Name: Produkcja glukozy w wątrobie, mocznicozna, i lipoliza oznaczone ilościowo przy użyciu perfundowanego modelu wątroby myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Poznaj metodę perfuzji wątroby myszy in situ do badania regulacji metabolizmu wątrobowego w czasie rzeczywistym. Technika zachowuje integralną architekturę narządu i pozwala na minutową kwantyfikację procesów metabolicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania i Nicolai J. Wewer Albrechtsen były wspierane przez Novo Nordisk Foundation Excellence Emerging Investigator Grant - Endokrynologia i Metabolizm (nr wniosku. NNF19OC0055001), Europejska Fundacja Badań nad Cukrzycą Future Leader Award (NNF21SA0072746) oraz Niezależny Fundusz Badawczy Dania, Sapere Aude (1052-00003B). Centrum Badań nad Białkami Fundacji Novo Nordisk jest wspierane finansowo przez Fundację Novo Nordisk (umowa o grant NNF14CC0001). Rysunek 1B został stworzony przy użyciu biorender.com. Dziękujemy dr Rune E. Kuhre (Novo Nordisk A/S) za owocne dyskusje na temat perfundowanej wątroby myszy.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą duńskiego Inspektoratu Eksperymentów na Zwierzętach przy Ministerstwie Środowiska i Żywności Danii (pozwolenie 2018-15-0201-01397) oraz lokalnej komisji etycznej, zgodnie z dyrektywą UE 2010/63/UE, wytycznymi National Institutes of Health (publikacja nr 85-3) oraz zgodnie z przepisami prawa duńskiego regulującymi eksperymenty na zwierzętach (1987). Jest to procedura terminalna, a przyczyną śmierci jest upuszczenie krwi oraz perforacja przepony w głębokiej anestezji.
1. Zwierzęta doświadczalne
<ol>
	<li>Należy pozyskać myszy odpowiedniej linii, w odpowiednim wieku i płci. W niniejszym badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6JRj w wieku od 11 do 16 tygodni. W jednej klatce należy umieścić do 5 samców lub 8 samic z dostępem ad libitum do karmy i wody, utrzymując 12-godzinny cykl światła i ciemności z zapalonym światłem od 6:00 do 18:00.</li>
</ol>
2. Przygotowania przedoperacyjne
<ol>
	<li>Przygotować bufor do perfuzji wątroby.
	<ol>
		<li>Bufor Krebsa-Henseleita. Wymieszać i rozpuścić 118 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgSO4 oraz 1,2 mmol/L KH2PO4 w dH2O. Rozpuścić 1,25 mmol/L CaCl2 w osobnym zlewce i dodać do buforu.</li>
		<li>Rozpuścić 25 mmol/L NaHCO3 i powoli dodać do buforu podczas mieszania. Przechowywać bufor w temperaturze 4 deg. Bufor jest stabilny przez co najmniej 1 miesiąc. 
		UWAGA: Może dojść do wytrącenia osadu, jeśli CaCl2 i NaHCO3 nie zostaną rozpuszczone oddzielnie przed dodaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przefiltrować bufor perfuzyjny przez filtr 2 µm i dostosować pH do 7,5 za pomocą HCl. 
	UWAGA: Ten etap należy wykonać w dniu eksperymentu, ponieważ pH wzrasta z czasem, nawet podczas przechowywania w zamkniętych kolbach.</li>
	<li>Przygotować związki testowe w stężeniu wyższym niż pożądane stężenie końcowe (np. stężenie 20x przy infuzji z prędkością 0,175 mL/min za pomocą pompy bocznej) w przefiltrowanym i skorygowanym pod względem pH buforze perfuzyjnym Krebsa-Henseleita. Jeśli jest to wymagane, rozcieńczyć związki testowe w buforze perfuzyjnym Krebsa-Henseleita z dodatkiem 1% BSA jako nośnika (aby zapobiec adhezji do drenów i szkła, co jest kluczowe dla wszystkich peptydów), przefiltrowanym przez filtr o odpowiedniej wielkości.</li>
</ol>
3. Obsługa i perfuzja
UWAGA: Ilustracja układu perfuzyjnego wykorzystanego w tym badaniu znajduje się na Rysunku 1.
<ol>
	<li>Napowietrz bufor perfuzyjny (95% O2, 5% CO2) przez co najmniej 30 min, aby dostarczyć wątrobie wystarczającą ilość tlenu i utrzymać prawidłowe pH od początku operacji (układ buforowy wodorowęglanowy osiągnie pH 7,4 przy ciągłym napowietrzaniu, patrz Supplementary Figure 1).</li>
	<li>Zanurz mysz w narkozie, podając ketaminę (90 mg/kg) i ksylazynę (10 mg/kg) poprzez wstrzyknięcie domięśniowe.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji na plecach na podgrzewanym stole operacyjnym i potwierdź brak odruchów w odpowiedzi na uciśnięcie palca u nogi. Spryskaj 70% etanolem, aby zapobiec przywieraniu sierści do nożyczek. Przymocowanie myszy do ciepłej powierzchni pomaga zwiększyć stabilność podczas kolejnych procedur.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie nożyczkami u podstawy brzucha i przetnij w górę do klatki piersiowej po obu stronach, aby odsłonić jamę brzuszną. Przesuń jelita w prawo za pomocą patyczka watnego, odsłaniając żyłę wrotną.</li>
