Profilowanie fenotypowe neuronów dopaminergicznych śródmózgowia pochodzących z ludzkich komórek macierzystych
July 7th, 2023
Ten protokół opisuje hodowlę komórek ludzkich neuronów dopaminergicznych śródmózgowia, a następnie barwienie immunologiczne i generowanie profili fenotypowych neuronów na podstawie uzyskanych mikroskopowych obrazów o wysokiej zawartości, co pozwala na identyfikację zmian fenotypowych spowodowanych modulacjami genetycznymi lub chemicznymi.
Konstruujemy profile fenotypowe zróżnicowanych komórek ludzkich, takich jak neurony. Naszym celem jest lepsze zrozumienie ogólnego wpływu leczenia związkami chemicznymi na komórki. Profile fenotypowe mogą sugerować mniej stronnicze punkty wejścia do dalszych badań mechanistycznych.
Jakość protokołów różnicowania ludzkich neuronów dopaminergicznych znacznie się poprawiła, umożliwiając produkcję dużych partii jednorodnych neuronów. Ponadto obserwuje się wzrost wykorzystania automatyzacji laboratoryjnej do obsługi odtwarzalności zróżnicowanych komórek w dłuższych okresach czasu, a wykorzystanie danych opartych na obrazowaniu stało się szybsze i bardziej szczegółowe. Dużym wyzwaniem jest zapewnienie, że profile fenotypowe są zarówno policzalne, jak i powtarzalne.
Aby to osiągnąć, konieczne jest wyprodukowanie jednorodnych partii neuronów i zidentyfikowanie protokołu odpowiedniego do automatyzacji. Jednak w przypadku zautomatyzowanych protokołów zawsze istnieje kompromis między techniczną wykonalnością a znaczeniem fizjologicznym. Tutaj znaleźliśmy dobry kompromis.
Opracowaliśmy gotowe do użycia rozwiązanie do dokładnej charakterystyki ludzkich neuronów dopaminergicznych przy użyciu metody obrazowania. Zautomatyzowany protokół, wraz z przepływem pracy związanym z obrazami i analizą danych, umożliwi większej liczbie naukowców tworzenie neuronalnych profili fenotypowych. Chcielibyśmy lepiej zrozumieć, w jaki sposób profile fenotypowe różnią się między monogenetycznymi i idiopatycznymi postaciami choroby Parkinsona.
Chcielibyśmy również zbadać zmiany w aspektach fenotypowych, gdy neurony dopaminergiczne wchodzą w interakcje z innymi typami komórek mózgowych, takimi jak na przykład mikroglej. Aby rozmrozić neurony w dniu wysiewu, podgrzej łaźnię wodną do 37 stopni Celsjusza. Należy również zrównoważyć cały środek konserwacyjny do temperatury pokojowej, jednocześnie chroniąc go przed światłem.
W międzyczasie wyjmij fiolkę zawierającą komercyjnie uzyskane zamrożone neurony ze zbiornika ciekłego azotu i przenieś ją do suchego lodu. Następnie umieścić fiolkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie minuty, aby zapewnić całkowite rozmrożenie, po czym zdezynfekować fiolkę przy użyciu 70% etanolu. Za pomocą pipety P1000 przenieś około 370 mikrolitrów rozmrożonych neuronów z fiolki do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.
Przepłukać pustą fiolkę 630 mikrolitrami kompletnego podłoża do konserwacji i za pomocą pipety dozować pożywkę kroplami do 50-mililitrowej probówki pod kątem 45 stopni. W podobny sposób, używając pipety P1000, dodaj jeden mililitr kompletnego podłoża konserwacyjnego do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie powoli dodaj do probówki dodatkowe dwa mililitry kompletnego podłoża konserwacyjnego.
Następnie wymieszaj 10 mikrolitrów błękitu trypanowego z 10 mikrolitrami zawiesiny komórek w mikroprobówce. Następnie dodaj 10 mikrolitrów mieszaniny do szkiełka komory liczącej do liczenia komórek. Po zliczeniu komórek i przeniesieniu neuronów do 15-mililitrowej probówki, wirować w 400 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Następnie usunąć supernatant. Za pomocą pipety P1000 ostrożnie zawiesić osad neuronu w jednym mililitrze kompletnego podłoża do konserwacji. Na koniec dodaj niezbędną objętość pożywki, aby osiągnąć pożądane stężenie do wysiewu neuronów tego samego dnia.
