Name: Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Poznaj metodę ekspresji transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów AAV. To proste i opłacalne podejście zapewnia wysoką wydajność transdukcji przy niskiej toksyczności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Robertowi Tjianowi i Xavierowi Darzacqowi za ich wsparcie i korzystanie ze sprzętu laboratoryjnego. Dziękujemy Markowi Kayowi za podarowanie plazmidów KP1 i LK03 rep/cap oraz Lukowi Vandenberghe za plazmid AAV4 rep/cap. Finansowanie zostało zapewnione przez Howard Hughes Medical Institute (34430, R. T.) oraz California Institute for Regenerative Medicine Training Program EDUC4-12790. N.W. dziękuje za finansowanie z Berkeley Stem Cell Center w ramach stypendium podoktorskiego Siebel oraz z Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) w ramach stypendium Waltera Benjamina.

Crude Vector Production and Efficient DNA Delivery in Cell Cultures

<ol><li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corrigendum%3A+An+essential+receptor+for+adeno-associated+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Corrigendum: An essential receptor for adeno-associated virus infection.</a> Nature. 539 (7629), 456(2016).</li>
<li>Nicolson, S. C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+utilizes+host+cell+nuclear+import+machinery+to+enter+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus utilizes host cell nuclear import machinery to enter the nucleus.</a> Journal of Virology. 88 (8), 4132-4144 (2014).</li>
<li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Vectors+in+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases%22%5BJournal%5D)">Viral Vectors in Gene Therapy.</a> Diseases. 6 (2), 42(2018).</li>
<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).</li>
<li>Ling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Adeno-Associated+Virus+Genome+Packaging+Puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Genetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Adeno-Associated Virus Genome Packaging Puzzle.</a> Journal of Molecular and Genetic Medicine. 9 (3), 175(2015).</li>
<li>Maurer, A. C., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus+Genome+Interactions+Important+for+Vector+Production+and+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus Genome Interactions Important for Vector Production and Transduction.</a> Human Gene Therapy. 31 (9-10), 499-511 (2020).</li>
<li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+the+adeno-associated+virus+DNA+termini+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Replication of the adeno-associated virus DNA termini in vitro.</a> Intervirology. 27 (3), 138-147 (1987).</li>
<li>Wang, X. S., Ponnazhagan, S., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+and+replication+of+adeno-associated+virus+type+2+as+well+as+vector+DNA+sequences+from+recombinant+plasmids+containing+deletions+in+the+viral+inverted+terminal+repeats%3A+selective+encapsidation+of+viral+genomes+in+progeny+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Rescue and replication of adeno-associated virus type 2 as well as vector DNA sequences from recombinant plasmids containing deletions in the viral inverted terminal repeats: selective encapsidation of viral genomes in progeny virions.</a> Journal of Virology. 70 (3), 1668-1677 (1996).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus+Serotype-Specific+Inverted+Terminal+Repeat+Sequence+Role+in+Vector+Transgene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus Serotype-Specific Inverted Terminal Repeat Sequence Role in Vector Transgene Expression.</a> Human Gene Therapy. 31 (3-4), 151-162 (2020).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concatamerization+of+adeno-associated+virus+circular+genomes+occurs+through+intermolecular+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Concatamerization of adeno-associated virus circular genomes occurs through intermolecular recombination.</a> Journal of Virology. 73 (11), 9468-9477 (1999).</li>
<li>Au, H. K. E., Isalan, M., Mielcarek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Advances%3A+A+Meta-Analysis+of+AAV+Usage+in+Clinical+Settings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Advances: A Meta-Analysis of AAV Usage in Clinical Settings.</a> Frontiers in Medicine. 8, 809118(2021).</li>
<li>Ellis, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+ex+vivo%2Fin+vitro+transduction+efficiency+of+mammalian+primary+cells+and+cell+lines+with+Nine+natural+adeno-associated+virus+%28AAV1-9%29+and+one+engineered+adeno-associated+virus+serotype%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype.</a> Virology Journal. 10, 74(2013).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
<li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Associated+Defective+Virus+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Associated Defective Virus Particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li>
<li>Meier, A. F., Fraefel, C., Seyffert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interplay+between+Adeno-Associated+Virus+and+its+Helper+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Interplay between Adeno-Associated Virus and its Helper Viruses.</a> Viruses. 12 (6), 662(2020).</li>
<li>Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+nonviral+transfection+and+adeno-associated+viral+transduction+on+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 21-32 (2004).</li>
<li>Batista Napotnik, T., Polajzer, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+due+to+electroporation+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell death due to electroporation - A review.</a> Bioelectrochemistry. 141, 107871(2021).</li>
<li>McCarty, D. M., Young, S. M. Jr, Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+and+recombinant+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors.</a> Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+AAV+system+enables+the+Cas9-mediated+correction+of+a+metabolic+liver+disease+in+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 334-338 (2016).</li>
<li>Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell culture contamination.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).</li>
<li>Parks, W. P., Melnick, J. L., Rongey, R., Mayor, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+assay+and+growth+cycle+studies+of+a+defective+adeno-satellite+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Physical assay and growth cycle studies of a defective adeno-satellite virus.</a> Journal of Virology. 1 (1), 171-180 (1967).</li>
<li>Bantel-Schaal, U., zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+DNA+of+a+defective+human+parvovirus+isolated+from+a+genital+site%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site.</a> Virology. 134 (1), 52-63 (1984).</li>
<li>Gao, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+adeno-associated+viruses+from+rhesus+monkeys+as+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 99 (18), 11854-11859 (2002).</li>
<li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clades+of+Adeno-associated+viruses+are+widely+disseminated+in+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6381-6388 (2004).</li>
<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Reports. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> Journal of Virology. 82 (12), 5887-5911 (2008).</li>
<li>Lisowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+evaluation+of+clinically+relevant+AAV+variants+in+a+xenograft+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model.</a> Nature. 506 (7488), 382-386 (2014).</li>
<li>Pekrun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+barcoded+AAV+capsid+library+to+select+for+clinically+relevant+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors.</a> JCI Insight. 4 (22), e131610(2019).</li>
<li>Colon-Thillet, R., Jerome, K. R., Stone, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+AAV+vectors+to+target+persistent+viral+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimization of AAV vectors to target persistent viral reservoirs.</a> Virology Journal. 18 (1), 85(2021).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.</a> Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).</li>
<li>Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+high-resolution+imaging+of+Ku+foci+to+decipher+mechanisms+of+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair.</a> The Journal of Cell Biology. 202 (3), 579-595 (2013).</li>
<li>Bi, X., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+rearrangement+mediated+by+inverted+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA rearrangement mediated by inverted repeats.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 93 (2), 819-823 (1996).</li>
<li>Samulski, R. J., Berns, K. I., Tan, M., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+adeno-associated+virus+into+pBR322%3A+rescue+of+intact+virus+from+the+recombinant+plasmid+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning of adeno-associated virus into pBR322: rescue of intact virus from the recombinant plasmid in human cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 79 (6), 2077-2081 (1982).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li>
<li>Sommer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+adeno-associated+virus+particles+and+empty+capsids+by+optical+density+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement.</a> Molecular Therapy. 7 (1), 122-128 (2003).</li>
<li>Zhu, J., Huang, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TLR9-MyD88+pathway+is+critical+for+adaptive+immune+responses+to+adeno-associated+virus+gene+therapy+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adeno-associated virus gene therapy vectors in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2388-2398 (2009).</li>
<li>Wagner, H., Bauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+is+not+Toll%3A+new+pathways+in+DNA+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">All is not Toll: new pathways in DNA recognition.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (2), 265-268 (2006).</li>
<li>Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+Digital+Droplet-Based+AAV+Genome+Titration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative and Digital Droplet-Based AAV Genome Titration.</a> Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titration+of+AAV-2+particles+via+a+novel+capsid+ELISA%3A+packaging+of+genomes+can+limit+production+of+recombinant+AAV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2.</a> Gene Therapy. 6 (7), 1322-1330 (1999).</li>
<li>Summerford, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-associated+heparan+sulfate+proteoglycan+is+a+receptor+for+adeno-associated+virus+type+2+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions.</a> Journal of Virology. 72 (2), 1438-1445 (1998).</li>
<li>Bell, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAV9+receptor+and+its+modification+to+improve+in+vivo+lung+gene+transfer+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2427-2435 (2011).</li>
<li>McCown, T. J., Xiao, X., Li, J., Breese, G. R., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+persistent+expression+patterns+of+CNS+gene+transfer+by+an+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Differential and persistent expression patterns of CNS gene transfer by an adeno-associated virus (AAV) vector.</a> Brain Research. 713 (1-2), 99-107 (1996).</li>
<li>Weitzman, M. D., Kyostio, S. R., Kotin, R. M., Owens, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+Rep+proteins+mediate+complex+formation+between+AAV+DNA+and+its+integration+site+in+human+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) Rep proteins mediate complex formation between AAV DNA and its integration site in human DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 91 (13), 5808-5812 (1994).</li>
<li>Miller, D. G., Petek, L. M., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vectors+integrate+at+chromosome+breakage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vectors integrate at chromosome breakage sites.</a> Nature Genetics. 36 (7), 767-773 (2004).</li>
<li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+AAV+vector+integration+into+CRISPR-induced+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High levels of AAV vector integration into CRISPR-induced DNA breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 4439(2019).</li>
<li>Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+mediated+by+adeno-associated+virus+and+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (10), 3558-3565 (2003).</li>
</ol>

