Zintegrowane tworzenie kości poprzez kostnienie endochrzęstne in vivo przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych

Nasze badania mają na celu opracowanie metody, która poprawi brak przepływu krwi i będzie mogła być stosowana w przypadku dużych ubytków kostnych. Przedstawiony tutaj protokół jest zgodny z podejściami, które przyjęliśmy w tym celu. Podejście do tworzenia kości za pomocą sztucznego wkładu, struktury naśladującej naturalny proces rozproszenia rozwija się podczas embriogenezy.

Takie podejście jest stosunkowo nowe w badaniach nad regeneracją kości. Ma tę zaletę, że indukuje neogenezę żelaza, która nie jest obecnie stosowaną metodą w krytycznej praktyce, z wyjątkiem unaczynionego przeszczepu kości. Tradycyjnie, w badaniach nad regeneracją kości stosowano techniki, które łączą komórki siły, biomateriały i czynniki wzrostu samodzielnie lub w połączeniu.

Metoda tworzenia kości poprzez wszczepienie sztucznej chrząstki wykorzystuje technikę, która wytwarza sztuczną chrząstkę poprzez zmieszanie komórek macierzystych z biomateriałami, które służą materiałowi rusztowania i indukują różnicowanie chrząstki. Kliniczne wyleczenie ubytku kostnego pacjenta wymaga dużej ilości wysokiej jakości sztucznej chrząstki. Nasz protokół odpowiada na wyzwanie, jakim jest produkcja wysokiej jakości sztucznej chrząstki oraz sposób na to, jak sprawić, by wiele chrząstek łączyło się ze sobą, tworząc jednolitą kość.

Nasz protokół pomaga generować większą, wyższej jakości chrząstkę z mniejszą liczbą komórek niż protokoły, które wykorzystują lub nie wykorzystują innych materiałów rusztowania do tworzenia sztucznej chrząstki. Co więcej, protokół może wygenerować jeden zintegrowany fragment kości, nawet w przypadku wszczepienia wielu fragmentów in vivo. Jest to o tyle istotne, że przygotowanie klinicznej chrząstki o kształcie i wielkości dopasowanej do ubytku kostnego jest niepraktyczne.

Zacznij od trypsynizacji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, aby stworzyć zawiesinę komórkową. Następnie podziel zawiesinę komórek na 1,5 mililitrową rurkę, aby utworzyć 10 konstruktów. Po odwirowaniu zawiesiny o sile 220 G przez trzy minuty, użyć pompy próżniowej do usunięcia supernatantu.

Teraz umieść granulkę komórkową na lodzie. Następnie doprowadź kwas hialuronowy modyfikowany tiolami, środek sieciujący reagujący tiolami, dikrylan glikolu polietylenowego i odgazowane butelki z wodą do temperatury pokojowej. W sterylnych warunkach za pomocą strzykawki wyposażonej w igłę dodaj jeden mililitr odgazowanej wody do butelki z kwasem hialuronowym.

Roztworu należy rozmieszać wirowo, od czasu do czasu podgrzewając go do 37 stopni Celsjusza, aż stanie się klarowny, a następnie umieścić roztwór na lodzie. W sterylnych warunkach dodaj 0,5 mililitra odgazowanej wody do butelki sieciującej. Rozpuść przez wielokrotne odwracanie przed umieszczeniem go na lodzie.

Teraz dodaj 120 mikrolitrów rozpuszczonego roztworu kwasu hialuronowego do podzielonego granulatu komórkowego i ponownie zawieś osad komórkowy, pipetując roztwór tam iz powrotem. Dodaj 30 mikrolitrów rozpuszczonego roztworu sieciującego do probówki z zawieszonymi osadami komórkowymi. Upewnij się, że mieszanie jest prawidłowe, stukając w rurkę.

Po wymieszaniu krótko odwiruj roztwór. Upuść 15 mikrolitrów połączonego roztworu na 24-dołkową płytkę pokrytą parafiną. Pozostaw do zastygnięcia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

W celu różnicowania in vitro dodaj 0,5 mililitra chondrogennej pożywki różnicującej do hydrożeli nasiennych komórkami. Po trzech tygodniach przejdź na pożywkę różnicującą przerostową, dodając 0,5 mililitra na dołek. Różnicowanie chondrogenne skutkowało siarczanowanymi glikozaminogenami i dodatnią kolagenowo-dodatnią macierzą zewnątrzkomórkową typu drugiego zarówno w konstruktach kwasu hialuronowego lub HA, jak i kolagenu.

Jednak dystrybucja była bardziej jednorodna w konstruktach kwasu hialuronowego. Struktury kolagenowe wykazywały komórki obwodowe o niejednorodnej morfologii. Średnia okrągłość komórek w konstruktach HA była wyższa niż w konstruktach kolagenowych.

Osadzanie się wapnia wykryto na zewnętrznych krawędziach obu konstruktów po pięciu tygodniach. W konstruktach hialuronowych in vivo wszystkie implanty zostały połączone ze sobą w kieszonkach podskórnych i utworzyły zintegrowaną tkankę kostną. 40% konstruktów kolagenu in vivo było niezależnych.

Tkanka kostna o morfologii blaszkowatej powstała w zewnętrznych obszarach obu konstruktów in vivo po ośmiu tygodniach od implantacji. Ubytek chrząstki zaobserwowano również w konstrukcie HA. Okazało się, że wiele konstruktów kwasu hialuronowego in vivo tworzy zintegrowaną tkankę kostną, na co wskazuje połączenie tkanek kostnych i obecność tkanki włóknistej stawu.

Podczas gdy 40% konstruktów kolagenowych było zjednoczonych, pozostałe konstrukty istniały osobno lub były połączone tylko bez połączeń tkanki kostnej. Oba konstrukty wykazywały dodatnio znakowane naczynia w szpiku kostnym, a wewnętrzna chrząstka była otoczona wielojądrowymi komórkami osteoklastów. Minerał został zdeponowany w zewnętrznym obszarze osteoidowym obu konstruktów, z większą objętością minerału w konstruktach HA ze względu na ich większy rozmiar.