Name: Profilowanie fenotypowe neuronów dopaminergicznych śródmózgowia pochodzących z ludzkich komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Poznaj metodę profilowania fenotypowego neuronów dopaminergicznych śródmózgowia pochodzących z ludzkich komórek macierzystych. Technika ta umożliwia badanie wpływu związków chemicznych i mutacji genetycznych na neurony w kontekście choroby Parkinsona.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim kolegom z Ksilink za ich cenną pomoc i dyskusje, które doprowadziły do zaprojektowania prezentowanego protokołu.

1. Przygotowanie podłoża i płytek do wysiewu neuronów (Dzień 1)
<ol>
	<li>Aby przygotować płytki do wysiewu neuronów w dniu 1, podgrzej Laminin do temperatury pokojowej (RT) tuż przed użyciem. Przygotować roztwór Lamininy, rozcieńczając roztwór podstawowy Lamininy (0,1 mg/ml) 1/10 w zimnym PBS+/+ (z Ca2+ i Mg2+). 
	UWAGA: Wszystkie odczynniki są wymienione w Tabeli materiałów. Składy roztworów i opisano w tabelach 1-4.</li>
	<li>Następnie dodać 25 μl roztworu laminy do każdego dołka na 384-dołkowej płytce z poli-D-lizyną (PDL) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Powlekane płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany na okres do jednego tygodnia. Uszczelnij płyty za pomocą folii z tworzywa sztucznego.</li>
	<li>Przygotować kompletne podłoża konserwacyjne i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca (Tabela 1).</li>
</ol>
2. Rozmrażanie neuronów (Dzień 0)
<ol>
	<li>Aby rozmrozić neurony w dniu 0, podgrzej kąpiel wodną do 37 °C i zrównoważ kompletną pożywkę konserwacyjną do RT, chroniąc ją przed światłem.</li>
	<li>Wyjąć fiolkę zawierającą uzyskane w handlu zamrożone neurony (patrz tabela materiałów) ze zbiornika z ciekłym azotem i umieścić ją na suchym lodzie. Następnie umieścić fiolkę w łaźni wodnej na 2 minuty. Po całkowitym rozmrożeniu płynu zdezynfekować fiolkę 70% etanolem.</li>
	<li>Odessać rozmrożone neurony za pomocą pipety P1000 (około 370 μl) i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml bez pipetowania góra-dół. Następnie przepłukać fiolkę 630 μl pożywki Complete Maintenance Medium, dozować kropla po kropli (pod kątem 45°) do probówki o pojemności 50 ml. Mieszaj powoli podczas dozowania. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby dozować pożywkę powoli, kropla po kropli, aby uniknąć osmotycznego pęknięcia komórek. Kąt 45° i lekkie mieszanie minimalizują wysokie lokalne ciśnienie osmotyczne podczas pipetowania.</li>
	<li>Podobnie, dodaj 1 ml pożywki do kompletnej pożywki konserwacyjnej do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z pipetą P1000. Następnie powoli dodaj 2 ml pożywki Complete Maintenance Media. Ostrożnie mieszać podczas dozowania.</li>
	<li>Policz komórki. Przygotować mikroprobówkę z 10 μl błękitu trypanowego i 10 μl zawiesiny komórek i dodać do szkiełka z komory liczenia (10 μl). Liczenie należy wykonywać za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz Tabela materiałów) lub ręcznie.</li>
	<li>Po zliczeniu odwirować probówkę o pojemności 50 ml zawierającą neurony o stężeniu 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Ostrożnie zawiesić osad ponownie za pomocą pipety P1000 i 1 ml pożywki do konserwacji. Następnie dodaj niezbędną objętość, aby osiągnąć pożądane stężenie (300 000 komórek/ml, patrz również następny krok).</li>
</ol>
3. Zasiewanie neuronów na przygotowanych płytkach (Dzień 0)
<ol>
	<li>Aby wysiać neurony na przygotowane płytki w dniu 0, wyjmij pokryte płytki z lodówki, umieść je pod kapturem hodowli komórkowej i pozwól im zrównoważyć się do RT przez około 30 minut.</li>
	<li>Tuż przed wysiewem należy zassać 15 μl roztworu powlekającego za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy lub 16-kanałowej pipety. Pozostawić około 10 μl na studzienkę, aby zapobiec uszkodzeniu powłoki.</li>
	<li>Następnie dozuj 50 μl roztworu komórkowego zawierającego 300 000 komórek/ml (przygotowanego w kroku 2.6) na dołek za pomocą 16-kanałowej pipety, co daje 15 000 wysiewanych neuronów na studzienkę i końcową objętość na studzienkę 60 μl.</li>
	<li>W płytce 384-dołkowej należy unikać używania kolumn 1, 2, 23, 24 oraz rzędów A, B, O i P, aby zminimalizować możliwe efekty krawędzi, które mogą mieć wpływ na profile fenotypowe. Niewykorzystane puste studzienki należy wypełnić 80 μl PBS. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
4. Zmiana podłoża lub leczenie związkiem (Dzień 3)
<ol>
	<li>W zależności od liczby studzienek, należy wstępnie podgrzać odpowiednią ilość Complete Maintenance Medium w temperaturze pokojowej. Chronić przed światłem.</li>