Na początek wyjmij z lodówki wstępnie pokrytą poli-d-lizyną płytkę 384-dołkową zawierającą 25 mikrolitrów lamininy na studzienkę i wyrównaj płytkę do temperatury pokojowej przez około 30 minut pod kapturem do hodowli komórkowej. Tuż przed wysiewem należy odessać 15 mikrolitrów roztworu powlekającego z każdej studzienki za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy lub 16-kanałowej pipety. Następnie dozuj 50 mikrolitrów roztworu komórkowego zawierającego 300 000 neuronów na mililitr do każdej studzienki.
Unikaj wypełniania komórek w kolumnach pierwszej, drugiej, 23 i 24 oraz w wierszach A, B, O i P, aby zminimalizować możliwe efekty krawędzi. Napełnij te nieużywane studzienki 80 mikrolitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.
Podgrzej odpowiednią ilość kompletnego podłoża pielęgnacyjnego w temperaturze pokojowej i z dala od światła. Przygotować 1,5-krotnie stężony roztwór złożony dla wszystkich pożądanych stężeń, które mają być badane, przy użyciu kompletnego podłoża konserwacyjnego do rozcieńczeń. Korzystając z automatycznego systemu pipetowania, wyrzuć 40 mikrolitrów pożywki na studzienkę z płytki zawierającej neuron, pozostawiając 20 mikrolitrów pożywki na dołek.
Następnie dodaj 40 mikrolitrów 1,5-krotnie stężonego roztworu związku na studzienkę, aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe. Zgodnie z pożądanym protokołem, zdrowy dawca lub mutacja LRRK2 G2019S przenosząca neurony dopaminergiczne śródmózgowia z powodzeniem hodowano przez sześć dni i leczono dimetylosulfotlenkiem lub inhibitorem kinazy LRRK2. Neurony wybarwiono barwnikiem jądrowym i przeciwciałami przeciwko alfa synukleinie, hydroksylazie tyrozynowej i MAP2.
Aby przetworzyć obrazy fluorescencyjnie barwionych neuronów uzyskane za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego, użyj oprogramowania PhenoLink do segmentacji obrazu i ekstrakcji cech. W oprogramowaniu załaduj wybraną płytę, aby uzyskać dostęp do danych i wybierz żądany obraz. Aby przeprowadzić segmentację obrazu na surowych obrazach skorygowanych przez oświetlenie, dostosuj intensywność fluorescencji, aby uwidocznić różne kanały.
Empirycznie określ odpowiednie progi intensywności kanału na płytkę, aby upewnić się, że żądany sygnał segmentowy odpowiada sygnałowi na surowym obrazie i zminimalizować sygnał tła. Aby oddzielić żywe komórki od martwych, określ progi wielkości jądra i intensywności. Zmierz rozmiar jądra, klikając dwukrotnie i wizualizuj wyświetlaną intensywność.
W przypadku korzystania z obrazów 40x zachowaj domyślne parametry i uruchom przetwarzanie. Na podstawie uzyskanych tabelarycznych danych ilościowych skonstruuj profile fenotypowe, aby porównać różne linie komórkowe lub warunki leczenia. Wykonaj notatnik Jupyter komórka po komórce przy użyciu oprogramowania Jupyter do generowania i wizualizacji profilu fenotypowego.
Obrazy podzielono na segmenty i wyodrębniono cechy fenotypowe. Określono łącznie 126 cech ilościowych, które można było zagregować w dobrze oparte profile fenotypowe. Niektóre cechy wykazywały zmiany po leczeniu złożonym.
Na przykład intensywność fluorescencji alfa synukleiny w hydroksylazie tyrozynowej lub komórkach TH dodatnich zmniejszyła się po leczeniu inhibitorem kinazy LRRK2, PFE-360. Inne cechy, takie jak długość sieci neurytowej MAP2 lub stosunek neuronów TH dodatnich, wykazywały różnice tylko między badanymi liniami komórkowymi, ale nie po leczeniu złożonym.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie opisuje protokół hodowania ludzkich komórek dopaminergicznych śródmózgowia, z uwzględnieniem barwienia immunologicznego i tworzenia profili fenotypowych neuronów poprzez obrazowanie o wysokiej zawartości. Badania mają na celu wyjaśnienie różnic fenotypowych wynikających z modyfikacji genetycznych i chemicznych, szczególnie w kontekście choroby Parkinsona.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Neurofarmakologia
Tło
- Poprawa protokołów różnicowania ludzkich neuronów dopaminergicznych.
- Automatyzacja poprawiła obsługę i powtarzalność zróżnicowanych neuronów.
