Name: Przygotowanie i barwienie immunofluorescencyjne wiązek i pojedynczych komórek włóknistych z kory i jądra soczewki oka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Poznaj metodę immunofluorescencyjnego barwienia komórek włóknistych soczewki oka, umożliwiającą szczegółową analizę architektury błon i międzykomórkowych wypustek. Technika ta pozwala badać białka odpowiedzialne za sztywność soczewki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To dzieło zostało wsparte przez grant R01 EY032056 (dla CC) z National Eye Institute. Autorzy dziękują dr Theresie Fassel i Kimberly Vanderpool z Scripps Research Core Microscopy Facility za pomoc w obrazach mikroskopu elektronowego.

Myszy były traktowane zgodnie z protokołem dotyczącym zwierząt zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Instytucjonalnymi na Uniwersytecie w Bloomington. Myszy użyte do uzyskania reprezentatywnych danych były kontrolnymi (dzikim typem) zwierzętami w tle C57BL6/J, płci żeńskiej i w wieku 8-12 tygodni. W tym eksperymencie można używać zarówno myszy samców, jak i samic, ponieważ płeć myszy jest bardzo mało prawdopodobna, aby wpłynąć na wynik eksperymentu.
1. Sekcja oka i usuwanie torebki
<ol>
	<li>Wyłącz myszy zgodnie z 'Wytycznymi ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi' Narodowych Instytutów Zdrowia, a także z protokołami dotyczącymi stosowania zwierząt zatwierdzonymi przez instytucję. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu myszy zostały uśpione przez przedawkowanie CO2, a następnie przeprowadzono dyslokację szyjną zgodnie z zatwierdzonym protokołem dotyczącym zwierząt (Uniwersytet Indiana).</li>
	<li>Usuń oczy myszy za pomocą zakrzywionych kleszczy, wciskając tkankę wokół oczu jedną stroną kleszczy, aby przemieścić oko z oczodół. Następnie zamknij kleszcze pod okiem i podnieś, aby usunąć oko z oczodół. Przenieś oczy do świeżego 1x roztworu tamponowego fosforanowego (PBS) w tackę do sekcjonowania.</li>
	<li>Przeciąć nerw wzrokowy ultradrobnymi nożyczkami jak najbliżej gałki ocznej. Ostrożnie wsuń drobne, proste kleszcze przez nerw wzrokowy do gałki ocznej w jego wylocie w tylnej części oka.</li>
	<li>Ostrożnie wsuń nożyczki w tym samym miejscu co kleszcze w kroku 1.3 i zacznij ciąć nacięcie od tyłu ku złączeniu rogówki i twardówki. 
	UWAGA: Soczewkowe okulisty zajmują około 30% ich oczu. Przypadkowe uszkodzenie wystąpi, jeśli kleszcze lub nożyczki zostaną włożone zbyt głęboko w oko.</li>