	<li>Za pomocą zakrzywionych kleszczyków umieść dwa podwiązania pod żyłą wrotną i przygotuj luźny węzeł dla każdego z nich.</li>
	<li>Wprowadź cewnik 0,7 mm do żyły wrotnej. Po przebiciu usuń igłę z cewnika i prowadź go przez żyłę, aż jego końcówka znajdzie się blisko wątroby, jak pokazano na Figure 2. Do cewnika zacznie wpływać krew.</li>
	<li>Zaciśnij podwiązania. Jeśli cewnik nie jest wypełniony krwią, napełnij go buforem perfuzyjnym, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyka powietrza.</li>
	<li>Podłącz rurkę perfuzyjną i rozpocznij perfuzję wątroby buforem wodorowęglanowym Krebsa-Henseleita w temperaturze 37 °C, uruchamiając pompę perystaltyczną przy przepływie perfuzyjnym 0,8 mL/min. W ciągu kilku sekund wątroba staje się blada.</li>
	<li>Przetnij klatkę piersiową i przeponę za pomocą nożyczek. W tym momencie zwierzę zostaje uśmiercone. Za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami umieść podwiązanie pod nadwątrobowym odcinkiem żyły głównej dolnej. Umieść długopis, zwiniętą gazę lub inny przedmiot jednorazowy pod grzbietem myszy, aby ułatwić dostęp do żyły.</li>
	<li>Wprowadź cewnik do nadwątrobowego odcinka żyły głównej dolnej poprzez prawy przedsionek serca. Po przebiciu usuń igłę z cewnika i prowadź go przez żyłę, aż jego końcówka znajdzie się blisko wątroby. Krew i bufor perfuzyjny natychmiast wypłyną na zewnątrz.</li>
	<li>Zaciśnij podwiązanie i podłącz rurkę do zbierania odcieku perfuzyjnego. Zabezpiecz wszystkie rurki wodoodporną taśmą (taśmą satynową lub podobną).</li>
	<li>Użyj adaptera zacisku naczyniowego, aby umieścić zacisk naczyniowy na podwątrobowym odcinku żyły głównej dolnej, bezpośrednio powyżej prawej żyły nerkowej, aby zapobiec domieszce (Figure 2).</li>
	<li>Zwiększ przepływ perfuzyjny do 3,5 mL/min i uruchom stoper. Rozpocznij rejestrację ciśnienia. Pomyślna perfuzja zazwyczaj skutkuje ciśnieniem ~10 mm/Hg.</li>
	<li>Przykryj wątrobę sterylną ściereczką zwilżoną solą fizjologiczną i dodawaj sól fizjologiczną w trakcie eksperymentu, aby zapobiec jej wysychaniu.</li>
	<li>Zbieraj odciek perfuzyjny przez 1 min i zmierz jego objętość. Objętość powinna wynosić około 3,5 mL/min. Na tym etapie nie spodziewamy się domieszki krwi, a serce nie pompuje już krwi.</li>
	<li>Odczekaj 30 min w okresie równoważenia przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
</ol>
<img alt="Układ systemu perfuzji wątroby: cyrkulator termostatyczny, pompa strzykawkowa; schemat przedstawia drogi przepływu płynu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65596/65596fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ilustracja układu perfuzyjnego. (A) Stół operacyjny jest uniesiony na statywie trójnogim i podgrzany do 37 °C. Bufor perfuzyjny jest napowietrzany (95% O2, 5% CO2), pompowany za pomocą perystaltycznej pompy rolkowej i podgrzewany w wymienniku ciepła z wbudowaną pułapką pęcherzykową. System składa się ponadto z manometru i pompy wrzecionowej do regulacji ciśnienia perfuzji. Ciśnienie perfuzji jest stale rejestrowane i wizualizowane za pomocą przetwornika na komputerze PC w programie do zapisu ciśnienia. (B) Czerwona ramka obejmuje połączenia kurków trójdrożnych. Pierwszy kurek trójdrożny jest otwarty dla infuzji związku testowego za pomocą pompy strzykawkowej, a drugi jest zamknięty. Trzeci jest otwarty dla ciągłych pomiarów ciśnienia. Czwarty kurek może być wykorzystany do pobierania próbek wejściowych, np. do analizy gazowej w perfundowanej wątrobie. Złącza mogą być modyfikowane zgodnie z potrzebami dla konkretnych eksperymentów wymagających większej lub mniejszej liczby linii infuzyjnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65596/65596fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Sekcja anatomiczna myszy z widoczną żyłą wrotną, wątrobą i nerką; opisana, eksperyment chirurgiczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65596/65596fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Zdjęcia jamy brzusznej myszy przed i w trakcie perfuzji wątroby. (A)Zielona kropka wskazuje położenie końcówki cewnika żyły wrotnej. Ważne jest, aby końcówka cewnika znajdowała się tuż poniżej miejsca rozgałęzienia żyły wrotnej na lewą i prawą żyłę wrotną wątrobową, ale powyżej odgałęzienia trzustkowo-dwunastniczego, aby uniknąć wycieku. Żółta kropka wskazuje prawidłowe miejsce założenia zacisku naczyniowego na podwątrobowym odcinku żyły głównej dolnej, pomiędzy prawą żyłą nerkową a wątrobą, aby zapobiec cofaniu się krwi do perfundowanej wątroby. (B, C) Perfundowana wątroba myszy z dwoma cewnikami wprowadzonymi do żyły wrotnej (B) oraz nadwątrobowego odcinka żyły głównej dolnej (C) i zaciskiem naczyniowym na podwątrobowym odcinku żyły głównej dolnej (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65596/65596fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
