Name: Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj częściowo zautomatyzowany protokół izolacji jąder z zamrożonych tkanek ssaków. Ta metoda zmniejsza zmienność techniczną i wspiera badania odkrywania leków oraz sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Filipowi Bochnerowi, Marion Richardson, Petrze Staeuble i Matthiasowi Selhausenowi za dostarczenie tkanek zwierzęcych, które były analizowane w tym manuskrypcie. Chcielibyśmy również podziękować Petrze Schwalie, Klasowi Hatje, Rolandowi Schmuckiemu i Martinowi Ebelingowi za ich wsparcie bioinformatyczne.

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą kantonalnego urzędu weterynaryjnego Bazylei-Stadt w ścisłym przestrzeganiu szwajcarskich przepisów federalnych dotyczących ochrony zwierząt lub za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt zgodnie z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt.
1. Przygotowanie tkanek i odczynników/narzędzi
<ol>
	<li>Czyszczenie i przygotowanie narzędzi
	<ol>
		<li>Wyczyść blaty stołowe i pęsety 70% etanolem i roztworem do odkażania RNazy. Wstępnie schłodzić wirówki do temperatury 4 °C.</li>
		<li>Wstępnie schłodzić wkłady do izolacji jąder w lodówce w temperaturze 4 °C przez co najmniej 30 minut.</li>
		<li>Uruchom zrobotyzowany dysocjator i włącz chłodzenie, ustawiając suwak w prawym górnym rogu ekranu na chłodzenie i klikając go, aby rozpocząć chłodzenie, aby suwak zmienił kolor na pomarańczowy. Sprawdzić, czy w dołączonej butelce z odczynnikiem do przechowywania jąder (NSR) i w butelce z buforem do izolacji jąder (NIB) pozostała wystarczająca ilość płynu i czy są one odpowiednio schłodzone.</li>
		<li>Przygotuj pudełko z pianki polistyrenowej wypełnione suchym lodem i wstępnie ostudź szalki Petriego i ostrza skalpela na suchym lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie buforu
	<ol>
		<li>Przygotować 1,5 M roztwór poduszki sacharozowej (SCS), jak pokazano w Tabeli 1. Rozprowadzić SCS do 500 μl podwielokrotności w 2 ml probówek DNazy/RNazy, aby uzyskać cztery podwielokrotności SCS po 500 μl na próbkę. Porcje należy przechowywać na lodzie do czasu dalszego użycia.</li>
		<li>W przypadku przetwarzania tkanki mózgowej należy zamiast tego przygotować 18% roztwór koloidu krzemionki, jak opisano w Tabeli 2, rozcieńczając roztwór podstawowy koloidu krzemionki w NSR i dodając inhibitor RNazy. Przygotuj 3 ml 18% roztworu koloidu krzemionki na próbkę i trzymaj go na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Homogenizacja tkanek i izolacja jąder
<ol>
	<li>Wyjąć próbkę z zamrażarki o temperaturze -80 °C i natychmiast umieścić ją na suchym lodzie.</li>
	<li>Pokrój próbkę na wstępnie schłodzonej szalce Petriego lub metalowej płytce na suchym lodzie za pomocą wstępnie schłodzonego skalpela na kawałek 15-50 mg (jeśli nie ma jeszcze odpowiedniego rozmiaru). Upewnij się, że próbka jest cięta we właściwym kierunku, tak aby próbka była nadal reprezentatywna dla interesujących struktur narządów. 
	UWAGA: Zgodnie z tym protokołem 15-50 mg jest optymalną wielkością próbki do ekstrakcji jądrowej. Aby osiągnąć dobrą wydajność po oczyszczeniu, zalecana jest wielkość próbki co najmniej 25 mg. W przypadku mniejszych próbek dostępne są specjalne wkłady, które są zoptymalizowane pod kątem przetwarzania małych danych wejściowych za pomocą zrobotyzowanego dysocjatora. Małe wkłady do izolacji jąder wejściowych zastosowano do dysocjacji próbek tkanek o masie zaledwie 4 mg z wydajnością wystarczającą do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder w dalszej kolejności. Przykład uzysku jąder przy użyciu wkładu o niskim wkładzie z tkanki wątroby szczura przedstawiono w tabeli 3.</li>
	<li>Wyjmij wkład do izolacji jąder z lodówki, rozpakuj go, wyjmij młynek i odpipetuj 15 μl inhibitora RNazy (40 U/μL) na dno wkładu. 
	UWAGA: Podczas ekstrakcji jąder zrobotyzowany dysocjator doda NIB i NSR do wkładu do całkowitej objętości 3 ml (z protokołem ekstrakcji jąder o małej objętości). Dodając 15 μl inhibitora RNazy (40 U/μL) do wkładu przed ekstrakcją, zawiesina będzie miała pożądane stężenie inhibitora RNAzy wynoszące 0,2 U/μL.</li>
	<li>Umieść próbkę tkanki na dnie wkładu za pomocą pęsety. Nie należy umieszczać próbki dokładnie na środku wkładu, aby uzyskać optymalną skuteczność zakłócania.</li>
	<li>Wybierz opcję Uruchom protokół na instrumencie i kliknij opcję Nuclei w lewym górnym rogu.
	<ol>
		<li>Z menu wybierz protokół Low Volume Nuclei Isolation i sprawdź, czy prędkość zakłóceń jest ustawiona na szybką, klikając Modyfikuj. Załaduj wkładkę do instrumentu, otwierając drzwi i wysuwając stage poprzez podniesienie czerwonego pokrętła.</li>
		<li>Włóż wkład w wyznaczone miejsce, obróć blokadę wkładu i wsuń stage, aż czerwone pokrętło zatrzaśnie się na swoim miejscu. Zamknij drzwiczki i rozpocznij ekstrakcję jąder w urządzeniu, klikając przycisk Dalej. Bieg trwa około 7 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu pracy wyjmij wkładkę z instrumentu, podnosząc czerwone pokrętło i wyciągając stage. Natychmiast umieść wkład na lodzie.</li>
	<li>Dla wszystkich tkanek z wyjątkiem mózgu przejdź do kroku 3.1. W przypadku próbek mózgu przejdź bezpośrednio do kroku 3.2.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie jąder
<ol>
	<li>Oczyszczanie gradientu sacharozy 
	UWAGA: W przypadku tkanki mózgowej pomiń ten krok i przejdź bezpośrednio do kroku 3.2. Wszystkie etapy oczyszczania są wykonywane na lodzie w celu zminimalizowania degradacji RNA. i probówki, a także wirówki muszą być wstępnie schłodzone. Wszystkie etapy ponownego zawieszania i mieszania są wykonywane wyłącznie przez staranne pipetowanie, ponieważ wirowanie może zagrozić jakości i integralności jąder.
	<ol>
		<li>Ostrożnie przebić okrągłą folię na kartridżu dysocjatora końcówką pipety. 
		UWAGA: Po dysocjacji otrzymana zawiesina jąder ma przybliżoną objętość 2 ml. Aby ułatwić oczyszczanie z gradientu sacharozy, należy podzielić zawiesinę jąder na dwie podwielokrotności o pojemności 900 μl, co daje całkowitą objętość 1,8 ml zawiesiny jąder podczas oczyszczania.</li>
		<li>Usunąć z wkładu pierwszą porcję 900 μl zawiesiny jąder i dodać ją do podwielokrotności SCS o objętości 500 μl przygotowanej uprzednio w probówce o pojemności 2 ml. Dobrze wymieszać, pipetując, aż mieszanina stanie się jednorodna.</li>
		<li>Usunąć 1400 μl zawiesiny jąder - mieszaniny SCS i ostrożnie nałożyć ją na nową porcję SCS o pojemności 500 μl, trzymając probówkę pod kątem i dodając mieszaninę kroplami, tworząc wyraźnie widoczną separację faz (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Ostrożnie zamknij rurkę i umieść ją z powrotem na lodzie, nie zakłócając separacji faz.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 3.1.2-3.1.4 z drugą podwielokrotnością zawiesiny o stężeniu 900 μl i nową podwielokrotnością SCS, aby uzyskać dwie probówki o pojemności 2 ml na próbkę z wyraźnie widocznym rozdzielaniem faz do wirowania gradientowego.</li>
		<li>Ostrożnie dodać probówki do wstępnie schłodzonej wirówki i wirować z prędkością 13 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>W międzyczasie należy przygotować NSR opisany w Tabeli 4, dodając inhibitor RNazy do podwielokrotności NSR. Przygotować 1 ml NSR na próbkę. 