	<li>Jeśli wymagana jest zmiana podłoża, przejdź do kroku 4.4. Jeśli pożądane jest traktowanie mieszanki, należy sprawdzić stężenie mieszanki i użyty rozpuszczalnik (woda, DMSO, metanol itp.).</li>
	<li>Przygotuj 1,5 x stężony roztwór związku dla wszystkich pożądanych stężeń, które mają być testowane. Przygotować rozcieńczenia złożone za pomocą Complete Maintenance Medium. 
	UWAGA: Jako neutralną kontrolę należy użyć odpowiedniego rozpuszczalnika w tym samym stężeniu, co badany związek. W przypadku stosowania wielu lub nieznanych związków w różnych stężeniach, zaleca się przeprowadzenie oddzielnego doświadczenia dawka-odpowiedź w celu zmierzenia wpływu rozpuszczalnika na profil fenotypowy.</li>
	<li>Jeśli używany jest automatyczny system pipetowania, dodaj 60 μl 1,5-krotnego roztworu związku do 384-dołkowej płytki do przechowywania. Alternatywnie można użyć pipety 16-kanałowej. Jeśli wymagana jest wymiana pożywki, dodaj zamiast niej 60 μl pożywki do konserwacji.</li>
	<li>Korzystając z automatycznego systemu pipetowania, odessać i wyrzucić 40 μl pożywki na studzienkę z płytki zawierającej neurony, aby zachować 20 μl/studzienkę. Następnie dodaj 40 μl/basenik 1,5x roztworu złożonego z 384-dołkowej płytki do przechowywania do każdego dołka, aby uzyskać pożądane stężenie końcowe. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby nie wykonywać pełnych zmian pożywki, ale zawsze pozostawiać resztkową pożywkę w studni, aby zapobiec uszkodzeniu dywanu neuronalnego lub powłoki.</li>
	<li>W przypadku, gdy hodowla neuronów jest wykonywana dłużej niż 6 dni opisanych w tym protokole, należy zmieniać pożywkę co 2-3 dni.</li>
</ol>
5. Utrwalanie i barwienie neuronów (dni 6 do 7)
<ol>
	<li>Aby naprawić i zabarwić neurony w 6 i 7 dniu, użyj automatycznego narzędzia do obsługi płynów na wszystkich etapach dozowania i mycia. Alternatywnie można użyć pipety 16-kanałowej.</li>
	<li>Przygotuj 10% roztwór Triton X-100, rozcieńczając Triton X-100 w 1x PBS. Wirować, aż roztwór będzie jednorodny. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Aby naprawić neurony, dozuj 20 μl/studzienkę 16% PFA, co daje 4% stężenie końcowe. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej i umyć ją trzykrotnie 1x PBS. Pozostawić 20 μl/studzienkę PBS po ostatnim praniu. 
	UWAGA: PFA jest uznawany za substancję niebezpieczną, o której wiadomo, że powoduje toksyczność ustną, skórną i oddechową. Stanowi również zagrożenie dla oczu i może prowadzić do mutacji genetycznych i raka. Właściwe obchodzenie się z PFA wymaga stosowania odpowiednich środków ochrony osobistej, takich jak ochrona oczu i twarzy, a także zapewnienia odpowiedniej wentylacji. Ważne jest, aby zapobiec uwalnianiu PFA do środowiska.</li>
	<li>W celu przepuszczalności i blokowania przygotuj 2x roztwór blokujący (Tabela 2).</li>
	<li>Dodać 20 μl/basenik 2x roztworu blokującego (1x stężenie końcowe), inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przemyć raz PBS. Po umyciu zachowaj 20 μl/studzienkę PBS.</li>
	<li>W przypadku barwienia przeciwciałami pierwszorzędowymi (patrz Tabela materiałów) należy przygotować 2x bufor do barwienia pierwotnego (Tabela 3).</li>
	<li>Dodać 20 μl/basenik 2x buforu do barwienia pierwotnego (1x stężenie końcowe) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego ranka, w dniu 7, przemyj trzy razy PBS. Po umyciu pozostawić 20 μl/studzienkę PBS.</li>
	<li>W przypadku barwienia przeciwciałami wtórnymi (patrz Tabela materiałów) należy przygotować 2x bufor do barwienia wtórnego (Tabela 4).</li>
	<li>Dodać 20 μl/studzienkę 2x buforu do barwienia wtórnego (1x stężenie końcowe), inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z dala od światła i przemyć trzykrotnie PBS. Pozostawić 100 μl PBS/dobrze po ostatnim praniu.
	<ol>
		<li>Dodaj aluminiowe uszczelnienie na płycie, aby zminimalizować parowanie. Alternatywnie przykryj talerz folią plastikową i folią aluminiową. Przejdź do akwizycji obrazu lub przechowuj płytkę w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany na okres do jednego tygodnia. Jeśli zaobserwuje się fluorescencję tła, rozważ wydłużenie czasu blokowania. Jeśli barwienie jest niewystarczające, spróbuj zwiększyć stężenie przeciwciał pierwotnych lub czas inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Obrazowanie fluorescencyjnie barwionych neuronów (Dzień 7)
<ol>
	<li>Uzyskaj obrazy platerowanych, hodowanych i barwionych neuronów w dniu 7. Najlepiej użyć automatycznego konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów). Możesz też pozyskać obrazy ręcznie.</li>