	<li>Kontynuuj cięcie wzdłuż złączenia rogówki i twardówki, aż co najmniej połowa złącza zostanie oddzielona.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby delikatnie nacisnąć na rogówkę, aby soczewka mogła wyjść przez nacięcie wykonane w krokach 1.4 i 1.5.</li>
	<li>Ostrożnie usuń wszelkie duże kawałki tkanki z soczewki za pomocą drobnych, prostych kleszczy. Zbadaj soczewkę, aby znaleźć region równikowy.</li>
	<li>Lekko przekłuj soczewkę za pomocą drobnych, prostych kleszczy, a następnie usuń torebkę soczewki. Masa komórek włókien soczewki pozostanie nienaruszona, a warstwa nabłonkowa soczewki pozostanie przymocowany do torebki soczewki. Wyrzuć torebkę soczewki.</li>
</ol>
2. Barwienie pojedynczych komórek włókien soczewki
<ol>
	<li>Przenieś masę komórek włókien soczewki do płytki dolnej z 500 μL świeżo przygotowanego 1% roztworu paraformaldehydu (PFA; w 1x PBS) i inkubować próbki w 4 °C przez noc z łagodnym nutowaniem (Rysunek 2A). 
	UWAGA: Podane objętości roztworów są zoptymalizowane dla płytek 48-dołkowych. Jeśli używane są płytki innego rozmiaru lub probówki, dostosuj objętości roztworów odpowiednio. Roztwory do fiksacji, blokowania i mycia (1x PTX, 0,1% Triton X-100 w 1x PBS) zostały przygotowane z 10x PBS i podwójnie destylowana woda (ddH2O) do końcowej koncentracji 1x PBS.</li>
	<li>Przenieś komórki włókien soczewki do 60 mm naczynia z 1% PFA. Użyj ostrego nożyka, aby podzielić kulkę komórek włókien na pół wzdłuż osi przednio-tylnej (Rysunek 2B). Pokrój połowy ponownie na pół wzdłuż tej samej osi, aby uzyskać ćwiartki.</li>
	<li>Użyj prostych kleszczy, aby usunąć region jądra z ćwiartkami komórek włókien soczewki (Rysunek 2C). 
	UWAGA: Oś przednio-tylna jest łatwo rozpoznawalna przez kierunek komórek włókien w masie tkankowej.</li>
	<li>Pofiksuj ćwiartki regionu kory soczewki w 200 μL 1% PFA przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT) z łagodnym wstrząsaniem (300 obr./min na wstrząsaczu płytkowym).</li>
	<li>Wypłucz ćwiartki tkanki dwa razy w 750 μL 1x PBS przez 5 min każdy z łagodnym wstrząsaniem w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zablokuj próbki za pomocą 200 μL roztworu blokującego (5% surowicy, 0,3% Triton X-100, 1x PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z łagodnym wstrząsaniem. 
	UWAGA: W reprezentatywnych danych w tym protokole próbki nie były barwione antyczałkami pierwotnymi ani wtórnymi. Po etapie blokowania próbki były inkubowane z lektyną z żyta (WGA; 1:100) i fałdyną (1:100) (patrz Tabela materiałów) przez 3 godziny w temperaturze pokojowej z łagodnym wstrząsaniem i ochroną przed światłem. Barwienie

