Name: Produkcja i optymalizacja LTE, bezkomórkowego systemu ekspresji białek pochodzących z Leishmania tarentolae do produkcji białek rekombinowanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T12:10:00.000+00:00
Duration: 3 min 59 s
Description: Poznaj system ekspresji białek LTE z Leishmania tarentolae do produkcji białek rekombinowanych. Ta metoda liofilizowana zapewnia stabilność w temperaturze pokojowej, upraszczając transport i zastosowania polowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować wielu członkom laboratorium Aleksandrowa, którzy przyczynili się do rozwoju systemów LTE w ciągu ostatnich 10 lat, w szczególności Sergeyowi Mureevowi, który był pionierem systemu i opracował miejsce wejścia rybosomów SITS. Rysunek 1 został stworzony przez Biorender.com i powielany na licencji.

Streamlined Protocol for Leishmania Translational Extract (LTE) Production

<ol><li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The dependence of cell-free protein synthesis in E.coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 47 (10), 1588-1602 (1961).</li>
<li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+2.3+mg%2Fml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li>
<li>Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Bacillus+subtilis+cell-free+transcription-translation+system+for+prototyping+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements.</a> Metab Eng. 38, 370-381 (2016).</li>
<li>Ezure, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+system+prepared+from+insect+cells+by+freeze-thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis system prepared from insect cells by freeze-thawing.</a> Biotechnol Prog. 22 (6), 1570-1577 (2006).</li>
<li>Harbers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheat+germ+systems+for+cell-free+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Wheat germ systems for cell-free protein expression.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2762-2773 (2014).</li>
<li>Kobs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+the+cell-free+protein+expression+system+that+meets+your+experimental+goals%5BTitle%5D)+AND+%22Promega+Corporation%22%5BJournal%5D)">Selecting the cell-free protein expression system that meets your experimental goals.</a> Promega Corporation. 21, 6-9 (2008).</li>
<li>Kovtun, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+cell-free+protein+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Leishmania cell-free protein expression system.</a> Methods. 55 (1), 58-64 (2011).</li>
<li>Basile, G., Peticca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Leishmania+tarentolae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Leishmania tarentolae.</a> Mol Biotechnol. 43 (3), 273-278 (2009).</li>
<li>Mureev, S., Kovtun, O., Nguyen, U. T., Alexandrov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-independent+translational+leaders+facilitate+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Species-independent translational leaders facilitate cell-free expression.</a> Nat Biotechnol. 27 (8), 747-752 (2009).</li>
<li>Gambin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+reveals+the+oligomerization+and+folding+steps+driving+the+prion-like+behavior+of+ASC%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence reveals the oligomerization and folding steps driving the prion-like behavior of ASC.</a> J Mol Biol. 430 (4), 491-508 (2018).</li>
<li>Sierecki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+mapping+of+interactions+between+human+SNX-BAR+proteins+measured+in+vitro+by+AlphaScreen+and+single-molecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Rapid mapping of interactions between human SNX-BAR proteins measured in vitro by AlphaScreen and single-molecule spectroscopy.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2233-2245 (2014).</li>
<li>Sierecki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomolar+oligomerization+and+selective+co-aggregation+of+alpha-synuclein+pathogenic+mutants+revealed+by+single-molecule+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Nanomolar oligomerization and selective co-aggregation of alpha-synuclein pathogenic mutants revealed by single-molecule fluorescence.</a> Sci Rep. 6, 37630(2016).</li>
<li>Leitao, A., Bhumkar, A., Hunter, D. J. B., Gambin, Y., Sierecki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+a+selective+mechanism+for+the+inhibition+of+alpha-synuclein+aggregation+by+beta-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Unveiling a selective mechanism for the inhibition of alpha-synuclein aggregation by beta-synuclein.</a> Int J Mol Sci. 19 (2), 334(2018).</li>
<li>Gambin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+reveals+self+assembly+and+nanoscale+segregation+of+two+distinct+cavin+subcomplexes+on+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis reveals self assembly and nanoscale segregation of two distinct cavin subcomplexes on caveolae.</a> Elife. 3, e01434(2013).</li>
<li>Ve, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+TIR-domain-assembly+formation+in+MAL-+and+MyD88-dependent+TLR4+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis of TIR-domain-assembly formation in MAL- and MyD88-dependent TLR4 signaling.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (9), 743-751 (2017).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+organisation+of+in+vitro+reconstituted+HOPS+and+CORVET+multisubunit+membrane+tethering+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Subunit organisation of in vitro reconstituted HOPS and CORVET multisubunit membrane tethering complexes.</a> PLoS One. 8 (12), e81534(2013).</li>
<li>Ruehrer, S., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+Leishmania+tarentolae+cell-free+extracts+for+the+synthesis+of+human+solute+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploiting Leishmania tarentolae cell-free extracts for the synthesis of human solute carriers.</a> Mol Membr Biol. 30 (4), 288-302 (2013).</li>