A.C.M. jest konsultantem w Janssen Pharmaceuticals i pełni funkcję SAB w NewBiologix. Wszyscy pozostali autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Klonowanie 
Protokół klonowania nie ogranicza się do plazmidu pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 użytego powyżej i może być łatwo zmodyfikowany w zależności od potrzeb doświadczalnych badacza. Wiele plazmidów zawierających ITR jest łatwo dostępnych w sprzedaży online. Na przykład dostępne są plazmidy zawierające zarówno Cas9, jak i miejsce klonowania sgRNA, jednak wymagają one kilku dodatkowych etapów, takich jak hybrydyzacja oligonukleotydów i traktowanie PNK30. Ponadto można znaleźć plazmidy zawierające wielomiejscową sekwencję klonowania (MCS) z samymi ITR, bez wewnętrznych elementów regulacyjnych31. W przypadku użycia innych plazmidów, enzymy restrykcyjne (RE) stosowane do trawienia są zazwyczaj jedynymi elementami, które mogą wymagać zmiany w tym protokole. Ograniczeniem rAAV jest jednak jego ograniczona pojemność ładunku. Ze względu na fizyczne ograniczenia kapsydu, genom wektora nie powinien przekraczać 4,9 kb, wliczając w to ITR.
Podczas izolowania plazmidu z bakterii kluczowe jest użycie zestawu do midiprepu lub maxiprepu o niskiej zawartości endotoksyn lub wolnego od endotoksyn, aby zminimalizować uszkodzenia komórek podczas transfekcji lub transdukcji potrójnym plazmidem. Plazmidy z zestawów do miniprepu często zawierają więcej zanieczyszczeń, mają niższe stężenia i mniejszą ilość DNA superzwiniętego, co może wpłynąć na późniejszą produkcję rAAV, dlatego ich stosowanie nie jest zalecane.
Zrozumienie struktury i właściwości ITR jest kluczowe podczas klonowania. Po pierwsze, przeprowadzenie reakcji PCR przez ITR jest niezwykle trudne. Należy unikać projektów klonowania wymagających amplifikacji PCR przez ITR oraz ograniczyć stosowanie techniki klonowania Gibson assembly. W związku z tym preferowaną metodą klonowania do plazmidów zawierających ITR jest klonowanie z użyciem enzymów restrykcyjnych. Co więcej, niektóre primery do sekwencjonowania metodą Sangera mogą być niekompatybilne, jeśli sekwencjonowany region zawiera ITR. Zamiast tego zaleca się stosowanie primerów, które sekwencjonują w kierunku oddalającym od ITR, w głąb rdzenia genomu wektora, aby uzyskać bardziej precyzyjne wyniki sekwencjonowania. Po drugie, ITR są podatne na delecje, rearanżacje i mutacje podczas transformacji do bakterii w celu amplifikacji plazmidu32,33. Aby zminimalizować te zjawiska, zaleca się stosowanie szczepów bakterii kompetentnych z defektem rekombinacji, takich jak Stbl3, oraz inkubowanie ich w temperaturze 30 °C, aby spowolnić podziały komórkowe. Wreszcie zauważono, że mniejsze kolonie mogą odpowiadać klonom bez rearanżacji lub delecji, ponieważ te pozbawione ITR mogą wykazywać przewagę wzrostu i być większe. Dlatego zaleca się wybieranie małych kolonii.
Produkcja wektora 
Na pomyślną produkcję wektora rAAV może wpływać wiele czynników. Jednym z krytycznych elementów jest stan zdrowia komórek HEK293 lub 293T wykorzystywanych do transfekcji. Zazwyczaj idealne są niskie numery pasaży, ponieważ komórki o wysokim numerze pasażu mogą wykazywać zmienność genotypową i fenotypową, co może prowadzić do obniżenia mian rAAV. Ponadto, dla efektywnej produkcji gęstość wysianych komórek powinna wynosić 75%-90% konfluencji. Rzadki zasiew komórek skutkuje niską wydajnością wektora, ponieważ dostępna jest mniejsza liczba komórek zdolnych do jego produkcji, natomiast komórki przerośnięte nie zostaną efektywnie transfektowane.
Różnice między partiami odczynników, zapasami komórek oraz ogólna zmienność między laboratoriami wpływają na różnice w wydajności transfekcji i mianie produktu. Jednym z czynników podlegających optymalizacji, który może prowadzić do poprawy miana, jest stosunek plazmidu do PEI w reakcjach transfekcji. Krytyczne jest stosowanie świeżego (wiek &lt;1 miesiąca) PEI MAX. Zaleca się, aby jako punkt wyjścia zastosować stosunek plazmidu do PEI wynoszący 1:1, a w przypadku niskiej wydajności transfekcji lub transdukcji, przetestować kilka różnych stosunków. Optymalizacja miana jest najłatwiejsza przy użyciu transgenu z odczytem wizualnym, takiego jak użyty tutaj jako materiał wyjściowy do klonowania transgen reporterowy CMV.Luc.IRES.EGFP. Aby przeprowadzić optymalizację, należy wykonać krok 3 protokołu, używając płytki 12-dołkowej i zmniejszając dwukrotnie masę plazmidu oraz objętość odczynników (końcowa masa plazmidu wynosi 2,6 µg). Należy odpowiednio dostosować objętość PEI tak, aby odpowiadała stosunkom w zakresie od 1:0,75 do 1:3, z przyrostem o 0,25 (Rycina 6). Po 15 min każdą reakcję należy rozcieńczyć 950 µL pożywki SF. Dla wygody można przygotować master mix zawierający trzy plazmidy i zapipetować go do probówek 1,5 mL przed dodaniem PEI – patrz Plik uzupełniający 2. Należy zebrać wektor, przeprowadzić transdukcję wybranych komórek i wykonać obrazowanie. Dołek z najwyższą wydajnością transdukcji (odsetek komórek GFP+) odpowiada najwyższemu mianu i najbardziej optymalnemu stosunkowi PEI:DNA.
<img alt="Schemat przygotowania wektora AAV; mieszanie plazmidów, transfekcja PEI, etapy transdukcji komórek HEK293." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Schemat optymalizacji PEI. Schemat kroków wymaganych do optymalizacji PEI. Testowane są różne proporcje plazmidu do PEI w celu wyznaczenia stosunku optymalnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Uwagi dotyczące zbioru i miareczkowania 
Technika zamrażania i rozmrażania stosowana do zbioru wektora rAAV skutecznie lizuje komórki HEK293 w sposób umożliwiający bezpośrednie wykorzystanie klarownego lizatu do transdukcji hodowlanych komórek. Niektóre serotypy rAAV, takie jak AAV1, AAV8 i AAV9, są uwalniane z komórek podczas produkcji wektora i mogą być zbierane z pożywki hodowlanej bez cykli zamrażania i rozmrażania34. Metoda opisana w niniejszej procedurze zazwyczaj daje miana rzędu 1 x 1010 VG/mL przy użyciu kapsydów AAV2 oraz 1 x 1011 VG/mL dla AAV8. Chociaż wyższe miana można osiągnąć poprzez lizę detergentową lub inną lizę chemiczną, są one szkodliwe dla komórek w dalszych etapach wykorzystania i wymagają dodatkowego oczyszczania rAAV z lizatu. Niższe miano jest jednym z kompromisów, które badacz powinien rozważyć, określając, czy preparaty surowe są odpowiednie do jego potrzeb badawczych; jednak nieznacznie niższe miana uzyskiwane metodami opisanymi tutaj mogą bardzo dobrze transdukować wiele typów komórek (patrz wyniki reprezentatywne). Oprócz wydajności transfekcji i stanu zdrowia komórek, miana wektora różnią się w zależności od kapsydu użytego podczas produkcji rAAV oraz wielkości i sekwencji transgenu wewnątrz VG35.