Immunofluorescence Staining of Membrane Interdigitations in Lens Fiber Cells

<ol><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+regulation+of+lens+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Growth factor regulation of lens development.</a> Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).</li>
<li>Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surface+morphology+of+embryonic+and+adult+chick+lens-fiber+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells.</a> The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).</li>
<li>Kuszak, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+epithelial+and+fiber+cells+in+the+crystalline+lens%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens.</a> International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).</li>
<li>Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereo+scanning+electron+microscopy+of+the+crystalline+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens.</a> Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).</li>
<li>Lo, W. K., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Square+arrays+and+their+role+in+ridge+formation+in+human+lens+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers.</a> Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).</li>
<li>Taylor, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+the+normal+human+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Morphology of the normal human lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (7), 1396-1410 (1996).</li>
<li>Vrensen, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+the+human+eye+lens-a+morphological+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Part+A%2C+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging of the human eye lens-a morphological point of view.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).</li>
<li>Vrensen, G. F., Duindam, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+fiber+membranes+in+the+human+eye+lens.+Ultrastructural+and+Raman+microspectroscopic+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations.</a> Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).</li>
<li>Willekens, B., Vrensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+organization+of+lens+fibers+in+the+rabbit.+A+scanning+electron+microscopic+reinvestigation%5BTitle%5D)+AND+%22Albrecht+von+Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Opthalmology%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation.</a> Albrecht von Graefe's Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).</li>
<li>Willekens, B., Vrensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+organization+of+lens+fibers+in+the+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).</li>
<li>Zhou, C. J., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+clathrin%2C+AP-2+adaptor+and+actin+cytoskeleton+with+developing+interlocking+membrane+domains+of+lens+fibre+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells.</a> Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).</li>
<li>Kuwabara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maturation+of+the+lens+cell%3A+a+morphologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The maturation of the lens cell: a morphologic study.</a> Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).</li>
<li>Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffness+gradient+in+the+crystalline+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Stiffness gradient in the crystalline lens.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (9), 1357-1366 (2007).</li>
<li>Weeber, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mechanical+properties+of+human+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic mechanical properties of human lenses.</a> Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).</li>
<li>Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+relationship+between+lens+stiffness+and+accommodative+amplitude%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude.</a> Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).</li>
<li>Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+increase+in+the+stiffness+of+the+human+lens+nucleus+with+age%3A+the+basis+for+presbyopia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia.</a> Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).</li>
<li>Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presbyopia+and+heat%3A+changes+associated+with+aging+of+the+human+lens+suggest+a+functional+role+for+the+small+heat+shock+protein%2C+alpha-crystallin%2C+in+maintaining+lens+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility.</a> Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).</li>
<li>Glasser, A., Campbell, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biometric%2C+optical+and+physical+changes+in+the+isolated+human+crystalline+lens+with+age+in+relation+to+presbyopia%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia.</a> Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).</li>
<li>Pierscionek, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+response+of+human+lenses+to+stretching+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Age-related response of human lenses to stretching forces.</a> Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).</li>
<li>Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+are+selectively+associated+with+interlocking+ball-and-sockets+but+not+protrusions+in+the+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens.</a> Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).</li>
<li>Lo, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-0+targets+interlocking+domains+to+control+the+integrity+and+transparency+of+the+eye+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropomyosin+3.5+protects+the+F-actin+networks+required+for+tissue+biomechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties.</a> Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropomodulin+1+regulation+of+actin+is+required+for+the+formation+of+large+paddle+protrusions+between+mature+lens+fiber+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).</li>
<li>Kuszak, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+lens+sutures%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The development of lens sutures.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 14 (2), 567-591 (1995).</li>
<li>Bassnett, S., Costello, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cause+and+consequence+of+fiber+cell+compaction+in+the+vertebrate+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens.</a> Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).</li>
<li>Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+interlocking+domains+may+contribute+to+formation+of+membranous+globules+and+lens+opacity+in+ephrin-A5%28-%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice.</a> Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).</li>
<li>Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+specializations+emerging+late+in+mouse+lens+fiber+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+eye+lens+biomechanics%2C+morphology%2C+refractive+index+and+transparency%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency.</a> Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA2+affects+development+of+the+eye+lens+nucleus+and+the+gradient+of+refractive+index%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2(2022).</li>
<li>Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+application+of+glass+coverslips+to+assess+the+compressive+stiffness+of+the+mouse+lens%3A+strain+and+morphometric+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e53986(2016).</li>
<li>Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E. Anatomy of the eye and orbit. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aForrester%2C+JV+%22The+Eye+%28Fourth+Edition%29%22">The Eye (Fourth Edition)</a>. Saunders, W. B. , 1(2016).</li>
<li>Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+actin+filament+cytoskeleton%3A+Diverse+structures+for+complex+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions.</a> Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).</li>
<li>Goldberg, M. W., Fiserova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+labeling+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunogold labeling for scanning electron microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).</li>
<li>Goldberg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+scanning+electron+microscopy+and+immuno-gold+labeling+of+the+nuclear+lamina+and+nuclear+pore+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex.</a> Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).</li>
<li>Hermann, R., Walther, P., Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+labeling+in+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunogold labeling in scanning electron microscopy.</a> Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).</li>
<li>Gokhin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry%2C+transparency%2C+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

To protokół wykazał metody fiksacji, zachowania i immunobarwienia, które wiernie zachowują 3D morfologię błony pęczków lub pojedynczych włókien soczewki z różnych głębokości soczewki. Barwione włókna soczewki są porównywane z preparatami SEM, które od dawna są używane do badania morfologii komórek włókien soczewki. Wyniki pokazują porównywalne struktury błony między obiema preparatami. EM pozostaje standardem złotym w badaniach morfologii komórek, ale immunolabeling jest bardziej wymagający w próbkach SEM w lokalizowaniu...