		UWAGA: W tym momencie kulki żelowe odczynnika do ekspresji genów pojedynczej komórki można wyjąć z zamrażarki o temperaturze -80 °C, umożliwiając im zrównoważenie do temperatury pokojowej (RT), a oligo przełącznika matrycy można ponownie zawiesić w buforze o niskiej temperaturze TE.</li>
		<li>Po odwirowaniu usunąć supernatant z obu probówek, nie naruszając osadu i ostrożnie ponownie zawiesić osad w 50 μl lodowatego NSR zgodnie z zaleceniami producenta. Zebrać dwie granulki tej samej próbki w nowej probówce o pojemności 1,5 ml i dodać 900 μl lodowatego NSR do całkowitej objętości 1 ml. Dobrze wymieszać przez pipetowanie.</li>
		<li>Odwirować próbkę przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wirówki z wirnikiem z wahliwym wirnikiem. 
		UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie wirnika z wahliwym wiadrem w celu zminimalizowania utraty jąder, zwłaszcza gdy oczekuje się, że wydajność jąder będzie niska lub gdy zaczynasz od małych ilości tkanki.</li>
		<li>W międzyczasie należy przygotować 500 μl na próbkę 1x PBS (bez Ca2+ i Mg2+) z 0,04% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 0,2 U/μL inhibitorem RNazy, jak opisano w Tabeli 5.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant bez wyrzucania osadu i ponownie zawiesić osad w 100 μl roztworu PBS, jak przygotowano powyżej (1x PBS + 0,04% BSA + inhibitor RNazy w stężeniu 0,2 U/μL). 
		UWAGA: W przypadku małych próbek tkanek stężenie jąder może być niskie, dlatego zaleca się ponowne zawieszenie osadu tylko w 50 μl roztworu PBS, aby zapewnić wystarczająco wysokie stężenia do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.</li>
		<li>Przejdź bezpośrednio do kroku 4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie gradientu koloidu krzemionkowego 
	UWAGA: W przypadku tkanki mózgowej gradient koloidu krzemionki jest bardziej odpowiedni niż gradient sacharozy w celu usunięcia mieliny i zanieczyszczeń z zawiesiny jąder. Wszystkie etapy oczyszczania są wykonywane na lodzie, aby zminimalizować degradację RNA. i probówki, a także wirówki muszą być wstępnie schłodzone. Wszystkie etapy ponownego zawieszania i mieszania są wykonywane wyłącznie przez staranne pipetowanie, ponieważ wirowanie może zagrozić jakości i integralności jąder.
	<ol>
		<li>Ostrożnie przekłuć okrągłą folię na kartridżu dysocjatora końcówką pipety.</li>
		<li>Usunąć zawiesinę jąder z wkładu i dodać ją do probówki o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C we wstępnie schłodzonej wirówce.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić osad w 1 ml lodowatego 18% roztworu koloidu krzemionkowego.</li>
		<li>Dodać dodatkowe 2 ml 18% roztworu koloidu krzemionki, aby uzyskać całkowitą objętość 3 ml i dobrze wymieszać przez pipetowanie.</li>
		<li>Odwirować próbkę o masie 700 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w wirniku z wahliwym kubełkiem z wyłączonym hamulcem.</li>
		<li>W międzyczasie należy przygotować NSR opisany w Tabeli 4, dodając inhibitor RNazy do podwielokrotności NSR. Przygotować 1 ml NSR na próbkę. 
		UWAGA: W tym momencie kulki żelowe odczynnika do ekspresji genów pojedynczej komórki można wyjąć z zamrażarki o temperaturze -80 °C, co pozwala na zrównoważenie do RT, a oligo przełącznika matrycy można ponownie zawiesić w buforze o niskiej temperaturze TE.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij próbkę z wirówki, nie naruszając warstwy mieliny unoszącej się na wierzchu.</li>
		<li>Najpierw usuń warstwę mieliny z wierzchu i wyrzuć, a następnie ostrożnie usuń cały supernatant, nie naruszając osadu. 
		UWAGA: Warstwę mieliny można łatwo usunąć, owijając sterylną, niestrzępiącą się chusteczką wokół końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby zassać warstwę mieliny wraz z 1-2 ml supernatantu.</li>
		<li>Zawiesić granulkę w 1 ml lodowatego NSR zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
		<li>Odwirować próbkę o masie 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z wirnikiem z obracanym wiadrem. 
		UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie wirnika z wahliwym wiadrem w celu zminimalizowania utraty jąder, zwłaszcza gdy oczekuje się, że wydajność jąder będzie niska lub gdy zaczynasz od małych ilości tkanki.</li>
		<li>W międzyczasie należy przygotować 500 μl na próbkę 1x PBS (bez Ca2+ i Mg2+) z 0,04% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 0,2 U/μL inhibitorem RNazy, jak opisano w Tabeli 5.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić próbkę w 100 μl roztworu PBS, jak przygotowano powyżej (1x PBS + 0,04% BSA + inhibitor RNazy przy 0,2 U/μL). 
		UWAGA: W przypadku małych próbek tkanek stężenie jąder może być niskie, dlatego zaleca się ponowne zawieszenie osadu tylko w 50 μl roztworu PBS, aby zapewnić wystarczająco wysokie stężenia do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Liczenie
<ol>
	<li>Dla każdej próbki, która ma być policzona, rozcieńczyć 10 μl zawiesiny jąder w 20 μl roztworu PBS w celu uzyskania rozcieńczenia 1:3.</li>
	<li>Do liczenia dodać 25 μl roztworu barwiącego jodek propidyny (PI) do studzienki mieszającej płytki zliczającej z licznikiem fluorescencyjnym. Dodać 25 μl zawiesiny rozcieńczonych jąder i dobrze wymieszać pipetując. Przenieść 50 μl barwionej próbki z dołka mieszalnika do dołka załadowczego.</li>
	<li>Załaduj płytkę liczącą na licznik komórek i rozpocznij liczenie. 
	UWAGA: Liczba jąder jest pobierana z czerwonego kanału fluorescencyjnego o czasie ekspozycji 700 ms. Kanał ten został zoptymalizowany w celu uzyskania dokładnego zliczania jąder poprzez porównanie z liczeniem ręcznym z komorą Neubauera i barwieniem błękitem trypanowym pod mikroskopem. Przy wysokich stężeniach jądra znajdują się bardzo blisko siebie, co utrudnia oprogramowaniu ich rozdzielenie. W takim przypadku zaleca się ponowne przeliczenie próbki w odpowiednim rozcieńczeniu. Integralność jąder, jak również czystość, można ocenić na podstawie obrazu w jasnym polu lub pod mikroskopem.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbki PBS (1x PBS + 0,04% BSA + inhibitor RNazy w stężeniu 0,2 U/μL) do pożądanego stężenia do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder. 
	UWAGA: Stężenia między 700-1,200 jąder/μl są uważane za optymalne do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder. Niższe stężenia w komórkach, takie jak 700 jąder/μl, mogą skutkować zmniejszonym zanieczyszczeniem tła przez otaczające RNA.</li>
</ol>
5. Przygotowanie biblioteki
<ol>
	<li>Wykonaj sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder za pomocą odczynników do ekspresji genów pojedynczej komórki przy użyciu protokołu producenta, którego celem jest odzysk jąder na poziomie 8000-10 000 jąder na próbkę.</li>
</ol>
6. Sekwencjonowanie
<ol>
	<li>Sekwencjonuj biblioteki z żądaną głębokością sekwencjonowania z sparowanym końcem, podwójnym indeksowaniem i następującymi odczytami sekwencjonowania: Odczyt 1: 28 cykli, Indeks i7: 10 cykli, Indeks i5: 10 cykli i Odczyt 2: 90 cykli.</li>
</ol>

