym zawierającą dekstran-FITC i krąży w naczyniach przez 30 minut. Zatyczki żelowe matrycy są zbierane i zatapiane żelem do zatapiania tkanek, a następnie wycinane są odcinki 12 μm w celu wykrycia fluorescencji bez barwienia. W tym teście dekstran-FITC o wysokiej masie cząsteczkowej (~150 000 Da) może być używany do wskazania funkcjonalnych naczyń do wykrywania ich długości, podczas gdy dekstran-FITC o niskiej masie cząsteczkowej (~4 400 Da) może być używany do wskazania przepuszczalności neo-naczyń. Podsumowując, protokół ten może zapewnić wiarygodną i wygodną metodę ilościowego badania angiogenezy in vivo.

Rysunek 1 przedstawia schemat blokowy przygotowania mieszaniny żelu macierzy, komórek naczyniowych, pożywki hodowlanej i odczynnika. Mieszaninę wstrzyknięto następnie podskórnie w grzbiet myszy Nu/Nu i podgrzano za pomocą maty grzewczej, aby przyspieszyć koagulację i doprowadzić do ostatecznego utworzenia się zatyczki żelowej.
Rysunek 2A przedstawia schemat blokowy wskazujący naczynia z dekstranem znakowanym fluorescencyjnie. Dekstran...

Przedstawiona tutaj metoda może ocenić wpływ odczynników na angiogenezę lub przepuszczalność naczyń in vivo bez barwienia. Metoda wykorzystuje wstrzyknięcie dekstranu-FITC przez żyłę ogonową w celu uwidocznienia naczyń nowych lub nieszczelności naczyniowej.

Zmodyfikowany test in vivo Matrix Gel Plug Test do badań angiogenezy

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...