- Wyzwania obejmują zapewnienie ilościowości i powtarzalności profili fenotypowych.
- Potrzeba równowagi między wykonalnością techniczną a fizjologicznym znaczeniem w zautomatyzowanych protokołach.
Cel badania
- Stworzenie profili fenotypowych dla zrozumienia wpływu związków chemicznych na neurony.
- Zbadanie różnic w profilach fenotypowych neuronów związanych z chorobą Parkinsona.
- Zbadanie interakcji neuronów dopaminergicznych z innymi typami komórek mózgowych.
Stosowane metody
- Główną platformą wykorzystaną jest hodowlania komórek, w szczególności ludzkich neuronów dopaminergicznych.
- Model biologiczny obejmuje dopaminergiczne neurony śródmózgowia od zdrowych donorów i nosicieli mutacji LRRK2 G2019S.
- Metody obejmują odmrażanie, hodowlę i leczenie neuronów, po których następuje barwienie i obrazowanie w celu analizy.
- Kluczowe kroki obejmują odmrażanie neuronów, rozkładanie ich w określonych stężeniach i leczenie roztworami związków.
- Podkreślono użycie oprogramowania PhenoLink do segmentacji obrazu i ekstrakcji cech.
Główne wyniki
- Udana hodowla neuronów dopaminergicznych, przy której dane z obrazowania umożliwiły wyodrębnienie 126 cech fenotypowych.
- Charakteryzacja reakcji neuronów na różne traktowania, ze szczególnym skupieniem na efektach inhibitorów kinazy LRRK2.
- Wgląd w różnice fenotypowe związane z tłem genetycznym i warunkami leczenia.
- Ustanowienie solidnej metody generowania ilościowych profili fenotypowych neuronów.
Wnioski
- To badanie zapewnia kompleksowy protokół charakteryzacji ludzkich neuronów dopaminergicznych, pozwalający na szersze badania w zakresie fenotypowaniu neuronów.
- Metoda umożliwia lepsze zrozumienie modeli chorobowych, szczególnie dotyczących choroby Parkinsona.
- Implikacje obejmują ulepszone ścieżki dla badań mechanizmatywnych na interakcje neuronów i różnice fenotypowe.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Phenotypic profiling of human iPSC-derived midbrain dopaminergic neurons enables multidimensional, quantitative assessment of disease-relevant cellular responses in Parkinson's disease research. This approach increases predictive confidence in early discovery by capturing complex phenotypes and supporting mechanistic de-risking for target validation. Scalable, high-content imaging workflows facilitate robust portfolio triage and cross-program comparability in neurodegeneration pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables unbiased interrogation of disease-relevant neuronal phenotypes for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by quantifying multiple cellular markers in parallel.
- Facilitates predictive confidence in target selection through multidimensional phenotypic data.
- Provides a platform for comparing genetic and compound-induced phenotypic changes.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible phenotypic assays using automated liquid handling and high-throughput imaging.
- Generates quantitative outputs across 126 features for robust compound evaluation.
- Enables scalable screening in 384-well formats for efficient assay development.
- Supports platform reuse for diverse compound and genetic perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro phenotypes with disease-relevant biomarkers for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by comparing healthy and disease-mutant neuronal responses.
- Provides mechanistic insights into compound effects in human neuronal systems.
- Facilitates cross-validation with other preclinical models when supported by phenotypic outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This phenotypic profiling workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by enabling quantitative, reproducible assessment of neuronal phenotypes in disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through multidimensional phenotypic readouts.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility with automated, high-content imaging platforms.
- Analytics: Delivers quantitative measurements and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Connects in vitro phenotypes to disease biomarkers for preclinical alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for neuronal phenotypic profiling across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegeneration research.
- Operational Value: Standardizes workflows for reproducibility and scalability in high-throughput settings.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodegeneration assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, neuronal differentiation, and high-content imaging analysis.
- Needs access to automated liquid handling, confocal microscopy, and advanced image analysis software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and data processing protocols.
- Adaptation to other neuronal subtypes or disease models may require protocol optimization.
- Balancing automation with physiological relevance is critical for robust phenotypic outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:05
Thawing Human iPSC‐Derived mDA Neurons for Seeding
4:22
Human iPSC‐Derived mDA Neurons Seeding and Compound Treatment for Phenotypic Profiling
6:53
Image Processing of Fluorescently‐Stained Human iPSC‐Derived mDA Neurons for Phenotypic Profile Generation