Isolation and Profiling of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues

<ol><li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Optimized+Tissue+Dissociation+Protocol+for+Single-Cell+RNA+Sequencing+Analysis+of+Fresh+and+Cultured+Human+Skin+Biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An Optimized Tissue Dissociation Protocol for Single-Cell RNA Sequencing Analysis of Fresh and Cultured Human Skin Biopsies.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).</li>
<li>Kimbley, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+optimized+methodologies+for+isolating+nuclei+from+esophageal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Comparison of optimized methodologies for isolating nuclei from esophageal tissue.</a> Biotechniques. 72 (3), 104-109 (2022).</li>
<li>Maitra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+nuclei+from+archived+postmortem+tissues+for+single-nucleus+sequencing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Extraction of nuclei from archived postmortem tissues for single-nucleus sequencing applications.</a> Nature Protocols. 16 (6), 2788-2801 (2021).</li>
<li>Nadelmann, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+nuclei+from+mammalian+cells+and+tissues+for+single-nucleus+molecular+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling.</a> Current Protocols. 1 (5), e132(2021).</li>
<li>Rousselle, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+single+nuclei+isolation+from+clinical+biopsies+for+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for single nuclei isolation from clinical biopsies for RNA-seq.</a> Scientific Reports. 12, 9851(2022).</li>
<li>Slyper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+and+single-nucleus+RNA-Seq+toolbox+for+fresh+and+frozen+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.</a> Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).</li>
<li>Leiz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+from+adult+mouse+kidney+for+single-nucleus+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), 62901(2021).</li>
<li>Alvarez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+nuclei+from+human+snap-frozen+liver+tissue+for+single-nucleus+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Isolation of nuclei from human snap-frozen liver tissue for single-nucleus RNA sequencing.</a> Bio-Protocol. 13 (3), e4601(2023).</li>
<li>Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+from+surgically+resected+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100844(2021).</li>
<li>Joshi, N., Misharin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+isolation+from+frozen+human+lung+tissue+for+single-nucleus+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols.io%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus isolation from frozen human lung tissue for single-nucleus RNA-seq.</a> Protocols.io. , https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.zu8f6zw (2019).</li>
<li>Martelotto, L. G., Luciano Martelotto, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Frankenstein%27+protocol+for+nuclei+isolation+from+fresh+and+frozen+tissue+for+snRNAseq%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols.io%22%5BJournal%5D)">'Frankenstein' protocol for nuclei isolation from fresh and frozen tissue for snRNAseq.</a> Protocols.io. , https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.3fkgjkw (2020).</li>
<li>Masilionis, I., Chaudhary, O., Chaligne, R., Mazutis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+extraction+for+single-cell+RNAseq+from+frozen+tissue+using+Singulator%E2%84%A2+100%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols.io%22%5BJournal%5D)">Nuclei extraction for single-cell RNAseq from frozen tissue using Singulator™ 100.</a> Protocols.io. , https://www.protocols.io/view/nuclei-extraction-for-single-cell-rnaseq-from-froz-q26g74xzqgwz/v1 (2022).</li>
<li>Matson, K. J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+spinal+cord+nuclei+for+massively+parallel+single-nucleus+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus RNA sequencing.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), 58413(2018).</li>
<li>Mendelev, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+profiling+of+single+nuclei+from+frozen+archived+postmortem+human+pituitary+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multi-omics profiling of single nuclei from frozen archived postmortem human pituitary tissue.</a> STAR Protocols. 3 (2), 101446(2022).</li>
<li>Soule, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+single+nucleus+RNA-seq+from+frozen+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">A protocol for single nucleus RNA-seq from frozen skeletal muscle.</a> Life Science Alliance. 6 (5), e202201806(2023).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+single-cell+and+single-nucleus+RNA-sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods.</a> Nature Biotechnology. 38, 737-746 (2020).</li>
<li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+transcriptomic+survey+of+cell+diversity+and+functional+maturation+in+postnatal+mammalian+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts.</a> Genes & Development. 32 (19-20), 1344-1357 (2018).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7, 6031(2017).</li>
<li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+Isolation+from+Fresh+Frozen+Brain+Tumors+for+Single-Nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), 61542(2020).</li>
<li>Jovanovich, S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJovanovich%2C+S+%22Automated+processing+of+solid+tissues+into+single+cells+or+nuclei+for+genomics+and+cell+biology+applications+with+the+Singulator%E2%84%A2+100+and+200+systems%22">Automated processing of solid tissues into single cells or nuclei for genomics and cell biology applications with the Singulator™ 100 and 200 systems</a>. , S2 Genomics, Livermore, CA. https://s2genomics.com/poster-download-automated-processing-of-solid-tissues-into-single-cells-or-nuclei-with-the-singulator-100-system-scrna-seq-and-atac-seq-data-on-human-and-mouse-tissues-agbt-2022 (2022).</li>
<li>Bell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+high-throughput%2C+high-speed+and+high-precision+plate-based+image+cytometric+cell+counting+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel high-throughput, high-speed and high-precision plate-based image cytometric cell counting method.</a> Cell & Gene Therapy Insights. 7 (4), 427-447 (2021).</li>
<li>Madler, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Besca%2C+a+single-cell+transcriptomics+analysis+toolkit+to+accelerate+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22NAR+Genomics+and+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Besca, a single-cell transcriptomics analysis toolkit to accelerate translational research.</a> NAR Genomics and Bioinformatics. 3 (4), lqab102(2021).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+single-cell+transcriptomic+response+of+murine+diabetic+kidney+disease+to+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mapping the single-cell transcriptomic response of murine diabetic kidney disease to therapies.</a> Cell Metabolism. 34 (7), 1064-1078 (2022).</li>
<li>Han, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transcriptomic+atlas+of+the+non-human+primate+Macaca+fascicularis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell transcriptomic atlas of the non-human primate Macaca fascicularis.</a> Nature. 604 (7907), 723-731 (2022).</li>
<li>Madissoon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scRNA-seq+assessment+of+the+human+lung%2C+spleen%2C+and+esophagus+tissue+stability+after+cold+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation.</a> Genome Biology. 21 (1), 1(2019).</li>
<li>Caglayan, E., Liu, Y., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+ambient+RNA+contamination+causes+misinterpreted+and+masked+cell+types+in+brain+single-nuclei+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal ambient RNA contamination causes misinterpreted and masked cell types in brain single-nuclei datasets.</a> Neuron. 110 (24), 4043-4056 (2022).</li>
<li>Luecken, M. D., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+best+practices+in+single-cell+RNA-seq+analysis%3A+a+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial.</a> Molecular Systems Biology. 15 (6), e8746(2019).</li>
<li>Fleming, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsupervised+removal+of+systematic+background+noise+from+droplet-based+single-cell+experiments+using+CellBender%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Unsupervised removal of systematic background noise from droplet-based single-cell experiments using CellBender.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decontamination+of+ambient+RNA+in+single-cell+RNA-seq+with+DecontX%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX.</a> Genome Biology. 21 (1), 57(2020).</li>
<li>Young, M. D., Behjati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SoupX+removes+ambient+RNA+contamination+from+droplet-based+single-cell+RNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Gigascience%22%5BJournal%5D)">SoupX removes ambient RNA contamination from droplet-based single-cell RNA sequencing data.</a> Gigascience. 9 (12), giaa151(2020).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są/byli pracownikami firmy F. Hoffmann-La Roche w czasie prowadzenia badania.