	<li>Uzyskaj kanały Hoechst, TH, α-synukleiny i MAP2 za pomocą laserów 405 nm, 488 nm, 561 nm i 647 nm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: Aby wygenerować wystarczającą ilość szczegółowych danych do profilowania fenotypowego, użyj obiektywu 40x i uzyskaj 16 pól/studnię za pomocą stosów Z składających się z 3 warstw Z oddzielonych od siebie 2 μm. W przypadku wystąpienia uszkodzeń dywanu neuronalnego związanych z pipetowaniem, należy unikać obrazowania tych obszarów.</li>
	<li>W zależności od mikroskopu i kamery należy oddzielnie dostosować czasy naświetlania i intensywność wzbudzenia dla każdego z czterech kanałów fluorescencyjnych, aby uzyskać optymalny zakres dynamiczny intensywności fluorescencji. 
	UWAGA: Oprogramowanie do obrazowania często udostępnia histogram w celu określenia idealnego czasu naświetlania. Jeśli histogram jest przesunięty zbyt mocno w lewo w zakresie niskiego sygnału, oznacza to, że czas ekspozycji jest zbyt krótki lub intensywność wzbudzenia jest zbyt niska. Jeśli po prawej stronie znajduje się ostry klif na maksymalnym poziomie sygnału, wartość sygnału jest nasycona. W takim przypadku należy zmniejszyć intensywność wzbudzenia lub skrócić czas ekspozycji.</li>
	<li>Przechowuj obrazy w bezstratnym i otwartym formacie, takim jak .tif.</li>
</ol>
7. Przetwarzanie obrazu (Dzień 8)
<ol>
	<li>Segmentacja obrazu i ekstrakcja cech fenotypowych są wymagane do stworzenia ilościowych profili fenotypowych. Użyj oprogramowania PhenoLink do segmentacji obrazu i ekstrakcji cech (Tabela materiałów). Instrukcje dotyczące instalacji PhenoLink można znaleźć w repozytorium GitHub (https://github.com/Ksilink/PhenoLink). 
	UWAGA: Segmentacja obrazu służy do identyfikowania i oddzielania różnych obiektów lub regionów na obrazie, podczas gdy ekstrakcja cech fenotypowych służy do analizowania i wyodrębniania odpowiednich informacji z tych regionów. Dostępnych jest kilka alternatywnych rozwiązań programowych, takich jak CellProfiler10, ImageJ/FIJI11, Napari12 lub Knime Analytics Platform13 do wyodrębniania informacji ilościowych z wielokanałowych obrazów fluorescencyjnych.</li>
	<li>Segmentacja obrazu na obrazach RAW z korekcją oświetlenia. Określ empirycznie odpowiednie progi intensywności kanału fluorescencyjnego dla każdej płytki, tak aby sygnał tła był minimalny, a żądany sygnał segmentowy odpowiadał sygnałowi na surowym obrazie. Płytki przetworzone i wybarwione tego samego dnia zazwyczaj wymagają porównywalnych progów intensywności kanału do segmentacji.</li>
	<li>Określ rozmiar i intensywność jądra, aby oddzielić żywe komórki od martwych. W przypadku korzystania z obrazów 40x zachowaj wszystkie inne parametry domyślne i uruchom oprogramowanie. Dla każdego dołka zostanie obliczonych sto dwadzieścia sześć ilościowych cech obrazu (Tabela uzupełniająca 1).</li>
	<li>Wykorzystaj uzyskane tabelaryczne dane ilościowe do skonstruowania profili fenotypowych i porównania profili fenotypowych z różnych linii komórkowych lub warunków leczenia. Każdy wiersz odpowiada warunkom biologicznym (studzienkom), a każda kolumna odpowiada określonej cechom fenotypowym. 
	UWAGA: Udostępniamy przykładowy plik wyjściowy wraz z potokiem analizy danych, aby zilustrować jego użycie (patrz Tabela materiałów). Dodatkowo, Rysunek 3 przedstawia skład profilu fenotypowego.</li>
</ol>
8. Generowanie i wizualizacja profilu fenotypowego (Dzień 8)
<ol>
	<li>Jeśli na komputerze nie są zainstalowane programy Python i Jupyter, zainstaluj dystrybucję Anaconda i otwórz oprogramowanie Jupyter. Pobierz dostarczony notes Jupyter i wszystkie inne dostarczone pliki i zapisz je w tym samym katalogu (patrz Spis materiałów). Otwórz plik notesu Jupyter przy użyciu oprogramowania Jupyter. 
	UWAGA: Anaconda to bezpłatna platforma typu open source dla języków programowania, takich jak Python. Ta platforma jest dostarczana z interpreterem języka Python Jupyter, który może wykonać dostarczony notes Jupyter w celu tworzenia i analizowania profilów fenotypowych (https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling).</li>
	<li>Wykonaj notatnik Jupyter komórka po komórce przy użyciu oprogramowania Jupyter. Podane przykładowe dane .fth i wymagania .txt plików muszą znajdować się w tym samym katalogu co notes Jupyter. Każda komórka notesu Jupyter jest opatrzona adnotacją w celu wyjaśnienia jej funkcjonalności. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby używać notatnika Jupyter we właściwej kolejności, zaczynając od ładowania i skalowania danych, a następnie przechodzić komórka po komórce do końca. Wszystkie dane wyjściowe i grafiki będą przechowywane w nowo utworzonym folderze w katalogu źródłowym notesu Jupyter. Rysunek 4 przedstawia przepływ pracy i wynik przepływu pracy.</li>
</ol>