Podczas pozyskiwania surowych preparatów wektorów może występować plazmidowe DNA użyte podczas transfekcji potrójnej, co w rzadkich przypadkach może prowadzić do wtórnej transfekcji w trakcie transdukcji. Co więcej, nieopakowane VGs mogą wiązać się z zewnętrzną stroną kapsydów i wywoływać wrodzoną odpowiedź immunologiczną na nagie i obce jednoniciowe DNA36,37. W związku z tym w przypadku wrażliwych typów komórek preparaty wektorów mogą wymagać trawienia DNazą i oczyszczania w celu usunięcia nieopakowanych VGs oraz plazmidów.
Jeśli chce się obliczyć miano surowego preparatu, można przeprowadzić qPCR w celu określenia liczby zapakowanych VG wewnątrz cząstek odpornych na DNazę (DRP). W skrócie, niewielką ilość surowego preparatu poddaje się trawieniu DNazą, aby usunąć DNA plazmidowe, zanieczyszczające kwasy nukleinowe lub częściowo zapakowane VG. Następnie próbkę poddaje się qPCR i kwantyfikuje chronione VG wewnątrz DRP, co pozwala uzyskać miano wyrażone w jednostkach genomu wektora na mL surowego preparatu38. Nie zaleca się przeprowadzania miareczkowania wektora za pomocą testów opartych na metodzie ELISA, które kwantyfikują miana kapsydów. W porównaniu z wirusem AAV typu dzikiego, rAAV charakteryzuje się obecnością pewnej proporcji kapsydów pustych i częściowo zapakowanych39. Test ELISA skwantyfikuje wszystkie kapsydy niezależnie od zawartości genomu i zawyży liczbę jednostek transdukcyjnych obecnych w preparacie, które wymagają zapakowanego VG.
Uwagi dotyczące transdukcji 
Wiele czynników wpływa na transdukcję rAAV, dlatego przy każdym nowym eksperymencie należy odpowiednio je rozważyć. W zależności od promotora sterującego ekspresją transgenu, początek ekspresji może nastąpić już 4 h po transdukcji (hpt), a szczyt ekspresji jest zazwyczaj osiągany do 48 hpt. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę czas od początkowego wysiewu komórek do punktu końcowego eksperymentu. Pozwala to oszacować początkowy stopień konfluencji komórek i upewnić się, że nie zrosną się one zbyt gęsto do końca badania. W przypadku zbyt wysokiej konfluencji zachowanie komórek może ulec zmianie z powodu odpowiedzi stresowej, co może zafałszować wyniki eksperymentu. Niektóre typy komórek, takie jak U2-OS, dość dobrze tolerują nadmierny wzrost/hamowanie kontaktowe. Dodatkowo mogą one wytrzymać długie okresy (48 h+) w bezsurowiczym medium warunkującym – produkcie niniejszego protokołu produkcji. Jednak wrażliwe typy komórek mogą wymagać dodania surowicy lub rozcieńczenia surowego preparatu specjalną pożywką wzrostową w celu utrzymania ich żywotności podczas transdukcji. Nieznacznie obniżona wydajność transdukcji przy użyciu pożywek zawierających surowicę jest potencjalnym kompromisem w celu zachowania stanu zdrowia komórek i powinna być rozważona przez badacza.
Zazwyczaj w przypadku szybko dzielących się komórek, optymalna początkowa konfluencja wynosi około 50% dla zastosowań, które zostaną zakończone 48 hpt. Niemniej jednak konfluencję można odpowiednio dostosować w zależności od potrzeb eksperymentu. Nie zaleca się transdukcji unieśmiertelnionych linii komórkowych typu monowarstwy przy konfluencji przekraczającej 75% ze względu na obniżoną wydajność transdukcji. Większość hodowanych typów komórek zostaje pomyślnie transdukowana i pozostaje zdrowa po nocnej inkubacji z surowymi preparatami rAAV, a następnie po zmianie na świeże medium zawierające surowicę następnego ranka.
Serotyp kapsydu jest istotnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę podczas produkcji rAAV w celu transdukcji komórki docelowej, ponieważ kapsyd jest głównym determinantem tropizmu komórkowego i późniejszej ekspresji transgenu13. AAV2 jest szeroko stosowanym serotypem ze względu na jego zdolność do efektywnej transdukcji wielu typów komórek hodowlanych12. Właściwość ta AAV2 może być przypisana proteoglikanom siarczanu heparanu (HSPGs), które służą jako główny czynnik przylegania dla AAV2, oraz wysokim poziomom HSPGs w komórkach hodowlanych wynikającym z adaptacji do wzrostu in vitro40. Inne kapsydy, takie jak AAV9, są mniej skuteczne w transdukcji szerokiego spektrum typów komórek, co można wyjaśnić ich zależnością od czynników przylegania, które nie są ekspresjonowane w takich warunkach41. Dlatego rekomendujemy AAV2 jako kapsyd pierwszego wyboru w komórkach hodowlanych, jeśli wybrana komórka docelowa nie była wcześniej testowana z rAAV w literaturze.
Należy pamiętać, że głównym ograniczeniem surowych preparatów wektorów jest fakt, iż nie nadają się one do transdukcji modeli zwierzęcych. Badania in vivo wymagają oczyszczenia preparatów oraz przeprowadzenia oceny ich jakości.
Ekspresja transgenu i kwestie potencjalnej integracji 
rAAV nie prowadzą w sposób niezawodny do permanentnej ekspresji transgenu. Z czasem genomy wirusowe (VG) mogą ulec wyciszeniu, a ekspresja transgeniczna może zostać zahamowana po kilku pasażach42. Ponadto większość VG pozostaje w formie episomalnej, a rAAV nie zawierają wirusowych białek Rep, które pośredniczyłyby w częstej integracji z genomem gospodarza, jak ma to miejsce w lizogennej infekcji wirusa typu dzikiego, ani nie promowałyby replikacji VG43. W konsekwencji episomy w transdukowanych komórkach będą z czasem rozcieńczane w komórkach potomnych w wyniku podziałów.
Integracja na poziomie podstawowym jest możliwa dla całego dostarczonego transgenicznego materiału DNA. Jednakże wektory genomowe (VG) zawierające sekwencje ITR wykazują tendencję do integracji z wyższą częstotliwością44. W związku z tym w niewielkiej podgrupie komórek może zostać zaobserwowana trwała ekspresja transgenu. Użytkownicy powinni wziąć pod uwagę tę możliwość, szczególnie podczas stosowania rAAV do dostarczania enzymów tnących DNA, takich jak Cas9, ponieważ pęknięcia dwuniciowe mogą prowadzić do jeszcze większej częstotliwości integracji i trwałej ekspresji45. Choć czyni to rAAV dobrym kandydatem do dostarczania matryc do naprawy sterowanej homologią w celu znakowania endogennego lub dodawania genów, należy rozważyć możliwość insercji Cas919,46.