Opracowaliśmy wszechstronny i częściowo zautomatyzowany protokół uzyskiwania wysokiej jakości pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków i zademonstrowaliśmy protokół na mózgu myszy, nerce szczura oraz tkance wątroby i śledziony.
Porównując wydajność tego protokołu z innymi opublikowanymi protokołami sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra w tkance mózgu, nerek, śledziony i wątroby 6,7,20,24,25,26, zauważamy, że jesteśmy w stanie wykryć podobną liczbę genów i liczby UMI na jądro i jesteśmy w stanie odzyskać oczekiwane typy komórek. W porównaniu z istniejącymi metodami, protokół ten ma kilka zalet. Po pierwsze, protokół w tym badaniu automatyzuje homogenizację tkanek i izolację pojedynczych jąder. Osiąga się to za pomocą robotycznego urządzenia do zaburzania tkanek21. W większości protokołów tkanka jest homogenizowana homogenizatorem Dounce w celu uwolnienia pojedynczych jąder 3,20. Zauważyliśmy jednak, że ten ręczny krok może prowadzić do eksperymentalnej zmienności w wydajności i integralności jąder w zależności od siły wywieranej podczas homogenizacji, co pogarsza odtwarzalność eksperymentów. W tym przypadku, dzięki zastosowaniu zautomatyzowanej rozdrabniarki do tkanek ze stałymi ustawieniami, uzyskano dobrą jakość jąder i wydajność z większą spójnością we wszystkich eksperymentach. Co więcej, automatyzacja tego kroku skraca również czas pracy nad protokołem (etap rozerwania tkanki trwa około 7 minut), pozwalając użytkownikowi przygotować się do kolejnych kroków. Po drugie, protokół opisany w tym badaniu jest wszechstronny, tj. jest kompatybilny z różnymi tkankami różnych gatunków. Dzięki temu możemy uniknąć długotrwałej optymalizacji protokołu, np. w celu identyfikacji/detergentów homogenizacyjnych dla różnych tkanek 2,5,6. Po trzecie, protokół ten nie jest uzależniony od dostępu do sortownika przepływowego w celu uzyskania czystych jąder, co czyni go bardziej dostępnym dla laboratoriów, które nie dysponują wymaganym sprzętem/wiedzą specjalistyczną w zakresie sortowania przepływowego. Zamiast tego zoptymalizowaliśmy filtrację opartą na gradiencie sacharozy, aby usunąć większość zanieczyszczeń. Jednak w szczególności w przypadku tkanki mózgowej zaleca się stosowanie gradientu koloidu krzemionki zamiast gradientu sacharozy w celu skuteczniejszego usuwania mieliny. Odkryliśmy również, że zastosowanie wirnika z wahliwym kubełkiem na końcu etapu wirowania w gradiencie koloidu sacharozy/krzemionki minimalizuje utratę jąder. Dlatego zdecydowanie zaleca się stosowanie takiego wirnika. Po czwarte, po przetestowaniu wielu metod liczenia jąder (ręczne liczenie pod mikroskopem, użycie kilku automatycznych liczników), zaleca się użycie automatycznego licznika komórek fluorescencyjnych22. Zastosowanie barwnika interkalacyjnego DNA, takiego jak jodek propidyny, zwiększa dokładność zliczania jądra. Po piąte, protokół ten zajmuje około 75 minut od uruchomienia do załadowania chipa mikroprzepływowego. Pomaga to zapewnić, że integralność jąder pozostaje wysoka podczas przetwarzania wielu próbek. Wreszcie, stwierdziliśmy, że protokół jest również kompatybilny z tkanką osadzoną w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). W przypadku stosowania takiego materiału tkankę można usunąć z bloku OCT za pomocą skalpela przed homogenizacją.
Jednym z częstych wyzwań w zestawach danych sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder jest obecność RNA w otoczeniu, które może być niejądrowe (np. mitochondrialne), a także pochodzenia jądrowego 27,28. W naszym protokole mitochondrialne RNA (wskaźnik zastępczy dla niejądrowego RNA otoczenia) jest niskie nawet przed filtrowaniem (0,1-1,6% dla pokazanych tkanek). Jednak, podobnie jak w przypadku innych protokołów i zestawów danych, zanieczyszczenie otaczającego RNA przez geny o wysokiej ekspresji w jądrach licznych typów komórek (takich jak hepatocyty w wątrobie, neurony w mózgach itp.) jestnadal obecne. Istnieje kilka narzędzi bioinformatycznych, takich jak CellBender, SoupX itp., które mogą usunąć takie zanieczyszczenie RNA w otoczeniu przed adnotacją jąder 29,30,31. Innym ograniczeniem tego protokołu jest to, że chociaż etapy rozerwania tkanki i izolacji jąder są zautomatyzowane, przepustowość tego etapu jest nadal ograniczona, ponieważ jednocześnie można przetwarzać tylko jedną próbkę. Ponieważ jednak ten etap zajmuje tylko około 7 minut na kawałek tkanki, wiele próbek może być nadal przetwarzanych w partii. Zazwyczaj przetwarzamy cztery próbki na partię, ale z dobrymi wynikami wykonaliśmy do sześciu próbek na partię. Ostatnie ulepszenia w zrobotyzowanym dysocjatorze, które umożliwiają równoległe przetwarzanie dwóch próbek jednocześnie, umożliwią przetwarzanie 8-12 próbek na partię, co jest zgodne z przepustowością chipa mikroprzepływowego, który jest używany do enkapsulacji pojedynczych jąder.
Chociaż nie używaliśmy jąder wyizolowanych przez ten protokół do innych zastosowań końcowych, takich jak ATAC-seq lub snRNAseq przy użyciu innych platform, w oparciu o jakość danych uzyskanych za pomocą zastosowanych tutaj odczynników do ekspresji genów, uważamy, że nasz protokół powinien być kompatybilny z dodatkowymi dalszymi aplikacjami. Jednak przyszłe prace będą obejmowały testowanie tego protokołu z innymi aplikacjami podrzędnymi, takimi jak ATAC-seq.
Podsumowując, opracowaliśmy szybki, prosty i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji jąder do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra, który, jak wykazano, jest kompatybilny z różnymi typami zamrożonych tkanek ssaków.