4. Eksperyment
<ol>
	<li>Rozpocznij eksperyment od pobrania pierwszych próbek bazowych za pomocą kolektora frakcji po zakończeniu okresu równoważenia. Pobieraj próbki w pożądanym odstępie czasu i natychmiast umieszczaj je w lodzie.</li>
	<li>Regularnie sprawdzaj pułapkę pęcherzykową i uzupełniaj bufor perfuzyjny, gdy poziom cieczy będzie niski.</li>
	<li>Pobierz próbkę buforu za pomocą kurka trójdrożnego bezpośrednio przed jego wprowadzeniem do organu oraz z cewnika zbierającego wprowadzonego do żyły głównej dolnej (po przepływie przez wątrobę).</li>
	<li>Zmierz próbki za pomocą analizatora gazometrii krwi, aby potwierdzić aktywność metaboliczną organu (wskaźnikiem jest wzrost ciśnienia parcjalnego CO2 oraz spadek pH).</li>
	<li>Powtórz kroki 4.3-4.4 na koniec eksperymentu, aby ocenić żywotność organu w trakcie całego przebiegu badania (Supplementary Figure 2). 
	UWAGA: Spadek ciśnienia parcjalnego tlenu nie stanowi wiarygodnej miary oddychania ze względu na straty tlenu przez dreny, organ itp.</li>
	<li>Po 15 min perfuzji bazowej rozpocznij pierwszą stymulację, podając substancję testową przez kurek trójdrożny z pożąganą prędkością przepływu przy użyciu pompy strzykawkowej (np. 20-krotne stężenie substancji testowej przy przepływie 0,175 mL/min za pomocą pompy bocznej). Alternatywnie zamień bufor bazowy na nowy (natleniony i podgrzany) bufor zawierający związek testowy w stężeniu końcowym.</li>
	<li>Zakończ stymulację i pobieraj próbki bazowe przez 20-30 min przed rozpoczęciem drugiej stymulacji.</li>
	<li>Na koniec eksperymentu podaj odpowiednią kontrolę pozytywną przez 5-10 min.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu wyciąć perfundowaną wątrobę i zważyć ją, aby znormalizować wyniki do masy wątroby. Zamrozić wątrobę gwałtownie w ciekłym azocie w celu ewentualnego pomiaru zawartości białka i normalizacji wyników do zawartości białka.</li>
</ol>
5. Pomiary biochemiczne
<ol>
	<li>Oznaczyć stężenie interesującej cząsteczki, stosując testy odpowiednie do pomiarów w buforze perfuzyjnym (własne lub dostępne komercyjnie testy kolorymetryczne lub ELISA). Bufor ten jest kompatybilny z większością technik opartych na omice, takich jak metabolomika i proteomika. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu poziom mocznika zmierzono przy użyciu opisanego wcześniej testu kolorymetrycznego14. Stężenie glukozy i wolnych kwasów tłuszczowych oznaczono z użyciem dostępnych komercyjnie zestawów.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Przedstaw dane na wykresach XY obrazujących wydzielanie w czasie. 
	UWAGA: Jedną z zalet systemu perfuzji in vitro jest możliwość wyrażenia danych jako rzeczywiste wydzielanie (stężenie × szybkość przepływu, np. µmol/min) zamiast mierzonego stężenia w odpływie (mmol/L), jak ma to miejsce w badaniach in vivo. Rozważ normalizację wydzielania do masy wątroby przy porównywaniu różnych modeli mysich lub do całkowitej zawartości białka (mierzonej metodą BCA) przy porównywaniu myszy kontrolnych z modelami mysimi z otyłością lub chorobami wątroby, gdzie wzrost masy wątroby może wynikać ze zwiększonej zawartości tłuszczu.</li>
	<li>Przedstaw dane podsumowujące w formie pojedynczych punktów dla każdego zwierzęcia, reprezentujących średnie lub całkowite wydzielanie w fazie bazowej oraz w okresie stymulacji (zazwyczaj 15-30 min) lub wydzielanie przyrostowe względem poprzedniej fazy bazowej dla każdego okresu stymulacji, w zależności od projektu badania.</li>
	<li>Przeanalizuj dane za pomocą testu t dla prób zależnych (dwie grupy) lub jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) przy wielokrotnych stymulacjach (więcej niż dwie grupy) z zastosowaniem odpowiedniego testu post-hoc dla porównań wielokrotnych.</li>
</ol>