<li>Varasteh Moradi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Interactions+among+cell-free+expressed+Zika+virus+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping Interactions among cell-free expressed Zika virus proteins.</a> J Proteome Res. 19 (4), 1522-1532 (2020).</li>
<li>Gagoski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+pipeline+for+discovery+of+thermotolerant+xylanases+and+endo-1%2C4-beta-glucanases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-free pipeline for discovery of thermotolerant xylanases and endo-1,4-beta-glucanases.</a> J Biotechnol. 259, 191-198 (2017).</li>
<li>Ergun Ayva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+performance+parameters+of+artificial+allosteric+protein+switches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring performance parameters of artificial allosteric protein switches.</a> J Mol Biol. 434 (17), 167678(2022).</li>
<li>Lau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+biosensor+for+real-time+interaction+dynamics+of+host+proteins+with+HIV-1+capsid+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Fluorescence biosensor for real-time interaction dynamics of host proteins with HIV-1 capsid tubes.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 11 (38), 34586-34594 (2019).</li>
<li>Ryan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+antiinflammatory+biologics+shaped+by+parasite-host+coevolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Novel antiinflammatory biologics shaped by parasite-host coevolution.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119 (36), e2202795119(2022).</li>
<li>McMahon, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intracellular+cavin+target+proteins+reveals+cavin-PP1alpha+interactions+regulate+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of intracellular cavin target proteins reveals cavin-PP1alpha interactions regulate apoptosis.</a> Nat Commun. 10 (1), 3279(2019).</li>
<li>Sierecki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+approach+to+accelerate+the+study+of+protein-protein+interactions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">A cell-free approach to accelerate the study of protein-protein interactions in vitro.</a> Interface Focus. 3 (5), 20230018(2013).</li>
<li>Johnston, W. A., Moradi, S. V., Alexandrov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaption+of+the+Leishmania+cell-free+expression+system+to+high-throughput+analysis+of+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaption of the Leishmania cell-free expression system to high-throughput analysis of protein interactions.</a> Methods Mol Biol. 2025, 403-421 (2019).</li>
<li>Jung, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+formation+and+interactome+analysis+of+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-free formation and interactome analysis of caveolae.</a> J Cell Biol. 217 (6), 2141-2165 (2018).</li>
<li>Fontaine, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+domain+analysis+of+SOX18+transcription+factor+using+a+single-chain+variable+fragment-based+approach%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Functional domain analysis of SOX18 transcription factor using a single-chain variable fragment-based approach.</a> MAbs. 10 (4), 596-606 (2018).</li>
<li>Overman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+the+transcription+factor+SOX18+delays+breast+cancer+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of the transcription factor SOX18 delays breast cancer in mice.</a> Elife. 6, e21221(2017).</li>
<li>Kubala, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+farnesyltransferase+alpha+subunit+regulates+vacuolar+protein+sorting-associated+protein+4A+%28Vps4A%29--dependent+intracellular+trafficking+through+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Mammalian farnesyltransferase alpha subunit regulates vacuolar protein sorting-associated protein 4A (Vps4A)--dependent intracellular trafficking through recycling endosomes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 468 (4), 580-586 (2015).</li>
<li>Han, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+scaffolds+Arp2%2F3+and+WAVE2+at+the+epithelial+zonula+adherens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cortactin scaffolds Arp2/3 and WAVE2 at the epithelial zonula adherens.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7764-7775 (2014).</li>
<li>Das Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+IIa+histone+deacetylases+drive+toll-like+receptor-inducible+glycolysis+and+macrophage+inflammatory+responses+via+pyruvate+kinase+M2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Class IIa histone deacetylases drive toll-like receptor-inducible glycolysis and macrophage inflammatory responses via pyruvate kinase M2.</a> Cell Rep. 30 (8), 2712-2728.e8 (2020).</li>
<li>Leitão, A. D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectivity+of+protein+interactions+along+the+aggregation+pathway+of+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Selectivity of protein interactions along the aggregation pathway of α-synuclein.</a> BioRxiv. , (2021).</li>
<li>Gagoski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+benchmarking+of+four+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Performance benchmarking of four cell-free protein expression systems.</a> Biotechnol Bioeng. 113 (2), 292-300 (2016).</li>
<li>Johnston, W. A., Alexandrov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+eukaryotic+cell-free+lysate+from+Leishmania+tarentolae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of eukaryotic cell-free lysate from Leishmania tarentolae.</a> Methods Mol Biol. 1118, 1-15 (2014).</li>
<li>Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+instabilities+explain+batch-to-batch+variability+in+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems.</a> Biotechnol Bioeng. 115 (8), 1904-1914 (2018).</li>
</ol>