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (sc) i pojedynczego jądra (sn) stało się powszechnie stosowanymi protokołami w biologii molekularnej i komórkowej ze względu na zwiększoną rozdzielczość ekspresji genów w porównaniu do sekwencjonowania masowego RNA. Jednak izolacja dobrej jakości preparatów pojedynczych komórek i pojedynczych jąder z tkanek stałych pozostaje wyzwaniem i często stanowi etap ograniczający szybkość w eksperymentach sc/sn-RNAseq. Rzeczywiście, opracowano mnóstwo protokołów, które wykorzystują różne procedury chemiczne i mechaniczne w celu uzyskania zawiesin komórek/jąder1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15. Co więcej, strategie oczyszczania takich preparatów z gruzu/grudek itp. obejmują sortowanie przepływowe, filtrację i mycie. Takie protokoły są często ręczne (co prowadzi do zmienności związanej z użytkownikiem), mogą być czasochłonne (prowadzą do zmniejszenia żywotności komórki/jądra) i/lub mogą wymagać dostępu do cytometru przepływowego w celu sortowania komórek/jąder. Badanie to koncentrowało się na opracowaniu prostego, szybkiego i częściowo zautomatyzowanego protokołu izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków do dalszych zastosowań sekwencjonowania RNA. Skupiliśmy się w szczególności na izolacji jąder, a nie na izolacji komórek, ponieważ jest ona kompatybilna z wykorzystaniem zamrożonych tkanek, co sprawia, że pobieranie/przetwarzanie próbek jest bardziej praktyczne i umożliwia bezstronne grupowanie próbek, zwłaszcza w eksperymentach z przebiegiem czasu. Ponadto, chociaż transkryptom jądrowy nie odzwierciedla w pełni transkryptomu komórkowego, kilka badań wykazało, że dane sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder są porównywalne z danymi sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki w celu identyfikacji typu komórki, mimo że proporcje typów komórek mogą się różnić6,16,17,18,19.
Izolacja jąder składa się z kilku etapów: 1) mechanicznego lub chemicznego rozerwania tkanki w celu uwolnienia jąder, 2) oczyszczenia z resztek i grudek, oraz 3) dokładnego zliczania jąder w celu przygotowania do dalszych zastosowań. W wielu protokołach krok 1 często wiąże się z użyciem homogenizatora Dounce w celu zakłócenia tkanki3,20. Alternatywnie można zastosować metody chemiczne, chociaż często muszą one być zoptymalizowane pod kątem różnych tkanek2,5,6. Z doświadczenia wynika, że ręczna procedura rozbioru tkanek jest podatna na zmienność związaną z operatorem, co prowadzi do zmiennej jakości i wydajności jąder. W celu zminimalizowania zmienności technicznej oraz uzyskania bardziej spójnego i powtarzalnego protokołu, który działa w różnych tkankach, opracowano protokół wykorzystujący dostępny na rynku robotyczny dysocjator tkanek 21. W kroku 2, chociaż wymiana buforu jest zwykle najprostszym sposobem mycia jąder, przyjęliśmy zastosowanie stosunkowo krótkiego etapu wirowania w gradionym poziomie sacharozy, aby uzyskać dokładniejsze usunięcie zanieczyszczeń. W szczególności w przypadku tkanki mózgowej używamy gradientu koloidu krzemionki zamiast gradientu sacharozy, aby uzyskać bardziej skuteczne usuwanie mieliny. Wreszcie, do liczenia, użycie hemocytometru jest złotym standardem w liczeniu i wizualnej kontroli jąder. W naszym protokole ten krok można niezawodnie zautomatyzować za pomocą dostępnego na rynku automatycznego licznika komórek fluorescencyjnych22. Protokół ten został przetestowany i jest kompatybilny z kilkoma zamrożonymi tkankami ssaków, w tym mózgu, nerek, śledziony i wątroby, z różnych gatunków ssaków (szczurów, myszy i naczelnych) i zapewnia dobrej jakości jądra do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder za pomocą platformy komercyjnej opartej na kropelkach. Protokół trwa około 75 minut od przygotowania tkanki do rozpoczęcia procesu sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

<table><tbody><tr><td>1 M DTT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>10x Separator magnetyczny</td><td>10x genomika</td><td>PN-120250</td><td></td></tr><tr><td>10x Adapter Vortex</td><td>10x genomika</td><td>PN-120251</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS (10x), bez wapnia, bez magnezu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td>przechowywany w temperaturze 4& C</td></tr><tr><td>30% Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9576_50ML</td><td></td></tr><tr><td>400 mM Tris-HCl, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>40U/&mu; l RNaseOUT Rekombinowany inhibitor rybonukleazy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10777019</td><td>przechowywany w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Agilent Zestaw DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Cellaca MX Automatyczny licznik komórek o wysokiej przepustowości</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CELMXSYSF2</td><td>Automatyczny licznik komórek fluorescencyjnych</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip G Zestaw pojedynczych komórek, 16 rxns</td><td>10x genomika</td><td>PN-1000127</td><td>Odczynnik do ekspresji genów jednokomórkowych, przechowywany w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Secondary Holder</td><td>10x genomika</td><td>PN-1000195</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns</td><td>10x genomika</td><td>PN-1000129</td><td>Odczynnik do ekspresji genów jednokomórkowych, przechowywany w temperaturze -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Pojedyncza komórka 3' GEM, biblioteka i Zestaw kulek żelowych v3.1, 4 rxns</td><td>10x genomika</td><td>PN-1000128</td><td>Odczynnik do ekspresji genów jednokomórkowych</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Kit v3.1 4 rxns</td><td>10x genomics</td><td>PN-1000158</td><td>Odczynnik do ekspresji genów w pojedynczej komórce, przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM Kit v3.1 4 rxns</td><td>10x genomics</td><td>PN-1000130</td><td>Odczynnik do ekspresji genów jednokomórkowych, przechowywany w temperaturze -20 & deg; </td></tr><tr><td>C Dzielone zbiorniki polistyrenowe</td><td>VWR</td><td>41428-958</td><td></td></tr><tr><td>Probówki DNA LoBind 1,5 ml Eppendorf</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EP0030108051</td><td></td></tr><tr><td>DNA Probówki LoBind 2 ml Eppendorf</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EP0030108078</td><td></td></tr><tr><td>Suchy lód</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Dynabeads MyOne SILANE</td><td>10x genomics</td><td>PN-2000048</td><td>Odczynnik do ekspresji genów w pojedynczej komórce, przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Etanol Czysta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Gliceryna (glicerol), 50% (v/v)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3290-16</td><td></td></tr><tr><td>Blok</td><td></td><td></td><td></td>ciepła</tr><tr><td>Wysokowydajne płytki liczące Nexcelom</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHM24-A100-001</td><td>Płytka zliczająca liczniki komórek</td></tr><tr><td>Bufor o niskiej zawartości TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA)</td><td>Thermo Fisher Mini</td><td></td> wirówka 12090015 <td></td>naukowej</tr> <tr><td></td><td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>zestaw odczynników NovaSeq 6000 SP v1.5 (100 cykli)</td> <td>Illumina</td><td>2002840</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do izolacji jąder</td><td>S2 Genomics</td><td>100-063-396</td><td>Przechowywany w 4 & stopniach; C</td></tr><tr><td>Wkład izolacyjny jąder</td><td>S2 Genomics</td><td>100-063-287</td><td>Wstępnie schłodzony w temperaturze 4 & stopni; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Nuclei PURE 2 M Sacharoza Poduszka Roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NUC201-1KT</td><td>Roztwór poduszki sacharozy&nbsp;</td></tr><tr><td>Nuclei PURE Sacharoza Cushion Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NUC201-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do przechowywania jąder</td><td>S2 Genomics</td><td>100-063-405</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; </td></tr><tr><td>C Probówki do PCR 0,2 ml 8-probówkowe</td><td>paski Eppendorf</td><td>30124359</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td>Roztwór koloidu krzemionki</td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem (Eppendorf 5804R)</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>5805000010</tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem z wirnikiem wahliwym (Eppendorf 5810R)</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>5811000015</tr><tr><td>RNAseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td>Roztwór do dekontaminacji RNAzy</td></tr><tr><td>Okrągła szalka Petriego do hodowli komórkowych</td><td>SPL</td><td>330005</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel jednorazowy</td><td>Aesculap AG</td><td>BA210</td><td>wstępnie schłodzony na suchym lodzie przed użyciem</td></tr><tr><td>Zestaw Single Index T Zestaw A, 96 rxns</td><td>10x genomika</td><td>PN-1000213</td><td>Odczynnik do ekspresji genów jednokomórkowych, przechowywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Singulator 100 System</td><td>S2 Genomics-Komercyjnie</td><td></td> <td>dostępny zrobotyzowany dysocjator tkanek</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu 1M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników SPRIselect Beckman</td><td>Coulter</td><td>b23318</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna pęseta</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>UltraPure DNase/RNazo-Free Woda destylowana</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10977049</tr><tr><td>ViaStain PI Roztwór do barwienia</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CS1-0109-5mL</td><td>Roztwór do barwienia jodku propidyny</td></tr><tr><td>Vortex Mixer+A2:D44</td><td>VWR</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