In Situ Mouse Liver Perfusion Model to Study Metabolic Responses to Substrates

<ol><li>Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+co-culture+of+rat+parenchymal+and+non-parenchymal+liver+cells+to+evaluate+cellular+interactions+and+response%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response.</a> Scientific Reports. 6, 25329(2016).</li>
<li>Lauschke, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+rearrangements+of+cellular+MicroRNA+signatures+are+key+drivers+of+hepatocyte+dedifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation.</a> Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).</li>
<li>Seirup, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+in+chromatin+structure+during+dedifferentiation+of+primary+hepatocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro.</a> Genomics. 114 (3), 110330(2022).</li>
<li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+in+vitro+human+liver+models+to+in+vivo+human+liver+using+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Archive+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq.</a> Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).</li>
<li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury%2C+liver+function%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187(2016).</li>
<li>Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+and+progress+in+precision-cut+liver+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137(2021).</li>
<li>Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glass-based%2C+continuously+zonated+and+vascularized+human+liver+acinus+microphysiological+system+%28vLAMPS%29+designed+for+experimental+modeling+of+diseases+and+ADME%2FTOX%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX.</a> Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li>
<li>Bartošek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarto%C5%A1ek%2C+I+%22Isolated+Liver+Perfusion+and+its+Applications%22">Isolated Liver Perfusion and its Applications</a>. , Raven Press. New York. (1973).</li>
<li>Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+rat+liver%3A+conceptual+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations.</a> Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).</li>
<li>Mischinger, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+technique+for+isolated+perfusion+of+rat+livers+and+an+evaluation+of+perfusates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates.</a> Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).</li>
<li>Vairetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+the+liver+temperature+employed+during+machine+perfusion+and+reperfusion+damage%3A+role+of+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2.</a> Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).</li>
<li>Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+and+improving+the+mouse+and+rat+isolated+perfused+liver+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).</li>
<li>Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+urea+concentrations+in+cell+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów istotnego dla tego artykułu.

Wyizolowana perfundowana wątroba myszy jest silnym narzędziem badawczym do badań nad dynamiką i mechanizmami molekularnymi metabolizmu wątrobowego. Możliwość pobierania próbek z minuty na minutę zapewnia szczegółową ocenę bezpośredniego wpływu badanego związku na wątrobę. W porównaniu z badaniami in vivo, perfundowana wątroba pozwala na badanie metabolizmu wątroby w sposób izolowany, z pominięciem czynników pozawątrobowych przenoszonych przez krew i z pełną kontrolą nad warunkami doświadczalnymi. Zaletą perfuzji...