Culturing Human Midbrain Dopaminergic Neurons for Phenotypic Profiling

<ol><li>Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of Parkinson's disease.</a> The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095(2021).</li>
<li>Caicedo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-analysis+strategies+for+image-based+cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Data-analysis strategies for image-based cell profiling.</a> Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017).</li>
<li>Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+profiling+for+drug+discovery%3A+due+for+a+machine-learning+upgrade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).</li>
<li>Bray, M. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Painting%2C+a+high-content+image-based+assay+for+morphological+profiling+using+multiplexed+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1757-1774 (2016).</li>
<li>Schiff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+deep+learning+and+unbiased+automated+high-content+screening+to+identify+complex+disease+signatures+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts.</a> Nature Communications. 13 (1), 1590(2022).</li>
<li>Ziegler, S., Sievers, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+profiling+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphological profiling of small molecules.</a> Cell Chemical Biology. 28 (3), 300-319 (2021).</li>
<li>Cobb, M. M., Ravisankar, A., Skibinski, G., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells+in+the+study+of+PD+molecular+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">iPS cells in the study of PD molecular pathogenesis.</a> Cell and Tissue Research. 373 (1), 61-77 (2018).</li>
<li>Elitt, M. S., Barbar, L., Tesar, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+for+human+genetic+diseases+using+iPSC+models%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Drug screening for human genetic diseases using iPSC models.</a> Human Molecular Genetics. 27 (R2), 89-98 (2018).</li>
<li>Vuidel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+phenotyping+of+Parkinson%27s+disease+patient+stem+cell-derived+midbrain+dopaminergic+neurons+using+machine+learning+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">High-content phenotyping of Parkinson's disease patient stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons using machine learning classification.</a> Stem Cell Reports. 17 (10), 2349-2364 (2022).</li>
<li>Stirling, D. R., Swain-Bowden, M. J., Lucas, A. M., Carpenter, A. E., Cimini, B. A., Goodman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+4%3A+improvements+in+speed%2C+utility+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Sofroniew, N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSofroniew%2C+N+%22napari%3A+a+multi-dimensional+image+viewer+for+Python%22">napari: a multi-dimensional image viewer for Python</a>. , (2022).</li>
<li>Berthold, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KNIME%3A+The+Konstanz+Information+Miner%5BTitle%5D)+AND+%22Data+Analysis%2C+Machine+Learning+and+Applications%22%5BJournal%5D)">KNIME: The Konstanz Information Miner.</a> Data Analysis, Machine Learning and Applications. , 319-326 (2008).</li>
<li>Fathi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverging+Parkinson%27s+Disease+Pathology+between+patient-derived+GBAN370S%2C+LRRK2G2019S+and+engineered+SNCAA53T+iPSC-derived+Dopaminergic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Diverging Parkinson's Disease Pathology between patient-derived GBAN370S, LRRK2G2019S and engineered SNCAA53T iPSC-derived Dopaminergic Neurons.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Wang, Y., Huang, H., Rudin, C., Shaposhnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+How+Dimension+Reduction+Tools+Work%3A+An+Empirical+Approach+to+Deciphering+t-SNE%2C+UMAP%2C+TriMap%2C+and+PaCMAP+for+Data+Visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Understanding How Dimension Reduction Tools Work: An Empirical Approach to Deciphering t-SNE, UMAP, TriMap, and PaCMAP for Data Visualization.</a> Journal of Machine Learning Research. 22 (201), 1-73 (2021).</li>
<li>Ke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LightGBM%3A+A+highly+efficient+gradient+boosting+decision+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Neural+Information+Processing+Systems%22%5BJournal%5D)">LightGBM: A highly efficient gradient boosting decision tree.</a> Advances in Neural Information Processing Systems. 30, https://papers.nips.cc/paper/2017/hash/6449f44a102fde848669bdd9eb6b76fa-Abstract.html (2017).</li>
<li>Avazzadeh, S., Baena, J. M., Keighron, C., Feller-Sanchez, Y., Quinlan, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+Parkinson%27s+Disease%3A+iPSCs+towards+Better+Understanding+of+Human+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modelling Parkinson's Disease: iPSCs towards Better Understanding of Human Pathology.</a> Brain Sciences. 11 (3), 373(2021).</li>
<li>Sánchez-Danés, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+phenotypes+in+dopamine+neurons+from+human+iPS-based+models+of+genetic+and+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson's disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (5), 380-395 (2012).</li>
<li>Oosterveen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell+derived+dopaminergic+subpopulations+model+the+selective+neuron+degeneration+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell derived dopaminergic subpopulations model the selective neuron degeneration in Parkinson's disease.</a> Stem Cell Reports. 16 (11), 2718-2735 (2021).</li>
<li>Hughes, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+high-content+cell+painting+identifies+copper+ionophores+as+selective+modulators+of+esophageal+cancer+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiparametric high-content cell painting identifies copper ionophores as selective modulators of esophageal cancer phenotypes.</a> ACS Chemical Biology. 17 (7), 1876-1889 (2022).</li>
<li>Akbarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+profiling+by+means+of+the+Cell+Painting+assay+enables+identification+of+tubulin-targeting+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphological profiling by means of the Cell Painting assay enables identification of tubulin-targeting compounds.</a> Cell Chemical Biology. 29 (6), 1053-1064 (2022).</li>
<li>Schiff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+deep+learning+and+unbiased+automated+high-content+screening+to+identify+complex+disease+signatures+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts.</a> Nature Communications. 13 (1), 1590(2022).</li>
<li>Way, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+gene+expression+profiling+provide+complementary+information+for+mapping+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Morphology and gene expression profiling provide complementary information for mapping cell state.</a> Cell Systems. 13 (11), 911-923 (2022).</li>
<li>Feng, Y., Mitchison, T. J., Bender, A., Young, D. W., Tallarico, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parameter+phenotypic+profiling%3A+using+cellular+effects+to+characterize+small-molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Multi-parameter phenotypic profiling: using cellular effects to characterize small-molecule compounds.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (7), 567-578 (2009).</li>
<li>Antonov, S. A., Novosadova, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+state-of-the-art+and+unresolved+problems+in+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+dopamine+neurons+for+parkinson%27s+disease+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Current state-of-the-art and unresolved problems in using human induced pluripotent stem cell-derived dopamine neurons for parkinson's disease drug development.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3381(2021).</li>
<li>Miller, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-based+modeling+of+late-onset+disease+via+progerin-induced+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 691-705 (2013).</li>
<li>Bezard, E., Gross, C. E., Brotchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presymptomatic+compensation+in+Parkinson%27s+disease+is+not+dopamine-mediated%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Presymptomatic compensation in Parkinson's disease is not dopamine-mediated.</a> Trends in Neurosciences. 26 (4), 215-221 (2003).</li>
<li>Wu, Y., Le, W., Jankovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Biomarkers+of+parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Preclinical Biomarkers of parkinson disease.</a> Archives of Neurology. 68 (1), 22-30 (2011).</li>
<li>Verstraelen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+quantification+of+synapses+in+primary+neuronal+culture%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Systematic quantification of synapses in primary neuronal culture.</a> iScience. 23 (9), 101542(2020).</li>
<li>Liu-Yesucevitz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS-Linked+mutations+enlarge+TDP-43-enriched+neuronal+RNA+granules+in+the+dendritic+arbor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ALS-Linked mutations enlarge TDP-43-enriched neuronal RNA granules in the dendritic arbor.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (12), 4167-4174 (2014).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są zatrudnieni przez firmę Ksilink.

Profilowanie fenotypowe to technika pomiaru dużej liczby fenotypów w komórkach poprzez zastosowanie barwienia fluorescencyjnego, mikroskopii i analizy obrazu3. Profile fenotypowe można uzyskać i porównać między liniami komórkowymi lub w innych warunkach eksperymentalnych, aby zrozumieć złożone zmiany w biologii komórkowej, które mogą pozostać niezauważone przy użyciu pojedynczego odczytu. W tym miejscu opisujemy zastosowanie profilowania fenotypowego do ludzkich neuronów mDA pochodzących z iPSC, t...