A Simple, Quick, and Partially Automated Protocol for the Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nucleus Sequencing

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki i pojedynczego jądra stało się powszechnym zastosowaniem laboratoryjnym ze względu na bogactwo informacji transkryptomicznej, które dostarczają. Sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra jest szczególnie przydatne do badania ekspresji genów w trudnych do dysocjacji tkankach. Co więcej, podejście to jest również kompatybilne z materiałami zamrożonymi (archiwalnymi). W tym miejscu opisujemy protokół izolowania wysokiej jakości pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra w sposób częściowo zautomatyzowany przy użyciu dostępnych na rynku instrumentów i odczynników. W szczególności zrobotyzowany dysocjator służy do automatyzacji i standaryzacji homogenizacji tkanek, a następnie zoptymalizowanego gradientu chemicznego do filtrowania jąder. Na koniec dokładnie i automatycznie liczymy jądra za pomocą automatycznego licznika komórek fluorescencyjnych. Działanie tego protokołu wykazano na mózgu myszy, nerce szczura oraz tkance wątroby i śledziony cynomolgus. Protokół ten jest prosty, szybki i łatwo adaptowalny do różnych tkanek ssaków bez konieczności rozległej optymalizacji i zapewnia dobrej jakości jądra do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Wydajność i wszechstronność niniejszego protokołu zostały zademonstrowane poprzez przeprowadzenie sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder komórkowych z zamrożonych na świeżo tkanek kory potylicznej mózgu trzech myszy B6, zamrożonych na świeżo tkanek nerek ciętych poprzecznie trzech szczurów Wistar oraz archiwalnych (11-letnich) tkanek wątroby i śledziony trzech makaków z Mauritiusa (Cynomolgus). Wszystkie zwierzęta nie były perfundowane.
Jak pokazano na rycinach 1B,C, uzyskano wysokiej jakości jądra komórkowe, wolne od oznak pęcherzykowania, zanieczyszczeń i agregacji. Filtrację opartą na gradiencie sacharozy zoptymalizowano w celu usunięcia większości zanieczyszczeń poprzez testowanie różnych gęstości, prędkości i czasu wirowania oraz ocenę czystości i integralności jąder pod mikroskopem, a także ocenę rozkładu wielkości jąder i wydajności (rycina 1D). Pozwoliło to na wybór gęstości gradientu sacharozy 1.5 M oraz zastosowanie krótkiego czasu wirowania wynoszącego 15 min. Następnie, aby dalej ocenić jakość jąder, dane wstępnie przetworzono za pomocą oprogramowania 10X Cell Ranger, a dalszą analizę danych przeprowadzono przy użyciu Besca23. Odsiewano jądra o zawartości mitochondrialnej &gt;5% (ponieważ są to zazwyczaj jądra uszkodzone/stresowane), a zachowywano jądra zawierające od 500 do 7,000 genów (aby zminimalizować liczbę pustych kropel i multipletów). Uwzględniono jedynie geny obecne w co najmniej 30 jądrach. Jako cel przyjęto 8,000 jąder na próbkę kory mózgu oraz 10,000 jąder na próbkę nerki, wątroby i śledziony. Po filtracji uzyskano 10,644 wysokiej jakości jąder z trzech próbek mózgu, 14,960 wysokiej jakości jąder z trzech próbek nerek, 18,795 wysokiej jakości jąder z trzech próbek wątroby oraz 13,882 wysokiej jakości jąder z trzech próbek śledziony. Rycina 2A,D,G,J przedstawia wykresy skrzypcowe obrazujące rozkład liczby UMI, liczby genów i zawartości mitochondrialnej w każdej próbce. Mediana liczby zliczeń we wszystkich próbkach mózgu wynosiła 7,563 UMI/jądro i 3,208 genów/jądro. Mediana liczby zliczeń we wszystkich próbkach nerek wynosiła 3,841 UMI/jądro i 1,915 genów/jądro. Mediana liczby zliczeń we wszystkich próbkach wątroby wynosiła 2,649 UMI/jądro i 1,676 genów/jądro. Mediana liczby zliczeń we wszystkich próbkach śledziony wynosiła 1,609 UMI/jądro i 1,138 genów/jądro. Następnie wygenerowano klastry przy użyciu genów o wysokiej zmienności i adnotowano je za pomocą znanych genów markerowych17,24,25,26. Jak widać na rycinach 2B,E,H,K, udało się zidentyfikować oczekiwane typy komórek dla każdej tkanki. Ponadto, jak pokazują ryciny 2B,E,H,K, wszystkie zwierzęta przyczyniły się do wszystkich klastrów, co wskazuje na ogólnie niską zmienność techniczną wprowadzoną przez protokół. Co więcej, proporcje komórkowe były porównywalne we wszystkich trzech próbkach dla danego typu tkanki, podobnie jak liczba UMI i genów (rycina 2A,C,D,F,G,I,J,L). Wyjątkiem jest wątroba, gdzie populacje hepatocytów w trzech próbkach wątroby różniły się proporcjami i profilem. Jest to najprawdopodobniej wynik różnic biologicznych między zwierzętami (płeć, wiek, stan metaboliczny).
<img alt="Rozdział faz w gradiencie gęstości sacharozy; obrazy mikroskopowe; wykres wydajności i rozkładu wielkości jąder." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65611/65611fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ocena jakości jąder i optymalizacja gradientu sacharozy. (A) Oczekiwany rozdział faz podczas wirowania w gradiencie sacharozy został zaznaczony strzałką. (B) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne jąder nerki szczura (góra) i śledziony makaka jawajskiego (dół) barwionych jodkiem propidyny, uzyskane zgodnie z protokołem. (C) Reprezentatywne obrazy mikroskopowe w polu jasnym jąder wyizolowanych z wątroby myszy (góra) i mózgu myszy (dół), pasek skali 500 µm. Zwróć uwagę na regularną, gładką powierzchnię jąder, co wskazuje na ich wysoką jakość. (D) Optymalizacja gradientu sacharozy. Przetestowano kilka gęstości sacharozy, prędkości oraz czasów wirowania. Dla każdego warunku przedstawiono obrazy jąder w polu jasnym, rozkład wielkości jąder oraz wydajność izolacji jąder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65611/65611fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy skrzypcowe, diagramy UMAP, wykresy słupkowe. Analiza danych snRNA-seq, poziomy ekspresji genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65611/65611fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne dane z snRNAseq z kory potylicznej mózgu myszy, nerki szczura (kora i rdzeń) oraz wątroby i śledziony makaka jawajskiego. (A) Wykresy skrzypcowe pokazujące rozkład genów/jądro, UMI/jądro oraz procentową zawartość mitochondrialną dla poszczególnych próbek mózgu. (B) Panel lewy: wykres UMAP przedstawiający wkład każdej próbki w klastry zidentyfikowane w mózgu. Panel prawy: UMAP pokazujący tożsamość klastrów adnotowanych na podstawie genów markerowych w tkance mózgu. (C) Proporcje