Produkcja i optymalizacja LTE, bezkomórkowego systemu ekspresji białek pochodzących z Leishmania tarentolae do produkcji białek rekombinowanych
8 listopada 2024
Leishmania Translational Extract (LTE) to eukariotyczny system ekspresji białek bez komórek, pochodzący od jednokomórkowego pasożyta, Leishmania tarentolae. Ten zoptymalizowany protokół sprawia, że produkcja LTE jest prosta i opłacalna. Nadaje się do różnych zastosowań skoncentrowanych na wielorównoległej ekspresji i badaniu złożonych białek eukariotycznych i ich interakcji.
Nasz bezkomórkowy system ekspresji białek, który zazwyczaj wymaga łańcucha chłodniczego do transportu, ma teraz pionierską wersję liofilizowaną. Ta wersja pozostaje stabilna w temperaturach otoczenia, co czyni ją pierwszym systemem eukariotycznym dostępnym w tym formacie. Upraszcza to transport do laboratoriów i zastosowań terenowych.
Obecne wyzwania eksperymentalne związane z bezkomórkową produkcją białek obejmują optymalizację warunków reakcji w celu zapewnienia, że rekombinowane białka są prawidłowo sfałdowane i aktywne. Chociaż opłacalność technik bezkomórkowych w porównaniu z konwencjonalną ekspresją białek in vivo pozostaje poważnym wyzwaniem, prostota naszego eukariotycznego systemu bezkomórkowego LTE pomaga złagodzić ten problem. Bezkomórkowy system LTE ułatwia szybką rekonstrukcję i analizę sieci białkowych i szlaków biosyntezy.
Jego integracja z technologiami takimi jak AlphaLisa i testami in vivo umożliwia funkcjonalną analizę złożonych systemów, w tym sieci interakcji białkowych SARS-CoV-2 i sekretonu tęgoryjca. Bezkomórkowy system LTE umożliwia szybką i ekonomiczną produkcję trudnych do ekspresji białek w formacie multipleksowym. Oferuje łatwą optymalizację syntezy białek, doskonaląc się i wytwarzając złożone lub toksyczne białka.
System jest skalowalny i zapewnia stałą jakość każdej partii. Na początek zbierz nocne kultury Leishmania tarentolae. Zmierzyć gęstość optyczną kultur podczas zbioru przy 600 nanometrach, używając rozcieńczenia 1:10 w pożywce hodowlanej.
Obliczyć docelową objętość koncentratu, aby osiągnąć końcową gęstość optyczną 300 przy 600 nanometrach. Przenieś zebraną kulturę komórkową do odpowiednich butelek wirówkowych, odwiruj butelki w temperaturze 2 500 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie zdekantować supernatant do pojemnika na odpady hodowlane.
Umyj paletę komórek w 500, 200 i 20 mililitrach buforu SEB. Następnie wlać koncentrat zawieszony SEB do odpowiedniego przemytego cylindra objętościowego. Uzupełnić objętość do objętości docelowej za pomocą zimnego SEB, a następnie delikatnie wymieszać za pomocą pipety.
Aby lizować koncentrat komórkowy, przenieś go do wstępnie schłodzonego urządzenia kawitacyjnego azotu pod ciśnieniem 70 barów i inkubuj przez 45 minut na lodzie. Następnie otwórz otwór wentylacyjny w urządzeniu kawitacyjnym i wyrzuć lizat do oczyszczonej kolby odbiorczej umieszczonej na lodzie. Następnie przenieść lizat do probówek wirówkowych i wirować w temperaturze 10 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po przeniesieniu supernatantu do świeżych probówek, odwirować lizat przy 30 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieść supernatant do świeżej probówki wirówkowej umieszczonej na lodzie. Ustaw cztery grawitacyjne żelowe kolumny filtracyjne PD-10 na 10 mililitrów lizatu w formacie stojaka, który umożliwia ich kapanie do odpowiedniej tacki zbiorczej.
Dodaj 2,5 mililitra lizatu do każdej kolumny. Po przejściu do kolumny dodaj 0,5 mililitra buforu elucyjnego, aby osadzić lizat. Wyjmij tacę na odpady i umieść nową tacę zbiorczą pod kolumnami.
Następnie dodaj 2,5 mililitra buforu elucyjnego, aby wymyć lizat przefiltrowany przez żel. Zebrać przefiltrowany w żelu lizat do świeżej probówki wirówkowej. Następnie zmierz absorbancję przefiltrowanego lizatu na głębokości 280 nanometrów za pomocą spektrofotometru NanoDrop.
Dodaj pięciokrotnie roztwór zasilający do lizatu w stosunku 2:5, a następnie dokładnie wymieszaj mieszaninę. Podziel mieszaninę na 1,5 mililitrowe probówki do mikrowirówek, a następnie zatrzaskowo zamroź probówki w ciekłym azocie do wykorzystania w przyszłości.
