Przygotowanie i barwienie immunofluorescencyjne wiązek i pojedynczych komórek włóknistych z kory i jądra soczewki oka

Soczewka jest przezroczystym elipsoidalnym narządem w przedniej komorze oka i odpowiada za precyzyjne skupianie światła na siatkówce w celu uzyskania wyraźnego obrazu. Funkcja soczewki opiera się na jej właściwościach biomechanicznych. Niedawno wykazano, że złożone interdigitacje między komórkami włókien soczewki są ważne dla sztywności soczewki.

Podczas gdy wyspecjalizowana morfologia komórek włókien soczewkowych została wcześniej opisana za pomocą mikroskopii elektronowej, niewiele wiadomo o białkach, które są wymagane dla tych zazębiających się błon. Wcześniejsze badania opierały się na wycinkach tkanek soczewki, które nie pozwalają na wyraźną wizualizację złożonej architektury komórek. Stworzyliśmy i udoskonaliliśmy nowatorską technikę, aby wiernie zachować złożone połączenia błonowe między komórkami włókien soczewkowych w celu barwienia i obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej określonych białek.

W tym protokole istnieje również nowa metoda barwienia komórek włóknistych ze środka soczewki, która jest również znana jako jądro soczewki. Metoda ta otwiera drzwi do zrozumienia różnicowania i dojrzewania komórek włóknistych poprzez badanie mechanizmów powstawania i zmian w interdigitacjach błon. Zacznij od ustawienia myszy poddanej eutanazji do enukleacji oka.

Za pomocą zakrzywionych kleszczy dociśnij tkankę wokół oka, aby wysunąć oko z oczodołu, a następnie podnieś i wyjmij oko i przenieś je do świeżego PBS na tacy sekcyjnej. Za pomocą ultracienkich nożyczek przetnij nerw wzrokowy jak najbliżej gałki ocznej i ostrożnie włóż prostą pęsetę z cienką końcówką do gałki ocznej przez wyjście nerwu wzrokowego w tylnej części oka. Teraz włóż nożyczki w tylną część oka i rozpocznij wykonywanie nacięcia od tyłu w kierunku połączenia twardówkowo-rogówkowego i kontynuuj nacięcie, aż połowa połączenia zostanie oddzielona.

Delikatnie dociśnij rogówkę, aby soczewka mogła wyjść przez nacięcie. Za pomocą prostej pęsety z cienką końcówką ostrożnie usuń wszelkie duże kawałki tkanki z soczewki. Po znalezieniu obszaru równikowego płytko przebij soczewkę, a następnie wyjmij kapsułkę soczewki.

Przenieś komórki włókien soczewki do 60-milimetrowej naczynia z 1% paraformaldehydem. Za pomocą ostrego skalpela podziel kulę komórek włóknistych na pół wzdłuż jej przedniej tylnej osi, a następnie przetnij połówki wzdłuż tej samej osi, aby uzyskać ćwiartki. Użyj prostej pęsety, aby usunąć obszar jądra z ćwiartki komórki światłowodowej soczewki.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów 1% paraformaldehydu do 48-dołkowej płytki. Przenieś korę soczewki na płytkę i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie potrząsając z prędkością 300 obr./min. Po zablokowaniu dodaj odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe do płytki 48-dołkowej i przenieś próbki do roztworu przeciwciała pierwszorzędowego.

Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając lub nutując. Następnego dnia umyj próbki PTX i podobnie inkubuj je z przeciwciałami drugorzędowymi. Po umyciu próbek dodaj jedną kroplę lub 50 mikrolitrów pożywki montażowej na plus naładowane szkiełko mikroskopowe.

Umieść chusteczkę w podłożu montażowym i za pomocą pęsety delikatnie oddziel komórki włókniste od siebie. Następnie delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na oddzielonych komórkach w podłożu montażowym. Po usunięciu nadmiaru podłoża użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego na szkiełku przed mikroskopią konfokalną.

Po rozwarstwieniu soczewki i usunięciu torebki soczewki, przenieś masę komórek włóknistych na mokre opuszki palców w rękawiczce i delikatnie przetocz we wszystkich kierunkach, aby oddzielić jądro soczewki. Następnie przenieś jądro soczewki do świeżo przygotowanego 1% roztworu paraformaldehydu na 48-dołkowej płytce i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym potrząsaniem lub nutacją. Następnego dnia przenieś próbkę do 60-milimetrowej naczynia z 1% paraformaldehydem i za pomocą ostrego skalpela rozłup rozłup jądro soczewki wzdłuż przedniej tylnej osi na pół, a następnie na ćwiartki.

Następnie utrwalij, zablokuj, wybarwij i zamontuj próbkę, jak pokazano wcześniej. W tych preparatach znajdują się wiązki komórek włókien soczewkowych o unikalnej morfologii z różnych regionów soczewki. Barwienie sieci F-aktyny wykazuje wzbogacenie błony komórkowej w włókna różnicujące i dojrzałe, podczas gdy sygnały F-aktyny są obecne w cytoplazmie włókien jądrowych.

Skaningowa mikroskopia elektronowa i obrazy konfokalne różnicujących się komórek włókien pokazują palce kulkowe i panewkowe z małymi zazębiającymi się występami, podczas gdy dojrzałe włókna mają łopatki ozdobione małymi wypukłościami. Obrazy ze skaningowej mikroskopii elektronowej i mikroskopu konfokalnego komórek włókien soczewki jądrowej ujawniają rzadkie i większe zazębiające się występy na krótszych bokach komórek, gdzie błona komórkowa jest szorstka i ma palce pióra i wpustu w tych komórkach od środka soczewki.