komórkowe zaobserwowane w 3 próbkach mózgu. (D) Wykresy skrzypcowe pokazujące rozkład genów/jądro, UMI/jądro oraz procentową zawartość mitochondrialną dla poszczególnych próbek nerki. (E) Panel lewy: wykres UMAP przedstawiający wkład każdej próbki w klastry zidentyfikowane w nerce. Panel prawy: UMAP pokazujący tożsamość klastrów adnotowanych na podstawie genów markerowych w tkance nerki. (F) Proporcje komórkowe zaobserwowane w 3 próbkach nerki. (G) Wykresy skrzypcowe pokazujące rozkład genów/jądro, UMI/jądro oraz procentową zawartość mitochondrialną dla poszczególnych próbek wątroby. (H) Panel lewy: wykres UMAP przedstawiający wkład każdej próbki w klastry zidentyfikowane w wątrobie. Panel prawy: UMAP pokazujący tożsamość klastrów adnotowanych na podstawie genów markerowych w tkance wątroby. (I) Proporcje komórkowe zaobserwowane w 3 próbkach wątroby. (J) Wykresy skrzypcowe pokazujące rozkład genów/jądro, UMI/jądro oraz procentową zawartość mitochondrialną dla poszczególnych próbek śledziony. (K) Panel lewy: wykres UMAP przedstawiający wkład każdej próbki w klastry zidentyfikowane w śledzionie. Panel prawy: UMAP pokazujący tożsamość klastrów adnotowanych na podstawie genów markerowych w tkance śledziony. (L) Proporcje komórkowe zaobserwowane w 3 próbkach śledziony. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65611/65611fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponenty</td>
			<td>Stężenie roztworu zapasu</td>
			<td>Objętość na próbkę</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór poduszki sacharozowej</td>
			<td>2 M</td>
			<td>1500 µL</td>
			<td>1,5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor poduszki sacharozowej</td>
			<td>-</td>
			<td>500 µL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ditiotreitol (DTT)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>2 µL</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inhibitor RNazy </td>
			<td>40 U/µL</td>
			<td>10 µL</td>
			<td>0,2 U/µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przygotowanie 1,5 M roztworu poduszki sacharozowej (SCS). Roztwór ten jest wykorzystywany do wirowania w gradiencie sacharozy podczas oczyszczania w kroku 3.1 i powinien być świeżo przygotowywany przed każdym rozpoczęciem protokołu. Przez cały czas trwania protokołu należy przechowywać SCS w lodzie. Roztwory wymienione w tej tabeli znajdują się w Tabeli materiałów.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Składniki</td>
			<td >Stężenie roztworu zapasowego</td>
			<td >Objętość na próbkę</td>
			<td >Stężenie końcowe</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Roztwór zapasowy koloidu krzemionki</td>
			<td >90%</td>
			<td >600 µL</td>
			<td >18%</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Nuclei Storage Reagent (S2 Genomics)</td>
			<td >-</td>
			<td >2400 µL</td>
			<td >-</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Inhibitor RNazy</td>
			<td >40 U/µL</td>
			<td >15 µL</td>
			<td >0.2 U/µL</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2: Przygotowanie 18% roztworu koloidu krzemionki. Roztwór ten jest wykorzystywany do wirowania w gradiencie koloidu krzemionki podczas oczyszczania w kroku 3.2 i powinien być świeżo przygotowany przed każdym rozpoczęciem protokołu. Przez cały czas trwania protokołu 18% roztwór koloidu krzemionki należy przechowywać w lodzie.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tkanka</td>
			<td>Masa próbki</td>
			<td>Wkład</td>
			<td>Wydajność</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wątroba szczura</td>
			<td>25 mg</td>
			<td>Wkład do izolacji jąder komórkowych</td>
			<td>65 000 jąder na mg tkanki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wątroba szczura</td>
			<td>4 mg</td>
			<td>Kartridż do izolacji jąder z małej ilości materiału wejściowego</td>
			<td>32 000 jąder na mg tkanki</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Wydajność jąder z kartridża do izolacji jąder przy niskim wkładzie w porównaniu z kartridżem do izolacji jąder po oczyszczaniu w gradiencie sacharozy.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponenty</td>
			<td>Stężenie roztworu zapasu</td>
			<td>Objętość na próbkę</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik do przechowywania jąder komórkowych</td>
			<td>-</td>
			<td>1000 µL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inhibitor RNazy </td>
			<td>40 U/µL</td>
			<td>5 µL</td>
			<td>0,2 U/µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Przygotowanie odczynnika do przechowywania jąder (NSR). Roztwór ten jest stosowany podczas izolacji jąder w krokach 3-5, a także podczas oczyszczania w kroku 3.1.8. Można go przechowywać w temperaturze 4 °C do 4 miesięcy. Należy przygotować świeżą alikwot z inhibitorem RNazy podczas etapu wirowania w kroku oczyszczania 6. Roztwory wymienione w tej tabeli są wyszczególnione w Tabeli materiałów.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody
>
		<tr
>
			<td colspan="4">Roztwór stokowy 1x PBS + 0,04% BSA</td>
		</tr>
		<tr
>
			<td>Składniki</td>
			<td>Stężenie stokowe</td>
			<td>Objętość do roztworu stokowego</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr
>
			<td>PBS (bez Ca2+, bez Mg2+)</td>
			<td>1x</td>
			<td>30 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr
>
			<td>Seryjowa albumina wołowa (BSA)</td>
			<td>30%</td>
			<td>40 µL</td>
			<td>0,04%</td>
		</tr>
		<tr
>
			<td colspan="4">1x PBS + 0,04% BSA + 0,2 U/µL inhibitor RNazy</td>
		</tr>
		<tr
>
			<td>Składniki</td>
			<td>Stężenie stokowe</td>
			<td>Objętość na próbkę</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr
>
			<td>Roztwór stokowy 1x PBS + 0,04% BSA</td>
			<td>-</td>
			<td>500 µL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr
>
			<td>Inhibitor RNazy</td>
			<td>40 U/µL</td>
			<td>2,5 µL</td>
			<td>0,2 U/µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 5: Przygotowanie PBS + 0,04% BSA. Roztwór ten jest stosowany na koniec etapu oczyszczania w punkcie 3.1.10 oraz po liczeniu w celu rozcieńczenia zawiesiny jąder do pożądanego stężenia dla sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder 10X (etap liczenia 4.4). Roztwór stokowy można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca. Należy przygotować świeżą alikwot z inhibitorem RNazy podczas etapu wirowania w kroku oczyszczania 6.

