Produkcja glukozy w wątrobie, mocznicozna, i lipoliza oznaczone ilościowo przy użyciu perfundowanego modelu wątroby myszy
6 października 2023
Tutaj prezentujemy solidną metodę perfuzji in situ wątroby myszy do badania ostrej i bezpośredniej regulacji metabolizmu wątroby bez naruszania architektury wątroby, ale przy braku czynników pozawątrobowych.
W naszym laboratorium badamy, w jaki sposób wątroba reaguje na powszechne i rzadkie choroby wątroby oraz jak ta adaptacja może predysponować do stanu przedcukrzycowego. Odpowiedź wątroby na zmiany w dostępności składników odżywczych i stężeniach hormonów ze zwiększoną transkrypcją odpowiednich genów, ale co ważne również z regulacją ostrą i nietranskrypcyjną. Dzięki perfuzji wątroby możemy określić ilościowo wszystkie aspekty metabolizmu, w tym uwalnianie metabolitów z dokładnością minuty do minuty.
Zaletą tej techniki w porównaniu z innymi modelami in vitro jest to, że wątroba pozostaje in situ z nienaruszoną architekturą wątroby i że wątroba jest zdolna do życia przez co najmniej trzy godziny, co pozwala każdej wątrobie myszy na samodzielną kontrolę, co znacznie zwiększa znaczenie translacyjne. Korzystając z mysiego perfundowanego układu wątrobowego, jesteśmy w stanie zidentyfikować i scharakteryzować nową kaskadę sygnalizacyjną hormonu glukagonu. Może to być ważne, ponieważ glukagon, podobnie jak inne hormony, może odgrywać istotną rolę w stanach dysmetabolicznych wątroby u pacjentów ze stłuszczeniem wątroby i cukrzycą.
Aby rozpocząć, umieść znieczuloną mysz C57 Black 6 JRJ na wznak na podgrzewanym stole operacyjnym. Potwierdź brak odruchowych reakcji na szczypanie palców u stóp. Spryskaj mysz 70% etanolem, aby zapobiec przywieraniu włosów do nożyczek.
Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie brzucha u podstawy, przecinając w górę po obu stronach klatki piersiowej, aby odsłonić jamę brzuszną. Użyj bawełnianego wacika, aby przesunąć jelita w prawo, odsłaniając żyłę wrotną. Za pomocą zakrzywionych kleszczy umieść dwie ligatury pod żyłą wrotną i luźno zawiąż każdą ligaturę.
Następnie wprowadź cewnik o średnicy 0,7 milimetra do żyły wrotnej. Po perforacji wyjmij igłę z cewnika i poprowadź cewnik przez żyłę, aż końcówka cewnika znajdzie się blisko wątroby. Następnie dokręć ligatury.
Obserwuj wątrobę. Ustaw natężenie przepływu z pompy rolkowej i zamocuj rurkę perfuzyjną. Rozpocznij perfuzję wątroby w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Gdy wątroba zblednie, użyj nożyczek, aby przeciąć klatkę piersiową i przeponę. Następnie za pomocą cienkich kleszczyków punktowych umieść podwiązanie pod żyłą główną nadwątrobową dolną. Następnie wprowadzić cewnik do żyły głównej nadwątrobowej dolnej przez prawy przedsionek serca.
Po perforacji wyjąć igłę i poprowadzić cewnik przez żyłę bliżej wątroby. Następnie dokręć ligatrę. Przymocuj rurkę do zbierania ścieków perfuzyjnych i zabezpiecz wszystkie rurki wodoodporną taśmą.
Za pomocą adaptera zacisku naczynia umieść zacisk naczynia w poprzek żyły podwątrobowej bezpośrednio nad prawą żyłą nerkową, aby zapobiec martwej mieszance. Następnie zwiększ natężenie przepływu perfuzji do 3,5 mililitra na minutę. Uruchom timer i rejestrację ciśnienia.
Przykryj wątrobę sterylną serwetą zwilżoną solą fizjologiczną. Równoważyć przez 30 minut i zmierzyć objętość ścieków. Po 30 minutach równowagi rozpocząć eksperyment dla pierwszego podstawowego pobrania próbki w kolektorze frakcji.
Regularnie monitoruj pułapkę bąbelkową i uzupełniaj buforem perfuzyjnym, gdy jest bliska opróżnienia. Pobrać próbkę buforową przez trójdrożny kran bezpośrednio przed jej wejściem do narządu oraz z cewnika zbiorczego umieszczonego w żyle głównej dolnej. Za pomocą analizatora gazometrii zmierz pobraną próbkę, aby potwierdzić, że narząd jest metabolicznie aktywny.
Po 15 minutach perfuzji wyjściowej, przy użyciu pompy strzykawkowej, rozpocząć pierwszą stymulację, wprowadzając substancję badaną przez trójdrożny kran odcinający z pożądaną szybkością przepływu. Po symulacji należy pobierać próbki wyjściowe przez 20 do 30 minut przed rozpoczęciem drugiej stymulacji. Wytwarzanie mocznika w perfundowanej wątrobie ze stałymi okresami wyjściowymi poprzedzającymi każdy z dwóch okresów stymulacji sugeruje, że odpowiedź mocznika na dwie kolejne stymulacje mieszanymi aminokwasami jest spójna.