Przegląd
Ekstrakt translacyjny Leishmania (LTE) to pionierski eukariotyczny system ekspresji białek bezkomórkowych, pochodzący z pasożyta Leishmania tarentolae. Ta innowacyjna wersja liofilizowana pozostaje stabilna w temperaturze pokojowej, co upraszcza transport i zastosowania terenowe.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Bezkomórkowa ekspresja białek
- Interakcje białkowe
- Zastosowania biotechnologiczne
Wstęp
- Tradycyjne systemy bezkomórkowe wymagają transportu w łańcuchu chłodniczym.
- Białka rekombinowane muszą być prawidłowo sfałdowane i aktywne.
- Wyzwanie stanowi opłacalność w porównaniu z ekspresją białek in vivo.
- System LTE umożliwia szybką rekonstytucję sieci białkowych.
Cel badania
- Opracowanie stabilnego, transportowalnego systemu ekspresji białek eukariotycznych.
- Ułatwienie badania złożonych białek eukariotycznych.
- Optymalizacja warunków reakcji w celu produkcji białek.
Zastosowane metody
- Opracowanie liofilizowanego systemu bezkomórkowej ekspresji białek.
- Optymalizacja warunków reakcji dla fałdowania białek.
- Analiza sieci białkowych i szlaków biosyntetycznych.
- Transport i zastosowanie w różnych warunkach laboratoryjnych.
Główne wyniki
- System LTE jest stabilny w temperaturach otoczenia.
- Upraszcza transport do laboratoriów oraz zastosowania terenowe.
- Jest bardziej efektywny kosztowo w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
- Umożliwia szybką analizę oddziaływań białkowych.
Wnioski
- System LTE stanowi znaczący postęp w bezkomórkowej ekspresji białek.
- Rozwiązuje on problemy logistyczne związane z produkcją białek.
- System ten może usprawnić badania nad oddziaływaniami białek oraz szlakami biosyntezy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezkomórkowy system ekspresji białek pochodzący z Leishmania tarentolae (LTE) wprowadza skalowalną, liofilizowaną platformę eukariotyczną do produkcji białek rekombinowanych, co eliminuje ograniczenia związane z łańcuchem chłodniczym i umożliwia zastosowania w terenie oraz rozproszone badania i rozwój (B+R). System ten rozwiązuje uporczywe problemy z ekspresją białek złożonych lub toksycznych, wspierając szybkie prototypowanie i analizę funkcjonalną we wczesnych etapach odkrywania leków oraz opracowywania testów. Spójność partii oraz zdolność do multipleksowania systemu LTE zwiększają pewność prognostyczną i zwinność operacyjną w całym procesie rozwoju biofarmaceutycznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia szybką syntezę i analizę funkcjonalną białek rekombinowanych w celu walidacji celu terapeutycznego.
- Wspiera minimalizację ryzyka mechanistycznego poprzez ułatwienie in vitro rekonstrukcji sieci białkowych i szlaków biosyntetycznych.
- Zapewnia platformę do oceny oddziaływań białko-białko istotnych dla szlaków chorobowych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia spójne, skalowalne partie lizatów do zstandaryzowanej optymalizacji testów i przepływów pracy w badaniach przesiewowych.
- Umożliwia multipleksową ekspresję białek, wspierając wysokoprzepustowe badania przesiewowe celów trudnych do ekspresji.
- Integruje się z technologiami takimi jak AlphaLisa w celu uzyskania ilościowych, powtarzalnych wyników.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia produkcję złożonych lub toksycznych białek do dalszych badań translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez dostarczanie niezawodnych odczynników białkowych.
- Przyspiesza decyzje o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka, umożliwiając szybką analizę funkcjonalną.
Integracja potoków i przepływów pracy
LTE pozycjonuje się jako elastyczne narzędzie obejmujące wczesne etapy odkrywania, identyfikację związków wiodących oraz badania przedkliniczne, wspierając zarówno przepływy pracy oparte na hipotezach, jak i na przesiewaniu.
- Biologia odkrywcza: Przyspiesza testowanie hipotez i mapowanie szlaków poprzez szybką syntezę białek i analizę sieci.
- Screening: Dostarcza lizaty gotowe do analizy o powtarzalności między partiami, co zapewnia wiarygodną ocenę związków.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar ekspresji białek i wyników interakcji do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Dostarcza złożone odczynniki białkowe do badań nad biomarkerami i mechanizmami, jeżeli są one wspierane przez dany schemat postępowania.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje liofilizowaną, stabilną w temperaturze otoczenia platformę, którą można dostosować do wielu ośrodków i projektów badawczo-rozwojowych (R&D).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad funkcją białek.
- Wartość operacyjna: Upraszcza logistykę dzięki odczynnikom stabilnym w temperaturze otoczenia oraz skalowalnej produkcji.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywną kapitałowo alokację zasobów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez umożliwienie szybkiej i powtarzalnej analizy białek w ramach różnych programów.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie bezkomórkowej ekspresji białek oraz optymalizacji lizatów.
- Wymaga dostępu do standardowej aparatury biologii molekularnej i platform analitycznych.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia jakości serii i integracji testów.
- Metoda jest dostosowalna do różnych białek docelowych, jednak w przypadku specyficznych konstruktów może być konieczna optymalizacja.
- W przypadku każdego zastosowania należy ocenić opłacalność w porównaniu z systemami in vivo.