Badanie opisuje prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych tkanek ssaków do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

Single-cell and single-nucleus RNA sequencing have become common laboratory applications due to the wealth of transcriptomic information that they ...

Badania te koncentrują się na wspieraniu badań nad odkrywaniem leków z wykorzystaniem sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder w celu zbadania skuteczności i bezpieczeństwa potencjalnych terapii. W związku z tym opracowujemy ustandaryzowane protokoły ekstrakcji jąder dla świeżo mrożonych próbek tkanek z różnych narządów. Naszym celem była automatyzacja i standaryzacja ekstrakcji jąder w celu uzyskania spójnych i wiarygodnych wyników poprzez zmniejszenie zmienności niebiologicznej.Zaletą jest częściowa automatyzacja dzięki zastosowaniu zrobotyzowanego dysocjatora oraz prosty i krótki przepływ pracy, który można zastosować do różnych próbek tkanek różnych gatunków. Posiadanie ustandaryzowanych protokołów może pomóc nam odpowiedzieć na pytania dotyczące biodystrybucji leków, a także zbadać mechanizmy leżące u podstaw wszelkich sygnałów bezpieczeństwa, które możemy zaobserwować. W przyszłości będziemy testować możliwość zastosowania naszego protokołu w innych aplikacjach podrzędnych, takich jak ATAC-seq lub multiomika.Będziemy również starali się ustalić protokoły wykrywania transgenów ulegających ekspresji wirusa w pojedynczych jądrach. Aby rozpocząć, uruchom robotyczny dysocjator. Włącz chłodzenie, ustawiając suwak w prawym górnym rogu ekranu na chłodzenie i klikając go, aby rozpocząć chłodzenie, aby suwak był pomarańczowy.Następnie sprawdź, czy dołączone butelki NSR i NIB mają wystarczającą ilość płynu i są odpowiednio schłodzone. Wyjmij próbki tkanek z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i natychmiast umieść je na suchym lodzie. Za pomocą wstępnie schłodzonego skalpela pokrój tkankę na kawałek o grubości od 15 do 15 miligramów na wstępnie schłodzonej szalce Petriego lub metalowej płytce umieszczonej na suchym lodzie.Wyjąć wkład do izolacji jąder z lodówki i rozpakować go. Wyjmij młynek i odpipetuj 15 mikrolitrów inhibitora RNA na dno wkładu. Za pomocą pęsety umieść próbkę tkanki na dnie wkładu.Następnie wybierz uruchom protokół na instrumencie i kliknij opcję jąder w lewym górnym rogu. Z menu wybierz protokół izolacji jąder o małej objętości, a następnie kliknij zmień, aby sprawdzić, czy prędkość zakłóceń jest ustawiona na najszybszą. Następnie otwórz drzwiczki instrumentu, włóż wkładkę w wyznaczone miejsce, obróć blokadę wkładki i wsuń do stage, aż czerwone pokrętło zatrzaśnie się na swoim miejscu.Zamknij drzwiczki i kliknij przycisk Dalej, aby rozpocząć ekstrakcję jąder. Po zakończeniu pracy wyjmij wkładkę z instrumentu, podnosząc czerwone pokrętło i wyciągając stage. Natychmiast umieść wkład na lodzie.Po wyizolowaniu pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków należy ostrożnie przekłuć okrągłą folię na kartridżu dysocjatora za pomocą końcówki pipety. Aby ułatwić oczyszczanie gradientu sacharozy, usuń 900 mikrolitrów zawiesiny jąder z wkładu i dodaj ją do 500 mikrolitrów roztworu poduszki sacharozowej lub SCS, przygotowanego w dwumililitrowej probówce. Dobrze wymieszać pipetując, aż mieszanina stanie się jednorodna.Następnie trzymaj probówkę pod kątem i ostrożnie dodaj kroplami 1 400 mikrolitrów mieszaniny zawiesiny jąder i SCS na nowe 500 mikrolitrów SCS, tworząc wyraźnie widoczną separację faz. Ostrożnie zamknij rurkę i umieść ją z powrotem na lodzie, nie zakłócając separacji faz. Ostrożnie obracać probówki o masie 13 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza we wstępnie schłodzonej wirówce.Usunąć supernatant bez naruszania osadu i ostrożnie ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach lodowatego NSR. Wyciągnij dwie granulki tej samej próbki do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj 900 mikrolitrów lodowatego NSR do całkowitej objętości jednego mililitra i dobrze wymieszaj pipetując.Odwirować próbkę o sile 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą wirówki z obracającym się wirnikiem kubełkowym. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach PBS. Do liczenia rozcieńczyć 10 mikrolitrów zawiesiny jąder w 20 mikrolitrach PBS.Dodać 25 mikrolitrów roztworu barwiącego jodek propidyny do studzienki mieszającej płytki zliczającej licznik fluorescencyjny. Następnie dodać 25 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny jąder i dobrze wymieszać pipetując. Przenieść 50 mikrolitrów zabarwionej próbki z dołka mieszającego do dołka załadowczego.Załaduj płytkę liczącą na licznik komórek i rozpocznij liczenie. Po zliczeniu należy rozcieńczyć próbki PBS do pożądanego stężenia do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder. Korzystając z częściowo zautomatyzowanego protokołu izolacji jąder, uzyskano dobrej jakości jądra bez śladów blaśnięcia, odłamków czy zbrylania.Pokazano wykresy skrzypcowe reprezentujące rozkład liczby genów, liczby UMI i zawartości mitochondriów w każdej próbce. Zidentyfikowano oczekiwane typy komórek z każdej tkanki, a wszystkie zwierzęta przyczyniły się do wszystkich klastrów, co wskazuje na niską zmienność techniczną wprowadzoną przez protokół. Co więcej, proporcje komórkowe, liczba UMI i liczba genów były porównywalne we wszystkich trzech próbkach na typ tkanki.

a-simple-quick-partially-automated-protocol-for-isolation-single

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego izolowania wysokiej jakości jąder ze świeżej lub zamrożonej tkanki do dalszego masowo równoległego sekwencjonowania RNA. Uwzględniamy opcje detergencyjno-mechanicznego i hipotoniczno-mechanicznego rozbijania tkanek oraz lizy komórek, które można wykorzystać do izolacji jąder.

Izolacja dorosłych jąder rdzenia kręgowego do masowo równoległego sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Ta publikacja opisuje protokół izolacji jąder z dojrzałych adipocytów, oczyszczania przez sortowanie aktywowane fluorescencją oraz transkryptomiki na poziomie pojedynczej komórki.

Izolacja jąder tkanki tłuszczowej do zastosowań genomicznych pojedynczych komórek

Izolacja pojedynczych jąder opiera się na dysocjacji i przenikaniu błony komórkowej za pomocą detergentów, etapach, które wymagają optymalizacji i są podatne na wprowadzanie artefaktów technicznych. Demonstrujemy bezdetergentowy i bezenzymatyczny protokół szybkiej izolacji nienaruszonych jąder bezpośrednio z całej tkanki, uzyskując jądra odpowiednie do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) lub ATAC-seq.

Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną

Niejednorodność wewnątrznowotworowa jest nieodłączną cechą nowotworów, w tym glejaków. Opracowaliśmy prosty i wydajny protokół, który wykorzystuje kombinację i wirowania gradientowego do izolowania pojedynczych jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka do badań sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i ATAC.

Izolacja jąder ze świeżo zamrożonych guzów mózgu dla sekwencji RNA pojedynczego jądra i sekwencji ATAC

Tutaj prezentujemy protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych nerek myszy, który poprawia reprezentację typów komórek rdzeniastych nerek i pozwala uniknąć artefaktów ekspresji genów spowodowanych dysocjacją enzymatyczną tkanki.

Izolacja jąder z nerki dorosłej myszy w celu sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Ten protokół opisuje szczegółowe, niskonakładowe przygotowanie próbki do sekwencjonowania pojedynczego jądra, w tym sekcję górnych zwojów szyjnych i gwiaździstych myszy, dysocjację komórek, krioprezerwację, izolację jądra i kodowanie kreskowe hashtagów.

Izolacja i multipleksowanie jądra o niskim poziomie wejściowym z przeciwciałami kodowymi zwojów współczulnych myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Tutaj prezentujemy protokół izolacji jąder z błyskawicznie zamrożonych, zarchiwizowanych tkanek wątroby dla jednojądrowego sekwencjonowania RNA, sekwencji ATAC i multiomiki stawów (sekwencja RNA i sekwencja ATAC).

Izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Protokół zapewnia niezawodne i zoptymalizowane podejście do izolacji jąder z próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego przy użyciu platformy 10x Genomics, w tym zalecenia dotyczące warunków dysocjacji tkanek, kriokonserwacji zawiesin pojedynczych komórek i oceny izolowanych jąder.

Zoptymalizowana izolacja jąder ze świeżych i mrożonych próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego

Opisujemy protokół ekstrakcji wysokiej jakości jąder z indukowanych kriokonserwowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących ze zrębu/śródbłonka i komórek krwi, aby wspierać analizy sekwencjonowania nowej generacji pojedynczego jądra. Wytwarzanie wysokiej jakości, nienaruszonych jąder jest niezbędne w eksperymentach multiomicznych, ale dla niektórych laboratoriów może stanowić barierę wejścia w tę dziedzinę.

Izolacja jądrowa z kriokonserwowanych komórek krwi pochodzących z in vitro

Biologia międzymięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) jest w dużej mierze niezbadana ze względu na ograniczoną dostępność tkanek ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji jąder i przygotowania biblioteki zamrożonego ludzkiego IMAT do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder w celu identyfikacji składu komórkowego tego unikalnego magazynu tłuszczu.

Izolacja jąder z ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder w dół

Poznaj częściowo zautomatyzowany protokół izolacji jąder z zamrożonych tkanek ssaków. Ta metoda zmniejsza zmienność techniczną i wspiera badania odkrywania leków oraz sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder.

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra (Wideo) | JoVE Journal

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

Przeglądaj więcej filmów