Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

Badania te koncentrują się na wspieraniu badań nad odkrywaniem leków z wykorzystaniem sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder w celu zbadania skuteczności i bezpieczeństwa potencjalnych terapii. W związku z tym opracowujemy ustandaryzowane protokoły ekstrakcji jąder dla świeżo mrożonych próbek tkanek z różnych narządów. Naszym celem była automatyzacja i standaryzacja ekstrakcji jąder w celu uzyskania spójnych i wiarygodnych wyników poprzez zmniejszenie zmienności niebiologicznej.

Zaletą jest częściowa automatyzacja dzięki zastosowaniu zrobotyzowanego dysocjatora oraz prosty i krótki przepływ pracy, który można zastosować do różnych próbek tkanek różnych gatunków. Posiadanie ustandaryzowanych protokołów może pomóc nam odpowiedzieć na pytania dotyczące biodystrybucji leków, a także zbadać mechanizmy leżące u podstaw wszelkich sygnałów bezpieczeństwa, które możemy zaobserwować. W przyszłości będziemy testować możliwość zastosowania naszego protokołu w innych aplikacjach podrzędnych, takich jak ATAC-seq lub multiomika.

Będziemy również starali się ustalić protokoły wykrywania transgenów ulegających ekspresji wirusa w pojedynczych jądrach. Aby rozpocząć, uruchom robotyczny dysocjator. Włącz chłodzenie, ustawiając suwak w prawym górnym rogu ekranu na chłodzenie i klikając go, aby rozpocząć chłodzenie, aby suwak był pomarańczowy.

Następnie sprawdź, czy dołączone butelki NSR i NIB mają wystarczającą ilość płynu i są odpowiednio schłodzone. Wyjmij próbki tkanek z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i natychmiast umieść je na suchym lodzie. Za pomocą wstępnie schłodzonego skalpela pokrój tkankę na kawałek o grubości od 15 do 15 miligramów na wstępnie schłodzonej szalce Petriego lub metalowej płytce umieszczonej na suchym lodzie.

Wyjąć wkład do izolacji jąder z lodówki i rozpakować go. Wyjmij młynek i odpipetuj 15 mikrolitrów inhibitora RNA na dno wkładu. Za pomocą pęsety umieść próbkę tkanki na dnie wkładu.

Następnie wybierz uruchom protokół na instrumencie i kliknij opcję jąder w lewym górnym rogu. Z menu wybierz protokół izolacji jąder o małej objętości, a następnie kliknij zmień, aby sprawdzić, czy prędkość zakłóceń jest ustawiona na najszybszą. Następnie otwórz drzwiczki instrumentu, włóż wkładkę w wyznaczone miejsce, obróć blokadę wkładki i wsuń do stage, aż czerwone pokrętło zatrzaśnie się na swoim miejscu.

Zamknij drzwiczki i kliknij przycisk Dalej, aby rozpocząć ekstrakcję jąder. Po zakończeniu pracy wyjmij wkładkę z instrumentu, podnosząc czerwone pokrętło i wyciągając stage. Natychmiast umieść wkład na lodzie.

Po wyizolowaniu pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków należy ostrożnie przekłuć okrągłą folię na kartridżu dysocjatora za pomocą końcówki pipety. Aby ułatwić oczyszczanie gradientu sacharozy, usuń 900 mikrolitrów zawiesiny jąder z wkładu i dodaj ją do 500 mikrolitrów roztworu poduszki sacharozowej lub SCS, przygotowanego w dwumililitrowej probówce. Dobrze wymieszać pipetując, aż mieszanina stanie się jednorodna.

Następnie trzymaj probówkę pod kątem i ostrożnie dodaj kroplami 1 400 mikrolitrów mieszaniny zawiesiny jąder i SCS na nowe 500 mikrolitrów SCS, tworząc wyraźnie widoczną separację faz. Ostrożnie zamknij rurkę i umieść ją z powrotem na lodzie, nie zakłócając separacji faz. Ostrożnie obracać probówki o masie 13 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza we wstępnie schłodzonej wirówce.

Usunąć supernatant bez naruszania osadu i ostrożnie ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach lodowatego NSR. Wyciągnij dwie granulki tej samej próbki do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj 900 mikrolitrów lodowatego NSR do całkowitej objętości jednego mililitra i dobrze wymieszaj pipetując.

Odwirować próbkę o sile 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą wirówki z obracającym się wirnikiem kubełkowym. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach PBS. Do liczenia rozcieńczyć 10 mikrolitrów zawiesiny jąder w 20 mikrolitrach PBS.

Dodać 25 mikrolitrów roztworu barwiącego jodek propidyny do studzienki mieszającej płytki zliczającej licznik fluorescencyjny. Następnie dodać 25 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny jąder i dobrze wymieszać pipetując. Przenieść 50 mikrolitrów zabarwionej próbki z dołka mieszającego do dołka załadowczego.

Załaduj płytkę liczącą na licznik komórek i rozpocznij liczenie. Po zliczeniu należy rozcieńczyć próbki PBS do pożądanego stężenia do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder. Korzystając z częściowo zautomatyzowanego protokołu izolacji jąder, uzyskano dobrej jakości jądra bez śladów blaśnięcia, odłamków czy zbrylania.

Pokazano wykresy skrzypcowe reprezentujące rozkład liczby genów, liczby UMI i zawartości mitochondriów w każdej próbce. Zidentyfikowano oczekiwane typy komórek z każdej tkanki, a wszystkie zwierzęta przyczyniły się do wszystkich klastrów, co wskazuje na niską zmienność techniczną wprowadzoną przez protokół. Co więcej, proporcje komórkowe, liczba UMI i liczba genów były porównywalne we wszystkich trzech próbkach na typ tkanki.