Sok jest przezroczystym i owalnym tkankiem w przedniej komorze oka, zbudowanym z dwóch rodzajów komórek, nabłonkowych i włóknistych1 (Rysunek 1). Istnieje pojedyncza warstwa komórek nabłonkowych, która pokrywa przednią półkulę soczewki. Komórki włókniste są zróżnicowane z komórek nabłonkowych i stanowią większość soczewki. Wysoce specjalizujące się komórki włókniste przechodzą programowanie wydłużania, różnicowania i dojrzewania, oznakowane wyraźnymi zmianami w morfologii błony komórkowej od obwodu soczewki do jej centrum2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12, znane również jako jądro soczewki. Funkcja soczewki polegająca na precyzyjnym fokusowaniu światła nadchodzącego z różnych odległości na siatkówkę zależy od jej właściwości biomechanicznych, w tym sztywności i sprężystości13,14,15,16,17,18,19. Złożone przeszycia włókien soczewki zostały wysunięte jako hipoteza20,21 i ostatnio wykazano, że są ważne dla sztywności soczewki22,23.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65638/65638fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Schematy anatomii soczewki i reprezentatywne zdjęcia mikroskopowe skaningowego elektronowego (SEM) z włókien soczewki. Rysunek przedstawia przekrój wzdłużny (od przodu do tyłu od góry do dołu) przedniej warstwy komórek nabłonkowych (zacienione na jasnoniebiesko) i masy komórek włókien soczewki (w kolorze białym). Środek soczewki (zacieniony na różowo) nazywany jest jądrem i składa się z mocno zagęszczonych komórek włóknistych. Po prawej stronie rysunek przekroju pokazuje wydłużony sześciokątny kształt komórek włókien soczewki, upakowane w wzór plastra miodowego. Komórki włókniste mają dwie szerokie strony i cztery krótkie strony. Reprezentatywne zdjęcia SEM umieszczone na dole pokazują złożone przeszycia błon między komórkami włókien soczewki na różnych głębokościach soczewki. Po prawej stronie nowo utworzone włókna soczewki na obwodzie soczewki mają małe wypustki wzdłuż krótkich stron i kulki z gniazdem wzdłuż szerokiej strony (czerwone pudełka). Podczas dojrzewania włókna soczewki tworzą duże domeny w kształcie łopatki, ozdobione małymi wypustkami wzdłuż krótkich stron (niebieskie pudełka). Dojrzałe komórki włókniste posiadają duże domeny w kształcie łopatki zilustrowane przez małe wypustki. Te przeszycia są ważne dla właściwości biomechanicznych soczewki. Komórki włókniste w jądrze soczewki mają mniej małych wypustek wzdłuż krótkich stron i mają złożone przeszycia języczkowo-ryflowane (fioletowe pudełka). Szerokie strony komórek wykazują globularną morfologię błony. Rysunek został zmodyfikowany z22,32 i nie został narysowany w skali. Skala 3 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65638/65638fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Sok rośnie poprzez dodawanie warstw nowych komórek włóknistych nakładanych na poprzednie pokolenia włókien24,25. Komórki włókniste mają wydłużony, sześciokątny kształt przekroju z dwiema szerokimi stronami i czterema krótkimi stronami. Te komórki rozciągają się od przedniego do tylnego bieguna soczewki, a w zależności od gatunku, włókna soczewki mogą mieć kilka milimetrów długości. Aby utrzymać strukturę tych wydłużonych i cienkich komórek, specjalistyczne przeszycia wzdłuż szerokich i krótkich stron tworzą przeszycia, aby utrzymać kształt soczewki i jej właściwości biomechaniczne. Zmiany w kształcie błony komórkowej podczas różnicowania i dojrzewania komórek włóknistych zostały szeroko udokumentowane w badaniach mikroskopii elektronowej (EM)2,3,4,5,6,7,8,9,10</sup