Wyjaśnienie molekularnych podstaw funkcji komórkowych często wymaga ekspresji transgenicznego DNA w hodowli komórkowej. Aby doszło do ekspresji, transgeny muszą przeniknąć przez selektywną błonę komórkową i dotrzeć do jądra1,2. Zatem zdolność do skutecznego ominięcia fizycznych barier komórki i manipulowania jej procesami centralnymi jest niezbędna do zastosowania transgenezy w celu odkrywania nowych zjawisk biologicznych. Jedno z podejść wykorzystuje naturalną zdolność wirusów do dostarczania i ekspresji obcego DNA3,4.
Wirus towarzyszący adenowirusom (AAV) jest jednym z najmniejszych wirusów ssaków: jego jednoniciowy genom DNA o długości 4,7 kilobazy (kb) zawiera dwa geny, rep (kodujący replikazę) i cap (kodujący kapsyd), zapakowane w 60-merowy kapsyd ikosaedryczny o rozmiarach 25 nm. Geny rep/cap posiadają wiele promotorów, ramek odczytu i produktów splicingu, które kodują co najmniej dziewięć unikalnych białek niezbędnych do replikacji, produkcji i pakowania wirusa5,6. Dodatkowo oba końce genomu zawierają struktury drugorzędowe nazywane odwróconymi powtórzeniami końcowymi (ITRs), które są niezbędne do replikacji DNA, pakowania genomu oraz dalszego przetwarzania podczas transdukcji7,8,9,10. ITRs są jedynymi elementami DNA wymaganymi do zapakowania genomu do kapsydu, w związku z czym AAV może być klonowany w celu dostarczania transgenów poprzez zastąpienie wirusowych genów rep/cap wybranymi przez badacza elementami regulacyjnymi i/lub genami zainteresowania6. Powstały rekombinowany AAV (rAAV) z zaprojektowanym genomem wektora (VG) jest szeroko stosowany w klinice w terapii genowej ludzi i odniósł wiele sukcesów11. Niedocenianym zastosowaniem tego wektora jest praca laboratoryjna; rAAV mogą efektywnie zapewniać ekspresję transgenu w hodowlach komórkowych, aby zaspokoić potrzeby eksperymentalne badacza12.
Najpowszechniejszą metodą produkcji rAAV jest transfekcja trzech plazmidów do komórek HEK293 lub 293T (Rycina 1). Pierwszy plazmid, zazwyczaj nazywany plazmidem cis, zawiera pożądany transgen flankowany przez sekwencje ITR (pAAV). W zależności od zastosowania, dostępne w sprzedaży są plazmidy cis z powszechnymi elementami, takimi jak silne promotory lub narzędzia oparte na systemie CRISPR. Drugim jest plazmid pRep/Cap, który zawiera geny rep i cap AAV typu dzikiego dostarczone w trans — tj. na oddzielnym plazmidzie niezawierającym ITR, który koduje elementy regulacyjne i strukturalne oddziałujące następnie z plazmidem cis — i jest on zatem nazywany plazmidem trans. Oprócz fizycznego zamykania VG wewnątrz, kapsyd wpływa na tropizm komórkowy12,13. Dzięki dostarczeniu specyficznego dla serotypu genu cap w trans, badacze mogą łatwo zmaksymalizować wydajność transdukcji, wybierając zoptymalizowany serotyp kapsydu dla danej komórki docelowej. Wreszcie, jako Dependoparvovirus, AAV wymaga wirusa pomocniczego do aktywacji ekspresji rep/cap z jego promotorów wirusowych, co jest osiągane za pomocą adenowirusowych genów pomocniczych dostarczonych na trzecim plazmidzie, takim jak pAdΔF614,15. Po 72 h od transfekcji trzech plazmidów, wektor może zostać uwolniony z komórek producenta do pożywki hodowlanej poprzez wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania. Następnie zbiera się całą zawartość płytki, a duże fragmenty komórkowe są usuwane przez wirowanie; otrzymany nadsącz z pożywki stanowi surowy preparat rAAV gotowy do dalszych transdukcji.
<img alt="Proces transfekcji genów; schemat wysiewania komórek HEK 293(T), pozyskiwania wektora i cyklu transdukcji komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd produkcji surowego wektora rAAV. Produkcja i transdukcja surowego rAAV mogą zostać zrealizowane w ciągu 5 dni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig01largev2.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
rAAV może być korzystniejszy w dostarczaniu transgenów w porównaniu z innymi metodami transfekcji, które są zazwyczaj wiązane z cytotoksycznością, niską wydajnością oraz kosztownymi odczynnikami i sprzętem, jak ma to miejsce w przypadku elektroporacji lub transfekcji chemicznej/lipidowej16,17. rAAV omija te przeszkody i często zapewnia silną ekspresję transgenu przy minimalnej toksyczności i niewielkim nakładzie pracy manualnej. Co istotne, produkcja rAAV i jego zastosowanie w hodowlach komórkowych jest proste i rzadko wymaga oczyszczania wektora z pożywki hodowlanej (Rycina 1). Ponadto rAAV nie integruje swojego VG z genomem gospodarza, w przeciwieństwie do dostarczania transgenów za pomocą lentiwirusów, co zmniejsza ryzyko mutagenezy insercyjnej18. Pomimo potencjalnych korzyści z użycia rAAV do dostarczania transgenów, należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia. Ważne jest, aby rozmiar transgenu, wliczając w to ITRs, nie przekraczał 4.9 kb ze względu na fizyczne ograniczenia kapsydu, co limituje możliwość efektywnego dostarczania dużych elementów regulacyjnych i transgenów. Ponadto, ponieważ rAAV jest wirusem nieintegrującym, transdukcja skutkuje przejściową ekspresją transgenu w komórkach dzielących się i może nie być praktyczna w przypadku chęci uzyskania stabilnej ekspresji. Niemniej jednak, w celu stabilnej insercji sekwencji w specyficznych locusach genomicznych, badacz może zastosować metody wykorzystujące podwójny system rAAV do dostarczania Cas9 oraz matryc naprawy kierowanej homologią (HDR)19.