W chorobie Parkinsona (PD) zaburzona jest szereg procesów biologii komórki. Na przykład dysfunkcja mitochondriów, stres oksydacyjny, defekty degradacji białek oraz zaburzenia transportu pęcherzykowego i funkcji endolizosomalnej są powiązane z utratą neuronów dopaminergicznych istoty czarnej (mDA) i są powszechnie obserwowane w PD1. W związku z tym wydaje się, że PD obejmuje wiele mechanizmów chorobowych, które mogą na siebie oddziaływać i wzajemnie się potęgować. Jednym z przydatnych sposobów badania tych wzajemnych zależności mechanistycznych jest stworzenie kompleksowego profilu lub fenotypowego „odcisku palca” neuronów dopaminergicznych istoty czarnej (mDA).
Profilowanie fenotypowe jest podejściem, które polega po pierwsze na tworzeniu profilu próbki w oparciu o zbiór mierzalnych cech, a po drugie na formułowaniu przewidywań dotyczących próbki na podstawie tego profilu2,3. Celem profilowania jest uchwycenie szerokiego zakresu cech, z których niektóre mogły nie być wcześniej powiązane z daną chorobą lub leczeniem3. W rezultacie profilowanie może ujawnić nieoczekiwane procesy biologiczne. Profilowanie fenotypowe opiera się zazwyczaj na komórkach barwionych fluorescencyjnie, a w celu tworzenia profili fenotypowych opracowano zestandaryzowane testy, takie jak Cell Painting4. Niedawno profilowanie fenotypowe zostało zastosowane na przykład do charakterystyki małych cząsteczek lub dokładnego przewidywania podtypów PD wyłącznie na podstawie fibroblastów pochodzących od pacjentów5,6. Pomimo tych postępów, profilowanie fenotypowe rzadko było stosowane w przypadku zróżnicowanych komórek pomitotycznych, takich jak neurony mDA pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), które wykazują mutacje związane z PD, np. LRRK2 G2019S. Istotne wyzwania związane z modelami pochodzącymi z iPSC obejmują obecność subtelnych lub zmiennych cech patologicznych w różnych partiach różnicowania lub genotypach, a także fakt, że izolowane fenotypy PD nie oddają pełnej złożoności choroby. Ponadto, choć neuronalne modele iPSC są istotne fizjologicznie, rzadko są one wykorzystywane w procesach poszukiwania leków na PD ze względu na obawy dotyczące złożoności technicznej7,8.
Opracowaliśmy wcześniej solidną metodologię pomiaru wielu patofizjologicznych fenotypów związanych z PD w ludzkich neuronach mDA, która jest czuła zarówno na zmiany fenotypowe indukowane genetycznie, jak i przez związki chemiczne9. Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje dalej zoptymalizowaną wersję tej metodologii w celu tworzenia profili fenotypowych z neuronów mDA (Rycina 1). Protokół ten posiada kilka zalet w porównaniu z wcześniej opisanymi podejściami do profilowania fenotypowego, takich jak wykorzystanie wysokiej jakości neuronów mDA oraz powtarzalność techniczna. Po raz pierwszy protokół ten umożliwia profilowanie fenotypowe w fizjologicznie istotnych postmitotycznych neuronach mDA po perturbacjach chemicznych w sposób wysoce skalowalny. W pełni zróżnicowane i kriokonserwowane neurony mDA są dostępne komercyjnie, co znacznie zmniejsza zmienność różnicowania między partiami. Po drugie, zmienność techniczną można dodatkowo zredukować, stosując dobrze zdefiniowany plan eksperymentalny (np. czas trwania hodowli lub unikanie studzienek brzegowych), zautomatyzowane dozowanie cieczy oraz zautomatyzowaną mikroskopię. Dodatkowo opisano tutaj wstępne kroki analizy profilu fenotypowego z wykorzystaniem klastrowania nienadzorowanego lub metod klasyfikacji nadzorowanej, wskazując sposób analizy danych z profilowania fenotypowego. Protokół ten będzie przydatny badaczom zainteresowanym zmianami fenotypowymi neuronów mDA indukowanymi przez perturbacje genetyczne lub chemiczne, szczególnie gdy wymagana jest wysoce skalowalna konfiguracja badania, na przykład podczas kampanii przesiewowych lub przy badaniu efektów mniejszej liczby związków, np. w celu określenia efektów toksycznych. Podsumowując, przewiduje się, że zastosowanie profilowania fenotypowego ludzkich neuronów będzie cenną techniką badania złożonych fenotypów związanych z chorobą oraz charakteryzowania efektów komórkowych kandydatów na leki.
<img alt="Schemat procesu hodowli komórkowej; powlekanie płytek, rozmrażanie, wysiewanie, traktowanie, barwienie, obrazowanie, profilowanie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65570/65570fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie protokołu eksperymentalnego służącego do generowania fenotypowych profili opartych na obrazowaniu z ludzkich neuronów mDA pochodzących z iPSC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65570/65570fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Anty-kurczak &ndash; Alexa 647</td><td>Jackson ImmunoRearch</td><td>703-605-155</td><td>Immunofluorescencyjna</td></tr><tr><td>Anakonda</td><td></td><td>https://www.anaconda.com/download</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Map2</td><td>Novus</td><td>NB300-213</td><td>Immunofluorescencyjna</td></tr><tr><td>przeciw myszom - Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td>Immunofluorescencyjny</td></tr><tr><td>anty-królik - Alexa 555</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21429</td><td>Immunofluorescencja</td></tr><tr><td>Hydroksylaza antytyrozynowa</td><td>Merck</td><td>T2928</td><td>Immunofluorescencja</td></tr><tr><td>anty-&alfa;-synukleiny</td><td>Abcam</td><td>138501</td><td>Immunofluorescencja</td></tr><tr><td>Bravo Zautomatyzowana platforma do obsługi cieczy z głowicą 384ST</td><td>Agilent</td><td></td><td>Jeśli nie jest dostępna żadna maszyna do obsługi cieczy, zaleca się użycie elektronicznej pipety wielokanałowej.</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny&nbsp;</td><td>Yokogawa</td><td>CV7000</td><td>W celu zapewnienia stałej jakości obrazu zaleca się stosowanie automatycznego konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego.</td></tr><tr><td>Hrabina Automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Liczenie komórek przed siewem. Można to również zrobić za pomocą ręcznej studzienki liczącej.</td></tr><tr><td>DPBS +/+</td><td>Gibco</td><td>14040-133</td><td>Bufor do mycia</td></tr><tr><td>EL406 Dozownik do pralki&nbsp;</td><td>BioTek (Agilent)&nbsp;</td><td></td><td>Jeśli nie jest dostępna maszyna do obsługi cieczy, zaleca się użycie elektronicznej pipety wielokanałowej.</td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu (PFA 16 %)</td><td>Euromedex</td><td>EM-15710-S</td><td>Utrwalenie przed barwieniem</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Barwienie jądrowe</td></tr><tr><td>iCell Base Medium 1</td><td>Fujifilm</td><td>M1010</td><td>Podłoże bazowe dla neuronów</td></tr><tr><td>iCell DPN, Donor#01279, Fenotyp AHN, partia#106339, 1M</td><td>Fujifilm</td><td>C1087</td><td>Pozornie zdrowy dawca</td></tr><tr><td>iCell DPN, Dawca#11299, Fenotyp LRRK2 G2019S, partia fenotypu PD#106139</td><td>Dawca Fujifilm</td><td>C1149</td><td>z mutacją LRRK2 G2019S&nbsp;</td></tr><tr><td>iCell Nervous System Supplement</td><td>Fujifilm</td><td>M1031</td><td>Suplement dla podłoża bazowego</td></tr><tr><td>iCell Neural Supplement B</td><td>Fujifilm</td><td>M1029</td><td>Suplement dla podłoża bazowego</td></tr><tr><td>Jupyter Python Notebook</td><td>Własny https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling rozwojowy</td><td></td><td>Notebook do wizualizacji i klasyfikacji profilu fenotypowego na podstawie surowych danych.</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Biolamina</td><td>LN521</td><td>Powłoka płytkowa</td></tr><tr><td>PFE-360</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-120085</td><td>Inhibitor kinazy LRRK2</td></tr><tr><td>PhenoLink</td><td>Własny rozwój</td><td>https://github.com/Ksilink/PhenoLink</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>PhenoPlate 384w, powłoka</td><td>PDL Perkin Elmer</td><td>6057500</td><td>Wstępnie powlekana płytka do hodowli komórkowej i obrazowania. Płytka ta umożliwia obrazowanie wszystkich dołków przy użyciu wszystkich obiektywów mikroskopu Yokogawa CV7000.</td></tr><tr><td>Płyty magazynowe Abgene 120 &micro; L</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0781</td><td>Niezbędny do dozowania mieszanek przy użyciu systemu pipetowania Vprep. Jeśli nie jest dostępna, zaleca się użycie elektronicznej pipety wielokanałowej.</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Permeabilizacja przed lizą</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154-20ML</td><td>Oznaczanie żywych komórek</td></tr><tr><td>System pipetowania Vprep&nbsp;</td><td>Wymiana pożywki Agilent</td><td></td><td>i dozowanie mieszanki. Alternatywnie można użyć elektronicznej pipety wielokanałowej.</td></tr></tbody></table>