Wątroba jest niezbędnym organem w metabolizmie. Odgrywa kluczową rolę w kontroli bilansu energetycznego całego organizmu poprzez regulację metabolizmu glukozy, lipidów i aminokwasów. Wzrost liczby chorób wątroby na całym świecie staje się głównym globalnym obciążeniem zdrowotnym i potrzebna jest większa wiedza na temat patofizjologii i jej konsekwencji dla funkcji wątroby.
Różne modele in vitro zostały opracowane do badań nad wątrobą, aby uzupełnić badania in vivo. Szeroko stosowane są izolowane i hodowane hepatocyty pierwotne od gryzoni i ludzi. Komórki niemiąższowe można oddzielić od hepatocytów za pomocą wirowania różnicowego i gradientowego, a kokultura różnych typów komórek jest przydatna do badania przesłuchów międzykomórkowych1. Chociaż pierwotne ludzkie hepatocyty są uważane za złoty standard w testowaniu toksyczności leków, kilka badań wykazało, że hepatocyty szybko deróżnicują się w hodowli tkankowej, co powoduje utratę funkcji wątroby2,3,4. Hodowla hepatocytów w systemie sferoidalnym 3D łagodzi odróżnicowanie, jest bardziej stabilna i wydaje się naśladować wątrobę in vivo w większym stopniu niż tradycyjne systemy hodowli 2D5. Precyzyjnie wycięte plastry wątroby to kolejny dobrze sprawdzony model in vitro, który utrzymuje nienaruszoną architekturę tkanki i zawiera komórki niemiąższowe obecne w liver6. Bardziej zaawansowane modele in vitro obejmują wątrobę na chipie7 i organoidy wątrobowe8. Jednak przy wszystkich tych podejściach dochodzi do utraty integralności strukturalnej i dynamiki przepływu, w tym wektorowego przepływu żyły wrotno-wątrobowej, co prawdopodobnie wpływa na możliwość uogólnienia.
Izolowana perfundowana wątroba szczura została po raz pierwszy opisana przez Claude'a Bernarda w 1855 roku9, i jest nadal używana w różnych dziedzinach nauki do badań nad biologią wątroby, toksykologią i patofizjologią. Zalety perfundowanej wątroby w porównaniu z wyżej wymienionymi modelami in vitro obejmują utrzymanie architektury wątroby, przepływu naczyniowego, polarności i strefowości hepatocytów oraz interakcji między hepatocytami a komórkami niemiąższowymi. W porównaniu z badaniami in vivo, perfundowana wątroba pozwala na badanie metabolizmu wątroby w sposób izolowany, unikając czynników pozawątrobowych przenoszonych przez krew i z pełną kontrolą nad warunkami eksperymentalnymi. Na przestrzeni lat wprowadzono kilka modyfikacji w celu ulepszenia modelu perfuzji wątroby szczura10,11,12,13. Chociaż myszy były wykorzystywane do izolowanych badań nad perfuzją wątroby, dostępna jest mniejsza literatura. W tym miejscu przedstawiamy metodę perfuzji in situ wątroby myszy poprzez kaniulację żyły wrotnej i żyły głównej nadwątrobowej dolnej w celu zbadania ostrych i bezpośrednich odpowiedzi metabolicznych na substraty metaboliczne i hormony mierzone w wątrobowym wycieku żylnym z wątroby myszy w czasie rzeczywistym.