<table><tbody><tr><td>100% Triton X-100</td><td>FisherScientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>60mm plate</td><td>FisherScientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10X phosphate buffered saline</td><td>ThermoFisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>1X phosphate buffered saline</td><td>ThermoFisher</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>48-well plate</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-7548</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips (22 x 40 mm)</td><td>FisherScientific</td><td>12-553-467</td><td></td></tr><tr><td>Curved tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>501981</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stereo Discovery V8</td><td></td></tr><tr><td>Fine tip straight tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72707-01</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>FisherScientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin (rhodamine)</td><td>ThermoFisher</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11</td><td>VWR</td><td>76241-186</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Straight forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp;Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)</td><td>FisherScientific</td><td>12-565-154</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-fine scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Wheat germ agglutinin (fluorescein)</td><td>Vector Laboratories</td><td>FL-1021-5</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i barwienie immunofluorescencyjne pęczków i pojedynczych komórek włókien z kory i jądra soczewki oka

Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens

Soczewica jest przezroczystym i elipsoidalnym narządem w komorze przedniej oka, który zmienia kształt, aby precyzyjnie skupiać światło na siatkówce i tworzyć jasny obraz. Większość tego tkanki składa się ze specjalizowanych, zróżnicowanych komórek włóknistych, które mają sześciokątne przekroje i rozciągają się od przednich do tylnych biegunów soczewki. Te długie i cienkie komórki są ściśle ustawione obok komórek sąsiednich i mają skomplikowane wtopy wzdłuż długości komórki. Specjalizowane, wzajemnie się łączące struktury są wymagane dla normalnych właściwości biomechanicznych soczewki i zostały szczegółowo opisane za pomocą technik mikroskopii elektronowej. Ten protokół demonstruje pierwszą metodę zachowania i immunobarwienia pojedynczych, a także pakietów komórek włóknistych soczewki myszy, aby umożliwić szczegółowe lokalizowanie białek wewnątrz tych skomplikowanych kształtów komórek. Przedstawione dane pokazują barwienie komórek włóknistych obwodowych, różnicujących się, dojrzałych i jądrowych na wszystkich obszarach soczewki. Ta metoda może być potencjalnie stosowana na komórkach włókniskowych izolowanych z soczewek innych gatunków.

Komórki włókien soczewki są przygotowywane z kory soczewki (różnicujące się włókna i dojrzałe włókna) oraz jądra, a komórki są barwione za pomocą phalloidyny na F-aktynę i WGA na błonę komórkową. Obserwuje się i obrazuje mieszankę pęczków komórek lub pojedynczych włókien soczewkowych (Rysunek 3). Z kory soczewki znajduje się dwa rodzaje komórek (Rysunek 3A). Różnicujące się komórki włókien na obrzeżach soczewki są proste, z bardzo małymi wypustkami wzdłuż ich kr...

Ten protokół opisuje metody przygotowania obwodowych, dojrzałych i jądrowych komórek włókien kryształka oka do barwienia immunofluorescencyjnego w celu zbadania złożonych wnikania komórki w komórkę oraz architekturę błony.

Przygotowanie i barwienie immunofluorescencyjne pęczków i pojedynczych komórek włókien z kory i jądra soczewki oka

The lens is a transparent and ellipsoid organ in the anterior chamber of the eye that changes shape to finely focus light onto the retina to form a clear ...