profilowanie fenotypowe neuronów dopaminergicznych śródmózgowia pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Phenotypic Profiling of Human Stem Cell-Derived Midbrain Dopaminergic Neurons

Choroba Parkinsona (PD) jest związana z szeregiem procesów biologicznych komórek, które powodują utratę neuronów dopaminergicznych (mDA) w śródmózgowiu. Wiele obecnych modeli komórkowych PD in vitro jest nieskomplikowanych i nie uwzględnia wielu fenotypów. Profilowanie fenotypowe w neuronach mDA pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) może rozwiązać te problemy poprzez jednoczesny pomiar szeregu fenotypów neuronalnych w typie komórki istotnym dla PD. W tym miejscu opisujemy protokół uzyskiwania i analizowania profili fenotypowych z dostępnych na rynku ludzkich neuronów mDA. Specyficzny dla neuronów panel barwienia fluorescencyjnego służy do wizualizacji fenotypów związanych z jądrem, α-synukleiną, hydroksylazą tyrozyny (TH) i białkiem związanym z mikrotubulami 2 (MAP2). Opisany protokół profilowania fenotypowego jest skalowalny, ponieważ wykorzystuje płytki 384-dołkowe, automatyczną obsługę cieczy i mikroskopię o wysokiej przepustowości. Użyteczność protokołu jest zilustrowana przy użyciu zdrowych neuronów mDA dawcy i neuronów mDA przenoszących mutację G2019S związaną z PD w genie kinazy powtórzeniowej bogatej w leucynę 2 (LRRK2). Obie linie komórkowe potraktowano inhibitorem kinazy LRRK2 PFE-360 i zmierzono zmiany fenotypowe. Dodatkowo pokazujemy, w jaki sposób wielowymiarowe profile fenotypowe mogą być analizowane przy użyciu klastrowania lub metod klasyfikacji nadzorowanej opartej na uczeniu maszynowym. Opisany protokół szczególnie zainteresuje badaczy zajmujących się modelowaniem chorób neuronalnych lub badających wpływ związków chemicznych na ludzkie neurony.

Profilowanie fenotypowe w neuronach mDA jest efektywnym sposobem ilościowego określenia wielu aspektów biologii komórkowej oraz ich zmian podczas modulacji eksperymentalnej. Aby zilustrować tę metodologię, w niniejszym badaniu wykorzystano kriokonserwowane neurony mDA od zdrowych dawców oraz od dawców z mutacją LRRK2 G2019S. Neurony te były różnicowane przez około 37 dni, są w fazie postmitotycznej i wykazują ekspresję markerów neuronalnych (TUBB3 i MAP2) oraz markerów neuronów dopaminergicznych, w tym tyrozynohydroksyla...