<table><tbody><tr><td>3-drożny kran</td><td>BD</td><td>394601</td><td></td></tr><tr><td>Dieta hodowlana Altromin</td><td>Altromin Spezialfutter</td><td>1319</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2&#183; 2H2O)</td><td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Cewniki (0,7 mm)</td><td>BD</td><td>381812</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna (wielkość porów 2,0 i #181; m)</td> <td>Zestaw do</td> pomiaru glukozy <td>Millipore AP2029325</td><td></td></tr><tr><td></td><td>QuantiChromTM</td><td>DIGL-100</td><td>Protokół niskiego stężenia</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>MSD Zdrowie zwierząt</td><td>511485</td><td>90 mg / kg</td></tr><tr><td>Ligatura (sterylny jedwab)</td><td>Agnthos</td><td>14739</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Nieestryfikowany tłuszcz zestaw kwasów</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>NEFA-HR(2)</td><td></td></tr><tr><td>Stół operacyjny, podgrzewany na statywie, typ 873</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td>733776</tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)</td><td>Merck</td><td>1.04877</td><td></td></tr><tr><td>Pompa rolkowa, z czterema kanałami</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td>730100</td><td></td></tr><tr><td>Elegancka taśma</td><td>Mediq danmark</td><td>4001910</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S1679</td><td></td></tr><tr><td>Cyrkulator termostatyczny</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td>730125</td><td>Pojemność wanny 3 l, 230 V/50 Hz</td></tr><tr><td>Wężyk</td><td>Tygon</td><td>E3603</td><td>Średnica wewnętrzna 1,59 mm, średnica zewnętrzna 3,18 mm</td></tr><tr><td>Uniwersalny system perfuzyjny</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td>732316</td><td>Jednostka podstawowa uniper UP-100, typ 834</td></tr><tr><td>Vamin</td><td>Fresenius Kabi</td><td>B05ABA01</td><td>Mieszane aminokwasy</td></tr><tr><td>Adapter zacisku naczynia</td><td>Deutsche Biomedical</td><td>DBC1002</td><td></td></tr><tr><td>Zaciski do naczyń</td><td>Deutsche Biomedical</td><td>DBC1005</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td>732068</tr><tr><td>Xylazine</td><td>Rompun Vet</td><td>530701</td><td>10 mg/kg</td></tr></tbody></table>

produkcja glukozy w wątrobie, mocznicozna, i lipoliza oznaczone ilościowo przy użyciu perfundowanego modelu wątroby myszy

Hepatic Glucose Production, Ureagenesis, and Lipolysis Quantified using the Perfused Mouse Liver Model

Wątroba pełni wiele funkcji, w tym metabolizm składników odżywczych. W przeciwieństwie do innych modeli badań wątroby in vitro i in vivo, izolowana perfuzja wątroby pozwala na badanie biologii i metabolizmu wątroby w całej wątrobie z nienaruszoną architekturą wątroby, oddzieloną od wpływu czynników pozawątrobowych. Perfuzje wątroby zostały pierwotnie opracowane dla szczurów, ale metoda została dostosowana również do myszy. Tutaj opisujemy protokół perfuzji in situ wątroby myszy. Wątroba jest perfundowana przednio przez żyłę wrotną za pomocą natlenionego buforu wodorowęglanu Krebsa-Henseleita, a wyjście jest pobierane z żyły głównej dolnej nadwątrobowej z zaciskaniem żyły podwątrobowej dolnej w celu zamknięcia obwodu. Za pomocą tej metody można ocenić bezpośrednie działanie badanego związku na wątrobę ze szczegółową rozdzielczością czasową. Czynność wątroby i jej żywotność są stabilne przez co najmniej 3 godziny, co pozwala na włączenie kontroli wewnętrznej do tego samego eksperymentu. Możliwości eksperymentalne z wykorzystaniem tego modelu są liczne i mogą wnioskować o wgląd w fizjologię wątroby i choroby wątroby.

Do określenia, czy dany bodziec lub substrat prowadzi do uwalniania interesującej nas cząsteczki, wymagana jest stabilna linia bazowa. Na Rysunku 3A przedstawiono przykład pomyślnie przeprowadzonego eksperymentu. Produkcja mocznika w perfundowanej wątrobie jest mierzona w odstępach 2 min i przedstawiona jako średnia ± SEM. Okresy bazowe poprzedzające każdy z dwóch okresów stymulacji są stabilne. Średnią produkcję mocznika podczas dwóch okresów stymulacji oraz...

Tutaj prezentujemy solidną metodę perfuzji in situ wątroby myszy do badania ostrej i bezpośredniej regulacji metabolizmu wątroby bez naruszania architektury wątroby, ale przy braku czynników pozawątrobowych.

Produkcja glukozy w wątrobie, mocznicozna, i lipoliza oznaczone ilościowo przy użyciu perfundowanego modelu wątroby myszy

The liver has numerous functions, including nutrient metabolism. In contrast to other in vitro and in vivo models of liver research, the isolated perfused ...