<table><tbody><tr><td>Snapgene DNA do przeglądania sofrware</td><td>Snapgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40</td><td>AddGene</td><td>105533</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/2 (Rep/Cap)</td><td>AddGene</td><td>104963</td><td></td></tr><tr><td>pAd&Delta; F6</td><td>AddGene</td><td>112867</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Carbenicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0418</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy inkubator Boekel Scientific Economy</td><td>Boekel Scientific</td><td>133000</td><td></td></tr><tr><td>LB podłoże, proszek</td><td>MP Biomedicals</td><td>113002042</td><td></td></tr><tr><td>Karpencylina (disód)</td><td>GoldBio</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>Nowy Brunszwik I26 Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>M1324-0000</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki wirówkowe</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22627040</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12945</td><td></td></tr><tr><td>PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPS</td><td>USA Scientific</td><td>1402-3900</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler nexus</td><td>Eppendorf</td><td>6333000022</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Buffer</td><td>NEB</td><td>B0518S Dostarczany</td><td>przy zakupie Phusion Polymerase</td></tr><tr><td>Phusion&nbsp; Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik w żelu, pomarańczowy (6X)</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean & Concentrator-100</td><td>Zymo</td><td>D4029</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel Zestaw do odzyskiwania DNA</td><td>Zymo</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Bufor CutSmart (10x)</td><td>NEB</td><td>B6004S Dostarczany</td><td>z zakupem enzymu restrykcyjnego</td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16500100</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Bufor reakcyjny ligazy DNA T4</td><td>NEB</td><td>B0202S Dostarczany</td><td>przy zakupie probówek T4 Ligase</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock (1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Precision Microprocessor Water Bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221046</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne plastikowe probówki hodowlane</td><td>Fisher Scientific</td><td>149566B</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml Probówka do mikrowirówek</td><td>Thomas Scientific</td><td>1149Y01</td><td></td></tr><tr><td>ZR Plasmid Miniprep - Klasyczny</td><td>Zymo</td><td>D4015</td><td></td></tr><tr><td>Xma1</td><td>NEB</td><td>R0180S</td><td></td></tr><tr><td>Sma1</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T komórki</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6-well</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronian</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 Sanyo MCO-18AIC(UV) Marshall</td><td>Scientific</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX (Chlorowodorek polietyleniny)</td><td>Polysciences</td><td>24765-100</td><td></td></tr><tr><td>Mikser Vortex Genie 2</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>102091-234</td><td></td></tr><tr><td>Sanyo Ultra niska zamrażarka Sanyo</td><td></td><td>14656-15267-16219</td><td></td></tr><tr><td>INCU-Line IL 10 z przezroczystym okienkiem</td><td>VWR</td><td>390-0384</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówki Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-005</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 96-well</td><td>Myszy Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Szczep</td><td>#000664</td><td></td></tr><tr><td>organoidowe podłoże wzrostowe</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>6005</td><td></td></tr><tr><td>L Komórki Wnt-3A</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>amid nikotynamidu</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor ROCK</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72052</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Membrana podstawna o obniżonym czynniku wzrostu (GFR)</td><td>Fisher</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>Fisher</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 z 15 mM HEPES</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>polibrene</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowe płytki</td><td>Fisher</td><td>08-772-3D</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Szkło nakrywane z komorą Nunc Lab-Tek</td><td>Fisher</td><td>12-565-470</td><td></td></tr><tr><td>Komórki BeWo</td><td>ATCC</td><td>CCL-98</td><td></td></tr><tr><td>F-12K Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Hepa1-6</td><td>ATCC</td><td>CRL-1830</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td> UC <td>Berkeley Zakład hodowli komórkowych BSD</td><td>HUH-7</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>HSkMC</td><td>ATCC</td><td>PCS-950-010</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek mięśni szkieletowych</td><td>Sigma</td><td>C-23060</td><td></td></tr><tr><td>Medium do różnicowania mięśni szkieletowych Sigma</td><td></td><td>C-23061</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; Cyfrowy kolorowy mikroskop fluorescencyjny EVOS</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-340</td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Opera Phenix</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH14001000</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate 96-dołkowy</td><td>Perkin Elmer</td><td>6055302</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoki poziom glukozy, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej</td><td>Suplement Thermo-Fisher</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo-Fisher</td><td>35050079</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/5 (Rep/Cap)</td><td>Addgene</td><td>104964</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/8 (Rep/Cap)</td><td>Addgene</td><td>112864</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap)</td><td>Addgene</td><td>130878</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/9n (Rep/Cap)</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td></td></tr><tr><td>pAnc80L65AAP</td><td>Addgene</td><td>92307</td><td></td></tr><tr><td>KP1 (rep/cap)</td><td></td><td></td><td>podarowany przez profesora Marka Kaya (Uniwersytet Stanforda)</td></tr><tr><td>LK03 (rep/cap)</td><td></td><td></td><td>podarowany przez profesora Marka Kaya (Uniwersytet Stanforda)</td></tr><tr><td>pAAV4 (rep/cap)</td><td></td><td></td><td>podarowany przez profesora Luka Vandenberghe (Harvard Medical School)</td></tr><tr><td>pAAV.Cas9.sgRNA</td><td>Addgene</td><td>61591</td><td></td></tr><tr><td>pAAV.MCS</td><td>Addgene</td><td>46954</td><td></td></tr><tr><td>gBlock (syntetyczne DNA)</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Transgene Expression in Cultured Cells Using Unpurified Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors

Rekombinowane wektory wirusowe związane z adenowirusem (rAAV) mogą osiągnąć silną i trwałą ekspresję transgenu bez integracji w szerokim zakresie typów tkanek, co czyni je popularnym wyborem do dostarczania genów w modelach zwierzęcych i w warunkach klinicznych. Oprócz zastosowań terapeutycznych, rAAV są użytecznym narzędziem laboratoryjnym do dostarczania transgenów dostosowanych do potrzeb eksperymentalnych badacza i celów naukowych w hodowanych komórkach. Niektóre przykłady obejmują egzogenne geny reporterowe, kasety nadekspresji, interferencję RNA i narzędzia oparte na CRISPR, w tym te do badań przesiewowych całego genomu. Transdukcja rAAV jest mniej szkodliwa dla komórek niż elektroporacja lub transfekcja chemiczna i nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu ani drogich odczynników do produkcji. Surowe lizaty lub kondycjonowane pożywki zawierające rAAV mogą być dodawane bezpośrednio do hodowanych komórek bez dalszego oczyszczania w celu transdukcji wielu typów komórek - niedoceniana cecha rAAV. W tym miejscu przedstawiamy protokoły podstawowego klonowania kaset transgenowych i pokazujemy, jak produkować i stosować surowe preparaty rAAV do hodowanych komórek. Jako dowód zasadności demonstrujemy transdukcję trzech typów komórek, które nie zostały jeszcze zgłoszone w zastosowaniach rAAV: komórek łożyska, mioblastów i organoidów jelita cienkiego. Omawiamy odpowiednie zastosowania surowych preparatów rAAV, ograniczenia rAAV w dostarczaniu genów oraz rozważania dotyczące wyboru kapsydu. Protokół ten przedstawia prostą, tanią i skuteczną metodę dla badaczy, która pozwala osiągnąć produktywne dostarczanie DNA w hodowli komórkowej przy użyciu rAAV bez konieczności pracochłonnego miareczkowania i oczyszczania.