Sokółka jest przezroczystym elipsoidalnym narządem w przedniej komorze oka i odpowiada za precyzyjne ustalenie ostrości światła na siatkówce, tworząc jasny obraz. Funkcja soczewki opiera się na jej właściwościach biomechanicznych. Złożone zagłębienia między komórkami włókien soczewki zostały niedawno uznane za ważne dla sztywności soczewki.Podczas gdy specjalistyczna morfologia komórek włókien soczewki została wcześniej opisana przez mikroskopię elektronową, niewiele wiadomo o białkach, które są wymagane do tych wpiętych błon. Poprzednie badania opierały się na sekcjach tkanki soczewki, które nie pozwalają na jasne uwidocznienie złożonej architektury komórki. Stworiliśmy i doskonaliliśmy nową technikę, aby wiernie zachować złożone zagłębienia błon między komórkami włókien soczewki do barwienia i obrazowania konfokalnego określonych białek.W tym protokole znajduje się również nowa metoda barwienia komórek włókien od środka soczewki, która jest również znana jako jądro soczewki. Ta metoda otwiera drogę do zrozumienia różnicowania i dojrzewania komórek włókien poprzez badanie mechanizmów tworzenia i zmian w zagłębieniach błon. Zacznij od ustawienia eutanatyzowanego mysza na enukleację oka.Używając wygiętych kleszczy, uciśnij tkankę wokół oka, aby przesunąć oko z oczodół, następnie podnieś i usuń oko, przenosząc je do świeżego PBS na tacy do sekcjonowania. Używając ultradrobnych nożyczek, przetnij nerw wzrokowy tak blisko gałki ocznej, jak to możliwe i ostrożnie wsuń drobne proste kleszcze do gałki ocznej przez wyjście nerwu wzrokowego z tylnej strony oka. Teraz, wsuń nożyczki do tylnej części oka i zacznij wykonywać nacięcie od tylnej strony w kierunku złącza rogówki ze ścięgnom i kontynuuj nacięcie, aż połowa złącza zostanie oddzielona.Delikatnie naciśnij na rogówkę, aby soczewka mogła wyjść przez nacięcie. Używając drobnych prostych kleszczy, ostrożnie usuń wszelkie duże kawałki tkanki z soczewki. Po znalezieniu regionu równikowego, płytko przekłuj soczewkę, a następnie usuń torebkę soczewki.Przenieś komórki włókien soczewki do 60-milimetrowej miski z 1% paraformaldehydem. Używając ostrego noża, podziel kulę komórek włókien na pół wzdłuż przednio-tylnej osi, a następnie dalej przetnij połówki wzdłuż tej samej osi, aby uzyskać ćwiartki. Użyj prostych kleszczy, aby usunąć region jądra z ćwiartki komórki włókna soczewki.Następnie dodaj 200 mikrolitrów 1% paraformaldehydu do 48-dołkowej płytki. Przenieś korę soczewki na płytkę i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej z lekkim wstrząsaniu przy 300 RPM. Po blokowaniu dodaj odpowiednie przeciwciała pierwotne do 48-dołkowej płytki i przenieś próbki do roztworu przeciwciał pierwotnych.Inkubuj próbki przez noc w czterech stopniach Celsjusza z lekkim wstrząsaniem lub nutacją. Następnego dnia przepłucz próbki PTX i podobnie inkubuj je z przeciwciałami wtórnymi. Po przepłukaniu próbek dodaj jedną kroplę lub 50 mikrolitrów mediów montażowych na naładowaną dodatnio szklaną slajdkę mikroskopijną.Umieść tkankę w mediach montażowych i użyj kleszczy, aby delikatnie oddzielić komórki włókien od siebie. Następnie delikatnie umieść pokrywkę na oddzielonych komórkach w mediach montażowych. Po usunięciu nadmiaru mediów użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie pokrywki na slajdzie przed mikroskopią konfokalną.Po sekcji soczewki i usunięciu torebki soczewki, przenieś masę komórek włókien na mokre, zabezpieczone rękawiczkami palce i delikatnie przewracaj we wszystkich kierunkach, aby oddzielić jądro soczewki. Następnie przenieś jądro soczewki do świeżo przygotowanego 1% roztworu paraformaldehydu w 48-dołkowej płytce i inkubuj przez noc w czterech stopniach Celsjusza z lekkim wstrząsaniem lub nutacją. Następnego dnia przenieś próbkę do 60-milimetrowej miski z 1% paraformaldehydem i użyj ostrego noża, aby podzielić jądro soczewki wzdłuż przednio-tylnej osi na pół, a następnie na ćwiartki.Następnie ponownie fiksuj, blokuj, barw i zamontuj próbkę, jak to zostało wcześniej pokazane. W tych preparatach wiązki komórek włókien soczewki o unikalnych morfologiach są znalezione w różnych regionach soczewki. Barwienie sieci F-aktyny pokazuje wzbogacenie na błonie komórkowej w różnicujących się i dojrzałych włóknach, podczas gdy sygnały F-aktyny są obecne w cytoplazmie włókien jądrowych.Mikroskopia elektronowa skaningowa i obrazy konfokalne różnicujących się komórek włókien pokazują zagłębienia typu gniazdo z małymi wpiętymi wypustkami, podczas gdy dojrzałe włókna mają łopatki zdobione małymi wypustkami. Mikroskopia elektronowa skaningowa i obrazy mikroskopu konfokalnego komórek włókien soczewki jądrowych ujawniają rzadkie i większe wpięte wypustki na krótkich bokach komórek