W naszym laboratorium badamy, w jaki sposób wątroba reaguje na powszechne i rzadkie choroby wątroby oraz jak ta adaptacja może predysponować do stanu przedcukrzycowego. Odpowiedź wątroby na zmiany w dostępności składników odżywczych i stężeniach hormonów ze zwiększoną transkrypcją odpowiednich genów, ale co ważne również z regulacją ostrą i nietranskrypcyjną. Dzięki perfuzji wątroby możemy określić ilościowo wszystkie aspekty metabolizmu, w tym uwalnianie metabolitów z dokładnością minuty do minuty.Zaletą tej techniki w porównaniu z innymi modelami in vitro jest to, że wątroba pozostaje in situ z nienaruszoną architekturą wątroby i że wątroba jest zdolna do życia przez co najmniej trzy godziny, co pozwala każdej wątrobie myszy na samodzielną kontrolę, co znacznie zwiększa znaczenie translacyjne. Korzystając z mysiego perfundowanego układu wątrobowego, jesteśmy w stanie zidentyfikować i scharakteryzować nową kaskadę sygnalizacyjną hormonu glukagonu. Może to być ważne, ponieważ glukagon, podobnie jak inne hormony, może odgrywać istotną rolę w stanach dysmetabolicznych wątroby u pacjentów ze stłuszczeniem wątroby i cukrzycą.Aby rozpocząć, umieść znieczuloną mysz C57 Black 6 JRJ na wznak na podgrzewanym stole operacyjnym. Potwierdź brak odruchowych reakcji na szczypanie palców u stóp. Spryskaj mysz 70% etanolem, aby zapobiec przywieraniu włosów do nożyczek.Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie brzucha u podstawy, przecinając w górę po obu stronach klatki piersiowej, aby odsłonić jamę brzuszną. Użyj bawełnianego wacika, aby przesunąć jelita w prawo, odsłaniając żyłę wrotną. Za pomocą zakrzywionych kleszczy umieść dwie ligatury pod żyłą wrotną i luźno zawiąż każdą ligaturę.Następnie wprowadź cewnik o średnicy 0,7 milimetra do żyły wrotnej. Po perforacji wyjmij igłę z cewnika i poprowadź cewnik przez żyłę, aż końcówka cewnika znajdzie się blisko wątroby. Następnie dokręć ligatury.Obserwuj wątrobę. Ustaw natężenie przepływu z pompy rolkowej i zamocuj rurkę perfuzyjną. Rozpocznij perfuzję wątroby w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Gdy wątroba zblednie, użyj nożyczek, aby przeciąć klatkę piersiową i przeponę. Następnie za pomocą cienkich kleszczyków punktowych umieść podwiązanie pod żyłą główną nadwątrobową dolną. Następnie wprowadzić cewnik do żyły głównej nadwątrobowej dolnej przez prawy przedsionek serca.Po perforacji wyjąć igłę i poprowadzić cewnik przez żyłę bliżej wątroby. Następnie dokręć ligatrę. Przymocuj rurkę do zbierania ścieków perfuzyjnych i zabezpiecz wszystkie rurki wodoodporną taśmą.Za pomocą adaptera zacisku naczynia umieść zacisk naczynia w poprzek żyły podwątrobowej bezpośrednio nad prawą żyłą nerkową, aby zapobiec martwej mieszance. Następnie zwiększ natężenie przepływu perfuzji do 3,5 mililitra na minutę. Uruchom timer i rejestrację ciśnienia.Przykryj wątrobę sterylną serwetą zwilżoną solą fizjologiczną. Równoważyć przez 30 minut i zmierzyć objętość ścieków. Po 30 minutach równowagi rozpocząć eksperyment dla pierwszego podstawowego pobrania próbki w kolektorze frakcji.Regularnie monitoruj pułapkę bąbelkową i uzupełniaj buforem perfuzyjnym, gdy jest bliska opróżnienia. Pobrać próbkę buforową przez trójdrożny kran bezpośrednio przed jej wejściem do narządu oraz z cewnika zbiorczego umieszczonego w żyle głównej dolnej. Za pomocą analizatora gazometrii zmierz pobraną próbkę, aby potwierdzić, że narząd jest metabolicznie aktywny.Po 15 minutach perfuzji wyjściowej, przy użyciu pompy strzykawkowej, rozpocząć pierwszą stymulację, wprowadzając substancję badaną przez trójdrożny kran odcinający z pożądaną szybkością przepływu. Po symulacji należy pobierać próbki wyjściowe przez 20 do 30 minut przed rozpoczęciem drugiej stymulacji. Wytwarzanie mocznika w perfundowanej wątrobie ze stałymi okresami wyjściowymi poprzedzającymi każdy z dwóch okresów stymulacji sugeruje, że odpowiedź mocznika na dwie kolejne stymulacje mieszanymi aminokwasami jest spójna.Zaobserwowano stałe podstawowe uwalnianie glukozy i nieestryfikowanych kwasów tłuszczowych przed silnym wzrostem glukozy i nieestryfikowanych kwasów tłuszczowych podczas infuzji glukagonu. Średnia wartość w stanie podstawowym i podczas infuzji glukagonu sugeruje, że glukagon szybko stymuluje glikogenolizę wątrobową i lipolizę. Jednak bez stałych okresów podstawowych niemożliwe staje się odróżnienie jednej odpowiedzi mocznika od drugiej.