Wyznaczanie optymalnego kapsydu do transdukcji wybranych hodowli komórkowych 
W celu określenia tropizmu różnych serotypów kapsydów poddano transdukcji szereg typów komórek (Rycina 5). Naturalne serotypy AAV214, AAV421, AAV522, AAV823, AAV924 oraz zmodyfikowane warianty kapsydów Anc8025, DJ26, LK0327 i KP128 zapakowano z genomem wektora ekspresyjnym dla mScarlet pod promotorem CMV, sklonowanym zgodnie z metodami opisanymi w niniejszym protokole. Nietytrowane surowe preparaty wektorów rozcieńczono w odpowiednich mediach hodowlanych, a komórki transdukowano przez ponad 24 h, po czym wykonano obrazowanie (Rycina 5B). Wydajność transdukcji obliczono jako proporcję całkowitej liczby komórek mScarlet+ lub proporcję komórek w pojedynczej płaszczyźnie z, które były mScarlet+ (w przypadku organoidów jelita cienkiego myszy; Rycina 5C). Wydajności transdukcji (komórki mScarlet+) nie podano dla zróżnicowanych miotub C2C12 i HSkMC, lecz dla niezróżnicowanych mioblastów C2C12 i HSkMC (Rycina 5A).
AAV2 i KP1 okazały się najsilniejszymi serotypami we wszystkich badanych liniach komórkowych (Rysunek 5A). Zaobserwowano również, że podobne typy komórek pochodzące od różnych gatunków są transdukowane z różną wydajnością. Na przykład Hepa1-6 (linia komórek wątroby pochodzenia mysiego) wykazuje wyraźny spadek poziomu transdukcji w porównaniu z Huh7 (linia komórek wątroby pochodzenia ludzkiego) przy zastosowaniu AAV2 (Rysunek 5B). Ponadto istotną rolę podczas transdukcji odgrywają różne warunki hodowlane. Organoidy jelita cienkiego myszy (mSIOs) hodowane w pożywce przedtransdukcyjnej są transdukowane mniej efektywnie niż te hodowane w pożywce do wzrostu organoidów (Rysunek 5C). Dodatkowo AAV2 wydajnie transdukuje niedróżnicujące się mioblasty HSkMC oraz zróżnicowane miotuby HSkMC (Rysunek 5B), choć analiza ilościowa miotub jest trudna, w związku z czym nie została przedstawiona.
Wysoka wydajność transdukcji zaobserwowana dla różnych typów komórek na Rysunku 5 wykazuje, że surowe preparaty wektorów mogą być skutecznie wykorzystywane do transdukcji wielu typów komórek bez konieczności przeprowadzania dodatkowych etapów, takich jak oczyszczanie i miareczkowanie. Należy jednak zachować szczególną ostrożność przy wyborze kapsydu, aby zmaksymalizować dostarczanie transgenu. Wiele innych linii komórkowych i kapsydów zostało wcześniej przetestowanych i opisanych w publikacjach, choć z zastosowaniem oczyszczonych preparatów wektorów12.
Efekt warunków hodowlanych, niezależny od cząsteczek wektora, może wpływać na wydajność transdukcji. Powszechnie przyjmuje się jednak, że tropizm (tj. swoiste dla typu komórki pobieranie i ekspresja wektora) jest cechą specyficzną dla kapsydu29. Do tej pory nie zaobserwowano, aby porównanie surowych i oczyszczonych preparatów o tej samej dawce wpływało na tropizm komórkowy. W związku z tym surowe preparaty wektorowe mogą być stosowane w hodowlach komórkowych w podobny sposób jak wektory oczyszczone.
<img alt="Analiza ekspresji genów w liniach komórkowych; schemat, obrazowanie fluorescencyjne, mScarlet, Hoechst, wykres danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Surowa transdukcja wektorem różnych typów komórek. (A) Procent komórek mScarlet+ po dodaniu różnych wektorów AAV zawierających transgen mScarlet. (B) Komórki wykazujące ekspresję mScarlet dostarczonego za pomocą serotypu AAV 2. Paski skali: 100 µm (Hepa1-6, Huh7, C2C12 oraz HSkMC), 200 µm (BeWo), 20 µm (mSIO). Skróty: hpt = godziny po transdukcji. (C) Mysie organoidy jelita cienkiego (mSIOs) były traktowane rAAV w pożywce przedtransdukcyjnej lub pożywce do wzrostu organoidów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Arkusz obliczeniowy dla transfekcji potrójnej plazmidowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/TriplePlasmidTransfection_Worksheet_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Arkusz optymalizacji PEI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/PEIoptimization_Worksheet_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Rekombinowany wirus związany z adenowirusem (rAAV) jest szeroko stosowany do klinicznego i przedklinicznego dostarczania genów. Niedocenianym zastosowaniem rAAV jest silna transdukcja hodowanych komórek bez konieczności oczyszczania. Dla badaczy, którzy są nowicjuszami w rAAV, udostępniamy protokół klonowania kaset transgenowych, produkcji prymitywnych wektorów i transdukcji kultur komórkowych.

Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) can achieve potent and durable transgene expression without integration in a broad range of tissue ...

Terapia genowa wykorzystuje kapsyd wirusowy do wprowadzenia DNA do komórek, a następnie komórki przetwarzają to DNA za pomocą mechanizmów, które nie są w pełni zrozumiałe. Badając, w jaki sposób komórka przetwarza DNA dostarczone przez AAV, mamy nadzieję poprawić bezpieczeństwo, skuteczność i długowieczność terapii genowych AAV. Badanie przetwarzania DNA AAV na poziomie tkanek lub organizmów było dość trudne.Podczas gdy opracowywaliśmy protokoły transdukcji hodowli komórkowych do wizualizacji AAV za pomocą mikroskopii superrozdzielczości, odkryliśmy, że prostota produkcji i stosowania nieoczyszczonych preparatów AAV w hodowlach komórkowych nie jest dobrze znana. Ta prosta metoda ekspresji przejściowej może być korzystna dla badaczy z wielu dziedzin. Tworzenie surowych preparatów AAV jest dość proste, a do tego mają one długi okres trwałości F4C, co pozwala na wykorzystanie ich w licznych eksperymentach.Ich stosowanie jest proste, co czyni je czasooszczędną i opłacalną alternatywą dla standardowych odczynników do transfekcji. Często surowe preparaty AAV są bardziej wydajne i mniej toksyczne niż transfekcja. Wektrologia ma dwa ramiona, produkcję i transdukcję, i obie są całkowicie zależne od maszynerii komórkowej gospodarza.Nasze przyszłe badania mają na celu zidentyfikowanie maszynerii komórkowej zaangażowanej w te procesy i sposobów manipulowania nią, abyśmy mogli poprawić wydajność produkcji i transdukcji. Zrozumienie podstawowej biologii leżącej u podstaw obu gałęzi wektrologii ma kluczowe znaczenie dla powodzenia terapii genowych.

transgene-expression-cultured-cells-using-unpurified-recombinant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym artykule opisujemy identyfikację serotypu 3 wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV3) jako najskuteczniejszego wektora do celowania w ludzkie komórki raka wątroby.<br...

Wysokoefektywna transdukcja komórek raka wątroby za pomocą wektorów rekombinowanego wirusa adeno-zależnego serotypu 3

Wektory rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom (rAAVs) stają się coraz bardziej cenne w badaniach in vivo na zwierzętach. Opisujemy, w jaki sposób rAAVs mogą być produkowane w laboratorium oraz jak można oznaczać miano tych wektorów, aby uzyskać dokładny odczyt liczby wyprodukowanych cząstek zakaźnych.

Produkcja i miareczkowanie rekombinowanych wektorów wirusowych opartych na wirusie towarzyszącym adenowirusom (AAV)

Prezentujemy podstawową technikę inżynierii molekularnej i ewolucji syntetycznych wektorów do terapii genowej opartych na wirusach towarzyszących adenowirusom (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA (DNA family shuffling). Ponadto przedstawiamy ogólne wytyczne oraz reprezentatywne przykłady selekcji i analizy poszczególnych chimerycznych kapsydów o ulepszonych właściwościach w odniesieniu do komórek docelowych w hodowli lub u myszy.

Inżynieria i ewolucja syntetycznych wektorów terapii genowej opartych na wirusach adeno-zależnych (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA

Transfer genu adenowirusowego do naiwnych limfocytów T CD4 z transgeniczną ekspresją receptora adenowirusa Coxsackie umożliwia molekularną analizę różnicowania regulatorowych limfocytów T in vitro.

Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg

Wstrzyknięcie dordzeniowe rekombinowanego rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) może być użyte do manipulowania dowolnym genetycznie znakowanym typem komórki w rdzeniu kręgowym. Tutaj opisujemy, jak transdukować neurony w rogu grzbietowym lędźwiowego rdzenia kręgowego. Technika ta umożliwia funkcjonalne badanie zmanipulowanego podtypu neuronu.

Ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego

Tutaj opisujemy efektywną i powtarzalną strategię produkcji, mianowania i kontroli jakości partii wektorów wirusowych związanych z adeno. Pozwala na uzyskanie preparatu wektorowego o wysokim mianie (≥1 x10 13 genomów wektorowych/ml) i wysokiej czystości, gotowego do użycia in vitro lub in vivo.

Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Tutaj prezentujemy protokół produkcji adenowirusa za pomocą systemu pAdEasy. Technologia obejmuje rekombinację plazmidów pAdTrack i pAdEasy-1, pakowanie i amplifikację adenowirusa, oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej, miareczkowanie wirusa oraz testowanie funkcjonalne adenowirusa.

Skuteczna metoda produkcji adenowirusa

Opisano metody generowania dużych ilości rekombinowanych adenowirusów, które następnie mogą być użyte do transdukcji rodzimego nabłonka dróg moczowych gryzoni, co pozwala na ekspresję transgenów lub regulację w dół produktów genów endogennych.

Ekspresja transgenów w natywnym nabłonku dróg moczowych pęcherza moczowego za pomocą transdukcji za pośrednictwem adenowirusa

Wirus związany z adenowirusem jest wytwarzany w hodowli komórek zawiesinowych i oczyszczany przez wirowanie w gradiacji gęstości podwójnego jodixanolu. Uwzględniono kroki mające na celu zwiększenie całkowitej wydajności wirusa, zmniejszenie ryzyka wytrącania się wirusa i dalszą koncentrację końcowego produktu wirusowego. Oczekiwane końcowe miana osiągają10-12 cząstek wirusa/ml i nadają się do przedklinicznego stosowania in vivo.

Produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Poznaj metodę ekspresji transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów AAV. To proste i opłacalne podejście zapewnia wysoką wydajność transdukcji przy niskiej toksyczności.

Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem (Wideo) | JoVE Journal

Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Przeglądaj więcej filmów