Ten protokół opisuje hodowlę komórek ludzkich neuronów dopaminergicznych śródmózgowia, a następnie barwienie immunologiczne i generowanie profili fenotypowych neuronów na podstawie uzyskanych mikroskopowych obrazów o wysokiej zawartości, co pozwala na identyfikację zmian fenotypowych spowodowanych modulacjami genetycznymi lub chemicznymi.

Profilowanie fenotypowe neuronów dopaminergicznych śródmózgowia pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Parkinson&#39;s disease (PD) is linked to a range of cell biological processes that cause midbrain dopaminergic (mDA) neuron loss. Many current in vitro ...

Konstruujemy profile fenotypowe zróżnicowanych komórek ludzkich, takich jak neurony. Naszym celem jest lepsze zrozumienie ogólnego wpływu leczenia związkami chemicznymi na komórki. Profile fenotypowe mogą sugerować mniej stronnicze punkty wejścia do dalszych badań mechanistycznych.Jakość protokołów różnicowania ludzkich neuronów dopaminergicznych znacznie się poprawiła, umożliwiając produkcję dużych partii jednorodnych neuronów. Ponadto obserwuje się wzrost wykorzystania automatyzacji laboratoryjnej do obsługi odtwarzalności zróżnicowanych komórek w dłuższych okresach czasu, a wykorzystanie danych opartych na obrazowaniu stało się szybsze i bardziej szczegółowe. Dużym wyzwaniem jest zapewnienie, że profile fenotypowe są zarówno policzalne, jak i powtarzalne.Aby to osiągnąć, konieczne jest wyprodukowanie jednorodnych partii neuronów i zidentyfikowanie protokołu odpowiedniego do automatyzacji. Jednak w przypadku zautomatyzowanych protokołów zawsze istnieje kompromis między techniczną wykonalnością a znaczeniem fizjologicznym. Tutaj znaleźliśmy dobry kompromis.Opracowaliśmy gotowe do użycia rozwiązanie do dokładnej charakterystyki ludzkich neuronów dopaminergicznych przy użyciu metody obrazowania. Zautomatyzowany protokół, wraz z przepływem pracy związanym z obrazami i analizą danych, umożliwi większej liczbie naukowców tworzenie neuronalnych profili fenotypowych. Chcielibyśmy lepiej zrozumieć, w jaki sposób profile fenotypowe różnią się między monogenetycznymi i idiopatycznymi postaciami choroby Parkinsona.Chcielibyśmy również zbadać zmiany w aspektach fenotypowych, gdy neurony dopaminergiczne wchodzą w interakcje z innymi typami komórek mózgowych, takimi jak na przykład mikroglej. Aby rozmrozić neurony w dniu wysiewu, podgrzej łaźnię wodną do 37 stopni Celsjusza. Należy również zrównoważyć cały środek konserwacyjny do temperatury pokojowej, jednocześnie chroniąc go przed światłem.W międzyczasie wyjmij fiolkę zawierającą komercyjnie uzyskane zamrożone neurony ze zbiornika ciekłego azotu i przenieś ją do suchego lodu. Następnie umieścić fiolkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie minuty, aby zapewnić całkowite rozmrożenie, po czym zdezynfekować fiolkę przy użyciu 70% etanolu. Za pomocą pipety P1000 przenieś około 370 mikrolitrów rozmrożonych neuronów z fiolki do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.Przepłukać pustą fiolkę 630 mikrolitrami kompletnego podłoża do konserwacji i za pomocą pipety dozować pożywkę kroplami do 50-mililitrowej probówki pod kątem 45 stopni. W podobny sposób, używając pipety P1000, dodaj jeden mililitr kompletnego podłoża konserwacyjnego do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie powoli dodaj do probówki dodatkowe dwa mililitry kompletnego podłoża konserwacyjnego.Następnie wymieszaj 10 mikrolitrów błękitu trypanowego z 10 mikrolitrami zawiesiny komórek w mikroprobówce. Następnie dodaj 10 mikrolitrów mieszaniny do szkiełka komory liczącej do liczenia komórek. Po zliczeniu komórek i przeniesieniu neuronów do 15-mililitrowej probówki, wirować w 400 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie usunąć supernatant. Za pomocą pipety P1000 ostrożnie zawiesić osad neuronu w jednym mililitrze kompletnego podłoża do konserwacji. Na koniec dodaj niezbędną objętość pożywki, aby osiągnąć pożądane stężenie do wysiewu neuronów tego samego dnia.Na początek wyjmij z lodówki wstępnie pokrytą poli-d-lizyną płytkę 384-dołkową zawierającą 25 mikrolitrów lamininy na studzienkę i wyrównaj płytkę do temperatury pokojowej przez około 30 minut pod kapturem do hodowli komórkowej. Tuż przed wysiewem należy odessać 15 mikrolitrów roztworu powlekającego z każdej studzienki za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy lub 16-kanałowej pipety. Następnie dozuj 50 mikrolitrów roztworu komórkowego zawierającego 300 000 neuronów na mililitr do każdej studzienki.Unikaj wypełniania komórek w kolumnach pierwszej, drugiej, 23 i 24 oraz w wierszach A, B, O i P, aby zminimalizować możliwe efekty krawędzi. Napełnij te nieużywane studzienki 80 mikrolitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.Podgrzej odpowiednią ilość kompletnego podłoża pielęgnacyjnego w temperaturze pokojowej i z dala od światła. Przygotować 1,5-krotnie stężony roztwór złożony dla wszystkich pożądanych stężeń, które mają być badane, przy użyciu kompletnego podłoża konserwacyjnego do rozcieńczeń. Korzystając z automatycznego systemu pipetowania, wyrzuć 40 mikrolitrów pożywki na studzienkę z płytki zawierającej neuron, pozostawiając 20 mikrolitrów pożywki na dołek.Następnie dodaj 40 mikrolitrów 1,5-krotnie stężonego roztworu związku na studzienkę, aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe. Zgodnie z pożądanym protokołem, zdrowy dawca lub mutacja LRRK2 G2019S przenosząca neurony dopaminergiczne śródmózgowia z powodzeniem hodowano przez sześć dni i leczono dimetylosulfotlenkiem lub inhibitorem kinazy LRRK2. Neurony wybarwiono barwnikiem jądrowym i przeciwciałami przeciwko alfa synukleinie, hydroksylazie tyrozynowej i MAP2.Aby przetworzyć obrazy fluorescencyjnie barwionych neuronów uzyskane za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego, użyj oprogramowania PhenoLink do segmentacji obrazu i ekstrakcji cech. W oprogramowaniu załaduj wybraną płytę, aby uzyskać dostęp do danych i wybierz żądany obraz. Aby przeprowadzić segmentację obrazu na surowych obrazach skorygowanych przez oświetlenie, dostosuj intensywność fluorescencji, aby uwidocznić różne kanały.Empirycznie określ odpowiednie progi intensywności kanału na płytkę, aby upewnić się, że żądany sygnał segmentowy odpowiada sygnałowi na surowym obrazie i zminimalizować sygnał tła. Aby oddzielić żywe komórki od martwych, określ progi wielkości jądra i intensywności. Zmierz rozmiar jądra, klikając dwukrotnie i wizualizuj wyświetlaną intensywność.W przypadku korzystania z obrazów 40x zachowaj domyślne parametry i uruchom przetwarzanie. Na podstawie uzyskanych tabelarycznych danych ilościowych skonstruuj profile fenotypowe, aby porównać różne linie komórkowe lub warunki leczenia. Wykonaj notatnik Jupyter komórka po komórce przy użyciu oprogramowania Jupyter do generowania i wizualizacji profilu fenotypowego.Obrazy podzielono na segmenty i wyodrębniono cechy fenotypowe. Określono łącznie 126 cech ilościowych, które można było zagregować w dobrze oparte profile fenotypowe. Niektóre cechy wykazywały zmiany po leczeniu złożonym.Na przykład intensywność fluorescencji alfa synukleiny w hydroksylazie tyrozynowej lub komórkach TH dodatnich zmniejszyła się po leczeniu inhibitorem kinazy LRRK2, PFE-360. Inne cechy, takie jak długość sieci neurytowej MAP2 lub stosunek neuronów TH dodatnich, wykazywały różnice tylko między badanymi liniami komórkowymi, ale nie po leczeniu złożonym.