Nasze badania dotyczą angiogenezy, czyli procesu powstawania nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących naczyń. Odgrywa kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych, takich jak nieprawidłowy rozwój, miażdżyca, rozwój guza i tak dalej. Skonstruowanie wiarygodnego modelu do oceny zakresu angiogenezy ma kluczowe znaczenie dla badań medycznych lub odkrywania leków na choroby zależne od angiogenezy.Jednak większość istniejących modeli jest złożona, droga i wymaga specjalistycznego sprzętu. Tutaj przedstawiamy zmodyfikowany test zatyczki żelowej matrycy, który można wykorzystać do badania angiogenezy i przepuszczalności naczyń bez barwienia, w jeden, bardziej intuicyjny, a także skuteczny sposób. Zacznij od przygotowania kompletnej pożywki do hodowli śródbłonka, używając 460 mililitrów pożywki z komórek śródbłonka i dodając do niej 50 mililitrów FBS, pięć mililitrów penicyliny streptomycyny i pięć mililitrów suplementu wzrostu komórek śródbłonka.Tak przygotowane podłoża można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez miesiąc. Następnie do 100-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego 0,1 miliona komórek naczyniowych dodaj osiem mililitrów przygotowanej kompletnej pożywki do hodowli śródbłonka. I hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż do osiągnięcia 70% konfluencji.Następnie wyjmij pożywkę hodowlaną z naczynia i dwukrotnie przepłucz komórki PBS, aby wyeliminować nieprzyczepione komórki i zanieczyszczenia. Po usunięciu PBS dodaj trzy mililitry 0,25% trypsyny zawierającej 2,21 milimolowego EDTA do komórek i inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Sprawdź oderwanie komórek pod mikroskopem świetlnym przy 40-krotnym powiększeniu.Zneutralizuj trypsynę siedmioma mililitrami kompletnej pożywki do hodowli śródbłonka i delikatnie spłucz komórki z naczynia hodowlanego. Odwirować zawiesinę komórkową po zebraniu jej w 15-mililitrowej probówce o natężeniu 400 G przez 10 minut. Ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach kompletnej pożywki do hodowli śródbłonka po usunięciu supernatantu.Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru i przenieś obliczoną objętość zawiesiny zawierającej 2 miliony komórek do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Osadzać komórki, odwirowując zawiesinę o sile 400 G przez pięć minut przed usunięciem supernatantu. Komórki naczyniowe są teraz gotowe do zmieszania z żelem macierzowym do testu czopów żelowych macierzy.Na początek przygotuj 10-krotną pożywkę hodowlaną M199, rozpuszczając proszek M199 do 10-krotnego stężenia w 90 mililitrach wody dejonizowanej, a następnie dodaj 10 mililitrów FBS. Przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 mikrona. Przefiltrowane podłoże można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dwóch miesięcy.Do przygotowania żelu macierzowego z komórkami naczyniowymi należy użyć około 2 milionów komórek naczyniowych. Schłodź sterylną 1,5 mililitrową probówkę zawierającą odpowiednio przygotowany osad komórkowy w łaźni lodowej. Całkowicie rozmrozić żel matrycowy w łaźni lodowej bez mieszania lub wirowania.Podobnie, schłodzić przygotowane 10-krotne podłoże hodowlane M199 wraz z odczynnikiem testowym lub lekiem będącym przedmiotem zainteresowania do czterech stopni Celsjusza. Następnie, utrzymując stosunek objętości 8,8:1,0:0,2, połącz wstępnie schłodzony żel matrycowy z wstępnie schłodzonymi 10-krotnymi mediami M199 zawierającymi 10% FBS i wstępnie schłodzonym odczynnikiem testowym, aby uzyskać mieszaninę żelu matrycowego. Na koniec ponownie zawieś wstępnie schłodzone ogniwa w 400 mikrolitrach przygotowanej mieszanki żelu matrycowego, delikatnie mieszając, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.Probówkę zawierającą komórki w żelu do matrycy należy przechowywać na lodzie, aż myszy będą gotowe do wstrzyknięcia żelu matrycowego. Na początek umieść strzykawki insulinowe o rozmiarze 30 mililitrów w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu schłodzenia. Świeżo przygotowaną mieszankę żelu macierzowego zawierającą komórki naczyniowe należy przechowywać na lodzie do czasu, aż mysz będzie gotowa do wstrzyknięcia.Następnie należy umieścić odpowiednio znieczuloną mysz na tablicy operacyjnej w pozycji leżącej i przymocować jej kończyny do tablicy za pomocą taśmy. Załaduj wstępnie schłodzoną strzykawkę insulinową 300 mikrolitrami mieszaniny żelu matrycowego, unikając tworzenia się pęcherzyków. Zdezynfekuj skórę z tyłu myszy za pomocą 75% wacików nasączonych alkoholem.Następnie wstrzyknąć podskórnie 300 mikrolitrów mieszaniny żelu matrycowego w strzykawce po jednej stronie grzbietu zwierzęcia. Delikatnie wyjąć igłę z miejsca wstrzyknięcia, aby zapobiec wyciekowi mieszaniny żelu. Upewnij się, że w miejscu wstrzyknięcia utworzy się mały garb.Umieść mysz na poduszce grzewczej na dwie minuty, aby mieszanina żelu matrycowego uległa koagulacji i utworzyła korek. Powtórz pokazane kroki, aby utworzyć wtyczkę po drugiej stronie pleców myszy. Zaznacz krawędzie garbu za pomocą markera.Zwierzę należy umieścić w specjalnym laboratorium dla zwierząt doświadczalnych wolnych od patogenów w temperaturze od 20 do 24 stopni, z 12-godzinnymi cyklami światła i 12-godzinnymi cyklami ciemności przez siedem dni. Aby wstrzyknąć myszy dekstran FITC siedem dni po wstrzyknięciu żelu matrycowego, należy ponownie zawiesić 0,5 miligrama dekstranu FITC w 500 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody. Dokładnie go zwirować, aby uzyskać jeden mikrogram na mikrolitr roztworu dekstranu FITC.Napełnij strzykawkę o rozmiarze 29 50 mikrolitrami roztworu dekstranu FITC. Przymocuj mysz do przyrządu do wstrzykiwania żyły ogonowej. Zdezynfekuj ogon wacikiem nasączonym 75% alkoholem, a następnie ostrożnie wstrzyknij 50 mikrolitrów roztworu dekstranu FITC w strzykawce do żyły ogonowej.Uciskać miejsce wstrzyknięcia wacikiem przez jedną minutę, aby zatamować krwawienie. Umieść mysz z powrotem w klatce i pozwól jej się zrelaksować przez 30 minut przed pobraniem zatyczki żelowej matrycy. Aby zebrać zatyczkę żelową, przeciąć skórę myszy poddanej eutanazji wzdłuż zaznaczonej granicy zatyczki za pomocą nożyczek chirurgicznych i usunąć skórę nad zatyczką żelową matrycy.Zebrać zatyczkę i opłukać ją w zlewce z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, aby zmyć nadmiar krwi. Następnie przykryj spód kasety do zatapiania tkanek około 0,5 mililitra żelu do zatapiania tkanek. Następnie szybko umieść zatyczkę żelową matrycy na żelu do zatapiania tkanek w zaplanowanej orientacji.Zanurz zatyczkę w dodatkowym żelu do zatapiania tkanek. Zestal kasetę w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Po wyjęciu zestalonego bloku zatyczki, wytnij odcinki o grubości 12 mikronów za pomocą mikrotomu zamrażającego.Następnie zamontuj sekcje na szkiełkach mikroskopowych.