Nie występują żadne konkurencyjne interesy finansowe.

Protokoły tworzenia LTE zostały opublikowane w ciągu ostatniej dekady7 i były okresowo aktualizowane25,34. Jednak nowicjusze w tej technice często napotykają stromą krzywą uczenia się, co skutkuje opóźnieniami w osiąganiu wysokiej jakości i wysokowydajnej ekspresji białek. Podobne wyzwania zostały zgłoszone przez inne grupy badawcze pracujące nad LTE35, w szczególności w odniesieniu do znacznych różnic między partiami. Format protokołu oparty na wideo może potencjalnie dostarczyć dodatkowej, mniej oczywistej wiedzy na temat konfiguracji, która przyniesie korzyści potencjalnym użytkownikom34. Do protokołu wprowadzono modyfikacje, mające na celu zwiększenie prawdopodobieństwa sukcesu, uproszczenie procedury, skrócenie czasu i zminimalizowanie błędów związanych ze złożonością.
W przypadku rozbijania komórek kluczowa jest precyzyjna kontrola nad ładowaniem komórek do rozdzielacza kawitacji azotu34. Osiągnięcie tego może być trudne ze względu na dużą gęstość komórek po zagęszczeniu komórek i umyciu. W pierwotnych protokołach stosowano różne metody, takie jak odwirowanie niewielkiej objętości końcowej zagęszczonej kultury i ilościowe określenie frakcji komórkowej. Jednak w tym protokole przyjęto prostsze podejście. Mierzy się objętość zbioru kultur i OD600 nm , a pomiary te służą do obliczenia docelowej objętości koncentratu komórkowego w mililitrach, dążąc do pożądanego końcowego OD600 nm wynoszącego 300. W obliczeniach tych zakłada się, że podczas prania nie dochodzi do znaczącej utraty komórek. Jeśli istnieje podejrzenie utraty komórek, stosuje się alternatywną metodę polegającą na trzykrotnym seryjnym rozcieńczeniu 1:10 zagęszczonych komórek po przemyciu, co ostatecznie prowadzi do rozcieńczenia 1:1000. Pozwala to na zmierzenie rzeczywistej średnicy zewnętrznej koncentratu600 nm, upewniając się, że osiąga on docelową średnicę zewnętrzną600 nm = 300 przed załadowaniem go do zakłócacza.
Nawet przy dokładnej kontroli obciążenia komórek zakłócających działanie substancji chemicznych może wystąpić znaczna zmienność zawartości białka lizatu po rozerwaniu, na co wskazuje Abs280nm filtrowanego żelem niesuplementowanego lizatu34. Dlatego przed wprowadzeniem suplementacji lizatu dokonuje się pomiaru Abs280nm , a lizat rozcieńcza się, aby osiągnąć Abs280nm = 60. Ponieważ reakcje ekspresji białek ostatecznie obejmują lizat 0,5 v/v, daje to standaryzowany lizat reakcyjny o Abs280nm = 30. Wydajność lizatu skonfigurowana z niższą niż Abs280nm = 30 ma tendencję do uzyskiwania długotrwałych reakcji o niskiej ekspresji, podczas gdy wartości większe niż Abs280nm = 30 mają tendencję do uzyskiwania wyższej ekspresji, ale zwiększonej tendencji do agregacji białek wyjściowych.
Optymalizacja wydajności lizatu polega na dostosowaniu danych wejściowych transkrypcji w roztworze żywieniowym, który uzupełnia lizat, w szczególności rNTP i magnez, w opcjonalnych krokach reakcji 7,0-7,3. Ważne jest, aby pamiętać, że rNTP i magnez odgrywają złożone i wielorakie role w sprzężonym systemie transkrypcji-translacji, takim jak LTE25. Wykazano jednak, że LTE ma przybliżone optimum ekspresji magnezu przy rNTP (mM) + 1,5. Ponieważ sam lizat wnosi 1,5 mM Mg do końcowej mieszaniny reakcyjnej, zapewnia to prosty sposób na różnicowanie i optymalizację wejścia rNTP bez współoptymalizacji Mg poprzez zmianę rNTP.Mg równomolowej.
Wydajność lizatu wykazuje znaczną zmienność przy zwiększaniu rNTP.Mg, przy czym ekspresja białka na ogół wzrasta do progu, w którym optymalizacja ulega odwróceniu, co skutkuje nieprawidłowym funkcjonowaniem ekspresji w postaci krótkich produktów zamiast białek o pełnej długości25. Dlatego korzystna jest końcowa optymalizacja systemu w celu zidentyfikowania tego progu. Oryginalny protokół LTE wykorzystywał stałą recepturę rozwiązania żywieniowego, z sugerowaną pewną optymalizacją Mg34. Podejście to zostało później zmodyfikowane o bardziej rozbudowaną optymalizację rNTP. Jednak ta metoda wymagała natychmiastowego zamrożenia lizatu w postaci nieuzupełnionej, aby umożliwić optymalizację podwielokrotności, która miała tendencję do zmniejszania ostatecznych poziomów ekspresji lizatu. Zmniejszenie to przypisano utracie właściwości krioprotekcyjnych roztworu zasilającego podczas błyskawicznego zamrażania nieuzupełnionego lizatu bezpośrednio po etapie filtracji żelu. Obecny protokół zapewnia równowagę poprzez suplementację roztworem żywieniowym zawierającym zmniejszoną rNTP.Mg przed zamrożeniem, który można uzupełnić do optymalnego poziomu w miejscu odciągania.
Oczekuje się, że te ulepszenia protokołu zwiększą użyteczność systemu LTE dla początkujących użytkowników poprzez złagodzenie głównych źródeł zmienności i poprawę spójności wyjściowej ekspresji białek.

W latach sześćdziesiątych XX wieku bezkomórkowe systemy ekspresji białek odegrały kluczową rolę w odkryciu kodu genetycznego1. Jednak prokariotyczne bezkomórkowe systemy ekspresji białek, oparte głównie na E. coli, dominują obecnie zarówno w zastosowaniach laboratoryjnych, jak i komercyjnych. Podczas gdy systemy oparte na E. coli oferują korzyści, takie jak opłacalność, skalowalność i wysoka wydajność ekspresji, napotykają wyzwania podczas produkcji białek wielodomenowych w ich aktywnych formach i ułatwiania składania kompleksów białkowych2,3. W dzisiejszych czasach powszechnie stosowane formy eukariotycznej syntezy białek bezkomórkowych (CFPS) obejmują ekstrakt z kiełków pszenicy (WGE), lizat retikulocytów królika (RRL) i lizat komórek owadów (ICL)4,5,6. Niniejsza praca przedstawia alternatywny, bezkomórkowy system eukariotyczny, który jest zarówno prosty, jak i skalowalny, oparty na jednokomórkowym pasożytze wiciowców Leishmania tarentolae.
Leishmania tarentolae może być łatwo hodowany w kolbach przy użyciu opłacalnych pożywek, a także może być skalowany w bioreaktorach, aby osiągnąć większą gęstość komórek. Obecność endogennych mRNA w lizacie komórkowym, które w przeciwnym razie mogłyby konkurować z wprowadzonymi wiadomościami, może być neutralizowana za pomocą oligonukleotydów antysensownych ukierunkowanych na konserwatywną sekwencję lidera splicingu mRNA Leishmania7. W przeciwieństwie do swojego bliskiego krewnego Leishmania major, który powoduje choroby u ludzi, L. tarentolae infekuje gekona mauretańskiego (Tarentolae mauritanica), dzięki czemu nadaje się do hodowli w warunkach laboratoryjnych PC2 bez konieczności stosowania specjalnych środków ostrożności. Wcześniej był używany jako organizm transgeniczny do ekspresji białek in vivo8.
Aby ułatwić tworzenie matryc w systemach bezkomórkowych, zaprojektowano uniwersalne sekwencje oparte na polimerowych strukturach RNA, które zwiększają inicjację translacyjną9. Te niezależne od gatunku sekwencje translacyjne (SITS) mają zastosowanie zarówno do systemów prokariotycznych, jak i eukariotycznych bezkomórkowych i są odpowiednie do wprowadzania informacji genetycznej do LTE. Chociaż protokół ten nie zapewnia szczegółowego wyjaśnienia budowy wektorów do ekspresji białek bezkomórkowych LTE, optymalizacja i kontrola jakości wymagają odpowiednich wektorów zawierających fuzje fluoroforowe pożądanych białek będących przedmiotem zainteresowania poniżej miejsca SITS. W tym celu odpowiednie wektory LTE zostały zdeponowane w repozytorium genów Addgene, takie jak wektor pCellFree_G03, który koduje N-końcową fuzję eGFP do pożądanego białka będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu miejsc klonowania Gateway.
LTE udowodniło swoją wartość w szerokim zakresie zastosowań wymagających ekspresji białek, w tym w analizie samoorganizacji białek10,16, produkcja ludzkich integralnych białek błonowych17, badania nad kandydatami na leki przeciwwirusowe18, rozwój biotechnologicznie użytecznych enzymów19, prototypowanie biosensorów białkowych20,21, oraz badanie leków biologicznych od tęgoryjców22. LTE odegrało również zasadniczą rolę w mapowaniu sieci interakcji białko-białko w dziedzinie wirusologii i struktur komórkowych21,32. LTE zostało przetestowane pod kątem działania podobnego do innych systemów eukariotycznych bezkomórkowych pod względem ekspresji białek o pełnej długości, monorozproszonych i niezagregowanych33, a wszystko to przy jednoczesnym oferowaniu bardziej opłacalnej i skalowalnej produkcji.
Ten protokół dostarcza technik hodowli i zakłócania organizmu gospodarza, przygotowania lizatu i uzupełniania roztworu żywieniowego (FS) do sprzężonej ekspresji białek transkrypcyjnych/translacyjnych. Dodatkowo zawiera protokół do optymalizacji partii produkcyjnych. W początkowej wersji systemu bezkomórkowego Leishmania zaobserwowano niepożądane różnice między partiami w poziomach ekspresji, frakcji białek o pełnej długości i obecności agregatów białkowych, co prowadziło do utylizacji batches34. Kolejne ulepszenia protokołu zostały wprowadzone w celu rozwiązania tego problemu25. Obecny protokół opiera się na tych ulepszeniach, umożliwiając optymalizację poszczególnych partii pod kątem szczytowej ekspresji i wielkości białka. Osiąga to poprzez ścisłą kontrolę obciążenia ogniw zakłócających (mierzone jako gęstość optyczna przy 600 nm; OD600nm) i normalizując otrzymaną produkcję lizatu za pomocą absorbancji przy 280 nm (Abs280nm). Ponadto zawiera metodę częściowego uzupełniania lizatu w rNTP i magnez podczas produkcji, z późniejszą optymalizacją tych składników roztworu paszowego podczas wyrażeń testowych. Chociaż ta optymalizacja jest przedstawiona jako opcja w protokole, jest zdecydowanie zalecana przez autorów.

<table><tbody><tr><td>PD-10 SuperDex 25 kolumn</td><td>Cytiva</td><td>17085101</td><td>Żelowe kolumny filtracyjne</td></tr><tr><td>Kawitacja azotu Zaburzacz komórek</td><td>Parr Industries</td><td>4635 lub 4639</td><td>Cell Disrupter</td></tr><tr><td>Hemin pochodzenia bydlęcego Hemin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5533</td><td>Dodatek do hodowli</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna 10000U/ml</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140122</td><td>Mieszanka</td></tr> <tr><td>antybiotykówOptiplate 384</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6007290</td><td>Płytka wielodołkowa do ekspresji 10ul</td></tr><tr><td>Synteza</td><td></td> <td>oligonukleotydów</td> IDT<td>&nbsp; Oligo z sekwencją CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT</td></tr><tr><td>Fosfokinaza kreatynowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-15-4</td><td>Enzym</td></tr><tr><td>Tecan Spark</td><td>Tecan</td><td></td><td>lub podobny Wielomodowy czytnik płytek</td></tr><tr><td>Chemidoc MP Imager</td><td>Biorad</td><td></td><td>lub podobny żel SDS-PAGE Imager</td></tr><tr><td>4-12% Bis-Tris Gels</td><td>Invitrogen</td><td>NW04125</td><td>SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>Biofotometr</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>lub podobny Spektrofotometr kuwetowy</td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>Spektrofotometr Nanodrop</td></tr><tr><td>Wirówka Avanti JXN-26 Beckman</td><td>Coulter</td><td></td><td>lub podobna wirówka, z wirnikami/probówkami o wartości 10K i 50K g</td></tr><tr><td>Mikrowirówka 5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>lub podobna mikrowirówka, z probówkami</td></tr> <tr><td>do mikrowirówek o pojemności 1,5 mlInkubator kolb Inova S44i</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>lub podobny wytrząsarka do inkubatora kolb odpowiednia do kolb 5L</td></tr><tr><td>Szklane kolby</td><td></td><td></td> hodowlane 5L <td>Szklane kolby z przegrodami do wzrostu kultur</td></tr><tr><td>Baktotrypton</td><td>BD</td><td>211705</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Merck</td><td>VM930053</td><td>Pożywka wzrostowa</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td></td><td></td><td>Dowolna klasa analityczna</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td></td><td></td><td>Dowolna klasa analityczna</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td>Dowolna klasa analityczna</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td></td><td></td><td>Dowolna klasa analityczna</td></tr><tr><td>UltraPure</td><td>water Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>Lub wyjście z dowolnego dystrybutora wody typu MilliQ</td></tr></tbody></table>

produkcja i optymalizacja lte, bezkomórkowego systemu ekspresji białek pochodzących z leishmania tarentolae do produkcji białek rekombinowanych

Production and Optimization of LTE, a Leishmania tarentolae Derived Cell-Free Protein Expression System for Recombinant Protein Production

Ten protokół opisuje produkcję i optymalizację eukariotycznego Systemu Ekspresji Białek Wolnych od Komórek (CFPS) pochodzącego z jednokomórkowego wiciowca Leishmania tarentolae, określanego jako Leishmania Translational Extract lub LTE. Chociaż organizm ten pierwotnie wyewoluował jako pasożyt gekonów, można go łatwo i niedrogo hodować w kolbach lub bioreaktorach. W przeciwieństwie do Leishmania major nie jest patogenny dla ludzi i nie wymaga specjalnych środków ostrożności laboratoryjnej. Kolejną zaletą stosowania Leishmania w CFPS jest to, że dodanie pojedynczego oligonukleotydu antysensownego do CFPS, ukierunkowanego na konserwatywną sekwencję lidera splicingu na końcu 5' wszystkich RNA kodujących białka, może hamować endogenną ekspresję białek. Zapewniamy procedury rozbijania komórek i przetwarzania lizatów, które zostały uproszczone i ulepszone w porównaniu z poprzednimi wersjami. Procedury te rozpoczynają się od prostych kultur kolbowych. Ponadto wyjaśniamy, jak wprowadzać informacje genetyczne za pomocą wektorów zawierających niezależne od gatunku miejsca inicjacji translacji (SITS) oraz jak przeprowadzić prostą optymalizację partii i kontrolę jakości, aby zapewnić stałą jakość ekspresji białek.