Zaobserwowano stałe podstawowe uwalnianie glukozy i nieestryfikowanych kwasów tłuszczowych przed silnym wzrostem glukozy i nieestryfikowanych kwasów tłuszczowych podczas infuzji glukagonu. Średnia wartość w stanie podstawowym i podczas infuzji glukagonu sugeruje, że glukagon szybko stymuluje glikogenolizę wątrobową i lipolizę. Jednak bez stałych okresów podstawowych niemożliwe staje się odróżnienie jednej odpowiedzi mocznika od drugiej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia niezawodną metodę perfuzji in situ wątroby myszej, która pozwala badaczom na analizę regulacji metabolizmu wątroby bez naruszania jej architektury. Technika ta umożliwia ilościowe określanie procesów metabolicznych w odstępach minutowych, co zwiększa wartość translacyjną w zrozumieniu chorób wątroby.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Metabolizm
- Fizjologia wątroby
Wstęp
- Wątroba odgrywa kluczową rolę w regulacji metabolicznej.
- Zrozumienie reakcji wątroby na zmiany poziomu składników odżywczych i hormonów jest niezbędne do leczenia chorób wątroby.
- Ostra i nietranskrypcyjna regulacja metabolizmu ma istotne znaczenie dla funkcji wątroby.
- Istniejące modele mogą nie odzwierciedlać wiernie warunków in vivo.
Cel badania
- Opracowanie metody badania metabolizmu wątroby in situ.
- Ocena wpływu hormonów, takich jak glukagon, na funkcje wątroby.
- Pogłębienie zrozumienia stanów dysmetabolicznych w chorobach wątroby.
Zastosowane metody
- Perfuzja in situ wątroby mysiej.
- Ilościowe określanie procesów metabolicznych z rozdzielczością minutową.
- Charakterystyka kaskad sygnalizacyjnych związanych z glukagonem.
- Porównanie odpowiedzi w obrębie tej samej wątroby mysiej w celu zwiększenia kontroli.
Główne wyniki
- Metoda perfuzji wątroby pozwala na zachowanie nienaruszonej architektury wątrobowej.
- Żywotność wątroby jest utrzymywana przez co najmniej trzy godziny.
- Zidentyfikowano nowe szlaki sygnalizacyjne związane z glukagonem.
- Technika ta umożliwia szczegółową analizę odpowiedzi metabolicznych.
Wnioski
- Metoda perfuzji in situ stanowi istotne osiągnięcie w badaniach nad wątrobą.
- Umożliwia ona uzyskanie wiedzy na temat ostrej regulacji metabolizmu wątroby.
- Podejście to może przyczynić się do lepszego zrozumienia chorób wątroby, takich jak stłuszczenie wątroby i cukrzyca.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model perfuzji wątroby myszy umożliwia wysokorozdzielczą kwantyfikację wątrobowej produkcji glukozy, ureogenezy oraz lipolizy w kontrolowanych warunkach, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach nad chorobami metabolicznymi. Dzięki zachowaniu nienaruszonej architektury wątroby i izolacji specyficznych odpowiedzi hepatocytoznymi, system ten zwiększa pewność prognostyczną w zakresie walidacji celów terapeutycznych oraz opracowywania biomarkerów translacyjnych. Zdolność do przeprowadzania kontroli wewnątrzpróbkowych oraz pomiarów rozdzielczych w czasie czyni go kluczowym narzędziem na etapie przejściowym między odkryciem a badaniami przedklinicznymi w ramach programów portfelowych dotyczących zaburzeń metabolicznych i endokrynologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę wątrobowych szlaków metabolicznych w odpowiedzi na hormony i składniki odżywcze.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów zaangażowanych w metabolizm glukozy, mocznika i lipidów.
- Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez wyizolowanie efektów specyficznych dla wątroby od wpływów systemowych.
- Dostarcza ilościowych danych rozdzielonych w czasie, co pozwala na opracowanie modeli predykcyjnych i selekcję celów.
Przesiewy i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowane, fizjologicznie istotne odczyty dla przesiewu związków w zakresie metabolizmu wątrobowego.
- Wspiera powtarzalność analizy dzięki kontrolom wewnętrznym i stabilnej żywotności wątroby przez maksymalnie trzy godziny.
- Umożliwia standaryzację pomiarów wydajności metabolicznej w celu zapewnienia porównywalności między badaniami.
- Przygotowuje stabilne systemy biologiczne do dalszej oceny farmakologicznej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dopasowuje wyniki metaboliczne do punktów końcowych istotnych dla chorób w modelach stłuszczenia wątroby i cukrzycy.
- Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną poprzez zachowanie kontekstu fizjologicznego.
- Wspiera decyzje o rozwoju projektów z uwzględnieniem ryzyka dzięki ilościowemu dopasowaniu biomarkerów.
- Zwiększa ciągłość translacyjną poprzez modelowanie regulacji ostrej i nietranskrypcyjnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od wczesnych badań mechanistycznych, przez identyfikację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną w kierunku wskazań metabolicznych i endokrynologicznych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących wątrobowej regulacji metabolicznej oraz mapowanie szlaków sygnałowych.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki do oceny związków i hormonów.
- Analityka: Wspiera pomiary uwalniania glukozy, mocznika i kwasów tłuszczowych w odstępach minutowych w celu przeprowadzenia analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy ostre odpowiedzi metaboliczne z fenotypami istotnymi dla chorób oraz strategiami biomarkerowymi.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku dla zróżnicowanych badań nad metabolizmem i sygnalizacją w ramach różnych programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w wątrobie.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne testy metaboliczne.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie skutecznej biologicznej redukcji ryzyka.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój projektów związanych z chorobami metabolicznymi.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga biegłości w technikach mikrochirurgicznych oraz w fizjologii wątroby.
- Wymaga specjalistycznej aparatury perfuzyjnej oraz platform analitycznych do pomiarów metabolicznych.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia porównywalności i powtarzalności danych.
- Może być konieczna adaptacja metody dla różnych szczepów myszy lub modeli chorobowych.
- Żywotność jest ograniczona do trzech godzin; wydajność i skalowalność powinny być planowane odpowiednio.