preparation-immunofluorescence-staining-bundles-single-fiber-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W wielu sytuacjach biologicznych i klinicznych korzystne jest badanie procesów komórkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku. W niniejszym materiale opisujemy montaż i zastosowanie niedrogiego mikroskopu światłowodowego, który umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym w hodowlach komórkowych, badaniach na zwierzętach oraz w badaniach klinicznych z udziałem pacjentów.

Wysokorozdzielcza mikroendoskopia światłowodowa do obrazowania komórkowego in situ

Techniki wizualizacji cytoarchitektury siatkówki bezpośrednio przylegającej do pojedynczych elektrod w stymulatorze siatkówki.

Techniki przetwarzania oczu z wszczepioną protezą siatkówki do miejscowej analizy histopatologicznej

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Pokazujemy trzy różne techniki przygotowania tkanek do immunohistochemicznej wizualizacji mikrokrążeń siatkówki szczura, tj. kriosekcje, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowanie sieci naczyniowej.

Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych

Te protokoły zostały opracowane w celu analizy morfologii soczewki korowej, integralności strukturalnej szwów soczewki danio pręgowanego w soczewkach stałych i żywych oraz do pomiaru położenia jądra soczewki danio pręgowanego wzdłuż osi przednio-tylnej.

Ocena lokalizacji jądra soczewki danio pręgowanego i integralności szwów

Obecne protokoły opisują nowatorskie obrazowanie całego mocowania do wizualizacji struktur peryferyjnych w soczewce oka z metodami kwantyfikacji obrazu. Protokoły te mogą być wykorzystywane w badaniach w celu lepszego zrozumienia związku między strukturami mikroskali soczewek a rozwojem/funkcją soczewki.

Obrazowanie całego mocowania w celu wizualizacji i ilościowego określenia struktury soczewek obwodowych, morfologii i organizacji komórek

Ten protokół opisuje niezawodną metodę uzyskiwania wysokiej jakości kriosekcji całych oczu królika. Szczegółowo opisuje procedury sekcji, fiksacji, osadzania i cięcia oczu królika, które można łatwo dostosować do użycia w dowolnym badaniu wykorzystującym immunohistochemię w większych oczach.

Uzyskanie wysokiej jakości kriosekcji całego oka królika

Metoda ta wizualizuje rodzimą strukturę włókien kolagenowych w ciele szklistym za pomocą mikroskopii konfokalnej refleksji.

Przygotowanie oczu wieprzi do mikroskopii refleksyjnej konfokalnej w celu wizualizacji sieci włókien kolagenowych szklistych

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzące z komórek macierzystych mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do terapii komórkowych w celu zwyrodnienia siatkówki, modelowania chorób i badań nad lekami. Poniżej przedstawiamy prosty protokół umożliwiający powtarzalne pozyskiwanie RPE z komórek macierzystych.

Efektywne pozyskiwanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Poznaj metodę immunofluorescencyjnego barwienia komórek włóknistych soczewki oka, umożliwiającą szczegółową analizę architektury błon i międzykomórkowych wypustek. Technika ta pozwala badać białka odpowiedzialne za sztywność soczewki.

Przygotowanie i barwienie immunofluorescencyjne pęczków i pojedynczych komórek włókien z kory i jądra soczewki oka

Przeglądaj więcej filmów