Celem bezkomórkowej ekspresji białek jest otrzymanie pełnych białek w złożonej, aktywnej formie, odpowiedniej do szerokiego zakresu zastosowań. LTE (Leishmania tarentolae (ekstrakt) był wcześniej porównywany z innymi prokariotycznymi i eukariotycznymi systemami ekspresji bezkomórkowej, wykazując wysoką zdolność do unikania trunkacji i agregacji przy optymalnym działaniu, szczególnie w porównaniu z E. colibezkomórkowa ekspresja oparta na33Jednak wcześniej wiązało się to ze znacznymi różnicami w jakości produktu między poszczególnymi partiami. Obecna metoda wprowadza dalsze ulepszenia w celu zapewnienia spójnej jakości produktu, głównie poprzez częściowe uzupełnienie niezbędnego roztworu do zasilania przed wstępnym zamrożeniem LTE w alikwotach. Następnie zoptymalizowano wkład transkrypcyjny rNTP.Mg w roztworze uzupełniającym, który można dodawać do każdej kolejnej reakcji lub wykorzystać do bezpośredniego uzupełnienia zamrożonych alikwotów. Warto zauważyć, że reakcje optymalizacyjne reprezentują również typowe praktyczne zastosowanie LTE do ekspresji białek, przy czym reakcje prowadzono w 25 °C przez 2 h.
Dane uzyskane z optymalizacji stężenia rNTP.Mg w reakcjach bezkomórkowych stanowią reprezentatywny zestaw danych. Poziomy ekspresji zazwyczaj rosną wraz ze wzrostem ilości substratu transkrypcyjnego (rNTP.Mg), co wskazuje na prawidłową ekspresję. Jednakże osiągany jest próg, powyżej którego system wykazuje tendencję do nieproduktywnej ekspresji produktów skróconych, szczególnie w przypadku większych białek (&gt;50 kDa). Taka suboptymalna ekspresja prowadzi do utraty sygnału fluorescencji wraz ze wzrostem stężenia rNTP.Mg, co jest szczególnie widoczne w przypadku fuzji z fluoroforem na końcu C-końcowym, gdzie translacja polipeptydu nie dociera do samego fluoroforu. W przypadku fuzji na końcu N-końcowym, choć nadmiar rNTP.Mg nie musi prowadzić do redukcji całkowitego RFU (Relative Fluorescence Units), nieudana ekspresja jest wyraźnie widoczna na żelach SDS-PAGE jako liczne fluorescencyjne produkty o malejących rozmiarach. Podejście to wykorzystuje zdolność GFP (Green Fluorescent Protein) do zachowania fluorescencji nawet podczas wizualizacji na konwencjonalnym żelu SDS-PAGE, pod warunkiem, że próbki nie zostaną podgrzane po zmieszaniu. Zamiast tego miesza się je z buforem do nakładania na żel i nakłada bezpośrednio na żel. Choć materiały i sprzęt do elektroforezy SDS-PAGE są zazwyczaj zamienne, obrazer żeli musi umożliwiać wizualizację fluorescencji GFP. Typowa konfiguracja dla wizualizacji GFP obejmuje wzbudzenie przy 485 nm (szerokość pasma 5 nm), emisję przy 516 nm (szerokość pasma 5 nm) oraz 1 min interwał odczytu przez 2 h.
Optymalizacja układu jest możliwa przy użyciu samej ekspresji eGFP. Rycina 2A,B (wstawka) przedstawiają typowe wyniki ekspresji w reakcjach optymalizacyjnych dla dwóch partii LTE, gdzie RFU eGFP wzrasta wraz ze wzrostem stężeń rNTP.Mg, osiągając optymalny poziom odpowiednio +0,6x rNTP.Mg (Rycina 2A) oraz +0,3x rNTP.Mg (Rycina 2B) dla maksymalnego RFU. Zredukowany roztwór zasilający rNTP zawiera 0,6x rNTP.Mg, co skutkuje całkowitym poziomem rNTP.Mg wynoszącym odpowiednio 1,2x i 0,9x ilości domyślnej dla tych partii LTE. Rycina 2C ilustruje kinetykę wzrostu RFU podczas reakcji dla partii LTE przedstawionej na Rycynie 2B, wykazując reakcję dwufazową z dwiema wyraźnymi fazami w czasie trwania procesu.
<img alt="kinetyka ekspresji eGFP, RFU względem rNTP.Mg, wykres; analiza wydajności transkrypcji DNA, schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65592/65592fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Optymalizacja dodatku uzupełniającego rNTP.Mg w LTE z zredukowanym rNTP 5x FS. (A) Poziomy ekspresji eGFP po 140 min ekspresji z plazmidu kontrolnego przy różnych poziomach dodatku uzupełniającego rNTP.Mg w bezkomórkowej reakcji ekspresyjnej (n = 3, wykreślono Mean ± SD). (B) Optymalizacja innej partii produkcji LTE, wykazująca zmniejszoną ekspresję powyżej określonego progu rNTP.Mg. (C) Kinetyka akumulacji eGFP w tych samych reakcjach co w (B), przy zwiększającym się dodatku uzupełniającym rNTP.Mg. Dane te reprezentują również typową kinetykę akumulacji białka w ekspresji z partii LTE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65592/65592fig02large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
Należy jednak zauważyć, że eGFP, będąc małym białkiem (27 kDa), które łatwo ulega fałdowaniu, prawdopodobnie zostanie wyekspresowane, sfałdowane i dojrzale niezależnie od zastosowanego systemu ekspresji bezkomórkowej. Niepowodzenie systemu jest bardziej prawdopodobne przy ekspresji większych białek docelowych, przy czym produkty skrócone stają się bardziej widoczne w przypadku białek wejściowych o masie powyżej 70 kDa33. Dlatego też lepsza jest optymalizacja systemu z białkiem lub białkami przeznaczonymi do rzeczywistego zastosowania, przy jednoczesnej obecności eGFP w celu kwantyfikacji, lecz w formie fuzji N-końcowej z białkiem docelowym.
Rysunek 3 przedstawia typową optymalizację poziomu uzupełnienia rNTP.Mg przy zastosowaniu większego szablonu białkowego wykazującego tendencję do wytwarzania produktów skróconych (eGFP-Sox18). Dzięki zastosowaniu formatu żelu SDS-PAGE w warunkach półnatywnych (tj. bez podgrzewania próbek) możliwe jest zwizualizowanie postępującego spadku wydajności ekspresji. Optymalny dodatek rNTP.Mg na poziomie +0,1x (w połączeniu z 0,6x rNTP.Mg w częściowym roztworze dosycającym, co daje łącznie 0,7x) wyraźnie zmniejsza frakcję prążka białka o pełnej długości w stosunku do całkowitych fluorescencyjnych produktów ekspresji, co wskazuje na niewydolność systemu przy nadmiernym dodatku rNTP.Mg.
Jak wspomniano w protokole, można pominąć etap optymalizacji rNTP.Mg i bezpośrednio dodać pełną ilość rNTP.Mg do „domyślnego” roztworu do zasilania podczas suplementacji natychmiast po filtracji żelowej w kroku 6.2. W ten sposób protokół w zasadzie powraca do pierwotnych opublikowanych metod tworzenia LTE34. Autorzy uważają jednak, że dopasowanie systemu w celu uzyskania optymalnych wyników, co pokazano na Rysunku 3 (ścieżka D do ścieżki E), przeważa nad dodatkową złożonością protokołu i zwiększa wartość LTE jako narzędzia do ekspresji białek.