phenotypic-profiling-human-stem-cell-derived-midbrain-dopaminergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

My, opierając się na wiedzy z biologii rozwojowej i opublikowanych badaniach, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół do efektywnego generowania neuronów dopaminergicznych A9 śródmózgowia zarówno z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co byłoby przydatne do modelowania chorób i terapii zastępczej w chorobie Parkinsona.

Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Neurony dopaminergiczne odgrywają istotną rolę regulacyjną w mózgu. Ich utrata jest związana z chorobą Parkinsona. W tym filmie pokazujemy, jak wygenerować pierwotne kultury centralnych neuronów dopaminergicznych z embrionalnego śródmózgowia myszy. Takie kultury są przydatne do badania ekstremalnej podatności tych neuronów na różne stresy.

Pierwotna hodowla mysich neuronów dopaminergicznych

Opisany jest niestandardowy protokół różnicowania komórek ES myszy w zdefiniowane populacje wysoce czystych neuronów wykazujących działające synapsy i emergentne zachowanie sieci. Analiza elektrofizjologiczna wykazała utratę przekaźnictwa synaptycznego po ekspozycji na serotypy neurotoksyny botulinowej /A-/G i neurotoksynę tężcową.

Ocena funkcjonalna neurotoksyn biologicznych w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych

W chorobie Parkinsona (PD) neurony dopaminergiczne istoty czarnej (SNc) ulegają degeneracji, co prowadzi do dysfunkcji motorycznej. W tym miejscu przedstawiamy protokół hodowli neuronów brzusznej części śródmózgowia od myszy wyrażającej eGFP napędzany sekwencją promotora hydroksylazy tyrozyny (TH), zbierania pojedynczych neuronów fluorescencyjnych z kultur i pomiaru ich transkryptomu za pomocą sekwencji RNA.

Wiarygodna identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia przy użyciu sekwencjonowania RNA i ekspresji eGFP sterowanej przez promotor TH

Protokół przedstawia przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w celu wywołania nerwowych komórek macierzystych przez infekcję wirusem Sendai, różnicowanie iNSC w neurony dopaminergiczne, przeszczepianie prekursorów DA do jednostronnie uszkodzonych modeli mysich choroby Parkinsona oraz ocenę bezpieczeństwa i skuteczności prekursorów DA pochodzących z iNSC w leczeniu PD.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Opisujemy procedurę różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w komórki neuronalne za pomocą metody wiszącej kropli. Ponadto przeprowadzamy kompleksową analizę fenotypową za pomocą RT-qPCR, immunofluorescencji, sekwencjonowania RNA i cytometrii przepływowej.

Różnicowanie i charakterystyka neuronalnych progenitorów i neuronów z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Pokazujemy automatyzację indukowanych przez człowieka hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i różnicowanie neuronów zgodne z automatycznym obrazowaniem i analizą.

Zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek

W tym filmie demonstrujemy, jak wprowadzić przewodnictwo do neuronu dopaminergicznego rejestrowanego w konfiguracji whole-cell w skrawkach mózgu szczura. Technika ta nazywa się dynamic clamp.

Zastosowanie przewodnictwa receptora NMDA w neuronach dopaminergicznych śródmózgowia szczura z wykorzystaniem techniki dynamicznej elektrodynamicznej kontroli prądu (dynamic clamp)

Poznaj metodę profilowania fenotypowego neuronów dopaminergicznych śródmózgowia pochodzących z ludzkich komórek macierzystych. Technika ta umożliwia badanie wpływu związków chemicznych i mutacji genetycznych na neurony w kontekście choroby Parkinsona.

Profilowanie fenotypowe neuronów dopaminergicznych śródmózgowia pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów