Platforma do ilościowej detekcji komórek odpornościowych endometrium w oparciu o immunohistochemię i cyfrową analizę obrazu

Obecnie trudno jest ustabilizować analizę w pewnym zakresie. Trudno jest również utrzymać kontrolę jakości eksperymentu. Nasze badania mogą pomóc pacjentkom z nieprawidłową wrażliwością endometrium w perspektywie immunologicznej w znalezieniu przyczyny niewydolności rozrodczej.

Miejscowy odsetek komórek odpornościowych w endometrium może być stabilnie i wielokrotnie wykrywany. Nasze odkrycia mogą przyczynić się do postępu w badaniach nad oceną wrażliwości endometrium u pacjentek z powtarzającymi się niepowodzeniami implantacji. Na początek użyj pęsety, aby przenieść tkankę endometrium z formaliny na papier do zatapiania.

Za pomocą linijki zmierz wymiary tkanki endometrium. Teraz zawiń chusteczkę w papier do zatapiania i umieść ją w kasecie do zatapiania. Przenieś kasetę do kosza na chusteczki w celu odwodnienia.

Aby odwodnić tkankę endometrium, umieść kosz na tkanki w komorze reakcyjnej odwadniacza i rozpocznij procedurę rutynowego odwadniania tkanek. Po zakończeniu odwadniania otwórz komorę reakcyjną odwadniacza i wyjmij kosz na chusteczki. Na początek wybierz odpowiednią formę do zatapiania, która pasuje do wielkości odwodnionej próbki endometrium.

Wypełnij go woskiem parafinowym podgrzanym do 70 stopni Celsjusza. Natychmiast umieść odwodnioną ludzką tkankę endometrium w formie. Użyj kleszczy, aby ostrożnie wyregulować tkankę, aby upewnić się, że jest umieszczona centralnie.

Teraz przenieś formę na płytę chłodzącą i delikatnie dociśnij tkankę pęsetą, gdy parafina na dnie zastygnie. Umieść osadzoną kasetę nad formą i posyp ją większą ilością wosku. Następnie umieść formę z powrotem na płycie chłodzącej.

Gdy parafina całkowicie zastygnie, wyjmij blok i dołączoną do niego kasetę z formy. W celu przekrojenia włóż blok do klipsa do próbki w mikrotomie. Umieść ostrze w uchwycie i wyreguluj kąt między płaszczyzną bloku a ostrzem.

Teraz dostosuj grubość przekroju do czterech mikrometrów. Następnie obróć pokrętło, aby rozpocząć krojenie. Wytnij cienkie odcinki z bloku, aby odsłonić odpowiednią powierzchnię tkanki.

Użyj pędzla, aby zebrać ciągłe i pełne sekcje. Po uzyskaniu wystarczającej liczby sekcji użyj pęsety, aby usunąć niekwalifikowane sekcje z przodu. Za pomocą pędzla przenieś skrawki do ciepłej łaźni wodnej podgrzanej do 42 stopni Celsjusza.

Gdy sekcje całkowicie się spłaszczą, użyj prowadnic zapobiegających odłączeniu, aby je podnieść. Następnie piecz je w szkiełku podgrzewanym w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez ponad 60 minut przed wyjęciem. Na początek przenieś rozcieńczony roztwór przeciwciał do specjalnej butelki z odczynnikiem.

Włóż zestaw detekcyjny do komory na odczynniki automatycznego stojącego przyrządu immunohistochemicznego. Następnie ustaw szkiełka z wyciętą tkanką endometrium na uchwycie szkiełek i przykryj je specjalną płytką maskującą. Następnie włóż uchwyt do komory eksperymentalnej reakcji przyrządu.

Gdy przyrząd automatycznie rozpozna informacje na odczynniku i szkiełku, naciśnij przycisk start, aby rozpocząć barwienie immunohistochemiczne. Po zabarwieniu wyjmij uchwyt szkiełka. Włóż poplamione szkiełko do uchwytu szkiełka, aby zmyć pozostały barwnik czystą wodą.

Teraz umieść uchwyt szkiełka na automatycznym pantoflu nakrywkowym i uruchom procedurę odwadniania i uszczelniania. Wyjmij szkiełka po zakończeniu odwadniania i uszczelniania. Na początek umieść szkiełka z immunohistochemicznie wybarwionymi skrawkami endometrium na stojaku na szkiełka panoramicznego skanera obrazów patologicznych.

Następnie umieść stojak w komorze skanowania slajdów instrumentu, aby rozpocząć skanowanie. Po zakończeniu skanowania uruchom oprogramowanie do analizy obrazu i utwórz nowy folder. Zaimportuj obrazy, które wymagają analizy.

Aby utworzyć klasyfikator tkankowy, zaznacz kilka tkanek wraz z pustą adnotacją, aby ustanowić klasyfikator, który identyfikuje tkankę i puste obszary. Korzystaj z dostrajania w czasie rzeczywistym, aby obserwować zdolność rozpoznawania oprogramowania podczas adnotacji znaku. Aby zbudować algorytm analizy, wybierz w oprogramowaniu standardowy algorytm IHC multipleksu i wybierz piksele ujemne i dodatnie, aby ustawić parametry kolorów rozpoznawania komórek.

Ustal parametry jądra, cytoplazmy i błony komórkowej, aż zostaną znalezione optymalne parametry obrazu. Teraz ustaw dodatni próg rozpoznawania komórek i optymalizuj go, aż do uzyskania odpowiedniego progu. Następnie wybierz klasyfikator tkankowy w algorytmie.

Sprawdź znajdującą się w nim część tkanki, aby zidentyfikować komórki na podstawie tkanek. Wybierz obszar analizy, a następnie użyj ustalonego algorytmu do analizy obrazów. Po zakończeniu analizy ręcznie sprawdź dokładność rozpoznawania tkanek, rozpoznawania negatywnego i pozytywnego.

Jeśli rozpoznawanie obrazu jest niedokładne, ponownie dostosuj algorytm i progi parametrów. Uruchom analizę obrazu, dopóki nie zakończy się pomyślnie. Następnie wyeksportuj wyniki analizy.

Ustaw różne parametry analizy zgodnie z ekspresją różnych markerów immunologicznych endometrium. Użyj oprogramowania, aby obliczyć proporcję komórek odpornościowych endometrium. Po obliczeniach użyj tych wartości do oceny poziomów różnych komórek odpornościowych w błonie śluzowej macicy u pacjentek z nawracającymi poronieniami.

Różne komórki odpornościowe zostały wybarwione immunohistochemicznie w oparciu o ich indywidualną ekspresję różnych markerów. Brązowa plama reprezentuje pozytywne komórki odpornościowe, a niebieska reprezentuje jądro. U kobiet z nawracającymi poronieniami stwierdzono ekspresję różnych komórek odpornościowych.

Komórki CD56 wydają się dominować w 16,76%, przy czym komórki CD1a i Foxp3 stanowią od 0,11 do 0,12% populacji komórek odpornościowych.