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej; rozdział prążków DNA; wizualizacja barwnikiem fluorescencyjnym; oczyszczanie białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65592/65592fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wpływ zwiększania ilości rNTP.Mg w uzupełnianiu na ekspresję eGFP-Sox18 w częściowo suplementowanym LTE. Półynatywny żel SDS-PAGE przedstawiający wpływ zwiększania ilości rNTP.Mg w uzupełnianiu na ekspresję eGFP-Sox18. Ścieżka A: uzupełnienie +0,1x (rNTP.Mg), ścieżka B: +0,2x (rNTP.Mg), ścieżka C: +0,3x (rNTP.Mg), ścieżka D: +0,4x (rNTP.Mg). Fuzja eGFP na N-końcu jest wizualizowana poprzez skanowanie fluorescencyjne żelu. Główny prążek w ścieżce A reprezentuje pełnowymiarowe eGFP-Sox18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65592/65592fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td rowspan="2">Składnik</td>
			<td rowspan="2">Stężenie zapasu</td>
			<td >5x roztwór pożywkowy</td>
			<td >µL zapasu/mL 5x roztworu pożywkowego</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Domyślne (zredukowane rNTP)</td>
			<td >Domyślne (zredukowane rNTP)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Spermidyna</td>
			<td >100 mM</td>
			<td >1.25 mM</td>
			<td >12</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >DTT</td>
			<td >500 mM</td>
			<td >10 mM</td>
			<td >20</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Fosforan kreatyny</td>
			<td >1000 mM</td>
			<td >200 mM</td>
			<td >200</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >HEPES-KOH pH7.6</td>
			<td >2500 mM</td>
			<td >100 mM</td>
			<td >40</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >PEG3000</td>
			<td >0.5 v/v</td>
			<td >0.05 v/v</td>
			<td >100</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Koktajl inhibitorów proteaz</td>
			<td >120x</td>
			<td >5x</td>
			<td >43</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Aminokwasy</td>
			<td >3.6 mM (każdy)</td>
			<td >0.68 mM (każdy)</td>
			<td >190</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >ATP</td>
			<td >100 mM</td>
			<td >8.5 (5.1) mM</td>
			<td >85 (51)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >GTP</td>
			<td >100 mM</td>
			<td >3.2 (1.9) mM</td>
			<td >32 (19) </td>
		</tr >
		<tr >
			<td >UTP</td>
			<td >100 mM</td>
			<td >2.5 (1.5) mM</td>
			<td >25 (15)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CTP</td>
			<td >100 mM</td>
			<td >2.5 (1.5) mM</td>
			<td >25 (15)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Mg(OAc)2</td>
			<td >1M</td>
			<td >16.7 (10) mM</td>
			<td >16.7 (10)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Oligo anty-splice leader</td>
			<td >1mM</td>
			<td >0.05 mM</td>
			<td >50</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Polimeraza RNA T7</td>
			<td >5 mg/mL</td>
			<td >0.5 mg/mL</td>
			<td >100</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Kinaza fosforanowa kreatyny</td>
			<td >5 units/µL</td>
			<td >0.2 units/µL</td>
			<td >42</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Woda ultrapure</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >19 (93)</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Skład 5x roztworu zasilającego (5x FS) dla LTE. 1 mL 5x FS jest wymagany na każde 2,5 mL nieuzupełnionego lizatu po filtracji żelowej. Uzupełnienie domyślnym 5x FS tworzy gotowy do ekspresji LTE do zastosowania w reakcjach ekspresyjnych w stosunku 7 µL/10 µL. Przepis z obniżoną zawartością rNTP.Mg (ilości zapisane kursywą) jest zalecany do optymalizacji ekspresji LTE i zawiera 0,6-krotność domyślnych poziomów rNTP i magnezu. Wartości te mogą być dostosowane do różnych poziomów (od 0,6 do 1,1 razy) w kolejnym eksperymencie optymalizacyjnym, korzystając z dodatków opisanych w Tabeli 2.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Uzupełnienie rNTP</td>
			<td >ATP (100 mM)</td>
			<td >GTP (100 mM)</td>
			<td >UTP (100 mM)</td>
			<td >CTP (100 mM)</td>
			<td >MgOAc (1 M)</td>
			<td rowspan="2" >Woda ultrapure</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >(1 µL/10 µL reakcji)</td>
			<td >µL/200 µL</td>
			<td >µL/200 µL</td>
			<td >µL/200 µL</td>
			<td >µL/200 µL</td>
			<td >µL/200 µL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >+0x</td>
			<td >0</td>
			<td >0</td>
			<td >0</td>
			<td >0</td>
			<td >0</td>
			<td >200</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >+0.1x</td>
			<td >3.4</td>
			<td >1.3</td>
			<td >1</td>
			<td >1</td>
			<td >0.7</td>
			<td >193</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >+0.2x</td>
			<td >6.8</td>
			<td >2.5</td>
			<td >2</td>
			<td >2</td>
			<td >1.3</td>
			<td >185</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >+0.3x</td>
			<td >10.2</td>
			<td >3.8</td>
			<td >3</td>
			<td >3</td>
			<td >2</td>
			<td >178</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >+0.4x</td>
			<td >13.6</td>
			<td >5.1</td>
			<td >4</td>
			<td >4</td>
			<td >2.7</td>
			<td >171</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >+0.5x</td>
			<td >17</td>
			<td >6.4</td>
			<td >5</td>
			<td >5</td>
			<td >3.3</td>
			<td >163</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Skład roztworów uzupełniających (rNTP.Mg) do optymalizacji LTE. Roztwory te są wykorzystywane do optymalizacji LTE poprzez dodanie 1 µL roztworu uzupełniającego na 10 µL reakcji ekspresji białka. Po ustaleniu poziomu uzupełnienia w eksperymencie optymalizacyjnym, można go konsekwentnie dodawać do wszystkich kolejnych reakcji ekspresji białka przy użyciu tych samych alikwotów partii LTE. Alternatywnie można go dodać bezpośrednio do samych alikwotów w ilości 1 µL na 7 µL (bez rozmrażania). Po rozmrożeniu i wymieszaniu lizaty te są stosowane w proporcji 8 µL LTE na 10 µL ekspresji białka, co pozwala zachować poziom uzupełnienia rNTP.Mg ustalony podczas optymalizacji.