hepatic-glucose-production-ureagenesis-lipolysis-quantified-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Lipogeneza de novo i utlenianie β-kwasów tłuszczowych stanowią kluczowe szlaki metaboliczne w hepatocytach, szlaki, które są zaburzone w wielu zaburzeniach metabolicznych, w tym w stłuszczeniu wątroby. Tutaj pokazujemy izolację pierwotnych hepatocytów myszy i opisujemy ilościowe oznaczanie utleniania i lipogenezy β-kwasów tłuszczowych.

Oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy

Tutaj opisane są zoptymalizowane metody generowania in vivo i in vitro modeli stłuszczenia wątroby oraz analizy fenotypów stłuszczeniowych i związanych z nimi parametrów fizjologicznych.

Zoptymalizowana analiza stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro

Istnieje znaczny niedobór dawców wątroby, a kryteria dla dawców wątroby zostały rozszerzone. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) został opracowany w celu oceny i modyfikacji funkcji narządów. Badanie to demonstruje szczurzy model NEVLP i testuje zdolność pegylowanej katalazy do łagodzenia uszkodzeń wątroby.

Mały zwierzęcy model normacyjnej perfuzji wątroby ex vivo

Pierwotne hepatocyty są cennym narzędziem do badania reakcji wątroby i metabolizmu in vitro. Wykorzystując dostępne na rynku odczynniki, opracowano ulepszony, efektywny czasowo i pracochłonnie protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy.

Ulepszony protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy pod względem czasu i pracy

To badanie opisuje bezpośredni pomiar produkcji glukozy w wątrobie w mysim modelu zespołu policystycznych jajników przy użyciu stabilnego izotopowego znacznika glukozy przez żyłę ogonową zarówno na czczo, jak i w stanie bogatym w glukozę w tandemie.

Ocena produkcji glukozy w wątrobie w mysim modelu zespołu policystycznych jajników

Protokół opisuje prostą metodę resekcji nienaruszonej wątroby myszy do badań metabolicznych poprzez perfuzję żyły wrotnej.

Ex vivo Perfuzja wątrobowa przez żyłę wrotną u myszy

Klirens insuliny wątrobowej jest kluczowy dla regulacji homeostazy glukozy. W tym artykule opisano przyjazną dla użytkownika procedurę perfuzji wątroby do bezpośredniej oceny szybkości klirensu insuliny w wątrobie in situ u myszy.

Ocena klirensu insuliny u myszy za pomocą perfuzji wątrobowej in situ

W tym miejscu podajemy szczegółowe informacje na temat stymulowanego glukozą wydzielania insuliny (GSIS) poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką jako dodatkową technikę oceny funkcji endokrynnej trzustki z redukcją możliwych czynników zakłócających.

Stymulowane glukozą wydzielanie insuliny poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką

Ortotopowe przeszczepienie wątroby u szczurów jest niezbędnym modelem eksperymentalnym w badaniach biomedycznych. W niniejszym materiale przedstawiamy procedury chirurgiczne ortotopowego przeszczepienia wątroby szczura z rekonstrukcją tętnicy wątrobowej z wykorzystaniem 50% częściowego graftu.

Procedury chirurgiczne w szczurzym modelu częściowego ortotopowego przeszczepu wątroby z rekonstrukcją tętnicy wątrobowej

Badanie fizjologii organów zwierzęcych można uzyskać, przeprowadzając eksperymentalny system perfuzji ex vivo. Dodanie nerki świni, jako narządu homeostatycznego, do naszego wcześniej opracowanego modelu perfuzji wątroby ex vivo, może być głównym krokiem w kierunku osiągnięcia lepszego środowiska fizjologicznego.

Etapy autologicznego eksperymentu ex vivo z perfuzją wątroby i nerek świni

Poznaj metodę perfuzji wątroby myszy in situ do badania regulacji metabolizmu wątrobowego w czasie rzeczywistym. Technika zachowuje integralną architekturę narządu i pozwala na minutową kwantyfikację procesów metabolicznych.

Produkcja glukozy w wątrobie, mocznicozna, i lipoliza oznaczone ilościowo przy użyciu perfundowanego modelu wątroby myszy

Przeglądaj więcej filmów