modified-in-vivo-matrix-gel-plug-assay-for-angiogenesis-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy film prezentuje protokół testu angiogenezy in vitro, który odtwarza kilka etapów angiogenezy. Przedstawiono obrazy time-lapse ukazujące kiełkowanie, formowanie światła naczyń, rozgałęzianie oraz anastomozę – kluczowe cechy angiogenezy.

Zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

Test tworzenia cewek stosuje się do oceny aktywności naczyniowej komórek nowotworowych.

Test tworzenia rurek na Matrigelu do oceny aktywności waskulogennej komórek nowotworowych

Normalna unaczyniona tkanka ssaka dorosłego, w której nie zachodzi fizjologiczna angiogeneza i która nie była poddana interwencji chirurgicznej, jest wykorzystywana do badania: (i) inicjacji i rozwoju angiogenezy po podaniu środków testowych do jamy otrzewnej; oraz (ii) modyfikacji angiogenezy po systemowym podaniu wybranych środków testowych.

Test angiogenezy w krezoni szczura

Test tworzenia probówek jest szybką, mierzalną metodą pomiaru angiogenezy in vitro. Komórki śródbłonka łączy się z kondycjonowanymi pożywkami i plateruje ekstraktem z błony podstawnej. Tworzenie się rurki następuje w ciągu kilku godzin, a nowo utworzone kanaliki można łatwo określić ilościowo.

Test tworzenia komórek śródbłonka do badania angiogenezy in vitro

Opisujemy test czopa matrigelowego, aby zilustrować potencjał angiogenny puli czynników wydzielanych przez komórki nowotworowe za pomocą dwóch uzupełniających się metod obrazowania, ultradźwięków i endomikroskopii. Matrigel, żel naśladujący macierz zewnątrzkomórkową (ECM), jest wykorzystywany do wprowadzenia gospodarza (myszy) z czynnikami angiogennymi wydzielanymi do kondycjonowanego podłoża (CM).

Monitorowanie funkcjonalności i morfologii układu krwionośnego rekrutowanego przez czynniki wydzielane przez szybko rosnące komórki nowotworowe

Ten manuskrypt opisuje test tworzenia rurki w celu ilościowego określenia wpływu danego związku lub stanu na angiogenezę za pomocą tworzenia komórek śródbłonka w kontrolowanym środowisku.

Strategiczny test tworzenia rurki śródbłonkowej: porównanie macierzy zewnątrzkomórkowej i zredukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej czynnika wzrostu

Przedstawiamy protokół do badania interakcji między ludzkim śródbłonkiem a perycytami u myszy za pomocą wariantu testu angiogenezy z zatyczką żelową macierzy.

In vivo (in vivo) Badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy

Utrzymanie zasięgu bariery krew-mózg jest kluczowe dla homeostazy ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje techniki in vitro w celu nakreślenia podstawowych i patologicznych procesów, które modulują pokrycie bariery krew-mózg.

In vitro Testy oceniające tworzenie i rozrywanie naczyń przypominających siatkę bariery krew-mózg

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Poznaj zmodyfikowany test matrix gel plug do badania angiogenezy i przepuszczalności naczyń in vivo bez konieczności barwienia. Ta metoda umożliwia wizualizację nowych naczyń krwionośnych u myszy.

Zmodyfikowany test in vivo Matrix Gel Plug Test do badań angiogenezy

Przeglądaj więcej filmów