Leishmania Translational Extract (LTE) to eukariotyczny system ekspresji białek bez komórek, pochodzący od jednokomórkowego pasożyta, Leishmania tarentolae. Ten zoptymalizowany protokół sprawia, że produkcja LTE jest prosta i opłacalna. Nadaje się do różnych zastosowań skoncentrowanych na wielorównoległej ekspresji i badaniu złożonych białek eukariotycznych i ich interakcji.

Produkcja i optymalizacja LTE, bezkomórkowego systemu ekspresji białek pochodzących z Leishmania tarentolae do produkcji białek rekombinowanych

This protocol outlines the production and optimization of a eukaryotic Cell-Free Protein Expression System (CFPS) derived from the unicellular flagellate ...

Nasz bezkomórkowy system ekspresji białek, który zazwyczaj wymaga łańcucha chłodniczego do transportu, ma teraz pionierską wersję liofilizowaną. Ta wersja pozostaje stabilna w temperaturach otoczenia, co czyni ją pierwszym systemem eukariotycznym dostępnym w tym formacie. Upraszcza to transport do laboratoriów i zastosowań terenowych.Obecne wyzwania eksperymentalne związane z bezkomórkową produkcją białek obejmują optymalizację warunków reakcji w celu zapewnienia, że rekombinowane białka są prawidłowo sfałdowane i aktywne. Chociaż opłacalność technik bezkomórkowych w porównaniu z konwencjonalną ekspresją białek in vivo pozostaje poważnym wyzwaniem, prostota naszego eukariotycznego systemu bezkomórkowego LTE pomaga złagodzić ten problem. Bezkomórkowy system LTE ułatwia szybką rekonstrukcję i analizę sieci białkowych i szlaków biosyntezy.Jego integracja z technologiami takimi jak AlphaLisa i testami in vivo umożliwia funkcjonalną analizę złożonych systemów, w tym sieci interakcji białkowych SARS-CoV-2 i sekretonu tęgoryjca. Bezkomórkowy system LTE umożliwia szybką i ekonomiczną produkcję trudnych do ekspresji białek w formacie multipleksowym. Oferuje łatwą optymalizację syntezy białek, doskonaląc się i wytwarzając złożone lub toksyczne białka.System jest skalowalny i zapewnia stałą jakość każdej partii. Na początek zbierz nocne kultury Leishmania tarentolae. Zmierzyć gęstość optyczną kultur podczas zbioru przy 600 nanometrach, używając rozcieńczenia 1:10 w pożywce hodowlanej.Obliczyć docelową objętość koncentratu, aby osiągnąć końcową gęstość optyczną 300 przy 600 nanometrach. Przenieś zebraną kulturę komórkową do odpowiednich butelek wirówkowych, odwiruj butelki w temperaturze 2 500 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie zdekantować supernatant do pojemnika na odpady hodowlane.Umyj paletę komórek w 500, 200 i 20 mililitrach buforu SEB. Następnie wlać koncentrat zawieszony SEB do odpowiedniego przemytego cylindra objętościowego. Uzupełnić objętość do objętości docelowej za pomocą zimnego SEB, a następnie delikatnie wymieszać za pomocą pipety.Aby lizować koncentrat komórkowy, przenieś go do wstępnie schłodzonego urządzenia kawitacyjnego azotu pod ciśnieniem 70 barów i inkubuj przez 45 minut na lodzie. Następnie otwórz otwór wentylacyjny w urządzeniu kawitacyjnym i wyrzuć lizat do oczyszczonej kolby odbiorczej umieszczonej na lodzie. Następnie przenieść lizat do probówek wirówkowych i wirować w temperaturze 10 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po przeniesieniu supernatantu do świeżych probówek, odwirować lizat przy 30 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieść supernatant do świeżej probówki wirówkowej umieszczonej na lodzie. Ustaw cztery grawitacyjne żelowe kolumny filtracyjne PD-10 na 10 mililitrów lizatu w formacie stojaka, który umożliwia ich kapanie do odpowiedniej tacki zbiorczej.Dodaj 2,5 mililitra lizatu do każdej kolumny. Po przejściu do kolumny dodaj 0,5 mililitra buforu elucyjnego, aby osadzić lizat. Wyjmij tacę na odpady i umieść nową tacę zbiorczą pod kolumnami.Następnie dodaj 2,5 mililitra buforu elucyjnego, aby wymyć lizat przefiltrowany przez żel. Zebrać przefiltrowany w żelu lizat do świeżej probówki wirówkowej. Następnie zmierz absorbancję przefiltrowanego lizatu na głębokości 280 nanometrów za pomocą spektrofotometru NanoDrop.Dodaj pięciokrotnie roztwór zasilający do lizatu w stosunku 2:5, a następnie dokładnie wymieszaj mieszaninę. Podziel mieszaninę na 1,5 mililitrowe probówki do mikrowirówek, a następnie zatrzaskowo zamroź probówki w ciekłym azocie do wykorzystania w przyszłości.

production-optimization-lte-leishmania-tarentolae-derived-cell-free

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Ekspresja białek malarycznych w systemach komórkowych pozostaje wyzwaniem. Pokazujemy dwuetapowe i jednoetapowe systemy ekspresji komórkowej IVT (translacja in vitro) do ekspresji rekombinowanych białek rhoptrii malarii z komórek HeLa. Do oczyszczania białek rhoptrii używamy systemu oczyszczania opartego na powinowactwie do żywicy Ni.

Oparte na HeLa systemy ekspresji bezkomórkowej do ekspresji białek Plasmodium Rhoptry

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

Ten protokół opisuje szybką i prostą metodę produkcji lizatu bakteryjnego do ekspresji genów bez komórek, przy użyciu zmodyfikowanego szczepu Escherichia coli i wymagającego jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Szybka, niedroga i nieskomplikowana produkcja lizatu bezkomórkowego

Tutaj opisujemy metodologię używaną do generowania szczepów L. panamensis i L. donovani wyrażających gen eGFP jako stabilny zintegrowany transgen za pomocą systemu pLEXSY. Transfekowane pasożyty klonowano poprzez ograniczenie rozcieńczenia, a klony o najwyższej intensywności fluorescencji u obu gatunków wybrano do dalszego wykorzystania w testach przesiewowych leków.

Rozwój szczepów gatunków Leishmania z konstytutywną ekspresją eGFP

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Kontrolowanie ekspresji białek jest nie tylko niezbędne dla każdego żyjącego organizmu, ale także stanowi ważną strategię badania funkcji białek w modelach komórkowych. Przedstawiony protokół przedstawia zastosowanie interferencji przeciwciał w komórkach ssaków, w tym w pierwotnych neuronach hipokampa, a także demonstruje zastosowanie trójwymiarowych rekonstrukcji w badaniu funkcji białek.

Badanie funkcji białek i roli zmienionej ekspresji białek przez interferencję przeciwciał i rekonstrukcje trójwymiarowe

Poznaj system ekspresji białek LTE z Leishmania tarentolae do produkcji białek rekombinowanych. Ta metoda liofilizowana zapewnia stabilność w temperaturze pokojowej, upraszczając transport i zastosowania polowe.

Produkcja i optymalizacja LTE, bezkomórkowego systemu ekspresji białek pochodzących z Leishmania tarentolae do produkcji białek rekombinowanych (Wideo) | JoVE Journal

Produkcja i optymalizacja LTE, bezkomórkowego systemu ekspresji białek pochodzących z Leishmania tarentolae do produkcji białek rekombinowanych

Przeglądaj więcej filmów